Resumos ivssi

De 25 a 27 de maio de 2011 Bento Gonçalves - RS

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RESUMOS APRESENTADOS

IV SIMPÓSIO SUL DE IMUNOLOGIA E XII ENCONTRO GAÚCHO DE

IMUNOLOGIA

DE 25 A 27 DE MAIO DE 2011 BENTO GONÇALVES - RS

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TITULO DO TRABALHO AUTOR PÁG

A HIPER-HOMOCISTEINEMIA CRÔNICA PROVOCA AUMENTO NOS NÍVEIS DE CITOCINAS E PROSTAGLANDINA E2 NO HIPOCAMPO DE RATOS

Aline Andrea da Cunha 4

A INIBIÇÃO DA REJEIÇÃO AGUDA PELA Hsp70 Mycobacterium tuberculosis É DEPENDENTE DA PRESENÇA DE TLR2 NO ENXERTO

Thiago J. Borges 5

AÇÃO DA IL-17 NA VIABILIDADE DE CÉLULAS DE GLIOMA HUMANO E CROSS-TALK COM O RECEPTOR P2X7 AND CROSS-TALK WITH P2X7 RECEPTOR

Marina Petersen Gehring

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ANÁLISE COMPARATIVA DE SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS À APOPTINA ENCONTRADAS NO RECÉM DESCOBERTO GIROVÍRUS AVIÁRIO TIPO 2 (AGV2)

Fernanda Luz de Castro 7

ANÁLISE DOS NÍVEIS PLASMÁTICOS DA PROTEÍNA S100B EM DIFERENTES FASES DO CICLO MENSTRUAL DE PACIENTES COM TRANSTORNO BIPOLAR TIPO I E II, EUTÍMICAS

Lucas Rizzo 8

ANÁLISE DOS PARÂMETROS IMUNOLÓGICOS DE MULHERES COM TRANSTORNO BIPOLAR TIPO I E II EM DIFERENTES FASES DO CICLO MENSTRUAL

Carine Prado 9

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FUNCIONAL DAS CÉLULAS NATURAL KILLER EM PACIENTES COM DOENÇA DO ENXERTO VERSUS HOSPEDEIRO AGUDA RESISTENTE A CORTICOESTERÓIDES PÓS-TRANSPLANTE DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS

Alice Dahmer 10

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE UMA QUIMERA RECOMBINANTE DE LTB E DOMÍNIOS RECEPTORES DAS TOXINAS BOTULÍNICAS C E D NOS MEIOS M9 E LURIA-BERTANI

Gustavo Moreira 11

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL DE SUÍNOS INOCULADOS COM UMA QUIMERA DE ANTÍGENOS DE Mycoplasma hyopnemoniae

Wallace Moraes Pereira 12

AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO DO TIPO-ANSIEDADE E DA ATIVIDADE DA GLUTATIONA-REDUTASE NA PROLE ADULTA DE CAMUNDONGOS NASCIDOS DE FÊMEAS INJETADAS COM LPS.

Lucas Kniess Debarba 13

CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS PARA O TRATAMENTO DA DOENÇA DO ENXERTO CONTRA O HOSPEDEIRO

Vanessa Valim 14

CITOMETRIA DE FLUXO COMO METODOLOGIA ALTERNATIVA PARA A AVALIAÇÃO IN VITRO DE COMPOSTOS COM POTENCIAL ATIVIDADE IMUNOMODULATÓRIA SOBRE LINFÓCITOS B

Douglas Bardini Silveira

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CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UM ANTÍGENO SALIVAR DO CARRAPATO Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Bruna Ferreira Leal 16

CONSTRUÇÃO DE VACINAS DE SUBUNIDADES RECOMBINANTES PARA O CONTROLE DA LINFADENITE CASEOSA

Suelen costa Rodrigues 17

EFEITOS ANTIINFLAMATÓRIOS CUTÂNEOS DO ANTAGONISTA SELETIVO DO RECEPTOR P2X7, A438079 Gabriela Lucas da Silva 18

EFEITOS DO ESTRESSE AGUDO EXPERIMENTAL SOBRE PARÂMETROS IMUNOLÓGICOS E NÍVEIS PLASMÁTICOS DE S100B EM PACIENTES COM TRANSTORNO BIPOLAR TIPO I E II

Andrea Wieck 19

ESTUDO CASO-CONTROLE DOS POLIMORFISMOS 2848G E -1237T DO GENE TLR9 EM PACIENTES COM DOENÇAS INFLAMATORIAS INTESTINAIS DO SUL DO BRASIL

Jaqueline Valverde 20

ESTUDOS PRELIMINARES SOBRE A EXPOSIÇÃO PRÉNATAL DE CAMUNDONGOS AO LPS E SUBSEQUENTE ALTERAÇÕES NO COMPORTAMENTO DO TIPO-ANSIEDADE E ATIVIDADE DA GLUTATIONA-REDUTASE APÓS O DESAFIO COM LPS NA FASE ADULTA.

Lucas Kniess Debarba 21

GRPR: UM NOVO RECEPTOR QUIMIOTÁTICO PARA NEUTRÓFILOS? Rafael Czepielewski 22

PADRONIZAÇÃO DE UM ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA LEPTOSPIROSE SUÍNA

Fernanda Munhoz dos Anjos Leal 23

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS DA PROTEÍNA RECOMBINANTE Ncp43 DE NEOSPORA CANINUM PARA UTILIZAÇÃO EM IMUNODIAGNÓSTICO.

Gizele Lima de Sá 24

SOLUBILIZAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE UMA QUIMERA RECOMBINANTE COMPOSTA PELA LTB E DOMÍNIOS RECEPTORES DAS TOXINAS BOTULÍNICAS C E D

Carlos Eduardo P. cunha

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SOROPREVALÊNCIA DE LEPTOSPIROSE EM CÃES ERRANTES Marina Amaral Xavier 26

UTILIZAÇÃO DA IMUNOSEPARAÇÃO MAGNÉTICA NA DETECÇÃO DE Leptospira sp.

João Paulo Mesquita Luiz 27

UTILIZAÇÃO DO ENSAIO DE POLARIZAÇÃO DA FLUORESCÊNCIA (FPA) PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-Brucella abortus EM SOROS DE CÃES ERRANTES

Thais Collares 28





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A HIPER-HOMOCISTEINEMIA CRÔNICA PROVOCA AUMENTO NOS NÍVEIS DE

CITOCINAS E PROSTAGLANDINA E2 NO HIPOCAMPO DE RATOS

Aline Andrea da Cunha

Aline A. da Cunha1, Andréa G.K. Ferreira1, Maira J. da Cunha1, Felipe Schmitz1, Fernando Spiller2, Fernando de Queiróz Cunha3 e Angela T.S. Wyse1 Laboratório de Doenças Metabólicas e Neuroproteção, Departamento de Bioquímica, UFRGS, Porto Alegre1; Departamento de Farmacologia, Centro de Ciências Biológicas, UFSC, Florianópolis2; Departamento de Farmacologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP, São Paulo3. Introdução: A homocistinúria, um erro inato do metabolismo, é caracterizada bioquimicamente pela deficiência da enzima cistationina β-sintase e pelo acúmulo tecidual de homocisteína. No presente estudo investigamos o efeito da hiper-homocisteinemia crônica sobre os níveis de citocinas (TNF-α, IL-1β e IL-6), quimiocina (MCP-1), nitritos e prostaglandina E2 (PGE2) no hipocampo de ratos. Como recentemente trabalhos demonstram o envolvimento do sistema colinérgico na inflamação, também verificamos o efeito da homocisteína sobre a atividade da acetilcolinesterase. Material e Métodos: Ratos Wistar receberam, duas vezes ao dia, doses crescentes de homocisteína subcutânea do 6º ao 28º dia (0,3–0,6 µmol/g de peso corporal, n=6) e salina (controle, n=6). Os animais foram sacrificados por decapitação 1 ou 12 horas após a última injeção. Os níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6 e MCP-1 foram determinados através de imunoensaio enzimático (ELISA) utilizando kits comerciais da Invitrogen®, os níveis de PGE2 foram determinados por radioimunoensaio, e os níveis de nitritos e a atividade da acetilcolinesterase foram realizados através de ensaio colorimétrico. Resultados: A hiper-homocisteinemia crônica promoveu um aumento estatisticamente significativo nos níveis das citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β, IL-6) e nos níveis da quimiocina (MCP-1). Além disso, verificamos que a administração crônica de homocisteína promoveu um aumento significativo nos níveis de nitritos, PGE2 e na atividade da acetilcolinesterase no hipocampo dos animais sacrificados 1 hora após a última injeção. Nos animais sacrificados 12 horas após a última administração de homocisteína, verificamos um aumento estatisticamente significativo somente nos níveis de IL-1β, IL-6, nitritos e PGE2 no hipocampo dos ratos. Conclusão: De acordo com nossos resultados, a administração crônica de homocisteína promoveu um aumento em diferentes parâmetros inflamatórios, sugerindo que a inflamação pode estar associada, pelo menos em parte, com as disfunções cerebrovasculares, que estão presentes em alguns pacientes homocistinúricos. Apoio Financeiro: CNPq, FAPERGS.





