microRNAs E CÂNCER

Genética Humana Molecular

Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

CLASSES DE RNA

RNA codificador

Codifica proteínas:

mRNA (3%)

RNA funcionais

Não traduzidos:

tRNA (15%)

rRNA (70%)

RNA não codificadores

(ncRNA)

snRNA(small nuclear): processamento de RNA transcritos (spliceossomo)

snoRNA (small nucleolar): modificação do rRNA

miRNA (micro): regulação da expressão gênica

siRNA(small interfering): defesa do genoma contra vírus e transposons

RNA pequenos

lncRNA: 200 nt ~100 kb, expressão tecido-especifica, regulação alterada em várias doenças e câncer

Gibb et al. Molecular Cancer 2011, 10:38

ncRNA longos

lncRNA: conteúdo no genoma humano varia de ~7000 - 23,000

•Função: imprinting e inativação do X

•Representa um enorme componente da rede celular normal que pode ser alterada na biologia do câncer.

SILENCIAMENTO GÊNICO

Compreende um grupo de vias relacionadas mecanisticamente que produzem moléculas de ncRNA pequenas, as quais modulam a expressão protéica via degradação do mRNA ou repressão da tradução.

RNA de interferência

iRNA

mecanismo exercido por moléculas de RNA complementares a mRNA, o qual inibe a expressão gênica na fase de tradução ou dificulta a transcrição de genes específicos

miRNA (microRNA) siRNA (small

interfering RNA)

microRNA - Histórico

•Ambros et al (1993): descobriram o gene lin-4 (small non-protein-coding RNA) regulação do desenvolvimento larval de Caenorhabditis elegans

•Identificação de 2.588 microRNAs (miRNAs) maduros em humanos 20-22 nucleotídeos não codificadores de proteínas

•Reguladores negativos da expressão gênica

•Regulam >60% de RNAm: função em processos como desenvolvimento, diferenciação, proliferação celular, apoptose e resposta a estresse

•Presentes em: C. elegans, D. melanogaster, plantas e mamíferos (humanos)

•miRNA: implicados em vários cânceres humanos tanto perda como ganho de miRNA contribuem para o desenvolvimento do câncer

Andrew Fire e Craig C. Mello (2006): Prêmio Nobel em Fisiologia ou Medicina sobre RNA interference em C. elegans, publicado em 1998.

O que são microRNAs?

•Pequenos RNAs endógenos fita simples não codificadores de proteínas, com tamanho de ~ 19-25 nucleotídeos.

•Potentes reguladores pós-transcricionais.

•Função:

-proliferação

-diferenciação

-apoptose

-carcinogênese: duplo papel (oncogênese e supressor tumoral)

miRNA x siRNA

miRNA

•Derivam de loci genômico distintos, agrupados em cluster: (introns, exons, regiões intergênicas)

•Processados a partir de RNAs em grampos: precursor forma alças dupla hélice c/hairpin; forma madura: linear (fita sem alças)

•Apenas a fita madura 3’ incorporada ao RISC, a outra 5’ degradada (?)

•Permanece intacto após cisão do mRNA alvo (pode se ligar em outras regiões)

•Conservado entre os organismos

siRNA

•Derivam de mRNA de transposons, vírus ou DNA heterocromático

•Processados a partir de grandes duplexes

•Ambas cadeias são aproveitadas no RISC

•Raramente conservados

•siRNA endógenos especificam autosilenciamento (silenciamento do mesmo locus) que o originou

Não se distinguem pela sua composição química ou mecanismo de ação, diferenciam pela origem e alvos.

Comparação entre miRNA x siRNA

http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n101007/100705.pdf

NOMENCLATURA dos miRNAmiRBase (Griffitis-Jones et al., 2006)

•Os genes que codificam os miRNA são denominados com o prefixo de três letras maiúsculas, hifenização (-) e itálico, seguida de um único número de identificação

Ex: MIR -156 no Arabidopsis e mir-1 na Drosophila.

