ÉRICA FELIPE MAURÍCIO...Érica Felipe Maurício DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE UM BIOSSENSOR...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

ESCOLA DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUÍMICOS

E BIOQUÍMICOS

ÉRICA FELIPE MAURÍCIO

DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE UM BIOSSENSOR ENZIMÁTICO PARA

CONTROLE DA QUALIDADE DE ÓLEOS COMESTÍVEIS TERMO-OXIDADOS

Rio de Janeiro

2017

Érica Felipe Maurício



Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos

Químicos e Bioquímicos da Universidade Federal do

Rio de Janeiro, como parte dos requisitos

necessários à obtenção do título de Mestre em

Ciências em Tecnologia de Processos Químicos e

Bioquímicos.

Orientadoras: Prof.ª Dr.ª Andréa Medeiros Salgado

Prof.ª Dr.ª Lívia Maria da Costa Silva

Rio de Janeiro

2017

FOLHA DE APROVAÇÃO

Érica Felipe Maurício



Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de

Processos Químicos e Bioquímicos da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como

parte dos requisitos necessários à obtenção do

título de Mestre em Ciências em Tecnologia

de Processos Químicos e Bioquímicos.

Aprovada em: ______________________

__________________________________________________

Andréa Medeiros Salgado, D. Sc., EQ/UFRJ – Orientadora

__________________________________________________

Lívia Maria da Costa Silva, D. Sc., TER/UFF – Coorientadora

__________________________________________________

Suely Pereira Freitas, D.Sc., EQ/UFRJ

__________________________________________________

Alexandre Guedes Torres, D.Sc., IQ/UFRJ

__________________________________________________

Sonia Couri, D.Sc., IQ/UERJ

Dedico este trabalho a Deus e aos meus pais, Elenice e Ferdinando.

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer a todos que de alguma forma contribuíram para a elaboração desta

dissertação.

Primeiramente, gostaria de agradecer a Deus pela força, coragem e determinação.

Aos meus pais, Elenice e Ferdinando, por estarem sempre presentes me dando apoio,

amor, carinho, ajuda e palavras de conforto nas horas do desespero.

A Ariana Farias Melo, que mesmo distante, foi quem me colocou no ramo dos

biossensores, me ensinou muito e com isso foi possível chegar até aqui.

As minhas tias, Alice e Elenilda, que sempre estiveram torcendo por mim. Aos novos

amigos, Cris e Wallace, que me aturaram na natação. E a todos os familiares e amigos pela

amizade, compreensão e palavras de apoio. Em especial, às minhas amigas Rafaela e Ana

Carina, pela ótima companhia e por estarem sempre me salvando, amo vocês. Agradeço

também a minha amiga Fernanda, que apesar de não nos vermos muito, está sempre comigo

de alguma forma.

As minhas fisioterapeutas, Danny e Carla, que me ajudaram muito nas aulas de pilates

aliviando o estresse e me acalmando. Assim como minha amiga Nilza que tornou as aulas

ainda mais alegres e ainda me deu muito incentivo.

A Paula pelas dicas, ajudas de grande importância e por aturar minhas perturbações

pré e pós defesa. E aos membros do laboratório E-122 pela companhia.

A minha orientadora e amiga de anos, Lívia Maria da Costa Silva, pela orientação,

atenção e conselhos.

A minha orientadora Andréa Medeiros Salgado, pela orientação, ensinamentos e por

me incentivar em novos caminhos.

A Capes pelo apoio financeiro.

“Foi o tempo que dedicastes à tua rosa que a

fez tão importante”

(Antoine de Saint-Exupéry)

“Construí amigos, enfrentei derrotas, Venci

obstáculos, bati na porta da vida e disse-lhe:

Não tenho medo de vivê-la!”

(Augusto Cury)

“Quando a vida decepciona, qual é a solução?

Continue a nadar! Continue a nadar! Continue

a nadar! Nadar! Nadar! Para achar a solução...

Nadar! Nadar!”

(Dory – Procurando Nemo 2003)

RESUMO

MAURÍCIO, Érica Felipe. Desenvolvimento e aplicação de um biossensor enzimático

para controle da qualidade de óleos comestíveis termo-oxidados. Rio de Janeiro, 2017.

Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) - Escola de

Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2017.

Atualmente muitas pessoas procuram praticidade no momento das suas refeições e uma

maneira fácil de consegui-la é a preparação por meio da fritura em óleos comestíveis por

imersão total, que é um método altamente eficiente devido a sua velocidade, alta temperatura

e transferência de calor. Por outro lado, vários estudos concluíram que as substâncias

formadas durante este processo, pode ser prejudiciais à saúde humana. Atualmente, existem

métodos para detectar tal degradação, porém estes apresentam algumas falhas, desde a

demora na obtenção do resultado até a variação dos resultados de acordo com o avaliador.

Neste contexto, a presente dissertação trata do desenvolvimento e aplicação de um biossensor

enzimático para controlar a qualidade dos óleos vegetais comestíveis termo-oxidados. O

método utilizado neste trabalho tem como benefícios um controle mais rápido e direto da

qualidade do óleo. Para o desenvolvimento do instrumento, foram utilizados um componente

biológico e um transdutor, sendo estes a enzima comercial lipase de Candida rugosa tipo VII,

na forma imobilizada, e um eletrodo íon-seletivo de hidrogênio para soluções não aquosas,

respectivamente. Os testes foram realizados com amostras de óleo de gergelim prensado a frio,

óleo de palma virgem, óleo de colza com baixo teor de ácido erúcico (canola) em sua forma

refinada e azeite de oliva. O sistema (enzima/eletrodo) mostrou melhor resposta com o tempo

reacional de 15 minutos, em pH 8,75 e 37ºC. A resposta do eletrodo (mV) foi proporcional à

concentração de 10 a 50% (v/v) de ácidos graxos livres. Uma análise de comparação entre as

curvas de calibração geradas pela enzima em suas formas livre e imobilizada mostrou uma

maior sensibilidade em sua forma imobilizada, e ao utilizar essa forma observou-se a

possibilidade de reutilização da enzima por 5 vezes, tendo uma perda de somente 1,4% e

1,1% para as concentrações 20% (v/v) e 40% (v/v)de óleo, respectivamente. O suporte usado

na imobilização foi passível de reutilização, resultando em 11 reutilizações com porcentagem

média de imobilização igual a 89,18 % ± 0,93%. O biossensor apresentou boa repetibilidade

durante 15 medições. As curvas de calibração do instrumento para cada tipo de óleo

mostraram uma boa correlação entre as variáveis estudadas (concentração do óleo e a resposta

do transdutor), indicando seu bom desempenho para a detecção potenciométrica de

triglicerídeos nas amostras. Quando testado em amostras de cada um dos óleos utilizados no

processo de fritura de batata, o biossensor apresentou boa resposta e sensibilidade de detecção

com fatores de correlação acima de 0,963, quando comparado ao método de detecção do

índice de acidez, que é a metodologia clássica, o que indicou a aplicabilidade do biossensor

desenvolvido.

Palavras-chave: lipase, Candida rugosa tipo VII, Potenciometria.

ABSTRACT

MAURÍCIO, Érica Felipe. Development and application of an enzymatic biosensor to

control the quality of thermo-oxidized edible oils. Rio de Janeiro, 2017. Dissertation

(Master in Chemical and Biochemical Process Technology) - School of Chemistry, Federal

University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2017.

This dissertation deals with the development and application of an enzymatic biosensor to

control the quality of edible vegetable oil during thermo-oxidized. Nowadays many people are

looking for convenience at the time of your meals and a good way to get it is the preparation

by frying for total immersion, which is a highly efficient method because of its speed, due to

high temperature and transfer heat. On the other hand, several studies have concluded that

substances formed during this process can be detrimental to human health. Currently, there

are methods to detect such degradation, but they have some flaws, since the delay in getting

the result to change this according to each rater. Therefore, the method used in this work has

the benefits faster and direct control of oil quality. To develop the tool, a biological

component and a transducer was used, and this commercial enzyme lipase obtained from

Candida rugosa type VII, in immobilized form, and an ion-selective electrode for hydrogen

non-aqueous solutions, respectively. The tests were performed with samples sesame oil cold

pressed, virgin palm oil, rapeseed oil low in erucic acid (Canadian Oil low acid - Canola) in

its refined form and olive oil. The system (enzyme / electrode) showed an optimal response

during the reaction time of 15 minutes at pH 8.75 and 37°C. The electrode response (mV) was

proportional to the concentration in the range of 10 to 50% (v/v) of free fatty acids.

Comparison analysis was made between the enzyme used in its free and immobilized forms

which resulted in greater specificity in its immobilized form, also observed the reusability of

the immobilized enzyme, and possible reuse 5 times in triplicate, having a loss of only 1.4%

and 1.1% for concentrations of 20% (v/v) and 40% (v/v) of oil, respectively. Another possible

reuse was the support used for the immobilization resulting in 11 reuses with average

percentage of immobilization equal to 89.18 ± 0.93%. Another important point for the

biosensor is its repeatability that showed good response for 15 measurements. Then they were

made instrument calibration curves for each type of oil and these showed a good correlation

between variables (oil concentration and transducer response), indicating its good

performance for the potentiometric detection of triglycerides in the samples. Subsequently,

the enzyme biosensor developed was applied to degraded samples sesame oil, through an

oxidation process (Rancimat). Furthermore, the biosensor was also tested on samples of each

oils used in the potato frying process. The values were always compared /related to the acid

value - test already used for oil degradation analysis and expressed as a percentage of free

fatty acids. We obtained good response and sensitivity of detection with correlation factors

above 0.963, and a great applicability of the developed biosensor.

Keywords: lipase, Candida rugosa type VII, potentiometric.

Lista de Ilustrações

Figura 1 - Estrutura química das principais lignanas presentes na semente e no óleo de gergelim. ..... 24

Figura 2 - Produção de canola no Brasil. .............................................................................................. 26

Figura 3 - Ilustração esquemática do funcionamento de um biossensor. .............................................. 31

Figura 4 - Biossensores comerciais em diferentes áreas. ...................................................................... 34

Figura 5 - Reação que ocorre entre a lipase e o triglicerídeo no biossensor. ........................................ 34

Figura 6 - Áreas de aplicação da análise potenciométrica. ................................................................... 35

Figura 7 - Tipos de biossensores utilizados na análise de alimentos. ................................................... 36

Figura 8 – Alguns segmentos de aplicação dos biossensores na área de alimentos. ............................. 37

Figura 9 - Representação esquemática das reações catalisadas por lipases. ......................................... 43

Figura 10 - Principais métodos de imobilização de enzimas. ............................................................... 45

Figura 11 – Esquema da medida da atividade enzimática. .................................................................... 49

Figura 12 - Suporte vítreo utilizado. ..................................................................................................... 51

Figura 13 – Descrição química da reação no processo de imobilização. .............................................. 52

Figura 14 - Esquema da análise potenciométrica. ................................................................................. 53

Figura 15 - Comparação entre a especificidade e coeficiente de correlação da enzima nas formas livre

e imobilizada na elaboração da curva padrão. ....................................................................................... 55

Figura 16 – Diferença de sensibilidade e coeficiente de correlação da curva padrão em relação a

enzimas de diferentes valores de atividade. .......................................................................................... 57

Figura 17 - Número de utilizações consecutivas feitas com a enzima imobilizada utilizando as

emulsões de 20 e 40 % (v/v). ................................................................................................................ 58

Figura 18 – Número de utilizações sequencias do biossensor em emulsões contendo 20 e 40% (v/v) de

óleo de gergelim. ................................................................................................................................... 59

Figura 19 - Variação de potencial em relação ao tempo de permanência do óleo de gergelim sob

oxidação à 110 °C com fluxo de ar. ...................................................................................................... 60

Figura 20 - Gráfico das curvas padrões dos óleos que serão utilizadas para a análise das amostras

degradadas por tratamento térmico (fritura). ......................................................................................... 62

Figura 21 - Gráfico com os resultados dos óleos degradados obtidos da leitura do biossensor após

cinco frituras com cada óleo.................................................................................................................. 64

Figura 22 - Gráfico das curvas geradas a partir da concentração de óleo dentro das especificações

durante o tratamento térmico................................................................................................................. 65

Figura 23 - Gráficos da correlação entre a variação de potencial (biossensor) e o índice de acidez no

decorrer da fritura (A – óleo de gergelim; B – óleo de canola; C – óleo de palma; D – azeite de oliva).

............................................................................................................................................................... 66

Figura 24 - Número de imobilizações reutilizando o suporte. .............................................................. 68

Lista de Tabelas

Tabela 1 - Comparação entre os índices de acidez das amostras antes e após passarem pelo biossensor.