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A INIBIÇÃO DA REJEIÇÃO AGUDA PELA Hsp70 Mycobacterium tuberculosis É DEPENDENTE DA PRESENÇA DE TLR2 NO ENXERTO

Thiago Borges Thiago J. Borges¹, Rachel Gaudenzi¹, Felipe D. Machado1, e Cristina Bonorino¹ ¹Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, Instituto de Pesquisas Biomédicas, PUCRS, Porto Alegre; Introdução: As proteínas de choque de calor (HSPs) são um grupo de proteínas induzidas por estresses celulares e possuem propriedades imuno-moduladoras. Recentemente, demonstramos que a Hsp70 de Mycobacterium tuberculosis (TBHsp70) pode atuar como imunossupressora, prolongando a aceitação do enxerto em dois modelos de aloenxerto murino e que esse efeito é mediado pela produção de IL-10 e pela indução de células T reguladoras (Tregs). Com esses achados, verificamos se a inibição da rejeição é dependente da presença de TLR2 tanto no enxerto quanto no recipiente. Também investigamos a hipótese da TBHsp70 estar atuando modulando uma APC e tornando o microambiente propício para o surgimento de Tregs e se esse efeito também é dependente de TLR2. Material e métodos: Realizamos um modelo de aloenxerto cutâneo, no qual os enxertos (provenientes de camundongos C57Bl/6 WT ou TLR 2 KO) foram tratados com 30 μg OVA ou TBHsp70 e posteriormente foram transplantados em recipientes BALB/c. Também tratamos enxertos provenientes de camundongos BALB/c WT com 30 μg OVA ou TBHsp70 e posteriormente os transplantamos em recipientes C57Bl/6 WT ou TLR 2 KO. Todos os enxertos foram acompanhados e fotografados diariamente. Foram feitas culturas de BMDCs WT e TLR2 KO as quais foram estimuladas por 48h com OVA, TBHsp70, DEXA ou PGN. Todos os sobrenadantes das culturas foram analisados para a produção de IL-10, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-4, IL-17A com o kit CBA Mouse Th1/Th2/Th17 da BD. Resultados: O tratamento com a TBHsp70 inibiu a rejeição dos enxertos C57Bl/6 WT quando comparados com os enxertos C57Bl/6 TLR2 KO (p=0,0067) que sofreram o mesmo tratamento e com os WT (p=0,01) e TLR2 KO (p=0,04) tratados com OVA. Quanto à presença do TLR2 nos recipientes, não houve diferença na inibição da rejeição entre os animais WT e TLR2 KO que receberam enxertos tratados com TBHsp70. As BMDCs WT tratadas com TBHsp70 tiveram uma maior produção de IL-10 quando comparadas com as TLR2 KO e quando comparadas com as tratadas com OVA. Conclusão: Em nosso modelo a TBHsp70 possui propriedades imunossupressoras que são dependentes da presença de TLR2 no enxerto e não no recipiente. Com isso, formulamos a hipótese de que a TBHsp70 está modulando uma APC, provavelmente DCs, e essas células estão tornando o microambiente, através da produção de IL-10, propício para o aumento da população de Tregs. Apoio: FINEP e CNPq.





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AÇÃO DA IL-17 NA VIABILIDADE DE CÉLULAS DE GLIOMA HUMANO E CROSS-TALK COM O RECEPTOR P2X7

Marina Petersen Gehring

1Marina Petersen Gehring, 2Ana Maria Oliveira Battastini, 3Maria Martha Campos, 4Fernanda Bueno Morrone. 1Laboratório de Farmacologia Aplicado a Cultura de Células, PUCRS; 2Bioquímica, UFRGS; 3Instituto de Toxicologia e Faculdade de Odontologia, PUCRS; 4Faculdade de Farmácia, PUCRS.

Introdução: Os gliomas estão entre os tumores mais letais. A interleucina-17 é caracterizada como uma citocina que promove resposta inflamatória e evidências recentes sugerem que as células T efetoras, Th17, estão envolvidas na imunologia do tumor e podem ser um alvo para a terapia do câncer. No sistema nervoso central, a sinalização purinérgica exerce uma papel único nas interações neurônio-glia e a expressão do receptor purinérgico P2X7 está aumentada em condições patológicas, incluindo o câncer. Objetivo: Avaliar a ação da IL-17 na viabilidade de células de glioma humano (U138-MG) e um possível cross-talk entre a IL-17 e o receptor P2X7 nesta linhagem tumoral. Metodologia: As células de glioma foram obtidas da ATCC (Rockville, Maryland, USA). As células foram cultivadas em DMEM/15% SFB, sob condições ideais de cultivo. As células foram semeadas em placas de 96 poços, em densidade de 5 x 103 células/poço. Após atingirem semi-confluência as células foram tratadas com IL-17 (5, 10 e 20 ng/ml) e com o antagonista seletivo do receptor P2X7 A740003 (10 μM). A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT, após 24 h de tratamento. Os experimentos foram realizados três vezes em triplicata. Os dados foram analisados por meio da análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey-Kramer. Resultados: A viabilidade da linhagem celular de glioma humano U138-MG foi significativamente reduzida (53.7%, 66.3% e 55.5%), quando tratada com a IL-17, na concentração de 5, 10 e 20 ng/ml, respectivamente. Quando as células foram tratadas com o antagonista do receptor P2X7 A740003, em combinação com a IL-17 (10 ng/ml), o antagonista do receptor P2X7 reverteu parcialmente a morte causada pela IL-17 em 45.8% (de 66.3% para 30.4%). Conclusões: Nossos resultados mostraram, pela primeira vez, que o tratamento com a IL-17 induz a citotoxicidade da linhagem celular de glioma humano U138-MG e que o antagonista seletivo do receptor P2X7 A740003 diminuiu a citotoxicidade causada pela IL-17, sugerindo um possível cross-talk entre a IL-17 e este receptor purinérgico. Nossos dados indicam a possível participação da IL-17 e do receptor P2X7 na regulação das células de glioma. Suporte Financeiro: CAPES e PUCRS.





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ANÁLISE COMPARATIVA DE SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS À APOPTINA ENCONTRADAS NO RECÉM DESCOBERTO GIROVÍRUS AVIÁRIO TIPO 2 (AGV2)

Fernanda luz de castro

Fernanda Luz de Castro1; Marcus Braga Knak1; Josiane Slongo1; Helton Fernandes dos Santos1; Camila Mengue Scheffer1; Paulo Michel Roehe1,2; Thais FumacoTeixeira2; Ana Cláudia Franco1

¹. Laboratório de Virologia, DM-ICBS / Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS, Brasil; ². FEPAGRO Saúde Animal - Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor, Eldorado do Sul, RS, Brasil

Introdução: Um novo vírus da família Circoviridae, denominado de Girovírus Aviário tipo 2 (AGV2), foi recentemente descoberto em galinhas e descrito por nosso grupo. Através da análise da sequência de nucleotídeos do AGV2 foram identificadas três fases abertas de leitura que codificam homólogos das proteínas VP1, VP2 e VP3 de um vírus relacionado, o vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). A proteína VP3 codificada pelo vírus CAV possui capacidade de induzir apoptose em células do timo de galinhas infectadas. A atividade de apoptose foi constatada in vitro em diversas linhagens celulares tumorais humanas, como linhagens derivadas de linfoma mielóide agudo e linfoma B imunoblástico. No entanto, não foi constatada a indução de apoptose em células não transformadas. A VP3 codificada pelo AGV2 possui 32,2% de identidade com a VP3 do CAV e apresenta domínios que parecem ter um papel na sua atividade apoptótica. Objetivo: Analisar sequências da VP3 de amostras de AGV2 e, dessa forma, verificar se há conservação dos diferentes domínios entre elas e entre os domínios encontrados na VP3 do CAV. Material e Métodos: Amostras de DNA de galinhas provenientes da região sul do Brasil e da Holanda foram extraídas e submetidas à PCR, amplificando produtos correspondentes à seqüência parcial da VP3. Os produtos de PCR foram sequenciados, traduzidos na fase de leitura referente à VP3 e, em seguida, alinhados e analisados. Foi feita também a comparação dessas com a sequência da VP3 do CAV e com duas sequências completas da proteína do AGV2, previamente determinadas. Resultados: O domínio rico em leucina (LRS), bem como uma sequência de localização nuclear (NLS) bipartida, presentes na VP3 do CAV foram identificados na VP3 codificada pelo AGV2. Variações foram observadas nos domínios NLS de algumas sequências, mas apenas em uma, aparentemente, houve a perda do domínio. Por outro lado, o sinal de exportação nuclear encontrado na VP3 do CAV não foi identificado, dentro da sequência analisada, em nenhuma das amostras estudadas. Conclusão: As diferenças nas sequências analisadas sugerem que a VP3 do AGV2 pode apresentar diferente atividade de apoptose em comparação com a VP3 do CAV. Além disso, principalmente devido à inexistência do NES, a seletividade de ação em células humanas tumorais pode ser alterada. Mais estudos são necessários para elucidar a atividade da VP3 do AGV2, possibilitando uma melhor compreensão de sua habilidade apoptótica. Apoio financeiro: CNPq/FAPERGS





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ANÁLISE DOS NÍVEIS PLASMÁTICOS DA PROTEÍNA S100B EM DIFERENTES FASES DO CICLO MENSTRUAL DE PACIENTES COM TRANSTORNO BIPOLAR TIPO I E II,

EUTÍMICAS Lucas Rizzo

Lucas Rizzo1, Lucas Tortorelli3, Carine Prado1, Andréa wieck1, Ledo Daruy Filho2, Rodrigo Grassi-Oliveira2, Carlos Alberto Gonçalves3 e Moisés E. Bauer1

1Laboratório de Imunologia do Envelhecimento, Instituto de Pesquisas Biomédicas (IPB), Hospital São Lucas, PUCRS; 2Programa de Pós-Graduação em Psicologia, PUCRS, Porto Alegre; 3Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, UFRGS, Porto Alegre. Introdução: Transtorno bipolar (TB) é uma doença crônica, severa e altamente incapacitante. Faltam biomarcadores adequados que auxiliem no diagnóstico desta doença. A proteína S100B é uma proteína ligante de cálcio produzida e secretada por células da glia, notadamente astrócitos. Atua em vários processos celulares, como metabolismo energético, contração, comunicação, sinalização e crescimento celular, sendo seus efeitos dependentes de sua concentração extracelulares. Em concentrações nanomolares ela pode atuar como fator de crescimento e diferenciação para neurônios e astrócitos, e em concentrações micromolares, pode induzir apoptose. Há fortes indícios de que S100B possua papel importante na patogênese de transtornos do humor como a depressão, esquizofrenia e TB tipo I e II. Sabe-se, também, que as alterações hormonais que ocorrem nas diferentes fases do ciclo menstrual podem levar a diversas alterações tanto em parâmetros imunológicos como neurológicos (peptídeos neurais). Objetivo: Analisar as variações plasmáticas da proteína S100B em pacientes com TB do tipo I e tipo II, em diferentes fases do ciclo menstrual. Material e Métodos: foram recrutadas 16 Mulheres que apresentavam diagnóstico de TB do tipo I ou II (SCID-I), eutímicas, no Ambulatório de Psiquiatria do Hospital Presidente Vargas, Porto Alegre. As pacientes foram divididas em dois grupos, de acordo com a fase do ciclo menstrual em que se encontravam: menopausa (n=8; idades: 48 a 64 anos) e folicular (n=8; idade: 23 a 51 anos). Foram coletadas 5ml de sangue periférico. O plasma foi separado por centrifugação e congelado para posterior análise. A determinação da concentração plasmática de S100B foi realizada por meio da técnica de ELISA sanduíche. A análise estatística foi realizada com o auxílio do programa SPSS 17.0, utilizando teste não-paramétrico de Mann-Whitney com um p<0,05. Resultados: Não foram verificadas diferenças significativas nas concentrações plasmáticas de S100B entre os grupos (p=0,23). Conclusão: Estes resultados preliminares sugerem que a proteína S100B não esteja associada diretamente com o ciclo menstrual. Pretendemos recrutar indivíduos saudáveis e avaliar os níveis de S100B com uma população maior de pacientes com TB. Apoio: CNPq,CAPES.