Humanos: hsa-mir-605

•Os precursores miRNA (pré-miRNA) também recebem a designação mir (letras minúsculas, sem itálico)

• As formas maduras dos miRNA são designadas miR (sem itálico)

Ex: miR-1, miR-89, miR-278

•miRNA originados de cópias parálogas, com sequencias maduras idênticas, acrescenta-se um hífem e um número

Ex.: miR-7-1, miR-7-2 e miR-7-3 (localizados nos cromossomos 9, 15 e 19)

•miRNA maduros cuja sequência difere em uma ou em duas posições (homólogos) são designados com sufixos com letras pequenas

Ex: miR-1a e miR-1b

Biogênese do microRNA

Gene miRNA (localizado em introns, região intergênica, exons)

miRNA: gerado pela transcrição de um longo precursor (pri-miRNA) pela RNA pol II processado

para produzir um segundo precursor

(pre-miRNA)

60-100 nt.

Transportado (Exportina 5) citoplasma processado RNase III(Dicer) remoção hairpin

miRNA duplex (~22nt) complexo RISC fita simples linear

Ligação 3’UTR RNAm inibição tradução

Cell. Mol. Life Sci. (2011) 68:2859–2871

Beezhold et al. Molecular Cancer 2010, 9:134

Apenas uma fita madura (guia 3’) é incorporada ao RISC, outra (passenger 5’) degradada. (?)

Sequência seed: região de 2-8nt do final 5’ do miRNA, importante p/ reconhecimento e silenciamento do mRNA

PRODUÇÃO E PROCESSAMENTO DO miRNA

Ambas as fitas podem se ligar ao RISC, usa-se os sufixos -5p ou -3phas-miR-133a-5phas-miR-133a-3p

http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

ANIMAÇÃO miRNA - NATURE

http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html

BIOGENÊSE DOS miRNA e siRNAverde: cadeia passengerazul: cadeia guiaPreto: seq. clivada

a)pri-miRNA forma hairpin reconhecido DGCR8 (double-stranded RNA-binding protein) e clivagem 11pb distante pela Drosha

b-c)pre-miRNA e siRNA são clivados pela Dicer formando miRNA duplex

d)complexo Dicer-dsRBP retem o produto maduro levado p/ Ago (efetor de RISC-RNA-induced silencing complexes)

e) após ligação ao duplex a cadeia passenger (verde) é removida e a guia (azul) permanece ligada a Ago

f-g) RISC ativado dirige-se p/o mRNA alvo

Current Opinion in Structural Biology 2010, 20:90–97

miRNA x siRNA

REGULAÇÃO POR miRNA

•1 miRNA pode regular ~200 mRNA (múltiplos alvos)

•1/3 dos genes estão sob controle dos miRNA. Ex.: genes de fatores de transcrição

•Genes de miRNA: banco de dados www.sanger.ac.uk/

> 2.588 miRNA em humanos

•70% dos genes de miRNA localizados em introns e exons

•30% localizados em regiões intergênicas

Mecanismos de Regulação pelos miRNA

Três processos:

1- clivagem endonucleolítica: requer complementaridade perfeita ou quase perfeita ao mRNA (observado em plantas, raro em mamíferos, devido interação incompleta entre miRNA-mRNA)

2- degradação do mRNA por deadenilação: repressão da tradução da proteína;

3- inibição do início da tradução (característico de animais)

MECANISMOS DE SILENCIAMENTO GÊNICO

PTGS (Postranscriptional gene silencing)

•Atua em nível do mRNA através do mecanismo dependente de Argonauta-2 (Ago-2)

•Referido como RNA de interferência (RNAi)

•siRNA atua para recrutar Ago-2 para o mRNA alvo pela complementaridade da sequência

•Resulta na clivagem ou repressão traducional do mRNA alvo

•Consequente diminuição da expressão gênica

•Depende da presença continua do siRNA

TGS (Transcriptional gene silencing)

