RODOLFO XAVIER DE SOUSA-LIMA...seria impossível realizar este sonho. A minha tia/irmã Andréia e...

RODOLFO XAVIER DE SOUSA-LIMA

PROPRIEDADES FÍSICAS E BIOLÓGICAS DE SISTEMAS ADESIVOS

AUTOCONDICIONANTES EXPERIMENTAIS

NATAL/RN

2018

www.posgraduacao.ufrn.br/ppgscol [email protected] 55-84-3342-2338

CENTRODECIÊNCIASDASAÚDEPROGRAMADEPÓS-GRADUAÇÃOEMSAÚDECOLETIVA

RODOLFO XAVIER DE SOUSA-LIMA

PROPRIEDADES FÍSICAS E BIOLÓGICAS DE SISTEMAS ADESIVOS

AUTOCONDICIONANTES EXPERIMENTAIS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Saúde Coletiva, Centro de

Ciências da Saúde da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte, como requisito para a

obtenção do título de Mestre em Saúde Coletiva.

Orientador: Prof. Dr. Boniek Castillo Dutra

Borges

NATAL/RN

2018

DEDICATÓRIA

Aos meu pais; Maria Adelaíde Xavier de Sousa Lima e José de Fátima Lima, por me

concederem o privilégio de sonhar.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradecer a energia mentora do universo pelas bençãos, força e

inspiração que inquestionavelmente está presente em cada detalhe dos meus dias.

Aos meus pais, José de Fátima e Maria Adelaíde, e irmã Virgínia Maria, pelo suporte, lições

grandiosas sobre honestidade, generosidade e amor que vocês me dão sempre. Sem vocês,

seria impossível realizar este sonho. A minha tia/irmã Andréia e minha “sobrinha” Maria

Cecília pela afetuosidade de cada encontro, onde há sempre bons abraços, beijos e um tantão

de afeto que deixam o coração do “tio” cheio de amor e vontade de seguir em frente. A minha

madrinha Silvia pelo carinho e diligência comigo.

Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Boniek Castillo Dutra Borges pela

sensibilidade de perceber potencial em mim, por ter sempre respostas pertinentes, pela

incrível disponibilidade durante todos esses anos de trabalho em conjunto e por me estimular

a ser melhor enquanto pessoa e pesquisador.

Aos queridos Bruna, Eva, Erick, Jean, Rafaella, Rômulo e Ruan, que estiveram

próximo a mim desde o momento em que o mestrado era só sonho até hoje. O vínculo que

guardamos é de uma preciosidade imensurável para mim. Obrigado pelo combustível de

humanidade que me inspiram. Aos ilustres: Victor, Kezia, Carla e Aliane pelas doses de afeto

gratuitas que me enchem o coração. A querida Raíza, com quem compartilhei o mesmo teto,

angústias, felicidades, (des)amores e bons cafés durante os últimos anos em Natal, obrigado!

Dividir tudo isso com você me salvou da vida, quando ela parecia pesada demais.

A Paloma, João, Tibério, Carlos e Raquel pelos momentos divertidos e

inesquecíveis. Aos amigos que a vida acadêmica me trouxe e que hoje guardam lugar especial

na minha vida: Ana Margarida, Débora, Lílian, Maria Eduarda, Claudiana e, em especial,

Letícia com quem compartilhei dúvidas, conquistas, anseios e muito trabalho durante os

últimos três anos. Obrigado por estarem na minha vida.

Aos professores Dr. Cícero Aragão e Dr. Carlos Augusto pela parceria,

disponibilidade e resolutividade durante esta pesquisa. A Dayanne e Vladimir, pessoas

fundamentais para a realização de dois dos testes deste trabalho. A Diego, que muito me

ajudou em etapas fundamentais. A Isabel, Guilherme e todos que nos ajudaram no

recolhimento dos dentes para esta pesquisa. Ao professor Hugo, que abriu as portas do

laboratório para a realização dos experimentos. Ao professor Dr. Rafael Ratto e a Ana Carla

pelo embasamento inicial para esta pesquisa.

Aos funcionários do Departamento de Odontologia: Helena, Joana, Marcilene,

Neide, Francisca, Clécia, Vênus e, em especial, Ângela, pelas inúmeras portas que abriram

para que essa pesquisa pudesse ser realizada. A funcionária Nilma, do Departamento de

Farmácia, pela simpatia e hospitalidade com que eu sempre era recebido.