............................................................................................................................................................... 61

Tabela 2 - Curvas padrões dos óleos que serão utilizadas para a análise das amostras degradadas por

fritura (x= % óleo (v/v) e y= variação do potencial). ............................................................................ 62

Tabela 3 - Resultados dos óleos degradados obtidos da leitura do biossensor após cinco frituras com

cada óleo (x= número de frituras e y=variação de potencial). .............................................................. 63

Tabela 4 - Curvas geradas a partir da concentração de óleo dentro das especificações durante a fritura

(x=número de frituras e y=concentração de triglicerídeos (%v/v))....................................................... 65

Tabela 5 - Correlação entre a concentração de óleo intacto e o índice de acidez no decorrer da fritura

(x=variação de potencial (mV) e y=%AGL). ........................................................................................ 66

Lista de Quadros

Quadro 1 - Conteúdo de óleo presente em diferentes materiais oleaginosos. ....................................... 21

Quadro 2 - Composição média dos principais ácidos graxos do óleo de gergelim. .............................. 23

Quadro 3 - Composição genérica dos principais ácidos graxos do óleo de colza com baixo teor de

ácido erúcico – canola. .......................................................................................................................... 25

Quadro 4 - Composição genérica dos principais ácidos graxos do óleo de palma. ............................... 27

Quadro 5 - Composição genérica dos principais ácidos graxos do azeite de oliva. .............................. 28

Quadro 6 – Limites superiores de índice de acidez expressos em porcentagem de ácidos graxos livres

de acordo com a RDC nº 270/2005. ...................................................................................................... 30

Quadro 7 - Comparação entre as técnicas analíticas tradicionais e os biossensores. ............................ 32

Quadro 8 - Biossensores encontrados recentemente na literatura com utilização em alimentos. ......... 38

Quadro 9 - Biossensores rotineiramente utilizados na indústria de alimentos. ..................................... 39

Quadro 10 - Aplicações industriais das lipases. .................................................................................... 44

Quadro 11 – Principais diferenças em sua composição entre os óleos de gergelim, canola, palma e

azeite de oliva. ....................................................................................................................................... 47

Quadro 12- Diferença da razão superfície/volume em relação ao número de frituras. ......................... 48

Lista de Equações

Equação 1 .............................................................................................................................................. 50

Equação 2 .............................................................................................................................................. 52

Equação 3 .............................................................................................................................................. 54

Equação 4 .............................................................................................................................................. 54

Sumário

CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 18

CAPÍTULO 2. OBJETIVOS.............................................................................................................. 20

2.1 Objetivo Geral ....................................................................................................................... 20

2.2 Objetivos Específicos ............................................................................................................ 20

CAPÍTULO 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 21

3.1 Óleos ..................................................................................................................................... 21

3.1.1 Óleo de gergelim ........................................................................................................... 22

3.1.2 Óleo de colza com baixo teor de ácido erúcico (canola) ............................................... 24

3.1.3 Óleo de palma................................................................................................................ 26

3.1.4 Azeite de oliva ............................................................................................................... 28

3.2 Métodos de controle de qualidade de óleos vegetais............................................................. 29

3.3 Biossensores .......................................................................................................................... 31

3.3.1 Biossensores potenciométricos...................................................................................... 35

3.3.2 Utilização dos biossensores nas indústrias de alimentos ............................................... 36

3.3.3 Biossensores utilizados em óleos .................................................................................. 40

3.4 Enzimas ................................................................................................................................. 41

3.4.1 Lipases ........................................................................................................................... 42

3.4.2 Imobilização enzimática ................................................................................................ 44

CAPÍTULO 4. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 47

4.1 Componente biológico .......................................................................................................... 47

4.2 Substratos de interesse: óleos ................................................................................................ 47

4.2.1 Informações dos óleos utilizados .................................................................................. 47

4.2.2 Degradação dos óleos .................................................................................................... 47

4.3 Preparação da emulsão para a curva de calibração do biossensor ......................................... 49

4.4 Biocomponente (lipase comercial) ........................................................................................ 49

4.4.1 Determinação da atividade lipásica ............................................................................... 49

4.4.2 Processo de imobilização da lipase ............................................................................... 50

4.5 Análises de degradação por procedimento de fritura ............................................................ 52

4.5.1 Biossensor enzimático ................................................................................................... 52

4.5.2 Índice de acidez ............................................................................................................. 53

CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 55

5.1 Enzima nas formas livre e imobilizada ................................................................................. 55

5.2 Diferentes atividades da enzima imobilizada ........................................................................ 56

5.3 Reutilização do biocomponente ............................................................................................ 57

5.4 Repetibilidade do biossensor ................................................................................................. 58

5.5 Estabilidade oxidativa do óleo de gergelim a 110°C com fluxo de ar .................................. 59

5.6 Análises com amostras residuais de fritura de batata ............................................................ 61

5.6.1 Elaboração da curva padrão .......................................................................................... 61

5.6.2 Variação de potencial em relação ao número de frituras .............................................. 63

5.6.3 Concentração de óleo intacto nas amostras após passarem por fritura .......................... 64

5.6.4 Porcentagem de ácidos graxos livres ............................................................................. 65

5.7 Reutilização do suporte para a imobilização enzimática ....................................................... 68

CAPÍTULO 6. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 69

CAPÍTULO 7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS..................................................... 71

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................. 72

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CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO

De acordo com o Codex Alimentarius (2015), os óleos vegetais comestíveis são

alimentos compostos principalmente de glicerídeos de ácidos graxos obtidos a partir de fontes

vegetais. Eles podem conter pequenas quantidades de outros lipídeos, tais como fosfatídeos e

de ácidos graxos livres naturalmente presentes no óleo. A qualidade dos óleos pode variar de

acordo com alguns aspectos como a atividade enzimática, a presença de microrganismos,

umidade e auto e foto-oxidação, ocorrendo a deterioração oxidativa que é responsável pela

formação de off flavor – compostos que descaracterizam o produto do ponto de vista sensorial,

em relação a aroma e gosto – e reduzem a vida de prateleira dos mesmos (WHITFIELD;

SHAW, 1985). Nesse contexto, durante a sua utilização em procedimento de fritura, ocorrem

reações como as de hidrólise, que são catalisadas pela ação do calor e umidade, tendo

formação de ácidos graxos livres, mono e diacilglicerois; as de oxidação, que está associada à

reação do oxigênio com ácidos graxos insaturados e compostos voláteis; e as reações de

polimerização, produzindo moléculas complexas (FREIRE; MANCINI-FILHO; FERREIRA,

2013).

Para a detecção da degradação de óleos são usados alguns métodos, o mais antigo sendo

a análise sensorial que é um método útil e sensível, mas requer treinamento de pessoal e os

resultados variam muito de uma equipe para outra (FRANKEL, 1993). Outros métodos

encontrados são: a determinação de compostos voláteis que exige muito tempo e trabalho; a

determinação dos ácidos graxos livres por índice de acidez; índice de peróxido e índice de

iodo, sendo testes mais rápidos, no entanto, às vezes, não representam a realidade das

amostras. Mais recentemente foram desenvolvidos os testes colorimétricos, que apesar de

serem muito eficientes, alguns autores acham limitados e subjetivos, porque sofrem

interferência de cor, e a análise pode mudar de um observador para outro (FREIRE;

MANCINI-FILHO; FERREIRA, 2013).

Com o intuito de avançar no estado da técnica, na tentativa de superar os problemas dos

métodos tradicionais, foi desenvolvida a proposta da elaboração de um biossensor. De acordo

com a International Union of Pure and Applied Chemistry – IUPAC (2014), um biossensor é

um dispositivo quantitativo ou semi-quantitativo que utiliza reações bioquímicas específicas

mediadas por enzimas isoladas, tecidos, organelas ou células intactas para a detecção de

compostos químicos, geralmente, por sinais elétricos, ópticos ou térmicos. Sendo assim, é

19

uma classe de instrumentos que, em muitos casos, proporcionam uma elevada especificidade,

uma vez que tem a capacidade de combinar a seletividade de um componente bioativo com o

analito de interesse, com a sensibilidade de um transdutor capaz de converter sinais biológicos

num sinal elétrico proporcional à concentração do analito. Além disso, estes instrumentos

podem ser portáteis, automatizados e colocados em linha no processo produtivo; são capazes

de fornecer resultados rápidos, com facilidade de processamento de dados; além de

apresentarem baixo custo (SALGADO, 2001).

Portanto, a fim de se obter um instrumento com alta seletividade, decidiu-se pela

utilização de enzimas como componente biológico, uma vez que estas possuem a combinação

de sensibilidade com seletividade, além de permitir a utilização de várias tecnologias de

transdução (SILVA, 2011). Para o biossensor em questão foi utilizada a enzima lipase, uma

vez que fornece uma conversão equivalente à digestão natural de lipídios e também a sua

hidrólise, agindo na interface óleo-água e gerando produtos lipolíticos como os mono,

diglicerídeos e ácidos graxos (MUTH et al., 2017). Além disso, a hidrólise enzimática pela

lipase ocorre em condições de temperatura e pressão ambientes e oferece seletividade em

relação aos produtos de reação, resultando assim no aumento da eficiência e diminuição do

custo efetivo (DE CASTRO; MENDES; DOS SANTOS, 2004).

Deste modo, a combinação do biossensor associado a enzima lipase de Candida rugosa

Tipo VII se mostra promissora, pois a enzima atuará na interface óleo-água agindo

especificamente sobre os triglicerídeos e assim formando ácidos graxos livres que poderão ser

mensurados ao longo dos experimentos e detectar assim se o óleo ainda está dentro das

especificações ou não para o consumo humano. Tal biossensor também é mencionado nos

seguintes trabalhos publicados: Mauricio et al., (2013), Mauricio et al., (2014a), Mauricio et

al., (2014b) e Salgado; Maurício; Silva (2016).

20

CAPÍTULO 2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

O objetivo do presente trabalho consistiu em desenvolver e aplicar um biossensor para

determinação de ácidos graxos livres em óleos vegetais comestíveis utilizados em frituras,

fazendo o uso da enzima lipase de Candida rugosa Tipo VII em conjunto com um eletrodo

íon-seletivo para hidrogênio como transdutor, sendo empregado o método potenciométrico.

2.2 Objetivos Específicos

Comparar o desempenho da enzima em suas formas livre e imobilizada em relação a sua

especificidade e coeficiente de correlação na curva padrão;

Testar a reutilização da enzima imobilizada no biossensor proposto;

Testar a reutilização do suporte em sucessivos procedimentos de imobilização da

enzima comercial lipase;

Testar a repetibilidade do biossensor desenvolvido utilizando o óleo de gergelim;

Elaborar as curvas de calibração do equipamento para os óleos de gergelim, canola,

palma e azeite de oliva; e

Comparar o método desenvolvido - biossensor - com o da medida do índice de acidez

(método tradicional), para as análises das amostras de óleos de gergelim, canola, palma

e azeite de oliva utilizadas no procedimento de fritura de batatas.

21

CAPÍTULO 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Óleos

Mundialmente, os óleos são produzidos e consumidos em grandes quantidades. A

produção da safra mundial de 2016/2017 (até junho) foi de 185,92 milhões de toneladas com

consumo doméstico de 183,70 milhões de toneladas (USDA, 2016a). Os lipídios, grupo do

qual os óleos fazem parte, estão presentes em quase todos os alimentos, podendo ser

encontrados na forma de triacilgliceróis, fosfolipídios, glicolipídios, esfingolipídios e

lipoproteínas. Os triacilgliceróis são ésteres de glicerol que contem três ácidos graxos

(ARAÚJO, 2015) e são encontrados em maior quantidade.

No Quadro 1 é possível observar as diferentes proporções de óleos encontradas em

alguns materiais oleaginosos. Nota-se que a semente de gergelim é o material de maior teor de

óleo seguido da palma, que possuem em torno de 50% de óleo.

Quadro 1 - Conteúdo de óleo presente em diferentes materiais oleaginosos.

Material oleaginoso Conteúdo de óleo (% w/w)

Gergelim 50 – 55

Palma (polpa) 45 – 50

Palma (amêndoa) 45 – 50

Amendoim 45 – 50

Colza 40 – 45

Girassol 35 – 45

Oliva 25 – 30

Farelo de arroz 20 – 30

Soja 18 – 20 Fonte: Adaptado de Beltrão et al., 2013.

Os óleos podem sofrer alterações durante o seu processamento, armazenamento e

consumo (ARAÚJO, 2015). Portanto, é importante o controle de sua qualidade durante todo o

seu tempo de validade. A reação que afeta os óleos de forma mais incisiva é a oxidação que é

um fenômeno natural responsável pela perda de valor nutricional e alterações sensoriais,

como por exemplo, de cor e flavor, além de proporcionar a rejeição do produto e a formação

de compostos potencialmente tóxicos nos alimentos. A oxidação pode ocorrer de quatro

formas: termoxidação , autoxidação, fotoxidação e enzimática (OETTERER; REGITANO-

D’ARCE; SPOTO, 2006).

22

A termoxidação consiste na oxidação de lipídios em altas temperaturas, envolvendo

reações oxidativas e termolíticas ao mesmo tempo, fazendo com que tantos ácidos graxos

saturados quanto insaturados sofram decomposição química. O principal exemplo desta

reação é o procedimento de fritura por imersão uma vez que há o arraste de oxigênio da

atmosfera pelo alimento inserido no óleo e também há o contato com vapor d’água liberado

pelo alimento, levando a diminuição da qualidade do óleo. Nesta reação há a formação de

hidroperóxidos que em temperaturas acima de 100ºC de tornam instáveis e promovem uma

decomposição rápida do óleo (OETTERER; REGITANO-D’ARCE; SPOTO, 2006).

Na autoxidação, o oxigênio reage nas insaturações dos óleos formando radicais livres e

levando a rancidez do óleo. Na fotoxidação, a reação ocorre na presença de luz, não havendo

a formação de radicais livres. Já na reação enzimática, há a presença de uma lipoxigenase que

catalisa a oxigenação de alguns ácidos graxos (ARAÚJO, 2015). Assim, alguns fatores que

afetam ou catalisam a oxidação dos lipídios são: presença de insaturação nos ácidos graxos,

luz, temperatura, presença de antioxidantes e de pró-oxidantes (como metais e clorofila),

enzimas, metaloproteínas, microrganismos e condições de armazenamento (ANTONIASSI,

2001).

Os óleos vegetais são comumente usados em fritura por ser uma alternativa de baixo

custo. Neste procedimento, o óleo se incorpora ao alimento e altera as suas propriedades

nutricionais e sensoriais. Cada vez mais a população brasileira incorpora a fritura na sua

alimentação devido a praticidade, redução do tempo de preparo e facilidade de consumo.

Vale ressaltar que a reutilização excessiva do óleo devido a reação pode levar a geração

de compostos tóxicos e tornar o produto impróprio para o consumo e sem a qualidade

desejada. O ponto de descarte do óleo deve ser muito bem controlado, uma vez que ao

descartá-lo prematuramente acarreta em maiores gastos e ao fazê-lo tardiamente leva a perda

de qualidade do alimento e também ocasiona riscos a saúde do consumidor (FREIRE;

MANCINI-FILHO; FERREIRA, 2013).

3.1.1 Óleo de gergelim

A principal fonte do gergelim comercial é o Sesamum indicum L. (NAMIKI e

KOBAYASHI, 1989 apud NAMIKI, 2007). Em 2014, o gergelim foi cultivado em 50 países,

sendo os principais produtores, Índia (811 mil toneladas), China – continente (61 mil

toneladas), Myanmar (519,4 mil toneladas) e Nigéria (434,99 mil toneladas). A produção

23

média mundial foi de 65 mil toneladas, e o Brasil, apresentou uma produção de 7 mil

toneladas, ficando em 25ª posição (FAO, 2014). Os Estados brasileiros produtores de

gergelim são: Goiás (67% da produção nacional), Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Ceará,

Piauí, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Bahia e Minas Gerais (ARRIEL et al.,

2007).