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ANÁLISE DOS PARÂMETROS IMUNOLÓGICOS DE MULHERES COM TRANSTORNO BIPOLAR TIPO I E II EM DIFERENTES FASES DO CICLO MENSTRUAL

Carine Prado

Carine Hartmann do Prado1, Andréa Wieck1, Lucas Rizzo1, Ledo Daruy Filho2, Rodrigo Grassi-Oliveira2 e Moisés Evandro Bauer1. 1Laboratório de Imunologia do Envelhecimento, Instituto de Pesquisas Biomédicas, PUCRS, Porto Alegre; 2 Programa de Pós-Graduação em Psicologia, PUCRS, Porto Alegre Introdução: O transtorno bipolar (TB) é caracterizado por recorrentes episódios maníacos e depressivos. Possui etiologia multifatorial, na qual fatores biológicos e psicossociais interagem em diversos níveis. É acompanhado de múltiplos sinais de ativação e alterações do sistema imune sugerindo que o mesmo, em interação direta com o sistema nervoso central, possua papel importante na patofisiologia do transtorno. Sabe-se que as alterações hormonais observadas nas diferentes fases do ciclo menstrual também podem levar a alterações em parâmetros imunológicos, como a freqüência de subtipos linfocitários circulantes. Objetivo: De forma a isolar o componente hormonal nas variações em parâmetros imunológicos decidiu-se avaliar as frequências de subtipos linfocitários em mulheres com TB, em diferentes fases do ciclo menstrual. Materiais e métodos: Foram recrutadas 16 pacientes com TB tipo I e II, eutímicas, do ambulatório psiquiátrico do Hospital Presidente Vargas,Porto Alegre. As pacientes foram divididas em dois grupos, de acordo com a fase do ciclo menstrual em que se encontravam: menopausa (n=8; idades: 48-64 anos) e folicular (n=8; idade: 23-51 anos). O diagnóstico de TB foi confirmado pelo SCID-I. Sangue foi coletado e células mononucleares periféricas por gradiente de densidade. Os seguintes subtipos linfocitários foram analisados por citometria de fluxo (FACS Calibur,BD): CD3+CD4+ (Th), CD4+CD45RA+ (naive), CD8+CD45RA+ (naive), CD4+CD45RO+ (memória), CD8+CD45RO+ (memória), CD3+CD8+ (Tc), CD3-CD19+ (B), CD3-CD16+CD56+ (NK), CD3+CD4+CD25+, CD3+CD4+CD69+, CD8+CD28- e CD4+CD25+FoxP3+. As diferenças entre as variáveis foram testadas pelo teste de Mann-Whitney (p<0,05). Resultados e conclusão: De um modo geral, as freqüências dos diferentes subtipos linfocitários não diferem de forma significativa entre os grupos. Entretanto, a porcentagem das populações de células B e de células T CD4+ virgens diferiu de forma significativa entre os grupos (p<0,05 e p=0,01 respectivamente). O grupo em menopausa apresentou uma porcentagem maior de células B e menor de células T virgens (0,11 e 0,15) do que o grupo folicular (0,06 e 0,28). Estes resultados preliminares apontam algumas diferenças linfocitárias associadas com o ciclo menstrual. Estudos posteriores com um tamanho amostral maior deverão ser realizados. Apoio: CNPq,CAPES.





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Avaliação da Atividade Funcional das Células Natural Killer em Pacientes com Doença do Enxerto versus Hospedeiro Aguda Resistente a Corticoesteróides Pós-Transplante de

Células Tronco Mesenquimais

Alice Dahmer

Autores: Alice Dahmer1; Fernanda S. de Oliveira1; Maria Aparecida Silva1; Vanessa Valim1; Lauro Moraes Jr1; Annelise Pezzi1; Regina Carvalho1; Natália E. Lemos1; Letícia Baggio1; Nathália Kersting1; Lucia Silla1

1Centro de Tecnologia Celular – Laboratório de Cultura e Análise Molecular de Células Humanas Introdução: A terapia com Células Tronco Mesenquimais (CTM) cultivadas tem sido mais sistematicamente utilizada no tratamento da Doença do Enxerto versus Hospedeiro aguda (DECHa) resistente a corticoesteróides, pós-Transplante de Células Tronco Hematopoéticas (TCTH) alogênico. Dados pré-clínicos, em modelo animal de DECHa, mostraram que a atividade terapêutica destas células se deve a uma acentuada imunossupressão medida dias ou semanas apos a infusão. Embora benéfica para o tratamento da DECH esta imunossupressão poderia ser um fator de risco para a recidiva da doença maligna de base. Dados sobre a recuperação imune pós-infusão de CTM em pacientes são escassos na literatura e, de uma maneira geral medidos tardiamente. Pacientes e métodos: Pacientes submetidos ao TCTH alogênico com DECHa resistente a corticoesteróides do setor de Transplante de Medula Óssea do HCPA que receberam Células Tronco Mesenquimais (CTM) cultivadas. A atividade das células NK foi avaliada imediatamente antes e 14 horas após a infusão das CTM. Sangue total foi coletado e a através do gradiente de Ficoll as células mononucleares foram separadas e realizado o ensaio de citotoxicidade (ensaio NK) com 51Cr. Resultados: Até o momento 4 pacientes foram avaliados, dos quais 3 apresentaram atividade NK significativamente aumentada 14h pós-infusão. Conclusão: Embora com um número ainda reduzido de pacientes, a observação de uma atividade NK aumentada 14h apos a infusão de CTM cultivadas, não foi ainda descrita na literatura e pode explicar o efeito protetor contra a recidiva da doença maligna de base, observado em todos os ensaios clínicos publicados até hoje sobre a utilização de CTM para o tratamento da DECHa. Apoio: FIPE/HCPA, CAPES, CNPq, FAPERGS, FINEP, Hemoamigos





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AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE UMA QUIMERA RECOMBINANTE DE LTB E DOMÍNIOS RECEPTORES DAS TOXINAS BOTULÍNICAS C E D NOS MEIOS M9 E LURIA-BERTANI

Gustavo Moreira Gustavo Marçal Schmidt Garcia Moreira¹, Carlos Eduardo Pouey da Cunha¹, Luciana Aquini Fernandes Gil¹² e Fabricio Rochedo Conceição¹ ¹Laboratório de Imunologia Aplicada, Centro de Desenvolvimento Tecnológico - Biotecnologia, UFPel;²Programa de Pós-Graduação em Veterinária, Faculdade de Veterinária, UFPel, Pelotas. Introdução: O botulismo é uma doença causada por neurotoxinas (BoNTs) produzidas pela bactéria Clostridium botulinum. A produção de toxóides a partir das BoNTS é fastidiosa, imprevisível e perigosa. Por isso, busca-se uma alternativa mais eficiente e segura para produção de vacinas. Este trabalho visa à obtenção de uma quimera composta pela subunidade B de enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB), um potente adjuvante de imunidade humoral, fusionada aos domínios receptores das BoNTs C e D na forma solúvel. Material e métodos: A quimera, previamente caracterizada, foi expressa por E. coli BL21 (DE3) Star. A cepa transformada foi cultivada em 20 mL de pré-inóculo por 16h a 37°C e, em seguida, transferida para 200mL dos meios Luria-Bertani (LB) e M9. O cultivo foi mantido a 37°C até DO600=0,6-0,8. Em seguida, foram induzidos com IPTG 0,5mM e 0,7mM, respectivamente, e incubados sob agitação a 28°C por 16h. Ambos foram centrifugados, ressuspendidos em 25mL de PBS, tratados com lisozima (3µg/mL), sonicados (5x30s; 60Hz) e centrifugados. Amostras do pellet e do sobrenadante foram analisadas por SDS-PAGE e por Western Blot com anticorpo anti-toxina colérica (Sigma-Aldrich). Na transferência, também foram utilizados os controles positivo (quimera purificada) e negativo (extrato, sobrenadante e pellet de E. coli BL21 (DE3) Star). Resultados: O SDS-PAGE mostrou que, em meio LB, a proteína foi produzida em grande quantidade, porém na forma insolúvel (corpos de inclusão). Já no meio M9 não houve expressão significante. O Western Blot apresentou reação tanto no pellet da expressão em LB quanto em M9, confirmando a presença da proteína na forma insolúvel. Conclusão: O meio LB é mais comum para a expressão de proteínas heterólogas, mas nem sempre ele apresenta resultados satisfatórios. No processo de desenvolvimento de vacinas recombinantes, buscam-se, preferencialmente, antígenos expressos na forma solúvel. A quimera em questão se mostrou altamente expressa em LB, porém na forma insolúvel. A alternativa de usar o meio de cultivo M9 não foi eficiente, uma vez que a proteína continuou insolúvel e em menor quantidade. Contudo, deve-se, ainda, avaliar in vivo o potencial protetor de ambas as quimeras. Apoio: CNPq, CAPES e FAPERGS.





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AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL DE SUÍNOS INOCULADOS COM UMA

QUIMERA DE ANTÍGENOS DE Mycoplasma hyopnemoniae Wallace Moraes Pereira

Wallace Moraes Pereira1, Sérgio Jorge1, Charles Klazer Gomes¹, Silvana Beutinger Marchioro1, Cledir Stark1, Andressa Fisch1, Odir Antonio Dellagostin1, Fabricio Rochedo Conceição2

1Laboratório de Biologia Molecular, 2Laboratório de Imunologia Aplicada, Centro de Desenvolvimento Tecnológico/Biotecnologia, UFPel, Pelotas, RS, Brasil.