Ao programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva – UFRN com área de

concentração em odontologia da UFRN e ao coordenador do programa, Prof. Dr. Angelo

Giuseppe Roncalli Da Costa Oliveira, meu respeito e admiração. A Universidade Federal do

Rio Grande do Norte, de forma geral, pela oportunidade incrível de ter contato com o

conhecimento em sua forma mais inspiradora. A CAPES pelo financiamento desta pesquisa.

“O sonho encheu a noite

Extravasou pro meu dia

Encheu minha vida

E é dele que vou viver

Porque sonho não morre”

Adélia Prado

RESUMO

Objetivo: avaliar a Liberação de Monômeros Residuais (LMR), resistência Flexural (RF),

módulo de elasticidade (ME) e citotoxicidade de adesivos experimentais (AE) formulados à

base de GDMA-P. Metodologia: os AE foram divididos em 9 grupos, de acordo com os

seguintes parâmetros: a) % monomérica em massa de GDMA-P/ HEMA/ UDMA (10/30/30;

20/30/20 e 30/30/10); mol % de fotoiniciadores CQ/BAPO/EDMAB/DH (1,0/0,0/1,0/0,2;

0,0/1,0/0,0/0,2; 0,5/0,5/1,0/0,2). Para citotoxicidade, foram utilizadas células NIH-3T3 e os

testes MTT Assay e Alamar Blue (n=8). Para RF e ME, seguiu-se o método descrito na ISO

4049 (n=7). Para aferir LMR, foram usados 54 terceiros molares para obtenção de uma área

plana de dentina (n=6), as quais receberam os sistemas adesivos e, após 24h, a LMR foi lida

em aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência. A análise estatística foi feita com

ANOVA a dois fatores e pós teste de Tukey (p<0,05). Resultados: para o % de redução do

Alamar Blue, não houve diferença entre as concentrações testadas. Entre os fotoiniciadores,

CQ e BAPO, isoladamente, apresentaram melhores valores para 30% e CQ+BAPO para a

concentração 20%. Para % de citotoxicidade através do MTT Assay, não houve diferença

entre fotoiniciadores e % de GDMA-P. Para LMR, entre os mesmos fotoiniciadores e

diferentes concentrações de GDMA-P, a concentração 10% liberou mais HEMA. Para as

diferentes concentrações de GDMA-P e mesmos fotoiniciadores, os grupos contendo CQ

liberaram mais HEMA. Para UDMA, entre os grupos de fotoiniciadores, apenas CQ

apresentou diferenças, sendo a porcentagem de 10% de GDMA-P a que mais liberou

monômeros UDMA. Para as três concentrações de GDMA-P, CQ liberou mais monômeros

UDMA. Para a liberação de GDMA-P, entre os mesmos fotoiniciadores, a concentração de

10% proporcionou maior liberação de monômeros para os grupos que contém CQ. Entre as

mesmas concentrações e diferentes fotoiniciadores, CQ proporcionou maior liberação de

GDMA-P para 10% e 30%. Para a concentração 20%, BAPO permitiu a maior liberação. Para

RF, 10% de GDMA-P apresentou diferenças entre os fotoiniciadores, sendo o grupo BAPO a

maior RF. A mistura BAPO+CQ permitiu maior valor de RF para as concentrações 20% e

30%. Para ME, 30% GDMA-P foi o único a apresentar diferença significativa, sendo o grupo

BAPO+CQ o maior valor. Conclusões: de forma geral, CQ liberou mais monômeros, de

forma que a concentração de 10% de GDMA-P em associação com o grupo de fotoiniciador

BAPO foi capaz de proporcionar melhores resultados para as propriedades testadas.

Palavras chave: Citotoxicidade. Sistema adesivo experimental. Resistência flexural.

ABSTRACT

Objective: to evaluate the Clearence of Residual Monomers (CRM), flexural strength (FS),

elastic modulus (EM) and cytotoxicity of experimental adhesives (EA) formulated based of

GDMA-P. Methodology: the EA were divided into 9 groups, according to the following

parameters: % of monomeric mass of GDMA-P GDMA-P/ HEMA/ UDMA (10/30/30;

20/30/20 e 30/30/10); mol % of photoinitiators CQ/BAPO/EDMAB/DH (1,0/0,0/1,0/0,2;

0,0/1,0/0,0/0,2; 0,5/0,5/1,0/0,2). For cytotoxicity, NIH-3T3 cells and MTT Assay and Alamar

