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Resoluo do Exame Normal de 2011

1 Parte

1. O mtodo de Bradford baseia-se na determinao da concentrao de protenas por

espectrofotometria com medies da absorvncia a 595nm. A colorao deve-se aoproduto formado pela ligao entre a protena e o Coomassie Blue. O Coomassie Blueliga-se s protenas apenas na forma desprotonada, pelo que adquire a cor azul. Assima maior intensidade da colorao azul, traduzida numa maior absorvncia a 595nm,deve-se ao aumento de protenas a que o Coomassie Blue, sendo possvel inferir aconcentrao de protena com base neste cromforo extrnseco. O mtodo dequantificao por absorvnica a 280nm um mtodo que no requer a introduo deum cromforo e portanto no contamina a amostra. Contudo, um mtodo que muito mais susceptvel de induzir a determinao de protena em erro, principalmentese no se conhecer a composio da protena. Isto porque o mtodo baseia-se naabsoro de radiao UV por parte dos anis aromticos das cadeias laterais de alguns

resduos de aminocidos, assim sendo a absorvncia vai depender do nmero deresduos aromticos, dado que a absorvncia ser tanto maior quanto maior for onmero de resduos de aminocido para uma mesma concentrao de protenasdiferentes. O prprio folding da protena condiciona a absorvncia a 280nm, uma vezque a proteco dos aminocidos aromtico confere uma menor absorvncia a 280nm.Os dois mtodos so bastantes rpidos, embora o da determinao a 280nm possasofrer interferncia na presena de solventes com carter aromtico, enquanto que omtodo de Bradford bastante alheio a contaminaes por solventes e tampes, sendoapenas condicionado pela presena de bases muito fortes e/ou detergentes aninicos.

2. Respondida no Exame de 2013

3.a) A tcnica A corresponde a uma electroforese SDS-PAGE em gel de poliacrilamida,

seguida de de transferncia para posterior immunoblotting. A tcnica B corresponde auma electroforese bidimensional seguida de transferncia e posterior immunoblotting.A tcnica B usada fundamentalmente quando temos uma mistura muito complexa deprotenas, onde vrias podem ter o mesmo peso molecular, e ento separam-se asprotenas com base em duas propriedades, o seu ponto isoelctrico e o seu pesomolecular.

b) A protena X, provavelmente multimrica, constituda por pelo menos duas

subunidades diferentes com pesos moleculares diferentes, uma com peso de 50kDa eoutra com cerca de 20kDa. Para alm disso podemos inferir acerca do seu pontoisoelctrico que de aproximadamente 7,3. Commumente conclu-se que a cadadomnio da protena possu uma zona que a torna reconhecvel pelo anticorpoespecfico para a protena X.

c) Primeiro procederia a uma cromatografia de troca inica, com um pH de 7,3 e trocadoaninico, pelo que primeiro sero eludas as protenas com carga positiva porque soreplidas pela coluna, depois a protena X e por fim as protenas carregadasnegativamente. Isto feito por eluio em gradiente de pH. A monitorizao pode serfeita por ensaio da atividade enzimtica de cada uma das fraes. Como forma demelhorar a separao poder-se-ia fazer uma cromatografia de afinidade como o

anticorpo para a protena X na fase estacionria e eluio por gradiente deconcentrao. Mais uma vez, a monitorizao poderia ser feita por ensaio da atividadeenzimtica.

Proposta de Resoluo de Henrique Fernandes

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2 Parte4.a) Respondida no Exame de 2013b) Respondida no Exame de 2013c) Respondida no Exame de 2013

5.a) A separao por centrifugao diferencial baseia-se no princpio de que todas as

partculas de um homogeneizado no migram com a mesma velocidade quandosujeitas aplicao de uma fora, como a fora centrifuga aplicada. Portanto existemvrios fatores que condicionam a migrao das partculas, como o tamanho, dado quequanto maior for a partcula maior a interao com o solvente e mais este ofereceatrito que se ope ao seu movimento. Isto faz com que as partculas de maioresdimenses experimentem uma menor acelerao e portanto atinjam velocidades maisbaixas durante o perodo de centrifugao, o que leva, consequentemente a umamenor migrao. A prpria forma da partcula interfere neste movimento migratrio,dado que partculas mais hidrodinmicas sofrero menos o atrito do solvente e portantomigraro mais de acordo com o mesmo princpio. A massa volmica tambm influnciao movimento das partculas, dado que partculas com maior massa volmica sofrerouma menor acelerao, isto porque F=m.a, assim quanto maior for a massa de umapartcula para o mesmo volume e forma, menor ser a acelerao que estaexperimenta, dado que a fora constante. Assim a velocidade que atingem inferior eportanto migram menos durante o tempo de centrifugao.

b) Respondida no Exame de 2013c) Existem vrias enzimas com localizao especfica na clula, e portanto possvel

avaliar a qualidade da separao por avaliao da atividade enzimtica dessas

mesmas enzimas em cada frao. Por exemplo, se tivermos uma enzima citoslica queapresenta atividade enzimtica na frao nuclear, significa que a separao no foiefetuada com sucesso, dado que apresenta uma enzima da frao citoslica. Amedio da atividade enzimtica d uma ideia da quantidade de enzima presente nafrao analisada. Contudo, essa quantidade relativa e s tem importncia porcomparao com a poro total de protena das amostras, s assim que se podeinferir acerca da melhor ou pior separao dos componentes celulares dohomogeneizado.

Proposta de Resoluo de Henrique Fernandes