As sementes de gergelim apresentam em sua composição de 50 a 60% de óleo, 20% de

proteínas, 18% de carboidratos e 5% de fibras, além de alguns componentes como cálcio,

fósforo, ferro, potássio, sódio, magnésio e enxofre. Após a extração do óleo, o farelo ou

farinha possui cerca de 40% de proteínas (BELTRÃO et al., 2013). O óleo de gergelim

apresenta composição de ácidos graxos conforme o Quadro 2, sendo um óleo composto

principalmente pelos ácidos oleico e linoleico.

Quadro 2 - Composição média dos principais ácidos graxos do óleo de gergelim.

Ácidos Graxos Estrutura Valores de Referência (%)

Ácido palmítico C16:0 7,9 – 12,0

Ácido esteárico C18:0 4,5 – 6,7

Ácido oleico (ômega 9) C18:1 34,4 – 45,5

Ácido linoleico (ômega 6) C18:2 36,9 – 47,9

Ácido linolênico (ômega 3) C18:3 0,2 – 1,0

Ácido araquídico C20:0 0,3 – 0,7 ND = Não detectável, definido como ≤ 0,05%.

Fonte: Adaptado do Codex alimentarius, 2015.

O óleo de gergelim apresenta altos teores de ácidos graxos poliinsaturados, porém sua

estabilidade oxidativa é elevada, isso se dá devido aos compostos lignanas: sesamolina e

sesamina (Figura 1) e de seus produtos de degradação, sesamol e sesamolinol, que são

potentes antioxidantes e estão presentes naturalmente no óleo (ANTONIASSI et al., 2013).

Durante a etapa de branqueamento do refino do óleo de gergelim, a quantidade de sesaminol

(produto de degradação da sesamolina) aumenta e não sofre tanta perda na etapa seguinte de

desodorização, como as outras lignanas sendo assim o composto lignana presente em maior

quantidade óleo de gergelim refinado e responsável por sua alta estabilidade oxidativa

(FUKUDA et al., 1986).

24

Figura 1 - Estrutura química das principais lignanas presentes na semente e no óleo de gergelim.

Fonte: Adaptado de Antoniassi et al., 2013.

Devido aos compostos citados acima, a literatura tem relatado uma série de benefícios

para a saúde provenientes do consumo de óleo de gergelim, tais como a redução das

concentrações de ácidos graxos no fígado e no soro e dos níveis séricos de colesterol (LIANG

et al., 2015). Também apresenta propriedades anticancerígenas e anti-hipertensivas

(KARATZI et al., 2013).

Na medicina taiwanesa tradicional, o óleo de gergelim é usado para aliviar dores nas

articulações, de dente, síndrome pré-menstrual, arranhões e cortes, nesse último caso, devido

a seus efeitos antibacterianos significativos (SHAMLOO et al., 2015) e, em modelos animais

experimentais, este tipo de óleo exerceu atividade analgésica, mas até agora não houve

estudos em humanos para avaliar o efeito do óleo de gergelim tópico sobre o manejo da dor

em pacientes (HSU; CHU; JOU, 2016).

3.1.2 Óleo de colza com baixo teor de ácido erúcico (canola)

O óleo de canola – nome derivado da sigla canadian oil low acid – é produzido a partir

da modificação genética de sementes oleaginosas com baixo teor de ácido erúcico derivadas

das espécies BrassicanapusL., Brassica rapa L. e Brassicajuncea L. Além disso, se diferem

em suas propriedades física, química e nutricional em relação ao óleo de colza (CODEX

ALIMENTARIUS, 2015).

O óleo de colza utilizado apresenta composição de ácidos graxos conforme Quadro 3,

sendo um óleo composto principalmente pelos ácidos oleico e linoleico.

25

Quadro 3 - Composição genérica dos principais ácidos graxos do óleo de colza com baixo teor

de ácido erúcico – canola.






Ácido linolênico (ômega 3) C18:3 5,0 – 14,0

Ácido araquídico C20:0 0,2 – 1,2

Ácido gadoloico C20:1 0,1 – 4,3 ND = Não detectável, definido como ≤ 0,05%.


De acordo com o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA, 2016b), na

safra de 2016/2017 (até junho) a produção mundial de colza foi de 66,15 milhões de toneladas,

sendo os principais produtores: União Europeia (21,8 milhões de toneladas), Canadá (15,5

milhões de toneladas), China (13,3 milhões de toneladas) e Índia (6,8 milhões de toneladas).

E segundo a Organização de Alimentos e Agricultura das Nações Unidas (FAO, 2014), em

2014, o Brasil, apresentou uma produção de 72 mil toneladas, ficando com a 29ª posição.

Uma análise da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB, 2016), mostra que os

Estados brasileiros produtores de colza são Rio Grande do Sul e Paraná, com uma produção

na safra de 2014/2015 de 43,8 mil toneladas e 11,1 mil toneladas, respectivamente, como

mostra a Figura 2.

26

Figura 2 - Produção de canola no Brasil.

Fonte: CONAB, 2016.

O óleo de canola é o terceiro mais produzido mundialmente dentre as commodities. Na

safra de 2016/2017 (até junho), a produção foi de 26,48 milhões de toneladas, podendo

ressaltar os principais produtores sendo: União Europeia (9,66 milhões de toneladas), China

(6,55 milhões de toneladas) e Canadá (3,50 milhões de toneladas) (USDA, 2016b).

O óleo de canola possui elevada quantidade de ácidos graxos ômega 3, 6 e 9 que

reduzem triglicerídeos e controla arteriosclerose, vitamina E, gorduras monoinsaturadas e o

baixo teor de gordura saturada que atua no controle do colesterol. A estabilidade de óleo de

canola é limitada principalmente pela presença de ácido linolênico, clorofila e pequenas

quantidades de ácidos graxos altamente insaturados que podem ser formados durante refino e

branqueamento (FIB, 2012).

3.1.3 Óleo de palma

O óleo de palma, também conhecido como azeite de dendê, é obtido a partir da espécie

Elaeis guineensis Jacq. Trata-se de uma planta tropical originária da parte central e oeste da

27

África (ALVES et al., 2013). É um óleo rico em vitamina E, sendo um potente antioxidante,

classificado em subgrupos de tocoferóis e tocotrienóis. Além disso, possui benefícios para a

saúde como: redução do risco de trombose arterial, aterosclerose, inibição da biossíntese do

colesterol endógeno, agregação de plaquetas e redução da pressão arterial (SOARES et al.,

2016).

A coloração do óleo de palma é atribuída principalmente à quantidade de carotenoides

do fruto, são considerados compostos bioativos, além de serem lipossolúveis, poli-insaturados,

sintetizados unicamente por vegetais. Além disso, a coloração característica do óleo de palma

está ligada a quantidade de e o -caroteno que varia de 80 a 90%. Estes compostos

possuem atividade pró-vitaminica A e atuam como antioxidantes, sequestrando espécies

reativas de oxigênio. Esses pigmentos ocorrem naturalmente na forma trans, sendo que o

aquecimento por tempo prolongado e a presença de luz podem conduzir a isomerização para

as formas cis, além de propiciar a oxidação que provoca a formação de epóxidos,

apocarotenoides e compostos de alto peso molecular (COSTA, 2015).

O óleo de palma é composto por ácidos graxos insaturados, oleico e linoleico que

contribuem com aproximadamente 50% do total, enquanto os saturados, palmítico e esteárico

com aproximadamente 44% do total da sua composição (SOARES et al., 2016), conforme

pode ser observado no Quadro 4.

Quadro 4 - Composição genérica dos principais ácidos graxos do óleo de palma.


Ácido mirístico C14:0 0,5 – 2,0




Ácido linoleico (ômega 6) C18:2 9,0 – 12,0 ND = Não detectável, definido como ≤ 0,05%.


De acordo com o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA, 2016c), o

óleo de palma é o óleo mais produzido mundialmente dentre as commodities com 17 países

produtores. Na safra de 2016/2017 (até junho), a produção mundial do óleo de palma foi de

65,39 milhões de toneladas, sendo os principais produtores: Indonésia (35 milhões de

toneladas) e Malásia (21 milhões de toneladas).

28

No Brasil, em 2014, segundo a Organização de Alimentos e Agricultura das Nações

Unidas (FAO, 2014), a produção foi de 370 mil toneladas, ficando como 7º produtor mundial.

Uma análise da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB, 2004), mostra que a

Companhia Refinadora da Amazônia (CRA), do grupo Agropalma, é a grande produtora de

óleo e gordura de palma e de gordura de palmiste. O Brasil tem uma participação ainda pouco

expressiva no mercado mundial (cerca de 0,5%), mas o Estado do Pará tem um grande

potencial para o dendê, detém mais de 90% da produção nacional, porém há pouco interesse

político em investir neste setor, pois a Malásia já detém alta tecnologia para utilizar (ALVES

et al., 2013).

3.1.4 Azeite de oliva

Segundo a RDC nº 270, de 22 de setembro de 2005 (BRASIL, 2005), o azeite de oliva é

o produto obtido somente dos frutos da oliveira Oleaeuropaea L., excluídos os óleos obtidos

através de solventes ou processos de reesterificação e ou qualquer mistura de outros óleos. No

Quadro 5, é possível observar que o azeite de oliva é composto principalmente pelo ácido

graxo oleico.

Quadro 5 - Composição genérica dos principais ácidos graxos do azeite de oliva.



Ácido palmitoleico C16:1 0,3 – 3,5




Ácido linolênico (ômega 3) C18:3 ~0,6 ND = Não detectável, definido como ≤ 0,05%.


O azeite de oliva apresenta alguns benefícios a saúde humana como: redução do

colesterol LDL (low-density lipoprotein cholesterol), aumento do colesterol HDL (high-

density lipoprotein cholesterol); redução da oxidabilidade do LDL; melhora do metabolismo

da glicose, do controle da pressão arterial e da função endotelial; redução da agregação

plaquetária e apresenta efeitos favoráveis contra a obesidade (NOGUEIRA-DE-ALMEIDA et

al., 2015).

O azeite de oliva, que é o nono óleo mais produzido mundialmente dentre as

commodities, apresentou produção na safra de 2016/2017 (até junho) de 2,98 milhões de

29

tonelada (USDA, 2016d). Em 2014, os maiores produtores de olivas foram: Espanha (4,58

milhões de toneladas), Grécia (2,28 milhões de toneladas) e Itália (1,96 milhões de toneladas).

O Brasil foi o 37º produtor de olivas com 512 toneladas (FAO, 2014).

3.2 Métodos de controle de qualidade de óleos vegetais

Como mencionado na seção 3.1, os óleos além de serem utilizados na forma in natura,

também são utilizado em formulações de diversos produtos alimentícios como pães, bolos,

biscoitos e margarinas (FIB, 2014). Outra forma de serem utilizados é em frituras uma vez

que desenvolvem um conjunto de propriedades organolépticas, como sabor, aroma, cor e

textura crocante, torna a fritura bastante atrativa, quando comparada a outras formas de

preparo de alimentos (COSTA, 2015). Além disso, a fritura proporciona a transferência de

massa que ocasionará na transferência de produtos benéficos do óleo para o alimento

(FREIRE; MANCINI-FILHO; FERREIRA, 2013). Porém, tal procedimento ocasiona um

grande dano as propriedades dos óleos levando a sua degradação (SANIBAL; MANCINI

FILHO, 2002).

Durante a fritura ocorrem diversas reações químicas as quais geram produtos que

afetam as suas características físicas, que podem ser utilizadas como indicadores da

deterioração do óleo. As principais reações que ocorrem durante o processo de fritura são

degradação química, hidrólise e oxidação (NOGUEIRA-DE-ALMEIDA et al., 2015).

Na literatura estão disponíveis diversos métodos de controle de qualidade do óleo de

fritura, dentre eles, podem ser destacados: determinação de compostos polares totais (CPT)

por cromatografia a gás, eletroforese capilar, ressonância magnética nuclear e determinação

de ácidos graxos livres, que apesar de não indicar o grau de oxidação dos óleos, mostra que

estes estão mais suscetíveis a sofrer degradação, uma vez que são menos estáveis. Também

são encontrados testes rápidos como: Fri-check, Testo 265, Testo 270 e Oil Test (FREIRE;

MANCINI-FILHO; FERREIRA, 2013), e do uso da análise sensorial (FRANKEL, 1993).

Os métodos supramencionados são bons para detecção da degradação de óleos, porém

apresentam alguns problemas. A determinação de compostos polares totais por cromatografia

a líquido é a técnica oficial internacional que estabelece um teor máximo de 25% de CPT. No

entanto, é uma técnica que demanda muito tempo e devido a esse fator é difícil para uma

utilização de rotina. Uma alternativa seria a substituição da cromatografia pela eletroforese

30

capilar que requer menos tempo, apesar de ainda requerer preparo da amostra, trata-se de um

procedimento mais simples (FREIRE; MANCINI-FILHO; FERREIRA, 2013).

Na ressonância magnética nuclear é possível observar a vantagem de não ser necessária

nenhuma calibração com padrões e é mais rápido, porém é incapaz de separar e quantificar os

esteróis individuais (GUILLÉN; URIARTE, 2012).

Os testes rápidos Fri-Check, Testo 265 e Testo 270 apesar de serem bem eficazes, sendo

o primeiro de fabricação Belga, baseado em medidas físicas (viscosidade, densidade e tensão

superficial) e os outros dois, de fabricação alemã, avaliarem o teor de compostos polares de

maneira rápida, não são muito utilizados no Brasil devido ao custo de importação. O Oil Test,

que é um teste colorimétrico rápido e em forma de kit que se baseia nas alterações de acidez e

na formação de peróxidos, é bem rápido, porém testes desse tipo são considerados limitados

por apresentar interferência das cores de produtos pigmentados, e subjetivos por poder variar

de um observador para outro não mantendo um padrão na análise (FREIRE; MANCINI-

FILHO; FERREIRA, 2013).

No Brasil, ainda não há uma legislação específica para óleo ou gordura de fritura, os

testes de fritura são feitos com base na acidez e índice de peróxido, que é determinante para

oxidação, como preconizado na RDC nº 270, de 22 de setembro de 2005 (BRASIL, 2005). O

Quadro 6 mostra a porcentagem máxima de ácidos graxos livres permitida para os óleos de

gergelim, canola, palma e azeite de oliva de acordo com a RDC mencionada acima, que foram

os dados usados para o presente trabalho.