Introdução: Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da Pneumonia Enzoótica Suína (PES). A patogenia da doença está associada à adesão da bactéria ao epitélio mucociliar do trato respiratório, causando paralisia e pré-dispondo o desenvolvimento de infecções secundárias. O controle estratégico da PES é realizado através de bacterinas, que apresentam elevado custo e conferem apenas proteção parcial. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resposta imune humoral de suínos inoculados com uma quimera recombinantes de três antígenos de M. hyopneumoniae (R1, P42 e NrdF) com a subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB). Material e Métodos: A quimera LTB-R1-P42-NrdF foi expressa em E. coli BL21(DE3), purificada por cromatografia de afinidade e caracterizada por SDS-PAGE e Western Blot. Cada proteína componente da quimera também foi produzida individualmente para a avaliação da resposta imune humoral mediante ELISA indireto. Foram utilizados oito leitões de uma granja que possui histórico positivo para PES, onde quatro foram inoculados com duas doses de 200 µg da quimera recombinante, via intramuscular, administradas aos 60 dias de vida e outra 21 dias após, sendo os animais restantes utilizados como controle (não inoculados). As coletas de sangue foram realizadas no dia 0, 21 e 42 a partir da primeira inoculação. O ELISA indireto procedeu com soros 1:50, sensibilização das placas com 200 ng/poço de proteína, conjugado anti-IgG de suíno e OPD como substrato, sendo a absorbância aferida em DO492. Resultados: A média de absorbância dos animais imunizados com a vacina recombinante foi maior que a média do grupo controle. No dia 42, a proteína R1 apresentou absorbância de 0,82 nos inoculados e 0,8 no grupo controle. A Nrdf apresentou absorbância de 1,5 e o grupo controle 1,2. A P42 atingiu uma absorbância de 3,0 nos inoculados e 0,8 no grupo controle. A rLTB apresentou absorbância de 1,85, enquanto o grupo controle obteve 1,4. Conclusões: A quimera LTB-R1-P42-NrdF foi imunogênica para suínos, fazendo dela uma potencial vacina recombinante. Estudos posteriores com um maior número de animais em condições experimentais devem ser realizados a fim de avaliá-la como um método mais efetivo de controle da PES. Apoio: MAPA, CNPq, CAPES e FAPERGS.





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AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO DO TIPO-ANSIEDADE E DA ATIVIDADE DA GLUTATIONA-REDUTASE NA PROLE ADULTA DE CAMUNDONGOS NASCIDOS DE

FÊMEAS INJETADAS COM LPS. Lucas Kniess Debarba Lucas Kniess Debarba¹, Sonia Gonçalves Carobrez², Péricles Arruda Mitozo¹ Renata Pinheiro Gonzales¹, Camila Konell¹, Paula Barcellos¹, Alcir Luiz Dafré³, Odival Cezar Gasparotto¹. ¹Departamento de Ciências Fisiológicas, ²Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, ³Departamento de Bioquímica, CCB, UFSC. Introdução: A administração de Lipolissacarídeo (LPS) em roedores no período gestacional pode induzir retardo no crescimento intra-uterino, parto prematuro, distúrbios neurológicos e morte fetal intra-uterina. Xu et al., 2006ª apontam o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) como o principal mediador desses efeitos deletérios. Dados obtidos por Xiang-Yun Li et al., 2008 indicam que há um envolvimento das espécies reativas de oxigênio, cujas mães onde se observa uma regulação positiva da enzima heme-oxigenase-1 no fígado fetal de animais, cujas mães foram expostas ao LPS. Objetivo: Avaliar o comportamento do tipo-ansiedade e a atividade da glutationa redutase (GR) no parênquima cerebral de camundongos suíços adultos, nascidos de fêmeas prenhas injetadas com LPS. Métodos e Resultados: Os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de ética para uso de animais da UFSC (Processo Nº 23080.029998/2009-23). Camundongos foram mantidos em ambientes climatizados, com iluminação artificial, ciclo claro/escuro de 12:12 horas, ração e água ad libitum. Fêmeas, no 8º dia de gestação, receberam uma única dose de LPS (10 mg/kg/ip). Como controle foram utilizadas fêmeas gestantes não injetadas com LPS. No 45º dia de vida, os animais foram testados no Labirinto em Cruz Elevado (LCE). Finalizados os testes comportamentais, os animais foram sacrificados para coleta do córtex e do hipocampo para análise da atividade da glutationa redutase (GR). A exposição ao LPS na vida intra-uterina foi capaz de provocar uma redução significativa (p < 0,001) na porcentagem de permanência de tempo no braço aberto (%TBA) na prole, tanto de machos como fêmeas, quando comparada a proles do grupo controle. A avaliação da porcentagem de exibição de acesso de risco (%AR) apresentou uma redução significativa (p < 0,001) nas proles provindas de fêmeas injetadas com LPS, quando comparadas ao grupo controle. Esse efeito sugere que o LPS exerce efeitos distintos nas diferentes formas de expressão da ansiedade. Estas formas de expressar a ansiedade possuem efeitos adaptativos diferentes e são construídas pelo processamento em vias neurais distintas que precisam ser melhor avaliadas. Não foi observado prejuízo na atividade da GR, tanto no hipocampo, quanto no córtex de ambos os gêneros. Conclusões: A administração de LPS (10 mg/kg/ip) no na fase intermediária do período gestacional foi capaz de modular o comportamento tipo-ansiedade na prole adulta de ambos os gêneros. Apoio: CAPES/PGN, CCB/UFSC.





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CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS PARA O TRATAMENTO DA DOENÇA DO ENXERTO

CONTRA O HOSPEDEIRO

Vanessa de Souza Valim Vanessa Valim1, Fernanda S. de Oliveira1, Maria Aparecida Lima da Silva1, Lauro Moraes Júnior1, Bruna Amorin1, Annelise Pezzi1, Alice Dahmer1, Regina Carvalho1, Letícia Baggio1, Nathalia Kersting1, Natália E. Lemos1, Lúcia Silla1

1Centro de Tecnologia Celular – Laboratório de Cultura e Análise Molecular de Células Humanas Introdução. A Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro aguda (DECHa) é uma uma complicação comum do transplante de medula óssea alogênico, no qual células imunes funcionais da medula óssea transplantada atacam células e tecidos do organismo receptor.Estudos demonstrando as propriedades imunorregulatórias das células tronco mesenquimais (CTM) têm permitido o seu uso em diversas patologias, fazendo uso de um mecanismo parácrino, que estas possuem, inibindo efetores imunes, quando este está ativado de forma descontrolada. Estudos clínicos têm demonstrado a eficiência imunorreguladora do uso destas células na DECH aguda. Material e Métodos: Células Tronco Mesenquimais foram expandidas em laboratório em ambiente GMP like (GooD Manufactories Practicies) e rastreadas por um complexo controle de qualidade, que incluiu testes para endotoxinas e micoplasmas. Até o momento 4 pacientes com DECHa resistente a corticosteróides foram infundidos, dentre os quais dois receberam 2 infusões, um paciente recebeu uma infusão e outro recebeu 5 infusões. A média e a mediana de células infundidas em cada infusão foi de 1,47 X 106 e 1,88 células/kg. Em todos os pacientes foi observada redução do grau da DECH, contudo um paciente veio a óbito devido ao prévio comprometimento sistêmico. Nenhum efeito colateral foi detectado durante ou após a infusão das CTM. Conclusão: A infusão de células tronco mesenquimais pode ser uma alternativa de tratamento positivo para pacientes com DECHa resistente a costicosteróides. Este estudo visa, além de avaliar o efeito terapêutico das CTM, observar a segurança e exeqüibilidade do todo (expansão e infusão das células), e até o momento, nossos resultados são satisfatórios. Um número maior de pacientes está sendo incluído neste estudo. Apoio: CNPq, FINEP, CAPES, FIPE/HCPA, FAPERGS e HEMOAMIGOS





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CITOMETRIA DE FLUXO COMO METODOLOGIA ALTERNATIVA PARA A AVALIAÇÃO IN VITRO DE COMPOSTOS COM POTENCIAL ATIVIDADE IMUNOMODULATÓRIA SOBRE

LINFÓCITOS B

Douglas Bardini Silveira

Douglas Bardini Silveira¹, Aguinaldo Roberto Pinto¹, Carlos Roberto Zanetti¹ ¹Laboratório de Imunologia Aplicada, Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, UFSC, Florianópolis.

Introdução. A citometria de fluxo (CF) destaca-se como um importante instrumento no estudo de eventos celulares envolvidos na resposta imune, possibilitando, dentre outras aplicações, investigações detalhadas do comportamento metabólico e funcional de subpopulações linfocitárias em diferentes estados de imunocompetência. No presente trabalho, a CF foi empregada para a análise de possíveis variações na expressão fenotípica de uma linhagem linfoblastóide B frente a estímulos de imunomodulação, objetivando estabelecer parâmetros experimentais para a avaliação e triagem in vitro de compostos com potencial atividade imunomodulatória sobre linfócitos B. Materiais e Métodos. Células da linhagem linfoblastóide B humana SKW 6.4 foram cultivadas em placas de 96 micropoços na presença de 100ng·mL-1 de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) ou 10ng·mL-1 de rapamicina (RAPA) – moduladores clássicos da resposta imune de linfócitos B in vitro – durante 48h à 37°C e 5% de CO2. Após incubação, células SKW 6.4 foram avaliadas por CF quanto à incidência de antígenos de superfície relacionados à ativação e/ou supressão da atividade imune basal de linfócitos B (CD19, CD23, CD40, CD54, CD69, CD80 e CD86). A estratégia de gates de quadrante foi utilizada para a determinação das porcentagens de eventos positivos, duplo-positivos e negativos em relação aos marcadores imunofenotípicos analisados. Os níveis de expressão de cada antígeno de superfície foram observados através de histogramas de intensidade de fluorescência registrada. Resultados. A porcentagem de células SKW 6.4 positivas para o marcador CD69 foi notadamente maior em condições referenciais de imunoestimulação por PMA (82%) comparado ao controle celular não tratado (28%); a atividade imunoestimulatória mediada por PMA pôde ainda ser evidenciada pelo aumento da expressão celular de CD69 e CD54, em acordo com dados relatados na literatura. Não foram constatadas mudanças significativas no perfil imunofenotípico de grupos celulares após imunossupressão com RAPA. Conclusões. Os resultados obtidos sugerem a utilização dos antígenos de superfície CD54 e CD69 como marcadores de imunoestimulação no modelo in vitro empregado, viabilizando sua análise por CF como alternativa metodológica para a avaliação e triagem de compostos com potencial ação imunoestimulatória sobre linfócitos B. Experimentos complementares para a identificação de possíveis marcadores antigênicos de imunossupressão encontram-se em andamento. Apoio: CNPq.