•Atua em nível de DNA e pode resultar em silenciamento a longo tempo (plantas e animais)

•Envolve mudanças na cromatina mediada por ncRNA na região promotora resultando em transcrição reduzida de genes alvos

•Modificações da cromatina: metilação do DNA e histonas nas regiões do lócus-alvo

•Observado em plantas, drosophila, levedura e humanos

•Utilização com siRNA sintéticos

MECANISMOS DE SILENCIAMENTO GÊNICONATURE|Vol 457|22 January 2009|doi:10.1038/nature07758

Mecanismos: ligação na região 3’UTR do RNAm (a)

•pós-transcricional (PTGS):

-clivagem direta do RNAm: miRNA é complementar ao RNAm degradado após clivagem p/RISC

-repressão da tradução e degradação RNAm: miRNA com pareamento incompleto

DGCR8: cofator de DROSHA

XPO5: exportinA-5 (transporte ao citoplasma)

RISC (RNA-induced silencing complex)

PROCESSOS DE INIBIÇÃO DA TRADUÇÃO

1- Competição pelo 5’ CAP: miRNAs podem interferir no reconhecimento do 5’CAP. A proteína AGO apresenta domínio semelhante ao da proteína de ligação ao 5’CAP, assim competindo com 5’CAP

2-Inibição da montagem dos ribossomos: AGO2 pode associar-se a eIF6 (fator de iniciação da tradução) e a unidade ribossomal maior, impedindo a montagem do ribossomo (subunidade maior e menor)

3-Deadenilação seguida pelo bloqueio da iniciação da tradução: impede a circularização do mRNA (pela interação do 5’CAP e cauda poli –A), que é essencial para a iniciação da tradução

4-Dissociação prematura de ribossomos: miRNAs levam a desmontagem antecipada dos ribossomos

5-Redução da velocidade de elongação durante a síntese proteica: miRNA reduz o número de ribossomos interagindo com o mRNA

6-Proteólise durante a fase de elongação: miRNAs promovem a degradação da cadeia polipeptídica nascente no ribossomo, durante a fase de elongação

Mecanismos de repressão mediado por miRISC

Direita: reprimir estágio pós-iniciação da tradução retirada dos ribossomos prematuramente; ou promover degradação do RNAm induzindo deadenilação e remoção do 5-cap

Abaixo: Alternativamente: pode induzir deadenilação do RNAm inibir circularização do RNAm

(Topo) RNAm não reprimidos recrutam fatores de iniciação e ribossomos e formam estruturas que aumentam tradução.

Esquerda (superior): Ligação de RISC ao RNAm pode reprimir iniciação pelo reconhecimento do 5-cap; Esquerda (inferior): ou recrutamento de 60S/eIF6.

BioTechniques 48:ix-xvi (The RNA World June 2010) doi 10.2144/000113442

Modelo de silenciamento gênico do tipo TGS

siRNA sintético ou miRNA endógeno

Plasmídeo expressando shRNA ou RNA antisense

Recrutamento de Ago-1promotor

Recrutamento de HDAC-1, DNMT3A, HMT

cromatina fechada transcrição inativa

microRNA e Câncer

Descoberta de miRNA câncer: Calin et al. (2002)

LLC (leucemia linfocítica crônica): del(13q14) dois genes de miRNA: miR-15-a e miR-16-1 perda em 70% de LLC evento precoce (iniciador) função de gene supressor de tumor

•Maioria dos miRNA localizados em regiões envolvidas em alterações cromossômicas:

-deleções,

-Amplificação,

-mutação (afeta o processamento dos miRNA),

-Metilação DNA e modificações histonas: função na regulação da expressão dos miRNAs (Ex.: miR-127 geralmente silenciado em células cancerosas)

www.nature.com/reviews/geneticsOCTObER 2009 | VOLuME 10

Mapa de miRNA envolvidos em alterações em câncer: 13q14 (miR-15-a e miR-16-1)- deletada em LLC; 7q32 (miR-29-a e miR-29b) deletada em SMD e LMA; 3p2 (let-7g-let-7a1); 9q22.3 (let-7f-1, let-7d) em tumores sólidos (pulmão, urotelial, mama, etc.