Blue tests were used (n=8). To measure RRM, 54 third molars were used to obtain a flat area

of dentin (n=6) that received the adhesives and, after 24 h, the CRM was in HPLC. For FS

and EM, followed by the method described in ISO 4049 (n = 7). Statistical analysis was

performed with two-way ANOVA and post Tukey test (p <0.05). Results: for the % of

reduction of Alamar Blue, between 10%, 20% and 30% there was no difference. Among the

photoinitiators, CQ and BAPO, singly, presented better values for 30% and CQ + BAPO for

the concentration 20%. For% cell viability through MTT Assay, there was no difference

between photoinitiators and % GDMA-P. For CRM, for the same photoinitiators and different

concentrations of GDMA-P, 10% of GDMA-P released more HEMA. For the different

concentrations of GDMA-P and the same photoinitiators, the groups containing CQ released

more HEMA. For UDMA, among the groups of photoinitiators, only CQ presented

differences, being the percentage of 10% of GDMA-P that most released UDMA monomers.

For the three concentrations of GDMA-P, CQ released more UDMA monomers. For the

release of GDMA-P, among the same photoinitiators, the 10% concentration gave greater

release of monomers to the groups containing CQ. Among the same concentrations and

different photoinitiators, CQ provided greater release of GDMA-P to 10% and 30%. For the

20% concentration, BAPO allowed the highest release. For RF, 10% of GDMA-P presented

differences between the photoinitiators, being the BAPO group the highest RF. The BAPO +

CQ mixture allowed higher RF values for the 20% and 30%. For EM, 30% GDMA-P was the

only one to present a significant difference, the BAPO + CQ group being the highest value.

Conclusions: In general, CQ released more monomers, so that the 10% concentration of

GDMA-P in association with the BAPO photoinitiator group was able to provide better

results for the properties tested.

Key words: Cytotoxicity. Experimental adhesive system. Flexural strength.

LISTA DE FIGURAS E QUADROS

Figura 1 - Imagem caracterizando a reação de síntese do monômero GDMA-P. 27

Figura 2 - Imagem com detalhamento da formulação dos sistemas adesivos...... 28

Figura 3 - Imagem ilustrativa de metodologia da análise da citotoxicidade........ 30

Figura 4 - Imagem ilustrativa com metodologia para análise de liberação de

monômeros residuais........................................................................... 32

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Resultados das médias do percentual de redução de Alamar Blue em

células NH3-T3 ± desvio padrão para concentração de GDMA-P

utilizada versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle... 34

Tabela 2 - Resultados das médias do percentual de sobrevida de células NH3-T3

em MTT Assay ± desvio padrão para concentração de GDMA-P

utilizada versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle... 35

Tabela 3 - Resultados das médias do percentual monômeros HEMA liberados ±

desvio padrão, de acordo com a porcentagem de GDMA-P, versus

tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle............................. 35

Tabela 4 - Resultados das médias do percentual monômeros UDMA liberados ±

desvio padrão, de acordo com a porcentagem de GDMA-P, versus

tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle............................. 36

Tabela 5 - Resultados das médias do percentual monômeros GDMA-P liberados

± desvio padrão, versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo

controle................................................................................................... 37

Tabela 6 - Resultados das médias do módulo de Resistência Flexural (MPa) ±

desvio padrão para concentração de GDMA-P utilizada versus tipo de

fotoiniciador........................................................................................... 37

Tabela 7 - Resultados das médias do módulo de elasticidade (MPa) ± desvio

padrão para concentração de GDMA-P utilizada versus tipo de

fotoiniciador............................................................................................ 38

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 12

2 REVISÃO DA LITERATURA............................................................................... 14

2.1 SISTEMAS ADESIVOS: EVOLUÇÃO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA................. 14

2.2 CITOTOXICIDADE E LIBERAÇÃO DE RESÍDUOS DE SISTEMAS

ADESIVOS E SEUS COMPONENTES................................................................... 20

2.3 RESISTÊNCIA FLEXURAL E MÓDULO DE ELASTICIDADE DE

SISTEMAS ADESIVOS........................................................................................... 22

3 OBJETIVOS............................................................................................................. 25

3.1 OBJETIVO GERAL.................................................................................................. 25

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................... 25

4 MÉTODO................................................................................................................. 26

4.1 CARACTERÍSTICAS DA PESQUISA.................................................................... 26

4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS................................................................................... 26

4.3 SÍNTESE DO MONÔMERO ÁCIDO...................................................................... 26

4.4 FORMULAÇÃO DOS SISTEMAS ADESIVOS EXPERIMENTAIS

SIMPLIFICADOS..................................................................................................... 27

4.5 ANÁLISE DA CITOTOXICIDADE......................................................................... 38

4.6 LIBERAÇÃO DE MONÔMEROS RESIDUAIS..................................................... 30

4.7 RESISTÊCIA FLEXURAL E MÓDULO DE ELASTICIDADE............................ 32

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................................ 33