Quadro 6 – Limites superiores de índice de acidez expressos em porcentagem de ácidos

graxos livres de acordo com a RDC nº 270/2005.

Óleo Ácidos Graxos Livres (% g ác. oleico)

Gergelim 2,01

Canola 0,300

Palma 5,03

Oliva 1,00

Além da Resolução de Diretoria Colegiada, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(Anvisa) disponibiliza um informe técnico onde estabelece que a quantidade de ácidos graxos

livres não seja superior a 0,9% para os óleos refinados; o teor de compostos polares não seja

maior que 25% e os valores de ácido linolênico, presentes nas frituras, não ultrapasse o limite

de 2%. Ademais, a agência reguladora ainda disponibiliza algumas recomendações de boas

práticas de fabricação (ANVISA, 2004).

31

Portanto, devido a essas complicações para a detecção do ponto certo para descarte do

óleo de fritura seria interessante um método novo que combinasse simplicidade, rapidez e alta

especificidade para tal identificação, como os biossensores.

3.3 Biossensores

Os biossensores são definidos como dispositivos que combinam a atividade seletiva de

elementos biológicos, por exemplo, enzimas, DNA, antígenos, anticorpos, células, organelas,

tecido animal ou vegetal, sensíveis a um analito de interesse, a um transdutor que converte a

reação de reconhecimento em um sinal mensurável com o intuito de contribuir na

imobilização do material biológico, reduzindo o tempo de resposta, aumentando a estabilidade

e a sensibilidade, bem como possibilitando a obtenção de limites de detecção cada vez

menores, conforme Figura 3 (OLIVEIRA et al., 2015).

Figura 3 - Ilustração esquemática do funcionamento de um biossensor.

Fonte: Melo, 2012.

Estes instrumentos permitem realizar as mais variadas tarefas como: efetuar controle em

linha em nível industrial, análise ambiental em tempo real, automatização de análises

bioquímicas, análise in vivo, detecção de substâncias biológicas relevantes (como hormônios e

drogas) e detecção de agentes de guerra química. Geralmente, um biossensor permite o uso de

métodos “limpos” e de baixo custo sem a necessidade de pré-tratamentos morosos e de

grandes volumes de amostra (SILVA, 2011). No Quadro 7 é possível observar as principais

diferenças entre as técnicas tradicionais e o uso de biossensores nas análises.

32

Quadro 7 - Comparação entre as técnicas analíticas tradicionais e os biossensores.

Técnicas Analíticas Tradicionais Biossensores

Alto custo Baixo custo

Demanda de tempo Detecção em tempo real

Pessoal bem treinado Uso simples

Manipulação pesada das amostras Preparação limitada das amostras

Equipamento com alta tecnologia Dispositivos simples e portáteis Fonte: Adaptado de Santoro; Ricciardi, 2016.

Os biossensores apresentam algumas características especificas que devem ser levadas

em consideração, a saber (ROSATTO et al., 2001):

Faixa de sensibilidade que corresponde à faixa de concentração mensurável;

Seletividade que está relacionada à habilidade que certas macromoléculas

biológicas possuem em discriminar diferentes substratos;

Natureza da solução que está relacionada com condições como pH, temperatura e

força iônica do meio as quais devem ser consideradas;

Tempo que pode ser o tempo de resposta; o tempo de recuperação e o tempo de

vida útil;

o tempo de resposta: tempo em que o biossensor leva para dar a resposta;

o tempo de recuperação: tempo em que o biossensor leva para voltar ao

estado inicial;

o tempo de vida útil: tempo em que o biossensor funciona adequadamente.

Estabilidade operacional, onde a resposta do biossensor pode variar em função de

diversos fatores como: geometria do sensor, método de preparo, assim como,

receptores e transdutores usados. Depende da difusão externa e interna do substrato,

e das condições operacionais de trabalho (concentração do analito, temperatura, pH,

natureza do tampão, presença de solventes orgânicos e de outras substâncias, e

composição da solução matriz que contém a amostra);

Reprodutibilidade que é a medida da dispersão ou flutuação em uma série de

medidas obtidas ao longo de um período de tempo para concentração de um analito

dentro de uma faixa de utilização;

Pequeno tamanho e potencial para miniaturização que permite a sua fácil instalação

no ambiente de medida e monitoração in situ;

33

Acurácia e precisão relacionadas ao resultado obtido em cada média que deve ser

próximo ao valor real esperado e estar relacionado a reprodutibilidade do resultado

obtido em cada média, ou seja, devem ser próximos entre si;

Frequência de amostragem;

Baixo custo de construção e estocagem.

Existem diferentes transdutores que podem ser utilizados nos biossensores. A escolha

deles dependerá do material biológico e das propriedades da amostra em análise. Os

transdutores podem ser classificados como eletroquímico (movimento de íons, difusão de

espécies eletroativas), óptico (absorção ou emissão de radiação eletromagnética),

piezoelétrico (alteração de massa e/ou microviscosidade) e termométrico (mudança de

temperatura) (FURTADO et al., 2008).

Os eletroquímicos têm se destacado entre os tipos de transdutores dos biossensores,

podendo ser de três tipos: amperométrico (mudanças de corrente elétrica são observadas

enquanto o potencial se mantém constante, resultante de alterações de oxidação, ou redução

de espécies eletroativas), condutimétrico (mudanças são observadas nas medidas de

condutância, resultante de produtos de reação catalítica) ou potenciométrico (mudanças são

observadas na diferença de potencial entre dois eletrodos em condições de corrente elétrica

constante) (NEVES, 2011).

O emprego industrial dos biossensores tende a crescer, em particular nas indústrias

químicas e demais setores correlatos, o que inclui a indústria farmacêutica e de alimentos

devido a um aumento na demanda de técnicas analíticas de baixo custo e resposta rápida para

serem utilizadas no monitoramento in situ (SILVA, 2011). Assim um vasto campo de

aplicação está em constante desenvolvimento e alguns eletrodos enzimáticos já se

apresentaram bem estabelecidos para análises de diagnósticos (MELO, 2008). Atualmente, é

possível adquirir biossensores comerciais em diferentes áreas (Figura 4), que são largamente

utilizados devido a sua praticidade e por serem métodos de grande reconhecimento em

análises por serem rápidos e precisos.

34

Figura 4 - Biossensores comerciais em diferentes áreas.

Fonte: Adaptado de Bahadir; Sezgintürk, 2015.

Em relação ao desenvolvimento de um biossensor cuja reação que ocorrerá entre o

biocomponente (lipase) e o analito (amostras de óleo) gerará uma variação de pH resultando

assim em uma variação de potencial, como visto na Figura 5, o tipo de biossensor mais

indicado é o potenciométrico.

Figura 5 - Reação que ocorre entre a lipase e o triglicerídeo no biossensor.

Fonte: Melo, 2008.

35

3.3.1 Biossensores potenciométricos

Baseados na determinação da diferença de potencial entre o eletrodo indicador e o de

referência (inerte) ou dois eletrodos de referência separados por uma membrana seletiva

permeável, em que não há fluxo de corrente significativa entre eles (THÉVENOT et al., 2001).

Os biossensores utilizam eletrodos íon-seletivos como meio de transdução da reação

biológica em um sinal elétrico. Esse sistema consiste de uma membrana com enzima

imobilizada em torno de uma sonda ligada a um medidor de pH, onde a reação catalisada gera

íons de hidrogênio. A reação que ocorre ao lado da fina membrana de vidro sensor provoca

uma mudança no pH, que podem ser lidos diretamente no visor medidor de pH (MELO,

2012).

Os eletrodos de íons seletivos apresentam como vantagens: rapidez, sensibilidade, baixo

custo e simplicidade na medição, onde somente a medição do pH é necessária, não um

sistema polarográfico como requer os sensores amperométricos. Em geral, a faixa analítica

destes sensores é de 10-1

a 10-5

mol e, como sua resposta é logarítmica, já que o potencial

elétrico desenvolvido pelo eletrodo é proporcional ao logaritmo da atividade do íon em

solução, a precisão da medida é constante por toda sua faixa dinâmica (THÉVENOT et al.,

2001). Na Figura 6 é possível observar as principais áreas de utilização de biossensores

potenciométricos, onde a análise de alimentos encontra-se em quarto lugar com 12% das

utilizações.

Figura 6 - Áreas de aplicação da análise potenciométrica.

Fonte: Modificado por Silva, 2011.

36

3.3.2 Utilização dos biossensores nas indústrias de alimentos

O controle de qualidade de alimentos necessita de métodos de análises rápidas e

dispositivos para testar diferentes parâmetros em campo. Biossensores vêm a atender a esses

requisitos e justificar o aumento do interesse em desenvolvê-los para este fim. Basicamente,

existem dois tipos de compostos que são analisados: compostos cuja concentração apresenta

interesse para a qualidade nutricional dos alimentos e contaminantes que não deveriam ser

encontrados em produtos alimentares.

Os principais tipos de biossensores eletroquímicos utilizados para análise de alimentos

são apresentados na Figura 7. Os biossensores enzimáticos representam a principal classe de

biossensores eletroquímicos utilizados para análise de alimentos. Dois princípios são

utilizados neste sentido: detecção do substrato pela sua conversão numa reação catalisada por

uma enzima com o consumo ou a formação de um composto eletroativo e detecção de

inibidores de enzimas. Os biossensores de afinidade são uma ampla classe de sensores, mas os

principais sensores eletroquímicos para análise de alimentos são à base de polímeros com

impressão molecular (ROTARIU et al., 2016).

Figura 7 - Tipos de biossensores utilizados na análise de alimentos.

Fonte: Adaptado de Rotariu et al., 2016.

37

Na Figura 8, encontram-se alguns segmentos de aplicação dos biossensores na área de

alimentos. O Quadro 8 mostra os biossensores encontrados recentemente na literatura com

utilização em alimentos e o Quadro 9 apresenta os biossensores rotineiramente usados na

indústria de alimentos, segundo Rumayor et al., 2005.

Figura 8 – Alguns segmentos de aplicação dos biossensores na área de alimentos.

Fonte: Adaptado de Rumayor et al., 2005.

38

Quadro 8 - Biossensores encontrados recentemente na literatura com utilização em alimentos.

Analito Biorreceptor Tipo de Transdutor Referência

Benzoatos

Tirosinase do extrato

do macro fungo

Agaricus bisporus

Eletroquímico SANTOS, 2016

Glutamato Glutamato

desidrogenase Amperométrico PRADO et al., 2015

Histamina Histamina

desidrogenase Amperométrico

HENAO-ESCOBAR

et al., 2016

Nitrito Nitrito redutase Amperométrico MONTEIRO et al.,

2015

Putrescina Putrescina oxidase Amperométrico HENAO-ESCOBAR

et al., 2016

Pesticidas

organofosforados Acetilcolinesterase Amperométrico YANG et al., 2014

Cervejas

envelhecidas Tirosinase Amperométrico

GHASEMI-

VARNAMKHASTI

et al., 2012

Bacillus cereus DNA Amperométrico IZADI et al., 2016

Frutose Frutose

desidrogenase Amperométrico

ANTIOCHIA;

VINCI; GORTON,

2013

Ureia Urease Potenciométrico RAMESH et al.,

2015

Aflatoxina B1 Acetilcolinesterase Potenciométrico STEPURSKA et al.,

2015

Açúcares Saccharomyces

cerevisiae Potenciométrico

VOITECHOVIC;

KIRSANOV;

LEGIN, 2016

E. coli Anticorpo

Ressonância

Plasmônica de

Superfície (SPR)

TORUN et al., 2012

39

Quadro 9 - Biossensores rotineiramente utilizados na indústria de alimentos.

Analito Biorreceptor Tipo de Transdutor

Aspartame Carboxil esterase e álcool

oxidase Amperométrico

Sorbitol Sorbitol desidrogenase e

NAD Amperométrico

Ácido Benzóico Tirosinase Amperométrico

Sulfitos Sulfito oxidase Amperométrico

Oxalato Oxalato oxidase Amperométrico

Glicoalcalóides Colinesterases Potenciométrico

Alérgeno da avelã Anticorpo SPR

Glúten Anticorpo Óptico

Aflatoxinas Anticorpos Biossensor fluorimétrico de

imunoafinidade

Enterotoxina B Anticorpos Fibra óptica

Vírus febre aftosa Anticorpo Piezoelétrico

Cryptosporidium Oligonucleotídeo Piezoelétrico

Amido α-amilase, amiloglucosidase

e glicose oxidase Amperométrico

Lactose β-galactosidase Amperométrico

L-lisina Lisina oxidase Amperométrico

Catecol Polifenol oxidase Amperométrico

Colesterol Colesterol oxidase e

peroxidase Amperométrico

Ácido fólico Anticorpo SPR

Polifenóis Tirosinase Amperométrico

Ácidos graxos de cadeia curta Lipase Eletroquímico

Histamina Amina oxidase Amperométrico

Hipoxantina Xantina oxidase Amperométrico

Fonte: Rumayor et al., 2005.

40

Logo, como pode ser visto no Quadro 8 e no Quadro 9 a maioria dos biossensores

utilizam enzimas como componente biológico e isso ocorre devido à sua alta especificidade.

3.3.3 Biossensores utilizados em óleos

Alguns biossensores que utilizam óleos como sua amostra de interesse já são

encontrados na literatura com propósitos distintos. O trabalho apresentado por Oujji et al.

(2013) mostra um biossensor amperométrico para a detecção de pesticidas organofosforados

utilizados nas oliveiras. O biossensor utiliza como biocomponente a acetilcolinesterase de

enguia elétrica e esta é imobilizada por encapsulação em matriz sol-gel em um eletrodo

impresso em tela. A atividade enzimática foi estimada por medição da tiocolina produzida

pela hidrólise enzimática do cloreto de acetiltiocolina utilizando ftalocianina de cobalto como

mediador. O dispositivo desenvolvido tem sido utilizado para realizar estudos de inibição com

três pesticidas: malation, metidatio e dimetoato (na sua forma oxidada) e testados utilizando

soluções padrão e amostras reais de azeite. Este biossensor mostrou uma boa

reprodutibilidade e estabilidade, limites de detecção razoáveis, alta sensibilidade e uma boa

vida útil quando armazenado a -18°C, sem a necessidade de um pré-tratamento laborioso.