Função dos miRNA como supressor tumoral x oncogene

Sequenciamento dos miRNA: evidenciado deleções, mutações (inclusive na linhagem germinativa forma familial de LLC)

Membros da família let-7 regula negativamente Oncogene RAS e outros oncogenes: CDK6, CCND2, CICLINA D

Perda de let-7 expressão > de RAS

Câncer de pulmão

miR-15-a e miR-16-1 alveja oncogene BCL2 (inibidor apoptose)

Perda desses miRNAs disfunção de oncogenes celulares

miR-155 e miR-17-92: amplificados em vários linfomas de células B, câncer pulmão, mama, etc

miR-17-92 (13q31) promove proliferação, inibe apoptose, induz agiogênese, e coopera c/ MYC desenvolvimento de linfomas e câncer pulmão

Overexpression miR-155 pobre prognóstico em adenocarcinoma pulmãomiRNAs encontrados na circulação (nanovesículas – exossomos): biomarcador não invasivo

www.nature.com/reviews/geneticsOCTObER 2009 | VOLuME 10

miRNA: Reguladores de Mudanças Epigenéticas

miRNA

Regula enzimas envolvidas na metilação DNA de genes supressores

Família miR-29 alveja

DNMT3A, DNMT3B e DNMT1

causando desmetilação

Linhagem de câncer de pulmão: introdução de miR-29 causou desmetilação do promotor de genes supressores reativação gênica e perda de tumorigenicidade

Células AML: introdução de miR-29 causou perda de expressão das DNMTs, do oncogene MCL1 e reativação de p16

Expressão de microRNA em Câncer

Profile MicroRNAs from Cancer and Normal Tissues. A susbset of the MicroRNA primers were used in this study to confirm published findings of 9 different MicroRNAs in 5 separate tumor vs. Normal RNA samples.

Aplicação no prognóstico, progressão da doença e resposta a terapia

Terapia baseada em miRNA ou anti-miRNA

miRNA podem estar deletados ou hiper expressos no câncer

-miRNA (ou siRNAs) podem ser consideradas drogas para silenciamento gênico: induzir apoptose e /ou parada do ciclo celular em células cancerosas com desregulação de miRNA

-anti-miRNA (antagomir): bloquear a atividade de miRNA endógenos

Introdução de miRNA nos tumores:

-diretamente nos tumores (fígado, medula, baço e rim)

- ou utilização de vetores

RNA interferência – Terapia por miRNA

Triagem clínica: alvos

-IL-10: tratamento da preeclâmpsia

-VEGF e VEGFR-1: degeneração macular

-BCR-ABL: LMC

-introduzidos em vetores: adenovírus, vírus adeno-associados (AAV), retrovírus, lipossomos, injeção do RNA, nanopartículas

Camundongos:

-miR-15a e miR-16-1: tratamento da leucêmia

-miR-26a: inibição da proliferação celular e indução de apoptose em hepatocarcinoma

-família miR-29: suprimir câncer de pulmão e leucêmia (LMA)

Riscos: miRNA/siRNA introduzidos exogenamente podem sequestrar componentes da maquinaria celular envolvidos no silenciamento gênico reduzindo acessibilidade da maquinaria p/os miRNA endógenos

Estratégias de introdução dos siRNA in vivo para terapia

Vetores não virais:

-conjugados de colesterol

-nanopartículas de polications ligadas a transferrina

-Anticorpos carregados positivamente

-SNALP: bicamada lipídica conjugada com polietileno glicol difusível

-MEA: partículas policonjugadas dinâmicas

devido o tamanho e carga negativa, não atravessam facilmente a membrana celular

Vetores virais:

-lentivírus: contra Ras (camundongo); doenças neurodegenerativas

-Adenovírus: sistema nervoso central injeção direta contra transcrito de ataxia espinocerebelar (camundongo)

Riscos: imunogenicidade viral; mutações insercional

Estratégias de introdução dos siRNA in vivo para terapia

-grupos de colesterol aumenta estabilidade do siRNA. Ex: entrega intravaginal (camundongo) siRNA contra HSV-2

Nanopartículas de polication podem introduzir os siRNA em células específicas através de ligantes de superfície (transferrina) ao receptor das células alvos. Ex.: sarcoma Ewing (Ews-Fli1,

mice); contra CCND1 em leucócitos camundongo

Anticorpos especificos com protaminas (carga +) entrega dos siRNA p/células específicas via receptor. Ex.: contra gene gag HIV

Estratégias de introdução dos siRNA in vivo para terapia

Permite siRNA ser absorvido pelas células e liberado por endossomos. Ex.: siRNA contra APOB fígado (primatas)

Similar aos SNALPS, mas menores, contêm um ligante que permite entrega para as células alvos

Triagens clínicas para tratamento de doenças

-Bevasiranib: contra VEGF degeneração macular (crescimento de vasos atrás da retina) perda visual. Tratamento melhora da visão sem efeito colateral. Também em fase II para tratamento de edema macular diabética

-Alnylan Pharmaceuticals: contra genes implicados na hipercolesterolemia, doença de Huntington, hepatite C

-Doenças alvo p/tratamento: AIDS, Parkinson, degeneração macular, diabetes tipo 2, obesidade, hipercolesterolemia, artrite reumatóide, doenças respiratórias e câncer

TERAPIA – ANTAGONISTAS DE miRNA (AMOs)

-inibir miRNA oncogênicos utilizando antagonistas de miRNA:

•anti-miRs, locked-nucleic acids (LNA) ou antagomiRs: são oligos com sequencias complementares aos miRNAs endógenos

•Alteram a configuração do miRNA impedindo o processamento por RISC, ou degradam miRNA endógenos

•Substituição do miRNA: reintrodução de um “miRNA mimético” supressor tumoral para restaurar uma perda de função

Cancer Res. Author manuscript; available in PMC 2011 September 15.

TERAPIA – ANTAGONISTAS DE miRNA (AMOs)

- Miravirsen (SPC3649): antagonizar miR-122 para tratar hepatite C crônica redução dos níveis de colesterol do plasma, sem toxicidade.

- liga-se a alça do precursor do miR-122 bloqueando o processamento pelas enzimas Dicer e Drosha

-2010: foi a primeira droga alvejando miRNA em triagem clínica e atualmente encontra-se em fase II

Cancer Res. Author manuscript; available in PMC 2011 September 15.

2010: antagomir alvejando o pró-metastático miR-10b antagonizar metástase em modelo murino de câncer de mama

- antagomir alvejando miR-155 em modelo murino de linfoma

APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS

Terapêutica baseada na inibição miRNAS:-uso de drogas inibidoras:-empresa Regulus e Sanafi-Aventis: mólécula moduladora do oncomiR miR-21, que tem como alvo os genes supressores PTEN e PDCD4 (glioblastoma, câncer de pâncreas, mama)

-Miravisen (teste clínico fase 3): tratamento da hepatite C – inibição do miR-122 em células do fígado (alveja duas regiões do RNA viral, levando a redução da contagem viral)

Terapêutica baseada na reposição de miRNAs:

-empresa Mirna Therapeutics: modulador que mimetiza o miR-16 (alveja BCL2, controle da apoptose)