5 RESULTADOS........................................................................................................ 34

5.1 ANÁLISE DA CITOTOXICIDADE........................................................................ 34

5.1.1 Alamar Blue.............................................................................................................. 34

5.1.2 Mtt Assay.................................................................................................................. 34

5.2 LIBERAÇÃO DE MONÔMEROS RESIDUAIS..................................................... 35

5.2.1 HEMA....................................................................................................................... 35

5.2.2 UDMA....................................................................................................................... 36

5.2.3 GDMA-P................................................................................................................... 36

5.3 RESISTÊNCIA FLEXURAL.................................................................................... 37

5.4 MÓDULO DE ELASTICIDADE.............................................................................. 48

6 DISCUSSÃO............................................................................................................. 39

7 CONCLUSÕES........................................................................................................ 47

REFERÊNCIAS....................................................................................................... 48

12

1 INTRODUÇÃO

Sistemas adesivos são materiais utilizados para proporcionar adesão entre dois

materiais de natureza distinta, sendo, no caso da Odontologia, entre os substratos dentário e o

material restaurador (REIS; PEREIRA; GIANNINI, 2007). O processo de adesão clássico

ocorre em três passos: aplicação de um ácido sobre os tecidos dentários, seguida da aplicação

de um primer e um adesivo que penetra nas rugosidades criadas pelo ácido e proporciona uma

microrretenção que origina a adesão (BUONOCORE, 1955). Esse protocolo, no entanto,

apresenta muitos passos, deixa a técnica sensível a falhas e requer maior tempo clínico. Nesse

quesito, tentando simplificar, surgiram os adesivos autocondicionantes, que dispensam a

aplicação de ácido, desmineralizando e penetrando simultaneamente nos tecidos dentários

(SILVA et al., 2013; MOSZNER; SALZ; ZIMMERMANN, 2005).

Estes adesivos baseiam-se em monômeros ácidos tais como o 10-metacriloxidecil

dihidrogênio fosfato (10-MDP) (TAKAHASHI, 2014). No entanto, a tendência para o futuro

são melhorias na adesão química ao dente a partir de novos monômeros ácido-funcionais

(VAN MEERBEEK et al., 2011). Surge, neste contexto, o GDMA-P, um monômero ácido

funcional dimetacrilato que tem habilidade de formar ligações cruzadas quando suas duplas

ligações de carbono reagem intermolecularmente com outra cadeia polimérica em

crescimento ou intramolecularmente com radicais livres na propagação da cadeia para

oferecer maior grau de conversão aos sistemas. A composição e concentração adequada

desses monômeros ácidos na composição dos sistemas adesivos é essencial afim de que os

iniciadores e co-iniciadores não sejam inibidos (MEEREIS et al., 2014; ZHANG; WANG.,

2012; ARIKAWA et al., 2004).

Permitir uma ativação adequada destes fotoiniciadores é importante para que seja

atingido grau de conversão adequado, tendo em vista que esta propriedade tem relação direta

com o desempenho do adesivo em vários aspectos. Entre os fotoiniciadores mais utilizados,

temos a Canforoquinona (CQ), classificada como fotoiniciador tipo II (NORRISH et al, 1949)

e devido depender de moléculas co-iniciadoras, há a geração de subprodutos que podem

originar problemas como o amarelamento da restauração e maior citotoxicidade

(ALBUQUERQUE et al., 2013; JAKUBIAK et al., 2003; STANBURY, 2000; ASMUSSEN,

1985). Tentando resolver esses problemas, iniciadores alternativos, tipo I, tais como Óxido

bil-alquil fosfínico (BAPO), Etil 4-dimetilamino benzoato (EDMAB) e Difenilidônio

Hexafluorfosfato (DH) passaram a ser mais usados tanto por serem macromoléculas (fato que

13

torna mais difícil a disseminação no complexo dentino-pulpar), quanto por apresentarem

maior reatividade, proporcionando maior grau de conversão e menos monômeros residuais na

interface adesiva (SALGADO et al., 2015; ALBUQUERQUE et al., 2013; SCHNEIDER et

al., 2012; PRICE; FELIX, 2009; NOMURA et al., 2006; NEUMANN et al., 2006;

NEUMANN et al., 2005).

