revista brasileira de.A.

BIOCIENCIASvolume 8 I espedal I janeiro/dezembro 2003

~ Efeilo de alguns reguladores de, 2003 SP-PP-01450

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ISSN0080-2228

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revista brasileira de BIO(I~N(IASPublicação do Centro de Ciências Biológicas - CCBUniversidade Federal de Pernambuco - UFPE50679-420 Recife - Pernambuco - Brasilbiociencias@ufpe.br

UFPEreitorAmaro Linsvice-reitorGilson Edmar

CCB

diretora Ana Maria Santos Cabralvice-diretora Leonor Costa Maia

editoresRalf SchwambornJosé Roberto Botelho de Souza

Bureau de Design - PROEXT - UFPEprojeto gráfico Moacyr Campêlocoordenação Paula Valadares

EDITORIAL

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Após ;llgllns anos de interrupção, cst.unos corn estevolume iniciando urna nova etapa dos esforços editoriaisda UFPE no âmbito das Ciências Biológicas. Com oobjetivo de oferecer aos pesquisadores atuantes em todoeste amplo leque das biociências um novo veículo paraseus trabalhos, a nossa meta principal é a agilidade equalidade na publicação dos manuscritos, após a revisãopelos especialistas nas respectivas áreas. Dandocontinuidade à tradição de algumas décadas depublicações em Ciências Biológicas sob o nome deRevista do Instituto de Antibióticos, e posteriormentecomo Biologice Bresitice, com este volume apresentamosa REVISTA BRA-S,i-iIRÂ DE BIOC/ÊNC/AS - BRAZILlAN

jOURNAL OF BIOSC/ENCES.

Neste primeiro volume sob o nome de REVISTA

BRASILEIRA DE 810C/ÊNC/AS - BRAZILlAN jOURNAL

OF BIOSC/ENCES, com novo conceito editorial IvideInstruções para os autores) e layout, contamos comcontribuições da várias áreas. Apresentamos aqui artigosrelacionados à oceanografia biológica, agronomia,fisiologia animal, bioquímica, ecologia vegetal, limnologiae fisiologia vegetal, mostrando assim um pouco daenorme variedade que atualmente existe no campo dasBiociências no Brasil.

Recife, 10 de novembro de 2003.

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13

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7 Variaçào Sazonal da Produção de Alg<ls l'criíü icns nos Estuários dos Rios Paripc e lgarassu.Localizados ao Sul do Canal de Santa Cruz (Pernambuco, Brasil)Al/.ullll' d.; N./<;( '1I1H.:III,; :\lour.1 1)1):.1; /'111"" de Uiln:ir.l P"""<H',lfJf("

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Efeito ele Alguns Reguladores de Crescimento na Regeneração de Plantas de Mandioca(Manihot Esculent« Crantz) Cultivadas In Vitro('/.lur/i., Uli.-.:'I·!i [l.ifi,) ~l-'ifl,l('ifl(, I li.'It·/iflkl 1\. (,3m,na I An/(lbio C/)/)\ .lh'(·;o. de '·\od"ul<·j N.lt,)tlir·' rt,ltIklin d(',\'ldv

/Efeito de Alguns Reguladores de Crescimento na Regeneraçãode Plantas de Mandioca (Manihot esculenta Crantz) CultivadasIn Vitro

Cláudia UlissesPrograma de Pós-Graduação em Botânica, Universidade Federal Rural de Pernambuco, 52171-900, Recife, PE, Brasil

Lilia WilladinoDepartamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, 52171-900, Recife, PE,Brasil

Terezinha R. CâmaraArnóbio Gonçalves de AndradeDepartamento de Química, Universidade Federal Rural de Pernambuco, 52171-900, Recife, PE,Brasil

Natoniel Franklin de MeioLaboratório de Biotecnologia, Embrapa 5emi-Árido, Caixa Postal 23, 56300-000, Petrolina, PE,Brasil