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CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UM ANTÍGENO SALIVAR DO CARRAPATO Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Bruna Ferreira Leal

Bruna Ferreira Leal¹, Adriana Seixas2 Itabajara da Silva Vaz Junior2, Carlos Alexandre Sanchez Ferreira¹ ¹Laboratório de Imunologia e Microbiologia– PUCRS; 2Laboratório de Imunologia Aplicada a Sanidade Animal – UFRGS. Introdução: O Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) é um ectoparasito importante na criação de gado. O controle é baseado no uso de acaricidas, os quais apresentam alto custo e causam sérios impactos no meio ambiente e contaminação no leite e carne, o que indica a necessidade de novos métodos de controle, como o desenvolvimento de vacinas. A paramiosina (PRM) é uma proteína com funções relacionadas à evasão do sistema imune de hospedeiros, especialmente devido à ligação às imunoglobulinas e inibição do sistema complemento, configurando-se em candidato para compor uma vacina. Objetivo: Detectar o mRNA referente ao gene da PRM, além de clonar e expressar a sequência de DNA codificante em vetor procarioto. Materiais e métodos: Primers foram utilizados para a amplificação do DNA codificante para a PRM completa adicionada de seis resíduos de histidina em sua porção C-terminal. A clonagem foi realizada utilizando o Champion Pet Directional Topo Expression Kit (Invitrogen), e a expressão foi feita em Escherichia coli. O RT-PCR foi realizado utilizando RNAs obtidos de intestino, ovário, glândula salivar, corpo gorduroso de fêmeas adultas e de ovos de R. microplus Resultados: Após expressão e purificação parcial, obteve-se proteína com uma massa molecular equivalente a esperada para a paramiosina, confirmando-se por western-blot a sua identidade utilizando-se soro anti-paramiosina. A análise por RT-PCR mostrou que o gene codificante para PRM está ativo em todos os tecidos testados. Conclusões e perspectivas: A síntese de PRM em vários tecidos adultos corrobora a possibilidade de atuar como imunomoduladora no hospedeiro. A proteína recombinante purificada possibilitará analisar o seu reconhecimento por soros de bovinos infestados, além de poder ser administrada em bovinos para avaliar reações de hipersensibilidade. Além disso, será realizado o PCR em tempo real (qRT-PCR) a fim de quantificar os níveis de expressão do gene nos diversos órgãos e tecidos. Resultados preliminares do qRT-PCR indicam a síntese do mRNA da PRM também no ovo de 1º dia e ovário e glândula salivar de adultos. Apoio: CNPq, INCT-Entomologia Molecular.





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CONSTRUÇÃO DE VACINAS DE SUBUNIDADES RECOMBINANTES PARA O CONTROLE DA LINFADENITE CASEOSA

Suelen Costa Rodrigues Suelen Costa Rodrigues1, Drielly Cristina Braite1, Gabriela Cristina de Paula1, Filipe Santos Pereira Dutra1, Vasco Azevedo2, Odir Dellagostin1 Simone Smionatto3 e Sibele Borsuk1

1 Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Biotecnologia, UFPel, 2 Departamento de Biologia Geral, UFMG, 3 Faculdade de Ciências Biológicas e Ambientais, UFGD.

Introdução: A Linfadenite Caseosa (LC) causada por Corynebacterium pseudotuberculosis, é uma doença infecto-contagiosa que acomete caprinos e ovinos, ocasionado grandes perdas econômicas devido à sua alta incidência, especialmente em regiões tropicais e subtropicais. As vacinas inativadas não apresentam resultados satisfatórios no controle para esta doença. As vacinas recombinantes são uma alternativa para uma imunoproteção mais eficaz, de baixo custo de produção, sem oferecer riscos e podendo ser produzidas em maior escala. Os genes Cp1002_1802, Cp1002_0369 e Cp1002_1957, que codificam para uma provável proteína secretada (CP1002_1802), provável lipase (CP1002_0369) e provável fosfatase (Cp1002_1957), potencialmente antigênicas, as quais podem vir a ser utilizadas no desenvolvimento de vacinas recombinantes. O objetivo deste trabalho foi à construção de vacinas de subunidade recombinantes para o controle da LC. Materiais e Métodos: Os genes 0369, 1802 e 1957 de C. pseudotuberculosis foram amplificados por PCR e em seguida digeridos com as enzimas Bam HI e Hind III (1802 e 1957) e com BamHI e Eco RI (0369) e ligados ao vetor pAE digerido com as mesmas enzimas.O produto da ligação foi transformado em células de E. coli Top10. Resultados: Os clones recombinantes foram caracterizados enzimaticamente e por seqüenciamento de DNA. Conclusão: Obtivemos os plasmideos recombinantes pAE/0369, pAE/1802 e pAE/1957 que serão transformados em cepas de expressão de E. coli e as proteínas recombinantes utilizadas para a imunização de camundongos a fim de avaliar o potencial imunogênico das mesmas. Apoio: BNB.





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EFEITOS ANTIINFLAMATÓRIOS CUTÂNEOS DO ANTAGONISTA SELETIVO DO RECEPTOR P2X7, A438079

Gabriela Lucas da Silva

Gabriela Lucas da Silva1,2, Nathália Denise de Moura Sperotto2,3, Ana Maria de Oliveira Batastini4, Maria Martha Campos5, Rafael Fernandes Zanin1,2, Fernanda Bueno Morrone2,3. 1Programa de pós-graduação em Biologia celular e Molecular PUCRS, Porto Alegre, RS. 2Laboratório de Farmacologia Aplicada PUCRS, Porto Alegre, RS. 3Faculdade de Farmácia, Porto Alegre, RS. 4ICBS, Departamento de Bioquímica, UFRGS, Porto Alegre, RS. 5Faculdade de Odontologia/Instituto de Toxicologia PUCRS, Porto Alegre, RS. Introdução: A maioria das doenças que acometem a pele possuem em sua etiologia componentes inflamatórios e/ou imunológicos. Embora haja uma sucessão previsível dos fenômenos envolvidos na resposta inflamatória cutânea, os mecanismos envolvidos na patogênese destas doenças são poucos conhecidos. Várias são as vias e cascatas envolvidas; assim, existe uma variedade de alvos que, quando antagonizados ou neutralizados, conduzem a um efeito anti-inflamatório e/ou imunossupressor. O óleo de cróton é um agente irritante muito utilizado em modelos experimentais de dermatite de contato. Estudos utilizando estes modelos demonstram que a dermatite de contato possui um mecanismo patogênico mediado por nucleotídeos. Objetivo: investigar o envolvimento do receptor purinérgico P2X7 na resposta inflamatória induzida pelo óleo de cróton. Materiais e métodos: Camundongos swiss (n=5) receberam aplicação tópica de óleo de cróton 1% na face interna da orelha direita. Os animais foram tratados com o antagonista do receptor P2X7, A438079 i.p.(80 μmol/kg) ou com a ectonucleotidade, Apirase s.c. (0,2 U/ear), 30 minutos antes e 3 horas depois da aplicação do irritante. Dexametasona (0,5 mg/kg) foi usada como controle positivo. Seis horas após a indução do edema, foram coletadas amostras de sangue e um plug de 6 mm de tecido foi removido de ambas as orelhas. O edema foi medido através da diferença de peso entre as orelhas. O acúmulo de neutrófilos no tecido foi quantificado através da medida da atividade da mieloperoxidase (MPO). As amostras de sangue coletadas foram utilizadas para dosagem de IL1β, através de kits ELISA. Resultados: Os tratamentos inibiram significativamente o edema de orelha e os níveis séricos de IL1β. Apirase provocou uma inibição do edema de 17.6% ± 4.5, enquanto o antagonista A438079 reduziu o edema em 41,7% ± 5.3. O tratamento com A438079 reduziu significativamente os níveis de MPO a valores comparáveis aos obtidos com o tratamento com a droga controle positivo, dexametasona. Conclusões: Muitos estudos tem demonstrado que o ATP atua como um importante mediador das respostas inflamatórias da pele. O ATP, quando presente em altas concentrações no espaço extracelular, ativa receptores P2X7 e as evidências indicando o papel patofisiológico destes receptores vêm aumentando. Nossos resultados demonstram a atividade antiinflamatória do antagonista seletivo do receptor P2X7, A438079, e sugerem o envolvimento do mesmo na patogênese da dermatite de contato.