Outro biossensor utilizado em óleos é o desenvolvido por Hammami; Kuliček; Raouafi

(2016), este é do tipo amperométrico à base de tirosinase e usa uma monocamada auto-

montada de x-mercaptopropil naftoquinona (matriz de quitosana) em eletrodo de ouro como

um mediador de elétrons. Este é avaliado a resposta crono-perimétrica do bioeletrodo

modificado com naftoquinona a adições sucessivas de fenol e exibe uma resposta

bioeletrocatalítica sensível a um potencial de trabalho de 0,35 V vs. Ag / AgCl (sat.KCl),

atingindo a corrente de estado estacionário dentro de 40 s após cada adição de solução de

fenol com um intervalo de 0-135 μM e um limite de detecção e quantificação que são de

0,019 μM e 0,0633 μM, respectivamente. Com isso, utilizado para determinar o teor de

polifenol em azeite virgem.

O biossensor desenvolvido por El-Moghazy et al. (2016) é do tipo amperométrico e

ultrassensível serigrafado para a detecção de fosmete em azeite, utilizando a

acetilcolinesterase geneticamente modificada imobilizada em nanocompósito de liga de água

de poli (álcool vinílico) PVA-AWP/Ni de Fe-Ni. A liga de Fe-Ni não só permitiu amplificar a

corrente de resposta, mas também reduzir o potencial aplicado de 80 mV para 30 mV vs

Ag/AgCl. Este biossensor se mostrou com desempenho analítico muito bom para a detecção

de fosmete, apresentando um limite de detecção de 0,1 nM, sendo este limite inferior às

41

concentrações admissíveis estabelecidas pelas regulamentações internacionais. A detecção de

fosfato foi entre as concentrações de 1x10-10

M e 5x10-9

M. Além da boa reprodutibilidade,

estabilidade operacional e de armazenamento, o biossensor desenvolvido foi utilizado com

sucesso na determinação de fosmete em amostras de azeite sem qualquer pré-tratamento

laborioso. A taxa de recuperação do fosfato foi de cerca de 96% após uma simples extração

líquido-líquido e os resultados obtidos estavam em concordância com os obtidos por análise

por HPLC.

Fernandez et al. (2009) apresenta em seu trabalho dois tipos de biossensores utilizados

para a análise de triglicerídeos. Um capacitor eletrolítico-isolador-semicondutor (EIS-CAP),

que é um dispositivo potenciométrico e um microcantilever de polissilício. O princípio de

detecção para ambos os sensores é baseado na hidrólise enzimática de triglicerídeos, embora

os mecanismos de detecção sejam diferentes: eletrônicos para o EIS-CAP e mecânicos para o

microcantilever. As características e desempenhos dos dois sensores são comparados

criticamente. O sensor EIS-CAP necessita da presença de um tampão para medições estáveis,

o que limita a sensibilidade do sensor a baixas concentrações do bioanalito a 1 mM. O sensor

cantilever funciona sem um tampão que aumenta a sensibilidade para 10 μM. Ambos os

sensores são encontrados para dar resultados reprodutíveis e confiáveis. Ambos os sensores

foram testados com várias concentrações de soluções de tributirina hidrolisada. Constatou-se

que a sensibilidade do EIS-CAP estava limitada a menos de 500 μM. Uma vez que um sensor

de microcantilever foi capaz de detectar níveis de tributirina tão baixos como 10 μM. A

capacidade de detecção micromolar de um sensor baseado em cantilever torna-o um candidato

adequado para um sistema de monitorização intracelular de triglicerídeos. Embora o

microcantilever mostrou maior sensibilidade, a caracterização do EIS-CAP foi mais fácil de

realizar e a sensibilidade deste pode ser melhorada com uma melhor escolha da solução

tampão. O desempenho do EIS-CAP com enzima imobilizada na superfície foi demonstrado

utilizando soluções de tributirina 5 mM. A enzima imobilizada na viga do sensor do cantilever

também foi usada para monitorar a cinética da reação de hidrólise. Verificou-se que a cinética

de reação prevista pelo EIS-CAP e o sensor de viga do cantilever estavam em concordância

entre si.

3.4 Enzimas

A denominação enzima vem do grego “énzymos” que significa “em leveduras” e foi

utilizada pela primeira vez por Kühne, em 1878. No entanto, foi a partir das primeiras décadas

42

do século XX, que houve a intensificação do desenvolvimento da tecnologia de enzimas. As

enzimas são catalisadores biológicos, de natureza principalmente proteica, que participam de

várias reações bioquímicas, tendo como papel fundamental o controle metabólico. Estas

moléculas aceleram reações termodinamicamente favoráveis, sendo extremamente versáteis,

estereoespecíficas, e de elevada importância nos processos biotecnológicos (COELHO;

SALGADO; RIBEIRO, 2008).

As enzimas, particularmente, apresentam várias vantagens, em especial uma feliz

combinação de seletividade com sensibilidade, além de permitirem a utilização de várias

tecnologias de transdução (SILVA, 2011).

As enzimas têm sido utilizadas nos últimos 20 anos para confecção de biossensores. Na

maioria dos casos, a enzima não interage diretamente com o eletrodo, mas a proximidade da

enzima permite que o eletrodo detecte um subproduto da reação enzimática. Diversos

biossensores foram preparados utilizando enzimas naturais, artificiais e sistemas de enzimas

isoladas a partir de células bacterianas e de tecidos de plantas ou animais (BOSCO, 2015).

No caso de triglicerídeos, as lipases são enzimas mais indicadas para ser utilizadas

como componente biológico, visto que catalisam a hidrólise de lipídios na interface água /

óleo. Muitos métodos têm sido relatados para seguir as reações de lipase tipicamente baseadas

na liberação de ácidos graxos livres (titulação de pH ou indicador baseado) (ANDERSEN;

BRASK, 2016).

3.4.1 Lipases

As lipases são enzimas classificadas como hidrolases (glicerol éster hidrolases, E.C.

3.1.1.3) e atuam sobre a ligação éster de vários compostos, sendo os acilgliceróis seus

substratos preferenciais ECQ, 1992). Estas enzimas são utilizadas para catalisar muitas

reações, como: a hidrólise total ou parcial de triacilgliceróis obtendo como produtos

diacilgliceróis, monoacilgliceróis, glicerol e ácidos graxos livres, além de reações de

esterificação, transesterificação e interesterificação de lipídios (Figura 9). A atividade de água

do meio que irá influenciar em que tipo de reação será catalisada (MESSIAS et al., 2011).

43

Figura 9 - Representação esquemática das reações catalisadas por lipases.

Fonte: Carvalho et al., 2003.

Pelas características discutidas, as lipase são aplicáveis em diversos setores industriais,

como na produção de surfactantes, na formulação de detergentes, na resolução de misturas

racêmicas, no tratamento de resíduos ricos em óleos e gorduras e na área da saúde, compondo

medicamentos, em diagnósticos, cosméticos ou antibióticos. Na indústria de alimentos,

apresentam aplicações na síntese de emulsificantes, na transformação de lipídios, na produção

de margarinas, no desenvolvimento de aromas, na maturação de queijos e embutidos cárneos,

entre outros. Recentemente, têm sido utilizadas na indústria da bioenergia, para a produção de

biodiesel. Algumas utilizações da lipase podem ser encontradas no Quadro 10 (COLLA;

REINEHR; COSTA, 2012).

44

Quadro 10 - Aplicações industriais das lipases.

Indústria Ação Produto ou Aplicação

Detergentes Hidrólise de gorduras Remoção de óleos

Derivados de

laticínios

Hidrólise de gorduras do

leite, maturação de queijos,

modificação de manteigas

Desenvolvimento de agentes

flavorizantes em leites, queijos e

manteiga

Panificação Melhora o flavor Prolongar a vida de prateleira

Bebidas Aromas Bebidas

Carnes e peixes Desenvolvimento de flavors Remoção de gordura, produtos

de carnes e peixes

Health foods Transesterificação Produção de alimentos com

apelo funcional

Gorduras e óleos Transesterificação, hidrólise

Manteiga de cacau, margarinas,

ácidos graxos, glicerol, mono e

diglicerídios

Química Enantiosseletividade,

síntese Construção de blocos quirais

Farmacêutica Transesterificação, hidrólise Lipídios específicos, digestivos

Cosméticos Síntese Emulsificantes, umidificantes

Papel Hidrólise Melhoria da qualidade de papel

Limpeza Hidrólise Remoção de gorduras

Couro Hidrólise Produtos de couro Fonte: Adaptado de Colla; Reinehr; Costa, 2012.

Para a caracterização de um biossensor deve-se utilizar o seu componente biológico na

forma imobilizada, portanto será necessário identificar o melhor meio de imobilização

enzimática.

As aplicações práticas das enzimas livres são limitadas, porque são instáveis,

provocando reações tóxicas e tendo uma vida curta na circulação sistêmica. Assim, a

imobilização enzimática aparece como um fator chave para desenvolver biossensores

eficientes com desempenhos apropriados, tais como boa estabilidade operacional e de

armazenamento, alta sensibilidade, alta seletividade, tempo de resposta curto e alta

reprodutibilidade (RAMESH et al., 2015).

3.4.2 Imobilização enzimática

Uma característica importante dos biossensores é a imobilização do componente

biológico utilizado, pois geralmente é nessa fase que o tempo de resposta, a estabilidade

enzimática e o tempo de vida do sensor são projetados. Os principais métodos utilizados para

a imobilização de enzimas são os métodos físicos (adsorção física, aprisionamento físico em

gel e aprisionamento em rede polimérica) e métodos químicos (ligação covalente e ligação

cruzada) (BOSCO, 2015), conforme mostrado na Figura 10.

45

Figura 10 - Principais métodos de imobilização de enzimas.

Fonte: Adaptado de Dalla-Vecchia; Nascimento; Soldi, 2004.

A encapsulação consiste na retenção física da enzima nas cavidades internas de uma

matriz sólida porosa constituída geralmente por polímeros entrecruzados como poliacrilamida,

gelatina, alginato, carragenana, resinas de poliuretano e silanos. Apresenta como principais

vantagens a grande área superficial para contato do substrato e da enzima no interior de um

volume relativamente pequeno, e a possibilidade de imobilização simultânea de diferentes

enzimas em uma única etapa (CANTONE et al., 2009). Como principais desvantagens, têm-

se: a restrição de que os biocatalisadores podem ser aplicados somente com substratos de

baixa massa molar; a possível inativação da enzima durante o procedimento de imobilização;

a alta concentração de enzima necessária para garantir a encapsulação e, os possíveis efeitos

de difusão de substratos e/ou produtos no interior da matriz porosa (MENDES; CASTRO;

GIORDANO, 2011).

A adsorção física é o método mais simples para imobilização de enzimas. Nesse caso, o

biocatalisador é estabilizado por interações fracas com o suporte como forças de van der

Waals (interações hidrofóbicas), pontes de hidrogênio e ligações iônicas. As principais

vantagens deste processo de imobilização são a facilidade e a simplicidade do processo e,

além disso, a estrutura conformacional da enzima é pouco alterada. A grande desvantagem é a

dessorção da enzima devido às variações de temperatura, pH e força iônica. Na imobilização

46

por adsorção iônica, a enzima se une ao suporte por meio de atrações eletrostáticas

estabelecidas entre as cargas opostas presentes, tanto na superfície do suporte, quanto da

enzima. Essa união é mais efetiva que a adsorção física, mas é inferior quando comparada

com outros métodos (CARDOSO; MORAES; CASS, 2009).

A imobilização por ligação covalente baseia-se na ativação de suportes com a inserção

de grupos reativos que reagem com os grupos nucleofílicos da enzima. Esta técnica não é

comum como o método de adsorção física, mas apresenta a vantagem de evitar o fenômeno de

dessorção (MELO, 2008). A seleção das condições para a imobilização por ligação covalente

é mais difícil que em outros métodos de ligação em suportes. Nesta técnica é comum utilizar

glutaraldeído como um agente de reticulação para ligação covalente da enzima porque são

solúveis em solventes aquosos e podem formar ligações covalentes estáveis inter e intra

subunidades. Também ajuda na manutenção da propriedade estrutural e funcional das enzimas

durante a imobilização e melhora a estabilidade do biocatalisador (RAMESH et al., 2015).

Este método pode também afetar a estrutura ativa da enzima, devido à alteração do centro

ativo. Suas principais vantagens são a maior resistência do biocatalisador quanto à variação de

pH, temperatura e influência de solventes orgânicos; os derivados preparados podem ser

empregados em diversas conformações de reatores, como fluxo contínuo, empacotado, tanque

agitado e leito fluidizado e, a carga de enzima permanece constante após a etapa de

imobilização (MATEO et al., 2007).

Como visto em Zehani et al. (2015) o biossensor utilizado para detectar pesticidas na

agricultura utiliza como biocomponente a enzima lipase imobilizada em nano partículas de

ouro. Para biossensores tendo como analito os triglicerídeos, como o trabalho desenvolvido,

Wu et al. (2014) preconiza que a imobilização da enzima é necessária para criar uma interface

entre a enzima e o eletrodo, nesta pesquisa o autor utiliza ouro nanoporoso para a

imobilização da lipase.

Outros trabalhos com propostas bem similares ao desenvolvido neste trabalho são os

apresentados por Reddy; Chadha; Bhattacharya (2001) e Reddy et al. (2003) que propôs um

novo método para estimar os triglicerídeos utilizando o silício poroso para imobilizar a lipase

provocando como reação a alteração no pH. Ambos os trabalhos utilizam a lipase pancreática

porcina como componente biológico, a tributirina como substrato e a imobilização feita por

adsorção.

47

CAPÍTULO 4. MATERIAIS E MÉTODOS

O presente capítulo tem como intuito descrever as metodologias e materiais utilizados

para o desenvolvimento do trabalho.

4.1 Componente biológico

Foi utilizada a enzima lipase de Candida rugosa Tipo VII da marca Sigma-Aldrich na

forma liofilizada com atividade a partir de 700U/mg de sólido.

Esta enzima foi solubilizada em tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,0 na proporção

de 1g de enzima liofilizada para 100 mL de tampão e utilizada como enzima livre e uma outra

solução nessa mesma proporção foi utilizada para a imobilização.