RESUMO

No presente trabalho foi avaliado o efeito de algunsreguladores de crescimento na regeneração de plantasde mandioca (Manihot escu/enta Crantz) viaorganogênese e/ou embriogênese somática. Num aprimeira etapa (indução), induziu-se a formação de calosa partir de folhas jovens, utilizando o meio MSsuplementado com 5, 10, 15 e 20 mg.L: de 2,4-0 (ácido2,4-diclorofenoxiacético) ou 1, 2, 4, e 6 mg.L: de ANA(ácido a-naftalenoacéticol, além de um tratamentocontrole, sem reguladores de crescimento. Na faseseguinte (desenvolvimento), os calos obtidos nos referidostratamentos foram transferidos para meio MS,suplementado com combinações fatoriais de AG. ({;[i'I.:-,giberélicol e BAP (6-benzilaminopurinal nos níveis ,;., ue 1 rng.L", a fim de induzir a formação de embriões. Osresultados obtidos mostraram que, na fase de indução, lJ

2,4-0 estimulou a formação de calos friáveis e o ANAfavoreceu a formação de calos compactos. Os calosobtidos em meio M5 com adição de 2, 4 e 6 mg.L: deANA, apresentaram organogênese indireta de brotos, eorganogênese direta e indireta de raizes. Por sua vez, oscalos tratados com 1 mg.L: de ANA apresentaram apenasorganogênese indireta de raizes, enquanto que, nocontrole, houve uma discreta formação de raizes.Embriões somáticos foram obtidos na fase dedesenvolvimento, apenas a partir de calos friáveis,cultivados em meios contendo 1 mg.L: de BAP, ou 1mg.L: de BAP associado com 1 rng.L:' de AG".Palavras-chave: organogênese, embriogênese sornática, reguladores de

crescimento.

ABSTRACT

[J(.~,ctof -ome gro ...vthrr-gulators on tho plant regcneration

of (.:ZlssaV':\ (/vf~l/líh()t esculenta Cranlzi cuhured in vitro.ln lhe pp.~~cnlwork. lhe· cllcc! 01'\OlllC' growlh rC'gulators

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Rev. Bras. de 8iociênc. I vol. 8. fev/mar. 2003 I ISSN 0080-2228 I pago 65 - 71

INTRODUÇÃO

A mandioca é uma especie que apresentavantagens culturais de subsistência à seca,capacidade de produzir em solos com baixafertilidade, habilidade competitiva com plantasinvasoras e resistência a pragas, além de servirtanto para alimentação humana como animal(Fukuda et aI., 1996; Nassar, 2000). Entretanto, O

sistema de produção empregado ainda éinadequado, resultando em uma baixaprodutividade, devida, principalmente, aos tratosculturais precários e ao acúmulo de doenças(Fukuda, 1993).

Por outro lado, processos biotecnológicospodem ser empregados para a obtenção demateriais mais produtivos e isentos de patógenos.Dentre essas técnicas, a regeneração de brotos eo cultivo de calos organogênicos são as maissignificolivas para a formação de plantas a partirde pedolos, folhas e segmentos nodais (Eskes etaI., 1974; Parke, 1978; Tilquin, 1979; Roca,1984; Smith et aI., 1986; Taylor et aI., 1996;Oliveira et el., 2000). Embriões somáticos demandioca também têm sido induzidos a partirde folhas jovens imaturas ou de ápices caul inaresde plantas propagadas in vitro (Szabados et el.,1987; Matsumoto et el., 1991; Meio, 2002). Valesalientar que a embriogênese somática emmandioca é um processo que pode oferecerimportantes possib il idades, não só para apropagação massiva de genótipos isentos dedoenças, mas também como uma ferramenta deapoio aos programas de melhoramentoassociada com métodos de genética molecular ecelular (Vasil, 1996). Entretanto, a regeneraçãode plantas a partir de sistemas de cultura decélulas e tecidos é ainda uma etapa limitante naaplicação de vários processos biotecnológicos.

Desta forma, o presente trabalho teve comoobjetivo estudar o efeito de alguns reguladoresde crescimento sobre a regeneração de plantasde mandioca cultivadas in vitro a partir de folhasjovens.

MATERIAL E MÉTODOS

o material vegetal utilizado foi gentilmente cedidopelo Banco de Gerrnoplasma do Laboratório deCultura de Tecidos Vegetais da EmpresaPernambucana de Pesquisa Agropecuária (lPA).

Foram utilizadas plantas de mandioca (M.

esculenta Crantz) da cultivar Trouxinha, mantidasin vitro em meio de cultura MS (Murashige &Skoog, 1962).

