Reprodução e crescimento microbiano

Introdução ao crescimento microbiano

• Crescimento: aumento ordenado de todos os componentes do sistema biológico → aumento da massa celular → multiplicação celular

• Em microrganismos que se dividem por fissão ou por gemulação → aumento do número de indivíduos

• Pontos de vista de estudo:• Individual : ciclo celular

– Replicação e segregação de cromossomos– Síntese de novos materiais dos envoltórios celulares– Coordenação da replicação e divisão celular

Ciclo celular» Sequência de eventos identificáveis que ocorrem

desde que surge uma nova célula até que esta se divida em duas filhas.

• Populacional– Cinética de crescimento– Fatores que afetam o tempo de geração– Fatores ambientais que afetam o crescimento

MULTIPLICAÇÃO BACTERIANA PELA FISSÃO BINÁRIA

Crescimento

Mitose

Células-filhas

Crescimento inicial

DNA polimerase e reparo de dano no DNA

Síntese de DNA

Ciclo celular eucariótico

Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e não ao aumento das dimensões celulares.

Crescimento Populacional: é definido como o aumento do número, ou da massa microbiana.

Taxa de crescimento: é a variação no número ou massa de microrganismos por unidade de tempo.

Tempo de geração: é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique. O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos até dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo de geração não corresponde a um parâmetro absoluto, uma vez que é dependente de fatores genéticos e nutricionais, indicando o estado fisiológico da cultura.

O tempo de geração pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela fórmula abaixo:

N=No.2n

onde N= número final de célulasNo= número inicial de célulasn= número de geraçõesn= log(N) - log(No)/0,301g = t/n , onde g= tempo de geração t= tempo de crescimento n= determinado acima.

Curva de crescimento (cultura descontínua)Quando uma cultura microbiana desenvolve-se em um sistema fechado, pode-se confeccionar uma curva de crescimento. Esta pode ser dividida em diferentes etapas: lag, log, estacionária e de declínio.

Lag: período variável, onde ainda não há um aumento significativo da população. Ao contrário, é um período onde o número de organismos permanece praticamente inalterado. Esta fase é apenas observada quando o inóculo inicial é proveniente de culturas mais antigas.

A fase lag ocorre porque as células de fase estacionária encontram-se depletadas de várias coenzimas essenciais e/ou outros constituintes celulares necessários à absorção dos nutrientes presentes no meio.

A fase lag também é observada quando as células sofrem traumas físicos (choque térmico, radiações) ou químicos (produtos tóxicos), ou quando são transferidas de um meio rico para outro de composição mais pobre, devido a necessidade de síntese de várias enzimas. Assim, durante este período observa-se um aumento na quantidade de proteínas, no peso seco e no tamanho celular.

Log ou exponencial: nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Deve ser levado em conta também que neste momento, a quantidade de produtos finais de metabolismo ainda é pequena.

A taxa de crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo em questão. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos. S. cerevisiae : g= 90 minutosE. coli : g= 20 minutos

Nesta fase são realizadas as medidas de tempo de geração. Geralmente, ao final da fase log, as bactérias passam a apresentar fenótipos novos, decorrentes do processo de comunicação denominado "quorum sensing".

Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da população, ou seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem.

É na fase estacionária que são sintetizados vários metabólitos secundários, que incluem antibióticos e algumas enzimas. Nesta etapa ocorre também a esporulação das bactérias.

Foram detectados alguns genes (sur) que são necessários à sobrevivência das células na fase estacionária. Além destes, existem outros genes (fatores s alternativos da RNA polimerase, proteínas protetoras contra dano oxidativo).

Declínio: A maioria das células está em processo de morte, embora outras ainda estejam se dividindo. A contagem total permanece relativamente constante, enquanto a de viáveis cai lentamente.

Em alguns casos há a lise celular.

Culturas descontínuas tendem a sofrer mutações que podem repercutir na população como um todo. As próprias condições ambientais tendem a promover variações de caráter fenotípico (reversível) nas culturas.

Crescimento em culturas contínuas: técnica muito usada nos processos industriais de obtenção de produtos microbiológicos.Nestes casos, tem-se o interesse em manter as células em fase log ou estacionária.

Utilizam-se fermentadores ou quimiostatos, que permitem um crescimento em equilíbrio dinâmico, havendo assim um controle da densidade populacional e da taxa de crescimento. Estes são respectivamente controlados pela concentração do nutriente limitante (fonte de C ou N) e pela taxa de fluxo (taxa de diluição).

Em baixas concentrações do nutriente limitante, a taxa de crescimento é proporcional à concentração do nutriente (que é virtualmente zero).

Entrada de meio fresco

Regulador de fluxo

Espaço não preenchido

Cuba

Cultura

Saída

Efluente

ESQUEMA DE UMQUIMIOSTATO

Crescimento sincronizado: inicialmente obtido por processos que retardavam a síntese de DNA. Atualmente, utiliza-se métodos de separação mecânica das células menores, recém-divididas.

Pode ser feita pela filtração em vários papéis de filtro, que retém células maiores, em fase de divisão.

MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DO CRESCIMENTO MICROBIANO

CÂMARA DE NEUBAUER

Ao microscópio – aumento de 100X

Ao microscópio – aumento de 400X

CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO

Coloração com azul de metileno para evidenciar células viáveis de leveduras – células azuis estão mortas; células sem coloração são células vivas

CONTAGEM EM PLACAE DILUIÇÕESSERIADAS

POUR-PLATE ESPALHAMENTO EM PLACA

METODOLOGIA UTILIZADA PARA ACONTAGEM DE COLÔNIASEM PLACA

Fonte de luz

Filtro Amostracontendocélulasmicrobianas

Detectorsensívelá luz

Leitura dosresultados em absorbânciaou transmitâncianoespectrofotômetro

DETERMINAÇÃO DE CRESCIMENTO MICROBIANO PORTURBIDIMETRIA

CURVA-PADRÃO PARA O CÁLCULO DE CRESCIMENTO MICROBIANO POR TURBIDIMETRIA

CONTAGEM DE BACTÉRIAS PELO MÉTODO DE FILTRAÇÃO

Células bacterianas na superfície da membrana (poros)

A membrana filtrante foi colocada sobre omeio de cultura e a placa foi incubada.↓

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MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL PARA ESTIMATIVA DE CRESCIMENTO