4.2 Substratos de interesse: óleos

4.2.1 Informações dos óleos utilizados

Para os experimentos foram utilizados diferentes tipos de óleos, adquiridos em mercado

local, o óleo de gergelim da marca Pazze, o óleo de canola da marca Purilev, o óleo de Palma

da marca Oldesa e o azeite de oliva da marca Quinta do Cais. Alguns diferenciais como

gorduras saturadas, monoinsaturadas e poliinsaturadas destes óleos podem ser observados a

seguir no Quadro 11.

Quadro 11 – Principais diferenças em sua composição entre os óleos de gergelim, canola,

palma e azeite de oliva.

Quantidade por porção de 13 mL (1 colher de sopa)

Óleos Gergelim Canola Palma Azeite de

Oliva

Gorduras Totais 14 g 12 g 10 g 12 g

Gorduras Saturadas 1,9 g 1,0 g 4,3 g 1,9 g

Linolênico (Ômega 3) - 1,0 g - -

Linoléico (Ômega 6) 6 g 3,7 g 0,9 g 0,8 g

Oléico (Ômega 9) 5 g 7,3 g 3,5 g 9,3 g

4.2.2 Degradação dos óleos

Os métodos descritos abaixo têm como intenção apenas de testar o biossensor em

condições de oxidação acelerada e não de representar os processos industriais ou domésticos.

48

A degradação do óleo foi feita de duas formas diferentes, inicialmente utilizando

equipamento Rancimat modelo 743 (marca Mettler), em modo automático1. Com isso, foi

feito o ensaio de estabilidade oxidativa, somente com o óleo de gergelim para estudo inicial, e

foi possível expor tal óleo a condições extremas de oxidação, combinando oxigenação e alta

temperatura. Para a execução do ensaio, foram realizadas análises em triplicatas, com as

seguintes condições de análise: ar como tipo de atmosfera; vazão de borbulhamento do ar de

10L/h; temperatura de 110ºC; massa de amostra de 3 ± 0,013g. Foram retiradas amostras ao

longo do tempo de experimento até a completa oxidação quando o aparelho desliga

automaticamente para verificar se o biossensor seria capaz de identificar os diferentes níveis

de degradação do óleo.

Posteriormente, utilizando os quatro óleos estudados (gergelim, canola, palma e oliva),

foi realizada a fritura da batata congelada na forma de palitos (marca McCain) adquirida em

comércio local, para as análises utilizando amostras reais de óleos comestíveis degradados.

Seis palitos de batata ainda congelados com área superficial de 26 cm2 foram colocados

diretamente em 200 mL de óleo pré-aquecido, a fritura durou em torno de 4,5 minutos em

temperatura média de 180 °C. Esta operação foi repetida cinco vezes com cada um dos óleos

e a cada fritura foram retiradas 35 mL de óleo sem reposição posterior dessa quantidade,

apresentando assim variação da razão superfície/volume a cada fritura (Quadro 12),

intensificando assim o processo de degradação do óleo. As cinco amostras de cada óleo (1 por

cada fritura realizada) foram analisadas com o biossensor enzimático desenvolvido e

determinado o índice de acidez.

Quadro 12- Diferença da razão superfície/volume em relação ao número de frituras.

Número da Fritura Superfície/Volume (cm2/mL)

1 0,78

2 0,94

3 1,2

4 1,6

5 2,6

1Atividade realizada em colaboração com o Laboratório de Análises de Biocombustíveis e Derivados de Petróleo

- LABIPETRO –do Instituto de Química/UFRJ.

49

4.3 Preparação da emulsão para a curva de calibração do biossensor

Para a elaboração da curva padrão do biossensor, foi necessária a preparação de

emulsões utilizando solução tampão fosfato de sódio (100 mM, pH 8,75), Tween 80% (v/v) –

como emulsificante – e os óleos mencionados na seção 4.2.1. A mistura foi homogeneizada

com um mixer (marca Kika® Werkeeurostar Power control-visc) por 5 minutos a 1500 rpm.

A concentração do óleo na emulsão variou de 10 a 50% (v/v). Para as análises realizadas

foram utilizadas 9,0 mL desta emulsão.

4.4 Biocomponente (lipase comercial)

4.4.1 Determinação da atividade lipásica

Para as análises de atividade enzimática, foi utilizado o método de titulação,segundo o

procedimento descrito por Soares et al. (1999), utilizando 9 mL de emulsão (descrita no item

4.3) e 1g de enzima imobilizada (lipase comercial de Candida rugosa tipo VII – marca

Sigma-Aldrich). O ensaio é realizando utilizando agitação magnética, a 37 °C durante 15

minutos. Após este tempo, a reação foi paralisada pela adição de 10 mL de uma mistura de

água, acetona e etanol (1:1:1, v/v/v), conforme esquema mostrado na Figura 11.

Figura 11 – Esquema da medida da atividade enzimática.

Fonte: Adaptado de Mauricio, 2013.

Este método consiste no princípio de que os ácidos graxos formados pela hidrólise dos

triacilgliceróis presentes na emulsão serão quantificados por meio da titulação utilizando

hidróxido de sódio na concentração de 0,05M e fenolftaleína como indicador. No branco, a

50

solução utilizada para paralisar a reação enzimática foi adicionada antes dos outros

componentes utilizados no método.

A atividade enzimática é dada por meio da Equação 1 e varia de acordo com as

concentrações das amostras. Além disso, é representada em unidade de atividade enzimática

(U). Definiu-se que 1U corresponde a quantidade de enzima que libera 1µmol de ácido graxo

livre por minuto nas condições da análise.

Equação 1

Onde,

Ativ: atividade da lipase (U)

Va: volume de hidróxido de sódio (NaOH) gasto para titular a amostra (mL)

Vb: volume de hidróxido de sódio (NaOH) gasto para titular o branco (mL)

M: molaridade do hidróxido de sódio (NaOH) utilizado na titulação (mol/L)

t: tempo de reação (min)

qenz: quantidade de enzima utilizada (mL)

4.4.2 Processo de imobilização da lipase

A imobilização utilizada consistiu na ligação covalente entre a lipase e o suporte vítreo

(pérolas de vidro aminopropil com tamanho de poro de 700 A°/ 80-120µm, marca Sigma-

Aldrich) mostrado na Figura 12. O suporte selecionado sofreu o processo de silanização com

3-amino-propiltrietoxissilano (APTS) e a ativação com glutaraldeído.

51

Figura 12 - Suporte vítreo utilizado.

Fonte: Melo, 2008.

A técnica utilizada para a imobilização foi a mesma empregada por Melo, 2008, a qual,

inicialmente, o suporte foi protonado utilizando solução de ácido nítrico 10 % (v/v) durante

30 minutos em temperatura ambiente (24±1°C) na proporção de 30mL de solução por grama

de suporte. Posteriormente, o suporte foi lavado com água ultrapura e em sequência com

soluções aquosas de acetona a 25%, 50%, 75% e 100% (v/v) sequencialmente, na proporção

de 10mL por grama de suporte. Finalmente, o suporte foi colocado na estufa, a 40°C, por 1

hora.

A silanização foi realizada com solução de 3- amino-propiltrietoxissilano (APTS) na

concentração de 0,5 % (v/v) a 75 °C por 3 horas, na proporção de 12 mL de solução por

grama de suporte. Após este tempo, o suporte foi lavado e secado novamente, como descrito

anteriormente, e submetido ao processo de ativação com solução de glutaraldeído a 2,5 %

(v/v) em solução tampão fosfato de sódio (100 mM, pH 7,0) por 60 minutos a 23 °C, na

proporção de 12,5 mL de solução por grama de suporte.

Com o suporte pré-ativado, foi adicionada a solução de lipase, utilizando lipase

comercial (1g) em 100 mL de solução tampão fosfato de potássio (50mM, pH 7,0), e

incubados a 20 °C por 24 horas. As reações que ocorrem durante o processo podem ser

observadas na Figura 13.

52

Figura 13 – Descrição química da reação no processo de imobilização.

Fonte: Melo, 2008.

Para a análise da eficácia de imobilização da enzima no suporte utiliza-se a Equação 2.

Equação 2

Onde,

% Imob: quantidade de enzima que se imobilizou no suporte (%)

Ativfinal: atividade final no sobrenadante – calculada pela Equação 1

Ativinicial: atividade inicial no sobrenadante – calculada pela Equação 1

4.5 Análises de degradação por procedimento de fritura

4.5.1 Biossensor enzimático

O biossensor desenvolvido relaciona a ação da enzima lipase sobre os óleos escolhidos.

Assim, utilizou-se a capacidade do eletrodo íon-seletivo de hidrogênio (transdutor) de captar a

mudança ocorrida na reação bioquímica esquematizada anteriormente na Figura 5, que

descreve a ação da lipase na presença de água e atua nos triglicerídeos gerando como produto

final glicerol e ácidos graxos livres.

Os ácidos graxos liberados após a reação têm a capacidade de mudar o pH da solução.

Assim, o transdutor selecionado tem a sensibilidade de detectar as mudanças que ocorrem e

53

produzirem uma diferença de potencial (mV). As mudanças de pH devem ser

logaritmicamente proporcionais à concentração dos ésteres presente na solução (MELO,

2012).

Assim, no presente trabalho, as medidas de variações de potencial (mV) foram

realizadas com auxílio de um pHmetro (marca Metrohm) e um eletrodo íon-seletivo de

hidrogênio na construção do biossensor enzimático (Figura 14). As condições de operação

empregadas foram emulsões variando a concentração do substrato de 10 a 50% (v/v), dos

óleos já mencionados a 37ºC, por 15 minutos com agitação controlada.

Figura 14 - Esquema da análise potenciométrica.

Fonte: Adaptado de Melo, 2012.

O sistema usado é mostrado na Figura 14, composto de: uma bomba peristáltica (1)

como elemento propulsor para o transporte das soluções padrão, amostras e solução de

limpeza – solução de Tween 0,5% (v/v) através do sistema de análise com vazão de 1,2L/h;

uma câmara reacional (2) com capacidade de 10mL, onde a lipase imobilizada foi

acondicionada e diretamente ligada ao eletrodo íon-seletivo de hidrogênio (3), imerso na

câmara por um orifício de diâmetro de 1,7cm; e o sistema de transdução (4), ligado ao

eletrodo íon seletivo, que apresenta o valor do sinal, em mV, referente às variações detectadas

pelo mesmo. O volume total do sistema foi de 15mL e foram usadas mangueiras de silicone

para conexão com diâmetro interno de 0,3mm e com 105cm de comprimento (MELO, 2012).

4.5.2 Índice de acidez

O índice de acidez é definido como o número de miligramas de hidróxido de potássio

necessário para neutralizar um grama de amostra (AOCS, 2009). O método avalia a acidez

titulável utilizando solução de álcali- padrão. Para a realização do método, as amostras devem

estar bem homogêneas e completamente líquidas.

54

Inicialmente, foram pesados 2,0 gramas da amostra de óleo em balança analítica (marca

Shimadzu - modelo AUY220) em frasco erlenmeyer de 125mL. Em seguida, foram

adicionados 25mL de solução de éter e álcool (2:1 v/v) neutra – titulada com solução de

NaOH 0,01M até o pH 7,0 – e adicionadas duas gotas do indicador fenolftaleína. Para a

titulação, foi utilizado hidróxido de sódio (0,01M) até o aparecimento da coloração rosa, a

qual deveria persistir por 30 segundos. Para o cálculo do índice de acidez, foi utilizada a

Equação 3. Ademais, para a utilização de uma unidade mais comumente aplicada na análise

de degradação de óleos comestíveis, foi feita a conversão de mgKOH/g utilizada no índice de

acidez para % ácidos graxos livres (% AGL) utilizando a equação de acidez em ácido oleico

(Equação 4).

Equação 3

Onde,

IA: índice de acidez do óleo analisado (mgKOH/g)

V : volume de hidróxido de sódio (NaOH) 0,01M utilizado na titulação da amostra (mL)

f: fator de conversão do hidróxido de sódio utilizado em relação ao de 0,1M

m: massa da amostra utilizada (g)

Equação 4

Onde,

%AGL: acidez em ácido oleico (% AGL)

IA: índice de acidez – calculado pela Equação 3 (mgKOH/g)

55

CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Enzima nas formas livre e imobilizada

Nesta etapa do trabalho foi feita uma comparação entre o comportamento das duas

formas de enzima (livre e imobilizada) em diferentes concentrações de óleo de gergelim. Na

Figura 15, observam-se duas curvas padrões utilizando a enzima livre e a enzima imobilizada.

É possível dizer que a enzima imobilizada apresenta uma menor atividade em relação a livre,

porém tem maior sensibilidade, de acordo com o coeficiente angular da equação, portanto

sendo mais adequada para identificar as variações decorrentes da degradação dos óleos.

Ambas as formas de enzima tiveram bons coeficientes de determinação 0,976 e 0,978 para as

enzimas livre e imobilizada, respectivamente, indicando que apresentam habilidade de estimar

corretamente os valores da variável de resposta y (variação de potencial).

Figura 15 - Comparação entre a especificidade e coeficiente de correlação da enzima nas formas livre e

imobilizada na elaboração da curva padrão.

A imobilização de enzimas pode produzir alterações na sua atividade observada,

especificidade ou seletividade. Embora em muitos casos um empobrecimento das

propriedades enzimáticas seja observado por imobilização (causada pela distorção da enzima

devido à interação com o suporte), em alguns casos tais propriedades podem ser melhoradas

por esta imobilização, podendo estar relacionadas com a estabilização de uma forma

hiperativada da enzima ou serão apenas uma consequência de modificações aleatórias nas

propriedades enzimáticas. As enzimas imobilizadas serão dispersas na superfície de suporte e

y = 6,6721ln(x) + 26,715

y = 10,623ln(x) - 7,3661

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60

ΔP

ote

nci

al

(mV

)

Concentração do Óleo de Gergelim (% v/v)

Enzima Livre Enzima Imobilizada

56

a agregação não será mais possível, enquanto a enzima livre pode sofrer agregação, o que

diminui muito a atividade enzimática. Além disso, a rigidez enzimática pode conduzir à

preservação das propriedades enzimáticas sob condições drásticas em que a enzima tende a

tornar-se distorcida, diminuindo assim a sua atividade (RODRIGUES et al., 2013).