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EFEITOS DO ESTRESSE AGUDO EXPERIMENTAL SOBRE PARÂMETROS IMUNOLÓGICOS E NÍVEIS PLASMÁTICOS DE S100B EM PACIENTES COM

TRANSTORNO BIPOLAR TIPO I E II Andréa Wieck Andréa Wieck1, Carine Prado1, Lucas Rizzo1, Lucas Tortorelli3, Ledo Daruy Filho2, Rodrigo Grassi-Oliveira2, Carlos Alberto Gonçalves3,e Moisés E. Bauer1

1 Laboratório de Imunologia do Envelhecimento, Instituto de Pesquisas Biomédicas, Hospital São Lucas, PUCRS, Porto Alegre; 2Faculdade de Psicologia, Programa de Pós-graduação em Psicologia, PUCRS,Porto Alegre; 3Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, UFRGS, Porto Alegre. Introdução: O estresse é uma ameaça à homeostase do organismo, resultando em uma cascata de processos biológicos adaptativos que visam retornar a homeostase. Evidências sugerem uma associação entre alterações nos mecanismos de resposta ao estresse e o desenvolvimento de transtornos de humor, assim como uma ligação entre o estresse crônico e a diminuição global da resposta imune celular. O Transtorno Bipolar (TB) é caracterizado pela variação do humor entre fases maníacas e depressivas. O conhecimento sobre as alterações imunológicas no TB é limitado devido às alterações imunes diferenciais ao longo dos ciclos de mania e depressão e à falta de biomarcadores que auxiliem no diagnóstico. A proteína S100B é uma proteína ligante de cálcio produzida e secretada por células da glia. Atua em vários processos celulares, sendo seus efeitos dependentes de sua concentração extracelular. Há indícios de que S100B possua papel importante na patogênese de transtornos do humor. Objetivos: Analisar populações linfocitárias e concentrações plasmáticas da proteína S100B em mulheres com TB antes e após uma intervenção de estresse agudo (TSST). Metodologia: Foram recrutadas 4 pacientes TB do tipo I e II, eutímicas, da Clínica São José,Porto Alegre. As células mononucleares periféricas foram isoladas por gradiente de densidade. Todos os dados foram aferidos nos momentos pré-TSST e pós-TSST. Os seguintes subtipos linfocitários foram analisados por citometria de fluxo (FACS Calibur,BD): CD3+CD4+ (Th), CD4+CD45RA+ (naive), CD8+CD45RA+ (naive), CD4+CD45RO+ (memória), CD8+CD45RO+ (memória), CD3+CD8+ (Tc), CD3-CD19+ (B), CD3-CD16+CD56+ (NK), CD3+CD4+CD25+, CD3+CD4+CD69+, CD8+CD28- e CD4+CD25+FoxP3+. A determinação da concentração plasmática de S100B foi realizada através da técnica de ELISA. As diferenças entre as variáveis foram testadas pelo teste de Mann-Whitney (p<0,05). Resultados e conclusão: De um modo geral, as freqüências dos diferentes subtipos linfocitários não diferem de forma significativa pré e pós-TSST. Porém, observamos a redução significativa (P<0,05) na porcentagem de células B pós-TSST (pré:0,11 e pós:0,048). Estes resultados preliminares sugerem que o estresse pode estar relacionado a alterações linfocitárias. Quanto às concentrações plasmáticas de S100B nos dois momentos, não observamos diferenças significativas (p>0,05), indicando que o estresse não afeta diretamente as concentrações desta proteína. Estudos posteriores com um tamanho amostral maior deverão ser realizados. Apoio: CNPq,CAPES.





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ESTUDO CASO-CONTROLE DOS POLIMORFISMOS 2848G E -1237T DO GENE TLR9 EM PACIENTES COM DOENÇAS INFLAMATORIAS INTESTINAIS DO SUL DO BRASIL

Jacqueline María Valverde Villegas Jacqueline M. Valverde Villegas1, Bruno Paiva dos Santos1, Machado, MB 2, José A. Bogo Chies1

1Laboratório de Imunogenética, UFRGS, Departamento de Genética, Instituto de Biociências 2Hospital São Lucas, PUCRS. Introdução: A Doença Inflamatória Intestinal (IBD) é classificada em Colitis Ulcerativa (CU) e em Doença de Crohn (DC) dependendo da área mais afetada no intestino, mas ambas apresentam uma série de sintomas de origem inflamatória e de etiologia multifatorial que acometem principalmente o trato intestinal. Os Receptores Toll-like (TLRs) têm um papel importante na regulação intestinal, principalmente na sinalização pró-inflamatória em resposta a distintos ligantes de microrganismos e na estimulação de respostas inflamatórias agudas e/ou crônicas. Alguns desses antígenos podem ser reconhecidos por TLRs e, mais precisamente, o DNA pelo TLR9. Como no Brasil não se tem estudos a respeito de TLR9 e IBD, o objetivo do nosso estudo é analisar a freqüência dos polimorfismos G2848A (rs352140) e T-1237C (rs5743836), no gene TLR9, em pacientes eurodescendentes com IBD provenientes de dois centros de saúde do Sul do Brasil e comparar com indivíduos eurodescendentes saudáveis, doadores de sangue, representando o grupo controle.

Materiais e métodos: Foram analisados 250 indivíduos controles e 253 pacientes, dos quais 105 provenientes do Hospital São Lucas da Pontificia Universidade Católica de Rio Grande do Sul (PUCRS) e 148 provenientes do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). As genotipagens foram feitas por RFLP-PCR para o G2848A e BIPASA para o T-1237C.

Resultados: Para a análise das freqüências alélicas e genotípicas, se dividiu as populações em 3 grupos: grupo 1, pacientes provenientes da PUCRS; grupo 2, pacientes provenientes do HCPA; e o grupo 3, pacientes provenientes de ambos centros de saúde. Para o G2848A, o nosso estudo encontrou associação do genótipo heterozigoto quando comparamos o grupo 1 e o grupo 3 aos controles (P = 0,000002 e P = 0,0013 respectivamente). Também, encontraram-se as mesmas associações quando se subdividiu os pacientes em DC e CU no grupo 1 (P=0,0002 e P=0,0013, respectivamente), embora no grupo 3 só encontrou-se associação entre pacientes DC (P=0,00057). Por outro lado, o polimorfismo T-1237C não apresentou qualquer associação nos grupos analisados. Também não houve associação quando comparamos haplótipos e a sintomatologia clínica dos pacientes.

Conclusão: Os resultados obtidos sugerem que o genótipo heterozigoto G/A do polimorfismo G2848A é um fator de susceptibilidade na doença inflamatória intestinal na população brasileira estudada.

Apoio financeiro: CNPq e FAPERGS.





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ESTUDOS PRELIMINARES SOBRE A EXPOSIÇÃO PRÉNATAL DE CAMUNDONGOS AO LPS E SUBSEQUENTE ALTERAÇÕES NO COMPORTAMENTO DO TIPO-ANSIEDADE E

ATIVIDADE DA GLUTATIONA-REDUTASE APÓS O DESAFIO COM LPS NA FASE ADULTA.

Lucas Kniess Debarba Lucas Kniess Debarba¹, Sonia Gonçalves Carobrez², Péricles Arruda Mitozo¹ Renata Pinheiro Gonzales¹, Camila Konell¹, Paula Barcellos¹, Alcir Luiz Dafré³, Odival Cezar Gasparotto¹. ¹Departamento de Ciências Fisiológicas, ²Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, ³Departamento de Bioquímica, CCB, UFSC. Introdução: A infecção com LPS no período gestacional em roedores induz a liberação de citocinas, sendo as citocinas TNF-α e IL-10 liberadas no encéfalo do feto exposto ao LPS intra-uterino (Xu et al., 2007). Godbout et al. 2004 demonstraram um aumento do estresse oxidativo encefálico do feto exposto ao LPS na vida intra-uterina. Objetivo: Avaliar o comportamento do tipo-ansiedade e a atividade da glutationa redutase (GR) no parênquima cerebral de camundongos suíços adultos, nascidos de fêmeas prenhas injetadas com LPS e re-expostos ao LPS na vida adulta. Métodos e Resultados: Os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de ética para uso de animais da UFSC (Processo Nº 23080.029998/2009-23). Os animais foram mantidos em ambientes climatizados, com iluminação artificial, ciclo claro/escuro de 12:12 horas, ração e água ad libitum. No 8º dia de gestação, as fêmeas gestantes foram divididas em dois grupos: (Grupo LPS) - receberam uma única dose de LPS (10 mg/kg/ip); (Grupo controle) - não injetadas com LPS. No 45º dia, as proles foram subdivididas em quatro subgrupos: I- prole do grupo LPS, injetada com LPS (5 mg / kg ip), II - prole do grupo LPS, injetada com PBS (solução salina tamponada com fosfatos, pH=7,2), III - prole do grupo controle, injetada com LPS (5 mg / kg ip) e IV - prole do grupo controle, injetada com PBS. Transcorrido quatro horas da injeção, os animais foram testados no Labirinto em Cruz Elevado (LCE). Finalizados os testes comportamentais, os animais foram sacrificados para coleta do córtex e do hipocampo para avaliação da atividade GR. Observou-se uma redução significativa (p < 0,001) da porcentagem de tempo no braço aberto (%TBA) tanto em machos quanto em fêmeas (♂, ♀) do subgrupo I quando comparados com o subgrupo III (♂, ♀). O mesmo índice de significância foi observado na %TBA quando se comparou proles do subgrupo II (♂, ♀) com o subgrupo IV (♂, ♀). A atividade da GR no hipocampo foi significativamente menor (p < 0,001), em machos do subgrupo I quando comparados com os do subgrupo III. Tal efeito não foi verificado nas fêmeas. Conclusões: O modelo de re-exposição ao LPS provoca um aumento na expressão da ansiedade, também observado em outros modelos de estresse. O prejuízo da atividade antioxidante no hipocampo de machos re-expostos ao LPS pode ser explicado por uma redução dos níveis da testosterona. Este hormônio possui um efeito neuroprotetor e sofre redução nas situações de estresse. Apoio: CAPES/PGN, CCB/UFSC.