A multiplicação do material foi realizadautilizando segmentos nodais, os quais foramInoculados verticalmente em frascos contendomeio nutritivo MS (Murashige & Skoog, 1962),modificado quanto à concentração de sacarose,diminuída de 30 g.L:' para 20 g.L:'. e àconcentração de tiamina, aumentada de 0,1rng.L:' para 0,5 mg.L:'. O meio MS foisuplernentado ainda com 0,04 mg.L:' de BAP (6-benz ilarninopurina), 0,02 rng.L:' de ANA (ácidoa-naftalenoacético), 0,05 rng.L:' de AG, (ácidogiberélico) e 7,5 g.L:' de ágar. Após a primeiramultiplicação, a concentração de AGJ foiaumentada para 0,1 rng.L:' a fim de promoverum maior alongamento das plantas. As plantaspermaneceram na fase de multiplicação por 4meses, totalizando 4 subcultivos.

Após a multiplicação, a indução ele calos foirealizada a partir de folhas jovens medindoaproximadamente 6 mm de comprimento,provenientes das plantas micropropagadas. As

r

folhas foram inoculadas horizontalmente emmeio de cultura semi-sólido, composto pelos saise vitaminas de MS, suplementado com osseguintes reguladores de crescimento: 2,4-0{ácido 2,4-diclorofenoxiacéticol, nos níveis 5, 10,15 e 20 rng.L:' e ANA {ácido a-naftalenoacético),nos níveis " 2, 4, e 6 mg.L:'. Como controle, foiutilizado o mesmo meio sem reguladores decrescimento. O delineamento experimental foiinteiramente casualizado, com 6 repetições portratamento.

Para indução da embriogênese somática, os calosformados a partir de folhas jovens foramtransferidos para meio básico MS, suplementado

com combinações fatoriais de AGI e BAP. Foramestabelecidos 4 tratamentos, num fatorial 2x2,compreendendo dois níveis de AG, {Oe 1 mg.L:'l e dois níveis de 13AP (O e 1 mg.L:'). Odelineamento experimental foi inteiramentecasualizado, com 6 repetições por tratamento.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

De uma maneira geral, o número médio desegmentos nodais, obtidos. na fase demultiplicação i n vitro, resultou emaproximadamente 6 plantas por segmento nodalinoculado. Entretanto, para a cultivar estudada

Regulador de Coloração das Folhas Formação de Calos"Crescimento

'" Semana 2" Semana 1" Semana 2" Semana

ANA verde verde ausente ++2,4-0 verde amarela ausente +++Controle verde verde ausente +

• (+ pouca, ++ média, +++ intensa)

Tabela 1 - Efeít~do ácido noftclenoacético (ANA) e ácido 2.4.<ficlorofenoxiacético (2.4·0) sobre o cullivo in vitro de folhas jovens de mandioca (Mlnihot escu/enl.l

Crantz),

Tratamentos Ráizes Brotos

2,4-0 (5 mg.L") ausente ausente

2,4-D (10 rng.L") ausente ausente

2,4-D (15 rng.L") ausente ausente

Tabela 2 - Respostas 2,4-0 (20 mg.L") ausente ausentemorfogenétic.as dos calos ANA (1 mg.L:') Organogênese indireta ausentede mandioca (Manihot

esculenta Crantz) em ANA (2 mg.L:') Organogênese direta e indireta Organogênese indiretarelação às concentrações

ANA (4 mg.L:') Organogênese direta e indireta Organogênese indiretade ácido nahalenoacético(ANA) e ácido 2,4.

ANA (6 rng.L") Organogênese direta e indireta Organogênese indiretadiclorofenoxiacético (2. 4-Ol utilizadas no cultivo ;n Controle Organogênese direta e indireta ausentevitro de folhas jovens.

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no presente trabalho, observou-se umalongamento reduzido das plantas, quandocultivadas em meio contendo 0,05 mg.L:' de AG"a aumento da concentração do AG) para 0,1mg.L:' promoveu um alongamento maisadequado, favorecendo o processo demultiplicação.

A Tabela 1 resume as respostas morfogenéticasdos explantes aos reguladores de crescimento,durante a indução de calos. Na primeira semanaapós a inoculação das folhas, a coloração dasmesmas permaneceu inalterada, não seobservando calogênese em nenhum dostratamentos avaliados. Na segunda semana deavaliação, as folhas mantidas em meio com 2,4-O apresentavam coloração amarelada,constatando-se uma intensa formação de calosdo tipo friável. Nos tratamentos com ANA, acalogênese foi menos intensa e os calos formadoseram do tipo compacto. Nesses últimostratamentos, as folhas permaneceramclorofiladas. No tratamento controle, acalogênese foi mínima quando comparada comos demais tratamentos, evidenciando aimportância das auxinas na indução de calos.Nesse caso, o rápido aumento da taxa decrescimento celular, promovido pelas auxinas, éconseqüência de um mecanismo múltiplo deação, resultando em uma condição final decrescimento ou desenvolvimento representativado efeito do balanço hormonal (Oavies, 1995;Biasi,2002).