5.2 Diferentes atividades da enzima imobilizada

Após identificar que a enzima imobilizada seria a melhor forma para utilização no

biossensor, foi feita a comparação das respostas obtidas utilizando enzimas imobilizadas com

diferentes atividades em concentração de óleo de 10% a 50% (v/v). Como pode ser observado

na Figura 16, tanto a enzima com atividade de 11,86 U/g quanto a com atividade de 50,91 U/g

apresentaram uma boa resposta de detecção, sendo capazes de identificar a degradação do

óleo. Além disso, em ambos os casos, as curvas geradas tiveram coeficientes de determinação

iguais a 0,994 e 0,978 para a enzima com atividade de 50,91U/g e 11,86U/g, respectivamente.

Ademais, pode-se observar que há uma maior sensibilidade do biossensor ao utilizar a enzima

com maior atividade, porém com a enzima de atividade menor ainda é possível detectar tal

sensibilidade, uma vez que as variáveis de reposta não se sobrepõem, sendo assim, também

podendo ser utilizada como uma boa curva padrão.

Sendo assim, uma baixa atividade da enzima não é um fator de impedimento para o

biossensor, desde que essa consiga estabelecer um coeficiente de correlação adequado (acima

de 0,90) entre o teor de óleo e a variação de potencial e seja possível identificar claramente a

diferença entre os teores de óleo e as distintas diferenças de potencial. Portanto, para uso do

biossensor com enzimas imobilizadas de diferentes atividades das testadas serão necessárias

novas curvas de calibração para correlacionar o teor de óleo com as variações de potencial,

adequadas de acordo com a atual atividade da enzima.

57

Figura 16 – Diferença de sensibilidade e coeficiente de correlação da curva padrão em relação a enzimas de

diferentes valores de atividade.

5.3 Reutilização do biocomponente

A reutilização da enzima imobilizada de Candida rugosa tipo VII na detecção foi

analisada, a fim de verificar se ao utilizar a enzima mais de uma vez no biossensor isso iria

ocasionar variações no resultado esperado, visando se seria possível reduzir o custo do

método. O teste foi realizado em triplicata e com duas concentrações de óleo 20% e 40% (v/v)

de óleo de gergelim. As concentrações foram escolhidas para representarem uma amostra

pouco concentrada e outra mais concentrada, além de não serem os limites da curva padrão do

instrumento. Entre uma utilização e outra, a enzima foi armazenada em geladeira em tampão

fosfato de potássio 50 mM pH 7,0 e feita a nova medição no dia seguinte. Todas as medições

foram feitas com a amostra de óleo novo, sendo assim não apresentando interferentes neste

aspecto.

Na Figura 17, é possível observar que, para cada concentração, foi possível utilizar a

mesma enzima 5 vezes. Os resultados obtidos até a quinta análise apresentaram desvios

padrões abaixo de 1,5mV e uma perda de resposta de 1,4% e 1,1% para as concentrações de

óleo de gergelim de 20% (v/v) e 40% (v/v), respectivamente. Sendo assim, a enzima

imobilizada de Candida rugosa tipo VII apresentou boa reprodutibilidade.

No entanto, a partir da sexta utilização, os resultados se mostraram bem distantes dos

encontrados com a curva padrão, com desvios-padrão acima de 4,0 mV e uma perda de

reposta em relação à primeira análise de 38,6% e 45,3% para as concentrações de óleo de

y = 10,623ln(x) - 7,3661

y = 13,702ln(x) - 5,1712

0

10

20

30

40

50

0 10 20 30 40 50 60

ΔP

ote

nci

al

(mV

)

Concentração do Óleo de Gergelim (% v/v)

Enzima Imobilizada 1 (Ativ = 11,86 U/g) Enzima Imobilizada 2 (Ativ = 50,91 U/g)

58

gergelim de 20% (v/v) e 40% (v/v), respectivamente. Com isso, os resultados para as duas

concentrações acabaram se sobrepondo não havendo mais uma detecção adequada do

biossensor em relação à quantidade de óleo presente nas amostras.

Figura 17 - Número de utilizações consecutivas feitas com a enzima imobilizada utilizando as emulsões de 20 e

40 % (v/v).

Em Silva (2011) observa-se que ao utilizar um tecido liofilizado extraído diretamente de

feijão, este não pode ser reutilizado no biossensor, mostrando assim que a enzima comercial

apresenta uma maior estabilidade, conseguindo ser reutilizada.

Segundo Braga et al. (2013) foi possível fazer o reuso de sua enzima por 5 vezes com

atividade até 50% da inicial e apenas 3 reusos consecutivos com o mesmo valor de atividade.

Como para apresentar a mesma variação de potencial mostrado na curva padrão, a enzima

precisa permanecer com a mesma atividade da que foi realizada a curva de calibração, pode-

se dizer mais uma vez que a lipase de Candida rugosa Tipo VII é estável, permanecendo com

a mesma atividade por mais tempo e também que apresentou o bom número de reutilizações

fazendo com que reduza o custo do biossensor. Além disso, o aumento do erro encontrado nas

utilizações 6 e 7, se dá devido à saturação da enzima, não respondendo mais de forma

adequada para ser utilizada no biossensor.

5.4 Repetibilidade do biossensor

Para testar se o biossensor seria estável, foi necessário fazer a análise de repetibilidade

dos seus resultados para poder observar a capacidade de reproduzir a mesma medição usando

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8

∆P

ote

nci

al

(mV

)

Nº de Utilizações Consecutivas da Enzima Imobilizada

20% de óleo (v/v) 40% de óleo (v/v)

59

as mesmas condições. O teste foi realizado em duas concentrações de óleo, 20% e 40% (v/v)

de óleo de gergelim, pelo mesmo motivo mencionado na sessão 5.3. Ademais o teste se deu

de forma ininterrupta, não havendo assim estocagem entre uma análise e outra. Na Figura 18,

observa-se que foi possível utilizar o biossensor 15 vezes com um desvio médio do valor

esperado (linhas contínuas) de 1,49% e 1,19% para as concentrações de 20% (v/v) e 40%

(v/v), respectivamente.

Na literatura há outros biossensores que também utilizam os óleos comestíveis como

fonte de análise. O biossensor para o azeite de oliva, utilizado por Oujji et al. (2013), foi

usado por 10 medições consecutivas e apresentou um desvio de 3%, já o utilizado por

Hammami; Kuliček; Raouafi (2016), também para o mesmo analito, apresentou uma

repetibilidade de 4 medições com desvio de 2,5%. Outro biossensor que utiliza o óleo é o

apresentado por Bogani et al. (2009), porém este para óleo de soja, apresentou repetibilidade

em 3 medições e com uma desvio médio de 11%. Consequentemente, é possível dizer que o

biossensor utilizado é um medidor eficaz, uma vez que, apresentou valores confiáveis e fiéis

ao estabelecido com a curva padrão.

Figura 18 – Número de utilizações sequencias do biossensor em emulsões contendo 20 e 40% (v/v) de óleo de

gergelim.

5.5 Estabilidade oxidativa do óleo de gergelim a 110°C com fluxo de ar

A análise de estabilidade oxidativa do óleo de gergelim foi feita como um ensaio

preliminar para avaliar a degradação do óleo de gergelim em condições severas e, portanto, o

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

ΔP

ote

nci

al

(mV

)

Número de Utilizações Sequenciais

20% óleo de gergelim (v/v) 40% óleo de gergelim (v/v)

60

comportamento do biossensor para a detecção da mesma. Segundo Velasco; Dobarganes

(2002) com o aumento de ácidos graxos livres decorrentes da degradação do óleo há a

diminuição da estabilidade do óleo, além disso, os ácidos graxos apresentam capacidade de

catalisar tanto a oxidação quanto a hidrólise dos triglicerídeos. Na Figura 19, é possível

observar que com o passar do tempo a variação de potencial vai decrescendo mostrando,

portanto, que há uma redução do substrato para a enzima agir, consequentemente, resultando

em uma menor variação de potencial gerada no biossensor. Além disso, apresenta um perfil

linear entre o tempo de degradação e a variação de potencial mostrando um coeficiente de

determinação igual 0,986 e desvio padrão médio de 0,8mV.

No entanto, apesar de obter a variação de potencial para cada amostra degradada ou

parcialmente degradada retirada do equipamento Rancimat, não foi possível calcular a

porcentagem de óleo intacto presente nas mesmas. Isso devido à baixa quantidade de amostra

que é possível colocar no equipamento e após a degradação ficou com percentual de óleo

abaixo do limite inferior de detecção da curva padrão. Sendo necessária a extrapolação da

curva o que não garante a obtenção de valores confiáveis para a análise.

Figura 19 - Variação de potencial em relação ao tempo de permanência do óleo de gergelim sob oxidação à

110 °C com fluxo de ar.

Além disso, ao utilizar a análise de índice de acidez medido nas amostras degradadas

que foram ou não passadas pelo biossensor, há uma diferença entre os valores encontrados.

Isso ocorre, pois quanto menor o tempo de exposição do óleo de gergelim às condições do

teste maior é a concentração de triglicerídeos presentes podendo assim a enzima do biossensor

atuar sobre eles aumentando a acidez do óleo, mostrando assim que os métodos não foram

y = -2,2723x + 17,149

0,0

4,0

8,0

12,0

16,0

20,0

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0

∆P

ote

nci

al

(mV

)

Tempo de Oxidação a 110°C com Fluxo de Ar (h)

61

coincidentes e comprovando que ainda é possível ter triglicerídeos mesmo depois de um

processo intenso. Nota-se que à medida que o tempo no equipamento Rancimat se aproxima

da degradação completa do óleo de gergelim a diferença foi diminuindo, mostrando que a

quantidade de óleo degradado aumentou e, consequentemente, o óleo intacto necessário como

substrato para a enzima atuar foi diminuindo (Tabela 1). Isso ocorre, pois o tempo de

aquecimento do óleo influencia na quantidade de compostos de degradação formados durante

o tratamento (CORSINI; JORGE, 2006).

Tabela 1 - Comparação entre os índices de acidez das amostras antes e após passarem pelo

biossensor.

Tempo de Oxidação a

110°C com Fluxo de Ar

(h)

Índice de Acidez (%AGL)

Antes do biossensor Após o biossensor Variação

0,0 0,184 0,374 0,191

0,5 0,381 0,550 0,169

1,5 0,571 0,702 0,131

3,0 0,736 0,800 0,064

5,45 0,918 0,980 0,062

5.6 Análises com amostras residuais de fritura de batata

Foi observado a aplicação do biossensor em uma amostra real fazendo a detecção da

degradação da amostra ao longo da sua utilização após fritura.

5.6.1 Elaboração da curva padrão

Para a utilização do biossensor é necessário previamente fazer as curvas de calibração

para o óleo de análise, a fim de poder fazer a quantificação exata da concentração de óleo

presente nas amostras. O estudo com os óleos de gergelim, canola, palma e o azeite de oliva

não extra virgem teve o intuito de mostrar o funcionamento do biossensor em diferentes tipos

de substratos como o óleo bruto, óleo refinado, óleo bruto com alta pigmentação e óleo misto

utilizado na culinária, respectivamente.

Na Tabela 2 e na Figura 20 é possível observar as curvas padrões obtidas utilizando o

biossensor, assim com os respectivos coeficientes de correlação e os desvios padrões obtidos,

que serão utilizadas para as análises com os óleos de gergelim, canola, palma e azeite de oliva

provenientes do tratamento térmico (fritura das batatas), nestas é possível identificar o perfil

62

logarítmico esperado devido a liberação do íon H+

(MELO, 2012). Tais resultados mostram

um bom ajuste dos pontos encontrados e também uma baixa dispersão dos dados.

Tabela 2 - Curvas padrões dos óleos que serão utilizadas para a análise das amostras

degradadas por fritura (x= % óleo (v/v) e y= variação do potencial).

Óleos Equação da curva

padrão

Coeficiente de

determinação

Desvio padrão

médio (%)

Gergelim y = 12,26ln(x) - 6,588 0,963 1,6

Canola y = 10,19ln(x) - 4,555 0,984 2,7

Palma y = 9,354ln(x) - 0,895 0,990 3,0

Azeite de Oliva y = 8,412ln(x) + 6,376 0,978 1,8

Figura 20 - Gráfico das curvas padrões dos óleos que serão utilizadas para a análise das amostras

degradadas por tratamento térmico (fritura).

O perfil logarítmico encontrado para os óleos estudados quando se trata da variação da

concentração de substrato em relação a variação de potencial encontrado com o bissensor

também foi encontrado por Fernandez et al. (2009) para o aumento da concentração de

tributirina que é um triglicerídeo.

As curvas de calibração encontradas com o biossensor se diferem devido as diferentes

matrizes (composição de ácidos graxos) dos óleos utilizados (VELASCO; DOBARGANES,

2002; LI et al., 2013).

0

10

20

30

40

50

0 10 20 30 40 50 60

∆P

ote

nci

al

(mV

)

% óleo (v/v)

gergelim canola palma oliva

63

5.6.2 Variação de potencial em relação ao número de frituras

Uma vez que já foi visto que o tempo de exposição do óleo à alta temperatura leva a sua

degradação, deve-se levar em consideração também o número de frituras realizadas com o

mesmo óleo. Este fator é de grande importância uma vez que as frituras descontínuas são

muito mais destrutivas para os óleos que o sistema de aquecimento contínuo. Isto se dá, pois

em elevada temperatura, as reações oxidativas ocorrem fundamentalmente na superfície de

contato com o ar; enquanto que durante o resfriamento, ao diminuir a velocidade das mesmas

e aumentar a solubilidade do ar, favorece a entrada deste na massa, produzindo maiores

quantidades de compostos, como os hidroperóxidos e radicais livres durante o posterior

aquecimento (CORSINI; JORGE, 2006).

A partir da Tabela 3 e da Figura 21 é possível identificar o decaimento da variação de

potencial (mV) em relação ao aumento do número de frituras com determinado óleo. Isso

ocorre, pois o tratamento térmico destrói as ligações duplas dos ácidos graxos presente no

óleo e com isso diminui o substrato para a enzima, uma vez que esta atua nas mesmas, como

visto na seção 3.4.1. Além disso, vemos que as correlações entre os dados se dão de forma

linear, coeficientes de determinação acima de 0,97 e os desvios padrões médios abaixo 2,3%

para os óleos de gergelim, canola, palma e azeite de oliva.