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GRPR: UM NOVO RECEPTOR QUIMIOTÁTICO PARA NEUTRÓFILOS? Rafael Czepielewski

Rafael S. Czepielewski1, Bárbara N. Porto1, Rafael Roesler2, Cristina Bonorino1 ¹Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, Instituto de Pesquisas Biomédicas, PUCRS, Porto Alegre, 2Laboratório de Pesquisas em Câncer, Centro de Pesquisa HCPA, UFRGS, Porto Alegre Introdução: O peptídeo liberador de gastrina (GRP) é um neuropeptídeo que atua através de seu receptor preferencial GRPR, promovendo proliferação e diferenciação celular, assim como outras funções sistêmicas. O GRP e seu receptor são expressos em diversas células e de forma aberrante em células tumorais, atuando como um fator de crescimento tumoral. O GRPR foi testado como possível alvo terapêutico específico para tumores e antagonistas seletivos do GRPR, como o RC-3095, têm sido desenvolvidos como potenciais agentes antitumorais. RC-3095 tem demonstrado promissores resultados em testes in intro, in vivo e clínicos de fase I na redução de tumores. O GRP mostrou-se também envolvido em inflamações, onde foi identificado sendo produzido por macrófagos ativados e o tratamento com RC-3095 em um modelo murino de sepse apresentou diminuição na liberação de citocinas pró-inflamatórias, elevando a sobrevida do animais. Como o principal componente da resposta inflamatória são os neutrófilos – células que migraram em direção ao foco inflamatório em função de gradientes de citocinas pró-inflamatórias e também estimuladas por alguns neuropeptídeos, como a substância P – avaliamos o papel do GRP na indução de quimiotaxia de neutrófilos in vitro e in vivo. Materiais métodos: Camundongos C57/Bl6 receberam injeções intraperitoneias de GRP ou GRP+RC-3095, e após 4 horas o lavado peritoneal foi realizado, assim como contagem diferencial do número de neutrófilos. Utilizamos a injeção de lipossomos clodronato para depletar os macrófagos peritoneias dos C57/Bl6. E neutrófilos isolados de sangue de voluntários saudáveis foram colocados para migrar num sistema Transwell em concentrações seriadas de GRP, seu antagonista (RC-3095) e inibidores de vias de sinalização. Resultados: O GRP induziu recrutamento de neutrófilos in vivo 4 horas após sua adminstração numa concentração de 0,6 µg por cavidade (p<0,001), e esse fenômeno antagonizado pelo RC-3095 (p<0,001). A depleção de macrófagos também reduziu o influxo de neutrófilos recrutados por GRP, assim como o anti-corpo monoclonal anti-TNF-α, Infliximab. In vitro observamos uma indução direta na migração de neutrófilos pelo GRP, antagonistazada pelo RC-3095 e sendo dependente das vias de sinalização PI3K e MAPKs (p38 e ERK). Conclusão: O GRP foi observado como novo quimioatrator de neutrófilos in vitro e in vivo, promovendo migração por via direta e indireta, dependente de macrófagos, e das vias das PI3K e MAPK. Apoio: CNPq





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PADRONIZAÇÃO DE UM ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO PARA LEPTOSPIROSE SUÍNA

Fernanda Munhoz dos Anjos Leal LEAL, Fernanda Munhoz dos Anjos1; MONTE, Leonardo Garcia1; JORGE, Sérgio2; HARTWIG, Daiane2; VASCONCELLOS, Silvio Arruda3; DELLAGOSTIN, Odir2; HARTLEBEN, Cláudia Pinho1

1 Laboratório de Imunodiagnóstico, 2 Laboratório de Biologia Molecular – Centro de Desenvolvimento Tecnológico – Universidade Federal de Pelotas; 3 Universidade de São Paulo

Introdução: No Brasil, a leptospirose em suínos tem sido uma das principais causas de falhas reprodutivas em vários estados, principalmente nas regiões sul e sudeste do país. A técnica padrão para o diagnóstico de leptospirose, a soroaglutinação microscopia (MAT), possui baixa sensibilidade, além de ser uma técnica laboriosa e dispendiosa. Devido aos problemas enfrentados no diagnóstico laboratorial dessa doença, há um intenso esforço de pesquisa no sentido de utilizar proteínas recombinantes para desenvolver testes mais sensíveis. Dessa forma, as proteínas do grupo Lig têm sido identificadas como alvos potenciais para uso em testes de diagnóstico e vacinas contra leptospirose. As proteínas LigA e LigB, que localizam-se na membrana externa das leptospiras, pertencem à superfamília das imunoglobulinas e estão presentes apenas nas espécies patogênicas e virulentas. Além disso, são fortemente reconhecidas pelo soro de animais diagnosticados com a doença. Objetivo: O objetivo desse trabalho foi padronizar um Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) utilizando a proteína recombinante rLigAni para o diagnóstico de leptospirose suína. Materiais e métodos: Uma microplaca de 96 cavidades (Polysorp, Nunc) foi sensibilizada com diferentes concentrações de rLigAni em tampão carbonato-bicarbonato 0,05M pH 9,8 por 16h a 4° e bloqueada com PBS contendo 10% de leite em pó. Um pool de soros negativos no MAT foi adicionado e incubado por 1h a 37°C. Após foi adicionado o conjugado anti-Ig suíno e peroxidase (Sigma) e também incubado a 37°C por 1h. Após a lavagem, foi adicionada solução substrato/cromógena contendo ortophenylendiamine (Sigma-Aldrich, USA) e peróxido de hidrogênio (0,1%) em 0,2 M tampão citrato-fosfato pH 4,0 por 15 min. a temperatura ambiente. A leitura foi realizada a 450 nm (VICTOR™ X5 Multilabel Plate Reader, PerkinElmer, USA). Para determinar a sensibilidade e especificidade do teste 103 soros suínos já caracterizados foram utilizados num título de 100. Resultado e discussão: A concentração de proteína rLigAni foi determinada em 100 ng por cavidade. O ELISA/rLigAni apresentou 82% de sensibilidade e 55,5% de especificidade em comparação ao teste padrão, o MAT. Conclusão: O ELISA/rLigAni pode ser uma alternativa como teste de triagem para o diagnóstico de leptospirose suína. Porém, mais soros devem ser testados para melhorar a sensibilidade e especificidade do teste. Apoio Financeiro: CNPq e FAPERGS





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Produção de anticorpos policlonais da proteína recombinante Ncp43 de Neospora caninum para utilização em imunodiagnóstico.

Gizele Lima de Sá Sá, Gizele Lima de1; Leal, Fernanda Munhoz dos Anjos1; Rizzi, Caroline2; Collares, Thaís Farias1; Borsuk, Sibele2; Berne, Maria Elisabeth Aires3; Hartleben, Cláudia Pinho1

1Laboratório de Imunodiagnóstico – Centro de Desenvolvimento Tecnológico – UFPel – Pelotas 2Laboratório de Biologia Molecular – Centro de Desenvolvimento Tecnológico – UFPel - Pelotas Introdução: O protozoário Neospora caninum é um dos principais parasitos de bovinos e cães, sendo uma das causas significativas de abortos na bovinocultura mundial. Anticorpos anti-neospora produzidos no soro de animais podem ser utilizados como ferramentas em ensaios imunológicos em pesquisa científica com finalidades diagnósticas. No entanto, testes de diagnóstico para detecção de anticorpos específicos de N. caninum é dificultado pela reação cruzada com outros coccídeos, já que se baseiam na detecção de antígenos de taquizoítos intactos. Logo o uso de um único antígeno poderia melhorar a especificidade de métodos de diagnóstico indireto. A proteína Ncp43 é um antígeno de superfície expresso tanto em taquizoítos quanto em bradizoítos e que é reconhecida por anticorpos séricos de animais infectados por N. caninum. Desta maneira, o objetivo do presente trabalho foi produzir anticorpos policlonais contra a proteína rNc-p43 e avaliar sua reatividade com a proteína na sua forma nativa e recombinante. Material e Métodos: O gene codificante da Nc-p43 foi clonado no vetor pAE, expressa em Escherichia coli (BL21 Star) e purificada até a homogeneidade. Posteriormente camundongos BALB/c foram imunizados com rNc-p43. O soro obtido destes animais foi testado para presença dos anticorpos policlonais em ensaios imunoenzimáticos (ELISA e Dot-blotting) empregando a proteína recombinante. Resultados: Os anticorpos produzidos contra a proteína recombinante Nc-p43 apresentaram reação quando esta proteína foi utilizada para sensibilizar placas de poliestireno e membranas de nitrocelulose. Conclusão: Os anticorpos obtidos contra rNc-p43 foram capazes de reconhecer a proteína em ensaios ELISA e Dot-blotting, podendo ser utilizados como ferramenta para detecção deste antígeno em ensaios imunoenzimáticos. Apoio: Capes





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SOLUBILIZAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE UMA QUIMERA RECOMBINANTE COMPOSTA PELA LTB E DOMÍNIOS RECEPTORES DAS TOXINAS BOTULÍNICAS C E D

Carlos Eduardo P. Cunha Carlos Eduardo Pouey da Cunha¹, Gustavo Marçal Schmidt Garcia Moreira¹, Luciana Aquini Fernandes Gil¹² e Fabricio Rochedo Conceição¹ ¹Laboratório de Imunologia Aplicada, Centro de Desenvolvimento Tecnológico - Biotecnologia, UFPel; ²Programa de Pós-Graduação em Veterinária, Faculdade de Veterinária, UFPel,Pelotas. Introdução: O botulismo bovino é uma doença causada pelas neurotoxinas (BoNTs) C e D produzidas pela bactéria Clostridium botulinum, caracterizada por paralisia e morte, ocasionado significativo prejuízo à bovinocultura. A produção de toxóides a partir das BoNTS é fastidiosa, imprevisível e perigosa. Por isso, uma estratégia mais eficiente e segura para obtenção de insumos biológicos para produção de vacinas é desejável. Este trabalho tem por objetivo a produção, solubilização e purificação de uma quimera composta pela LTB, um potente adjuvante da imunidade humoral, fusionada aos domínios receptores das BoNTs C e D. Material e métodos: A quimera foi expressa por Escherichia coli BL21 (DE3) Star em caldo Luria-Bertani, sendo confirmada por Western Blot. As células foram centrifugadas, ressuspendidas em 30 mL de PBS, tratadas com lisozima (3 µg/mL), sonicadas (5 ciclos de 30s; 60 Hz) e centrifugadas. O pellet foi ressuspendido em PBS com N-Lauroylsarcosine (NLS) 0,4% (w/v) sob agitação durante 48h a 4°C, sendo centrifugado logo em seguida. Após a confirmação da presença da proteína no sobrenadante, por SDS-PAGE 10%, procedeu-se o refolding através de diálise em 1L de PBS com NLS 0,2% (24h) seguida de adição gradual de 3L de PBS (48h). Western Blot com anticorpo anti-toxina colérica (anti-CT, Sigma-Aldrich) foi realizado para análise do sobrenadante e do pellet, utilizando LTB recombinante (rLTB) e extrato de E. coli BL21 (DE3) como controles. Resultados: O Western Blot indicou que a expressão e os processos de purificação e solubilização da quimera foram satisfatórios, permitindo observar que o anticorpo comercial anti-CT reagiu com a quimera recombinante, tanto na porção solúvel, quanto no pellet (insolúvel). No entanto, foi notada perda da proteína após o refolding, sugerida pela menor intensidade de banda no SDS-PAGE. Conclusão: Os resultados obtidos demonstram que a quimera apresenta parcial solubilidade em PBS com NLS 0,4% e possui, mesmo que desnaturada, alguns epítopos que permitem o reconhecimento pelo soro anti-CT. O pellet remanescente foi tratado com 8M de uréia sob agitação durante 48h,porém, tal tratamento não solubilizou os corpos de inclusão. Outras estratégias de solubilização e refolding estão sendo avaliadas. Futuros experimentos serão realizados para avaliar o potencial protetor dessa quimera in vivo. Apoio Financeiro: CNPq, CAPES e FAPERGS.