A formação de órgãos, como raízes e brotos, foiobservada também a partir da segunda semanade-cultivo. Nos tratamentos com ANA ocorreuorganogênese de brotos e raízes na maioria dosníveis empregados, com exceção do tratamentocontendo 1 mg. L-I, no qua I só observou-se

formação de raízes. No tratamento controletambém ocorreu apenas formação de raízes,ainda que com menor intensidade do que nosdemais tratamentos. Nos meios nutritivos ondese empregou o 2,4-0 não houve formação detecidos diferenciados. A formação de raízesocorreu tanto por organogênese direta comoindireta, enquanto que a formação de brotos foiexclusivamente por via indireta (Tabela 2). Osfatores que controlam a organogênese são váriose resultam da divisão e diferenciaçâo celular,organizada com padrões definidos quedependem da atividade e expressão de certosgenes (Peres, 2002).

Por outro lado, observou-se a formação deembriões somáticos nos estádios globular etorpedo, na terceira semana após a inoculaçãodos calos nos meios contendo 1 mg.L-I de BAPou 1 mg.L:' de BAP associado com 1 rng.L:' deAG). Nesse caso, vale salientar que apenas oscalos formados em meio com 2,4-0 apresentaramcompetência embriogênica. Os calos induzidoscom ANA não apresentaram Iorm ação deembriões até 8 semanas após a inoculação doscalos. Algumas espécies apresentam respostasdiferentes em relação a formação de calos. Emcenoura tDeucus carola), por exemplo, aformação de diferentes tipos de calos foi reportadapor Jimenez & Bangerth (2001) durante oprocesso de embriogênese. Nessa espécie, calostranslúcidos não produziram embriõessomáticos, enquanto calos compostos deestruturas pré-globulares e globulares foramcompetentes em regenerar embriões sornáticos.Em mandioca, observou-se respostaembriogênica somente nos calos do tipo friável.Esseresultado sugere a ocorrência de células comdiferentes suscetibilidades na rota de formaçãode calos até a indução e desenvolvimento de

embriões somáticos.

Nesse contexto, vale ressaltar o efeito indutor deembriogênese causado pelo 2,4-0 na cultivarestudada. Segundo Michalczuk et aI. (1992), aretirada do 2,4-0 do meio favorece aembríogênese somática à medida que desativa arota metabólicada síntese do ácido indolacético(AIA) a partir do triptofano, ativando a síntese doAIA pela rota independente deste aminoácido.Em mandioca, Matsumoto et aI. (1991)observaram a formação de ca los a partir do cu Itivode folhas jovens em meio contendo 2,4-0, comdesenvolvimento posterior de embriõessomáticos num segundo estádio de cultura, semo 2,4-0. Outro fator, indicado pelos autores comoresponsável pelo desenvolvimento dos embriõessomáticos, foi o AG

Jna concentração de 1 rng.L:

I. Da mesma forma, Meio (2002) obteve formaçãode embriões somáticos nas cultivares Mcol-1468e MBRA235 de mandioca, utilizando 1 rng.L:' deAG,. Por outro lado, no presente trabalho,verificou-se que a formação de embriões ocorreucom a utilização de BAP isoladamente ouassociado com AG

J• Assim, a citocinina BAP

parece ter influência no desenvolvimento deembriões para a cultivar Trouxinha,possivelmente devido ao estímulo no processode divisão celu lar, favorecido por essa classe deregulador de crescimento.

Finalmente, o protocolo obtido neste trabalhopoderá ser útil como base para odesenvolvimento de outras técnicas, como aprodução de sementes sintéticas (Guerra et el.,1999) ou como suporte em técnicas detransformação genética mediante a utilização devetores biológicos (Sluys, 1999) ou biobalísticos(Lacorte et aI., 1999), cujo emprego tem resultadoem importantes avanços para a agricultura (Vasil,1996).

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