-droga MRX34: modulador mimetizador do miR-34 (alveja genes reguladores do ciclo celular, como MYC, MET RRAS, CCND1). Modelo animal de câncer pulmonar (única dose induziu apoptose e redução da massa tumoral em 60%). Próxima fase, teste clínico em pacientes com câncer hepático

miRNA E DOENÇAS NEUROLÓGICAS

miRNAs exercem papel importante no desenvolvimento de muitas doenças: marcadores progresso, prognóstico e avaliação da resposta ao tratamento

miRNA E DOENÇAS NEUROLÓGICAS

Epilepsias

-diminuição de miRNAs expressos no hipocampo: falha na maquinaria de maturação dos miRNAs e diminuição na expressão da enzima Dicer (formação dos miRNAs maduros). Ex.:miR-206, miR-347-Enquanto outros apresentam expressão aumentada após a crise epilética: Ex.: miR-132, miR-134

Doença de Alzheimer

-desregulação dos miRNAs em cérebros de pacientes relacionados com a progressão da doença: miR-9, miR-29, miR-34, miR-106, miR-107 (regulam genes chaves envolvidos na DA).-miR-107: ( mais relevante) baixa expressão nos estágios iniciais da doença no lobo temporal, correlacionado com alta expressão de BACE1 (enzima beta secretase 1)-miR-29: casos esporádicos de DA - tem sítios de ligação para o gene BACE1 (sua perda é correlacionada com alta expresão desse gene)-miR-153: contribui para a regulação pós-transcricional dos genes APP/APLP2

Doença de Huntington

miRNA E DOENÇAS NEUROLÓGICAS

-distúrbio neurodegenerativo, perda da cognição e alterações psiquiátricas, perda progressiva de neurônios do córtex e corpo estriado-expansão do códon CAG no gene HTT (proteína huntingtina)-miR-200: alterado no córtex de camundongos mutantes de HTT nas fases iniciais da doença (comprometimento de genes envolvidos na plasticidade e sobrevivência neuronal)-hopexpressão : miR-146a, miR-125b, e miR-150-hiperexpressão: miR-34b -desregulação da Dicer, Drosha e Exportina-5

Outras Doenças-Esquizofrenia

-Autismo-Doenças Cardiovasculares

Doenças autoimunes ou inflamatórias crônicas

miRNA COMO BIOMARCADORES DE DIAGNÓTICO E PROGNÓSTICO

Padrão de expressão dos miRNAs: assinatura potencial para a classificação, diagnóstico, prognóstico e resposta terapêutica

-Utilização de biópsias, fluidos biológicos como soro, plasma, urina, escarro, etc

•Diabetes: níveis séricos do miR-23a (sensibilidade de 79,2% e especificidade de 75%) capaz de discriminar pacientes com diabetes do tipo 2•Epilepsia: níveis séricos do miR-106-b-5p (melhor preditor com sensibilidade de 80,3% e especificidade de 81,2%) •Esclerose múltipla: desregulação de miRNAs em linfócitos T isolados do sangue•Doença de Alzheimer: níveis séricos do miR-342-3p apresentou melhor sensibilidade 81,5% e especificidade 70,1%

PRINCIPAIS MODULADORES DE miRNAs EM DESENVOLVIMENTO

-273 testes clínicos registrados na plataforma clinicaltrials-49% das patentes relacionadas a tecnologias para modulação de miRNAs e novas técnicas de administração dos moduladores de miRNAs.

Segurança da Terapia

-Um único miRNA pode regular os níveis de centenas de proteínas consequências de hipoexpressão ou expressão ectópica

-relatos de mortes em camundongos devido em parte a saturação do fator de transporte” exportina 5”, que transporta o miRNA do núcleo p/ citoplasma

-utilização de menor concentração possível de siRNA que forneça eficácia terapêutica

-siRNA alteram a expressão de genes alvos e não alvos

-Outras barreiras: toxicidade associada a entrega; pobre transfecção, pouco conhecimento da biodistribuição, liberação sistêmica, degradação na circulação, sequestração endossomal e estimulação da resposta imune celular