Tabela 3 - Resultados dos óleos degradados obtidos da leitura do biossensor após cinco

frituras com cada óleo (x= número de frituras e y=variação de potencial).

Óleo Curva de

degradação

Coeficiente de

determinação

Desvio padrão

médio (%)

Gergelim y = -3,257x + 43,31 0,970 2,1

Canola y = -3,314x + 36,28 0,980 2,3

Palma y = -2,728x + 35,90 0,993 2,1

Azeite de oliva y = -1,314x + 40,28 0,975 1,3

64

Figura 21 - Gráfico com os resultados dos óleos degradados obtidos da leitura do biossensor após cinco

frituras com cada óleo.

As curvas encontradas se diferem para cada tipo de óleo uma vez que estes geram

compostos diferentes no decorrer da degradação, pois dependem da composição inicial de

cada ácido graxo presente nas amostras, uma vez que os óleos de gergelim e canola são ricos

em ácidos graxos insaturados e os óleos de palma apresentam porcentagens consideráveis de

ácidos graxos saturados que são menos suscetíveis a degradação que os mencionados

anteriormente (VELASCO; DOBARGANES, 2002; ANTONIASSI et al., 2013; LI et al.,

2013).

5.6.3 Concentração de óleo intacto nas amostras após passarem por fritura

Uma vez tendo as variações de potencial a cada tratamento térmico, é possível, por meio

de cada curva padrão (Seção 5.6.1), identificar a porcentagem de óleo que não sofreu

degradação ao final de cada uma das cinco frituras realizadas com cada óleo, como pode ser

observado na Tabela 4 e na Figura 22. Nesta tabela pode-se observar as equações das curvas

geradas da concentração de óleo intacto em relação ao número de frituras, e nestas equações é

visto que o comportamento linear decrescente se repete para os quatro óleos analisados,

mostrando que quanto maior o número de frituras menor é a concentração de óleo apto para o

consumo. Além disso, pode-se dizer que tais resultados obtiveram excelentes coeficientes de

determinação acima de 0,98 com desvios padrões médios abaixo de 6,5%, mostrando assim

que os dados são coerentes e com baixa dispersão dos resultados para os óleos de gergelim,

canola, palma e azeite de oliva.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 1 2 3 4 5 6

∆P

ote

nci

al

(mV

)

Número de Frituras


65

Tabela 4 - Curvas geradas a partir da concentração de óleo dentro das especificações durante a

fritura (x=número de frituras e y=concentração de triglicerídeos (%v/v)).

Óleo Curva de

concentração de óleo

Coeficiente de

determinação

Desvio padrão

médio (%)

Gergelim y = -8,100x + 53,53 0,983 5,8

Canola y = -8,254x + 48,89 0,982 4,6

Palma y = -7,624x + 46,90 0,971 6,3

Azeite de oliva y = -6,069x + 54,73 0,967 5,6

Figura 22 - Gráfico das curvas geradas a partir da concentração de óleo dentro das especificações durante o

tratamento térmico.

5.6.4 Porcentagem de ácidos graxos livres

Para averiguar se os resultados obtidos estavam de acordo com o esperado, foi utilizado

o método de índice de acidez que é o tradicionalmente utilizado atualmente. O índice de

acidez foi expresso em porcentagem de ácidos graxos livres (%AGL) e conforme a Tabela 5 e

a Figura 23 é possível dizer que quanto maior a concentração de tri, di ou monoglicerídeos no

processo de fritura menor é a quantidade de ácidos graxos livres. Sendo assim, o óleo está

menos degradado uma vez que se encontra com menos radicais livres e outros compostos

indesejáveis que são produzidos durante o tratamento térmico, como mencionado na seção 3.1.

Ademais, o ajuste dos resultados se manteve de forma linear, com coeficientes de

determinação acima de 0,90 e desvios padrões médios abaixo de 2,5% para os óleos de

gergelim, canola, palma e azeite de oliva.

0

20

40

60

0 1 2 3 4 5 6

[tri

gli

cerí

deo

s] %

(v/v

)

Número de Frituras


66

Tabela 5 - Correlação entre a concentração de óleo intacto e o índice de acidez no decorrer da

fritura (x=variação de potencial (mV) e y=%AGL).

Óleo %AGL %AGL

(0 fritura)

%AGL

(5ª fritura)

∆

%AGL

Coef.

Det.

(R2)

Desvio

padrão

médio

(%)

Gergelim y = -0,036x + 2,234 0,64 1,26 0,62 0,977 1,9

Canola y = -0,017x + 1,106 0,47 0,76 0,29 0,962 2,1

Palma y = -0,067x + 5,180 2,63 3,67 1,04 0,903 1,5

Azeite de Oliva y = -0,039x + 2,071 0,48 0,73 0,25 0,988 1,9

Figura 23 - Gráficos da correlação entre a variação de potencial (biossensor) e o índice de acidez no decorrer da

fritura (A – óleo de gergelim; B – óleo de canola; C – óleo de palma; D – azeite de oliva).

De acordo com o Quadro 6 – Limites superiores de índice de acidez expressos em

porcentagem de ácidos graxos livres de acordo com a RDC nº 270/2005., observa-se que para

diferentes tipos de óleos, a Anvisa estipula uma valor máximo de índice de acidez, sendo estes

2,01%AGL, 0,300%AGL, 5,03%AGL e 1,00%AGL para os óleos de gergelim, canola, palma

e azeite de oliva, respectivamente. Essa diferença de valores ocorre devido aos diferentes

tipos de processamento dos óleos e de suas respectivas composições.

Conforme a Tabela 5, observa-se que houve aumento dos ácidos graxos livres em

relação ao óleo sem passar pela fritura em todos os óleos testados. Além do mais, é possível

67

observar diferentes variações entre as porcentagens de ácidos livres. O azeite de oliva foi o

que apresentou menor degradação, isso ocorre, pois é rico em ácido graxo monoinsaturado

(oleico) e possui baixos teores de ácidos graxos saturados (palmítico, por exemplo) e poli-

insaturados (linoleico, por exemplo) e quantidades muito pequenas de ácido linolênico e

nenhuma gordura trans. Ademais, apresenta antioxidantes naturais (VELASCO;

DOBARGANES, 2002).

Em segundo lugar com a menor degradação ficou o óleo de canola seguido do de

gergelim, apesar de apresentarem os ácidos graxos oleico e linoleico como os principais em

sua composição, ocorre tal diferença devido as porcentagem presentes nestes. O óleo de

canola apresenta maior quantidade de ácido oleico que é monoinsaturado e menos suscetível a

degradação, enquanto que o óleo de gergelim apresenta praticamente porcentagens iguais de

ácidos oleico e linoleico, fazendo assim com que este tenha menor teor de ácido

monoinsaturado e aumentando o poli-insaturado e com isso aumentando seu grau de

degradação (LI et al., 2013). Vale a pena ressaltar que o teor de degradação do óleo de

gergelim não se eleva tanto devido a presença natural de lignanas em sua composição que são

excelentes antioxidantes (ANTONIASSI et al., 2013).

Por fim, o óleo de palma sofreu maior degradação, tal fato não ocorreria devido a sua

composição de ácidos graxos, uma vez que este óleo tem aproximadamente 44% de ácidos

graxos saturados e 50% de ácidos graxos insaturados, sendo a sua maior parte monoinsaturada

(cerca de 40%), portanto sendo um óleo de boa estabilidade (SOARES et al., 2016). Porém,

por se tratar de um óleo bruto pode haver algum fator que tenha acelerado tal degradação

como a presença de metais oriundos do solo, fertilizantes, equipamentos durante o processo

ou até mesmo dos containers de estocagem. Igualmente, apresenta pigmentos carotenóides

que são sensíveis a luz e, portanto, geram uma foto-sensibilização do óleo (VELASCO;

DOBARGANES, 2002).

Outro ponto importante a ressaltar é o coeficiente de determinação entre os dois

métodos estudados, variação de potencial (biossensor) e o índice de acidez, que ficou acima

de 0,9, mostrando assim que os dois métodos se correlacionaram bem e seria possível a

utilização do biossensor para predizer a quantidade de ácidos graxos livres presentes no óleo.

68

5.7 Reutilização do suporte para a imobilização enzimática

Um fator bastante desejável na confecção de um biossensor, por poder reduzir o custo

do mesmo, é a reutilização do suporte de imobilização, uma vez que o consumidor poderia

estar devolvendo o suporte sem atividade enzimática e adquirir novamente com a enzima por

um preço mais baixo, como se fosse um refil. Isto ocorre devido a possibilidade de fazer a

limpeza do suporte e realizar a imobilização da enzima novamente. Logo, ao longo do

trabalho foi realizada a análise de percentual de imobilização no suporte para ver se este ainda

estava apto para poder ser utilizado.

Como mostra a Figura 24, foram feitas 11 utilizações do mesmo suporte para

imobilização da enzima utilizada nos experimentos. Com base nos percentuais de

imobilização calculados utilizando a Equação 2, houve desvio inferior a 1,80% entre os

percentuais de imobilização e, no geral, houve um percentual médio de imobilização de 89,18

± 0,93%. Na reutilização da matriz de imobilização feita por Li et al. (2015) foram feitos 5

reusos apresentando a mesma eficiência que o primeiro. Por conseguinte, apesar da eficiência

não ter permanecido exatamente a mesma, esta permaneceu acima de 80% que é considerado

um bom percentual de imobilização e podendo ser reutilizada por mais ciclos que o

encontrado na literatura.

Figura 24 - Número de imobilizações reutilizando o suporte.

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

% d

e Im

ob

iliz

açã

o

Número de Imobilizações

69

CAPÍTULO 6. CONCLUSÃO

Ao longo dos testes foi possível concluir que o biossensor desenvolvido se mostrou com

potencial para ser utilizado na detecção da degradação de óleos comestíveis, independente da

forma de processamento ou composição de ácidos graxos apresentados. Em primeira instância

foi possível concluir que a melhor forma de utilização do componente biológico é a enzima

em sua forma imobilizada, pois houve o aumento da sensibilidade do biossensor. E devido a

possibilidade de se reutilizar tanto a enzima imobilizada quanto o suporte para a imobilização,

estes fatores levam a diminuição considerável dos custos do biossensor, uma vez que estes são

os componentes mais caros do método.

Ao utilizar o método de oxidação a 110°C com fluxo de ar e o biossensor, ambos os

métodos foram capazes de mostrar respostas coerentes quanto à diminuição de variação de

potencial – apresentando um coeficiente de determinação de 0,986 e um desvio padrão médio

de 0,8mV – e também o aumento da porcentagem de ácidos graxos livres com o aumento do

tempo no equipamento de degradação, resultando assim em uma diferença de índice de acidez

menor ao comparar tais índices antes e após passar pelo biossensor. Portanto, o biossensor

acompanha a degradação do óleo.

Para as análises com os óleos estudados (gergelim, canola, palma e azeite de oliva) foi

possível construir curvas padrões adequadas com altos coeficientes de determinação (acima

de 0,960) com perfil logaritmo, mostrando que é um método versátil.

Além disso, ao observar a variação de potencial nas amostras reais retiradas do processo

de fritura, foi possível constatar que as curvas geradas estavam de acordo com o método

preliminar utilizado (Rancimat). O comportamento dos óleos estudados se manteve de forma

similar, isto é, com o aumento no número de frituras, houve a diminuição das variações de

potencial. E com relação aos dados obtidos foi possível ver os altos coeficientes de

determinação (acima de 0,970) e baixos desvios padrões (abaixo de 2,5 %).

Outro fator importante na utilização do biossensor é que com o mesmo pode-se avaliar a

porcentagem de óleo degradado com o tratamento térmico, portanto sendo possível expor até

que ponto o óleo poderia ser reutilizado ou não.

Por ser um método recente e não apresentar valores estabelecidos que digam quando o

óleo ainda pode ser reutilizado, o biossensor pôde ter seus dados comparados com o método

70

de índice de acidez e, portanto, ter uma correlação imediata com os valores preditos pela

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) e ser avaliado como apto ou não para a

utilização. Nas curvas de correlação entre os dois métodos, observou-se coeficientes de

determinação acima de 0,9 e desvio padrão médios abaixo de 2,5%, mostrando assim que os

dados estão bem correlacionados e apresentam baixa dispersão entre os resultados obtidos

para cada ponto. Ademais, A oxidação degrada mais o óleo que a hidrólise e os ácidos graxos

livres indicam o potencial de formação de peróxidos (compostos tóxicos) de um óleo que será

comercializado com vida de prateleira alta.

Do mesmo modo, ao realizar a análise de repetibilidade do biossensor foi possível

utilizá-lo 15 vezes com um desvio médio abaixo de 0,12mV para as concentrações testadas.

Por último, ao longo dos experimentos foi possível identificar que o suporte pôde ser

reutilizado para os processos de imobilização 11 vezes e ainda manter um percentual de

imobilização de 89,18 ± 0,93%. Logo, podendo comprovar que o custo seria bastante

reduzido com esse aspecto.

Com isso, é possível concluir que o biossensor desenvolvido e aplicado nos

experimentos descritos ao longo do trabalho é promissor e eficaz pela diminuição de custos

devido à reutilização da enzima e do suporte de imobilização, reprodutibilidade e

repetitividade, sensibilidade em detectar a degradação de diferentes óleos independente dos

tipos de tratamento – Rancimat ou fritura – e composição de ácidos graxos. Portanto, é

possível dizer que o biossensor utilizado é um medidor eficaz uma vez que apresenta valores

confiáveis e fiéis ao estabelecido pela curva padrão.

71

CAPÍTULO 7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Como sugestões para trabalhos futuros, têm-se:

o Fazer testes, usando o biossensor desenvolvido, com outros óleos para garantir a

utilização com diferentes substratos;

o Fazer uma análise financeira do instrumento desenvolvido;

o Estudar possível miniaturização do biossensor para se tornar portátil;

o Testar outros métodos de imobilização para ver como o biossensor se comporta;

o Fazer uma validação do método com maior robustez, como Teste F e Anova; e

o Fazer o monitoramento de peróxidos, por meio do método número 3 (método

padrão baseado em minicolunas) encontrado em

http://lipidlibrary.aocs.org/content.cfm?ItemNumber=39200;

o Relacionar índice de peróxido com a porcentagem de ácidos graxos.

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