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SOROPREVALÊNCIA DE LEPTOSPIROSE EM CÃES ERRANTES Marina Amaral Xavier

Marina Amaral Xavier1, Fernanda dos Anjos Munhoz Leal1, João Paulo Mesquita Luiz1, Wallace Moraes Pereira1, Sérgio Jorge1, Leonardo Garcia Monte1, Claudiomar Brod2, Cecília Nunes Moreira3, Cláudia Pinho Hartleben1

1Laboratório de Imunodiagnóstico – Centro de Desenvolvimento Tecnológico/Biotecnologia – UFPel; 2Centro de Controle de Zoonoses – Faculdades de Veterinária – UFPel; 3Faculdade de Veterinária - UFG - Campus Jataí - Unidade Jatobá Introdução: A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. Na espécie canina, a infecção pela variante sorológica (sorovar) Canicola é um dos mais freqüentes nesta espécie, sendo o próprio cão considerado o reservatório deste sorovar. Contudo, a infecção em cães pode ocorrer por diferentes sorovares, dependendo do ambiente no qual é mantido, podendo estes animais inclusive ser indicadores da contaminação ambiental por leptospiras. Um exemplo seria a detecção de anticorpos anti sorovar icterohaemorrhagiae em soros de cães, que tem como principal reservatório os ratos. Animais domésticos, assim como a maioria das espécies silvestres, podem tornar-se portadores e contribuírem para a disseminação do microrganismo na natureza. A eliminação da Leptospira pela urina dos portadores pode variar de poucas semanas a vários meses, entre os animais domésticos, e por toda vida no caso dos roedores. A doença nos cães pode ocorrer na forma subclínica ou clínica, com evolução aguda ou crônica. A leptospirose canina é um sério problema sanitário devido ao potencial de contágio, pela proximidade estabelecida entre os seres humanos e os cães. Por este motivo o objetivo deste trabalho foi de detectar anticorpos anti-Leptospira em soros de cães errantes do município de Jataí, Goiás, para monitorar a contaminação ambiental por este patógeno. Material e métodos: foi utilizado o teste de aglutinação microscópica (MAT) segundo Faine et al., (1999), com título de triagem de 100, 21 cepas de Leptospira, 20 patogênicas e 1 saprófita. Os soros reagentes na triagem de 100 foram titulados, considerando-se como título final aquele com presença de 50% de aglutinação do antígeno. Nos casos de coaglutinação, o sorovar que apresentou maior título foi considerado como o prevalente. Resultados: A soroprevalência foi de 42,72% (47/110). Dentre os soros reagentes, independente de coaglutinações, as reações mais freqüentes foram contra os sorovares Canicola (38,3%), Bratislava (38,3%), Copenhageni (36,2%) e Icteroaemorragiae (31,9%). Estes resultados concordam com o status de reservatório desta espécie para o sorovar Canicola e sugere que estes animais foram expostos a infecção por leptospiras eliminadas de roedores sinantrópicos. Conclusão: a soroprevalência de leptospirose na espécie canina deve ser identificada para implantação de medidas de controle direcionadas ao ambiente e aos hospedeiros.





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UTILIZAÇÃO DA IMUNOSEPARAÇÃO MAGNÉTICA NA DETECÇÃO DE Leptospira sp.

João Paulo Mesquita Luiz João Paulo Mesquita Luiz, Leonardo Garcia Monte, Francine Alves Sinnott, Fabiana Seixas, Odir Dellagostin, Fabricio Rochedo Conceição, Cláudia Pinho Hartleben Laboratório de Imunodiagnóstico, UFPel, Pelotas, Centro de Desenvolvimento Tecnológico Introdução: A leptospirose é uma doença zoonótica grave, cosmopolita, causada pela infecção por bactérias patogênicas do genero Leptospira. A infecção de animais e humanos por leptospiras apresenta variedade na apresentação clínica, ocorrendo de forma aguda ou crônica, com quadro leve ou grave, podendo resultar na falência de múltiplos órgãos. O diagnóstico precoce é importante para a instituição do tratamento adequado, sendo preferível a identificação do agente a anticorpos contra ele gerados, os quais podem ser detectáveis somente 10 dias após início dos sintomas. O sistema de separação imunomagnética (IMS) tem sido freqüentemente utilizado no isolamento e na detecção de patógenos, sendo possível eliminar contaminantes e inibidores, os quais interferem no cultivo e nas técnicas de identificação moleculares. Por estes motivos, o objetivo deste trabalho foi utilizar um anticorpo monoclonal (mab) específico contra leptospiras patogênicas na metodologia de IMS, com intuito de capturar leptospiras em suspensão. Materiais e métodos: Foram utilizadas partículas magnéticas (Bangs) cobertas com mab, preparadas segundo protocolo estabelecido. Amostras de Leptospira patogênica L. interrogans cepa L1 130 e Leptospira saprófita L. biflexa cepa patoc 1 foram diluídas da concentração 108/mL a 100/mL. Para a IMS, partículas/Mab foram adicionadas as diferentes diluições, incubadas por 15 min a 30ºC, em agitação suave, lavadas 2 vezes utilizando solução tampão estéril, e suspendidas em 20µL de solução de extração de DNA. Para o procedimento de lavagem e separação foi utilizado o separador magnético para microtubos (Invitrogen). Para a detecção do microorganismo capturado foi utilizada reação de PCR, com par de primers que amplificam uma região de 264 pb do gene codificador da proteína LipL32. A amplificação foi avaliada através de eletroforese em gel de agarose. Resultados: A sensibilização das partículas foi eficiente utilizando a concentração de 1,2 mg de LipL32Mab, estimada através da medida de anticorpo não ligado às partículas, após cada lavagem. Todas as diluições de amostra contendo leptospiras patogênicas foram amplificadas através da PCR e não houve amplificação de amostras contendo Leptospiras saprófitas. Conclusão: A associação das técnicas de IMS e PCR foi eficiente para detectar leptospiras de amostras artificialmente contaminadas até a diluição contendo 100 bactérias/mL. Apoio: CNPq Fapergs





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UTILIZAÇÃO DO ENSAIO DE POLARIZAÇÃO DA FLUORESCÊNCIA (FPA) PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-Brucella abortus EM SOROS DE CÃES ERRANTES

Thaís Collares

Thaís Farias Collares1; Fernanda Munhoz dos Anjos Leal1; Francine Alves Sinnott1; Gizele Lima de Sá1; Claudiomar Brod2; Luis Samartino3; Cecília Nunes Moreira4; Cláudia Pinho Hartleben1

1Laboratório de Imunodiagnóstico - Centro de Desenvolvimento Tecnológico - UFPel - Pelotas 2Centro de Controle de Zoonozes - Faculdade de Veterinária - UFPel - Pelotas 3Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuária - INTA - Buenos Aires - Argentina

4Faculdade de Veterinária - UFG - Campus Jataí - Unidade Jatobá

Introdução: A brucelose é uma doença infecto-contagiosa de evolução crônica causada por bactérias do gênero Brucella, tendo como vias de penetração as mucosas do trato digestivo, genital ou nasal, conjuntiva ocular ou por soluções de continuidade da pele. Dentre as bactérias do gênero Brucella, a espécie B. abortus pode acometer diferentes espécies, inclusive o homem. Canídeos domésticos e silvestres infectam-se pela ingestão de restos placentários ou fetos abortados de rebanhos bovinos infectados ou por contato indireto com águas e outros alimentos contaminados. Portanto, a infecção de canídeos domésticos deve ser monitorada dada a importância desta enfermidade em saúde pública. O diagnóstico de brucelose baseia-se na detecção de anticorpos no soro dos hospedeiros suscetíveis sendo os testes do antígeno acidificado tamponado (AAT), 2-Mercaptoetanol (2-ME) e fixação do complemento, os utilizados para o diagnóstico indireto no soro. Porém, o AAT devido a baixa especificidade, deve ser confirmado por 2-ME, o qual utiliza substâncias tóxicas em sua formulação e resultado de leitura de 48hs. O teste da polarização da fluorescência (FPA) para diagnóstico de brucelose apresenta-se como uma alternativa, em substituição aos testes citados, pois possui elevada sensibilidade e especificidade. Logo, o objetivo deste trabalho foi comparar os testes ATT e 2-ME com o Brucelose FPA(Bru/FPA) em soros caninos. Material e métodos: Os soros (110) são provenientes da Universidade Federal de Goiás, coletados de cães errantes. Como triagem realizou-se o ATT e, para confirmação dos soros suspeitos, o 2-ME e Bru/FPA, utilizando antígeno gentilmente cedido pelo Dr.Klaus Nielsen, Canadá. As leituras do teste Bru/FPA foram realizadas no leitor Sentry® 100 - Diachemix, e os resultados expressos em unidades de milipolarização (mP). Resultados: Das 65 amostras de soro testadas, 9 apresentaram aglutinação no AAT e quando submetidas a confirmação por 2-ME 1 amostra apresentou título de 50. Das amostras testadas na metodologia de FPA, 1 apresentou leitura de 115,4mP (título de 50 no 2-ME) e as 8 demais apresentaram leituras de mP entre 42,3 e 81,6 caracterizando-as como não reagentes. Conclusão: O teste de Brucella FPA pode ser utilizado isoladamente para identificação de anticorpos anti Brucella abortus em soros de cães. O FPA é uma metodologia de rápida execução e possui especificidade para substituir o 2-ME, podendo ser utilizado no monitoramento da infecção de cães por B.abortus.




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