Como estes monômeros ácidos dos sistemas autocondicionantes permitem a

desmineralização e infiltração simultânea, a smear layer é englobada na camada híbrida

(SILVA, 2013; SUYAMA et al., 2013) e o sistema adesivo fica em contato maior com os

tecidos dentários, tendo em vista que o passo da lavagem é dispensado. Além disso, a

polimerização incompleta dos materiais seja pela inativação dos fotoiniciadores diante da

acidez ou pela menor reatividade inerente à molécula, pode favorecer a presença de

monômeros residuais na interface adesiva que oportuniza maior citotoxicidade de sistemas

adesivos através da dispersão destes produtos residuais para tecidos circunvizinhos e polpa

dentária (WEISBURGER et al., 1978; NOMURA et al., 2006). Dessa maneira, é importante

entender o papel dos monômeros ácidos, tais como o GDMA-P, e sua combinação com

diferentes grupos fotoiniciadores e a capacidade citotóxica/ comportamento biológico dos

diferentes adesivos (SCHWEIKL; SPAGNUOLO; SCHMALZ, 2006).

Portanto, o presente estudo objetiva avaliar a liberação de monômeros residuais, a

citotoxicidade e resistência flexural/módulo de elasticidade de sistemas adesivos

experimentais de frasco único com diferentes concentrações de GDMA-P e sistemas

fotoiniciadores a base de CQ, DH, EDMAB e BAPO. Desta forma, a hipótese nula testada

nesta pesquisa é de não haverá diferenças estatisticamente significativas na liberação de

monômeros residuais, citotoxicidade e resistência flexural/módulo de elasticidade entre os

sistemas adesivos testados com diferentes concentrações de GDMA-P/fotoiniciadores.

14

2 REVISÃO DA LITERATURA

Para construção desta revisão de literatura, foram utilizadas as bases de dados PubMed

e Google Acadêmico. Na base PubMed foram utilizadas combinações das palavras chaves:

“self-etching adhesives”, “Citotoxicity”, “flexural strength” and “Elastic modulus”. Para o

Google Acadêmico foram utilizadas combinações das palavras chave “adesivos

autocondicionantes”, “citotoxicidade”, “Resistência flexural” e “Módulo de elasticidade”. Na

base PubMed, foram selecionados apenas artigos na língua inglesa e que se enquadraram

dentro da temática abordada e na base Google Acadêmico, foram selecionados artigos em

inglês e português com preferência aos trabalhos de dissertação de mestrado e tese de

doutorado em repositórios das universidades.

2.1 SISTEMAS ADESIVOS: EVOLUÇÃO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA

A função primordial dos sistemas adesivos é manter unidos dois materiais de natureza

igual ou distinta, aderindo a superfície de cada um. Essa possibilidade de unir materiais de

naturezas diferentes, no caso da Odontologia, se deu com o auxílio das descobertas dos

estudos de Buonocore (1955) e o condicionamento ácido nos substratos dentários,

propiciando o surgimento da Odontologia adesiva de forma que, com sua evolução, hoje, os

procedimentos adesivos são utilizados em diversas áreas, desde a fixação de restaurações

(diretas e indiretas) a esplintagem de dentes periodontalmente comprometidos (REIS;

PEREIRA; GIANNINI, 2007).

Em todo procedimento restaurador existem sempre, no mínimo, dois materiais

aderentes (biológicos ou sintéticos) a ser unidos por intermédio de um adesivo. Dessa forma,

para que se obtenha uma adesão duradoura, peculiaridades estruturais de cada parte envolvida

devem ser conhecidas, bem como, as variações morfológicas que podem causar alterações na

qualidade da adesão (AGGARWAL et al., 2013; PERDIGÃO, 2002). O processo de adesão

em esmalte tem relação com as diferentes inclinações dos prismas de hidroxiapatita, de forma

que na região interprismática há uma inclinação progressiva desses cristais, formando uma

espécie de depressão chamada de bainha. Essas diferentes orientações permitem a formação

de saliências e depressões após a aplicação do ácido fosfórico que facilitam a microrrentenção

dos sistemas adesivos (BUONOCORE, 1955). Isso ocorre porque o esmalte é constituído de

95% mineral, 2% de material orgânico e 3% a 4% de água em peso. Assim, a adesão em

15

esmalte é baseada na retenção micromecânica gerada pela introdução e polimerização dos

monômeros resinosos infiltrados em microporosidades geradas pela dissolução química dos

cristais de hidroxiapatita (VERMELHO, 2015).

A dentina, no entanto, é descrita como um composto biológico heterogêneo em

sua composição e morfologia, dinâmico em sua fisiologia, quando comparado ao esmalte. É

formada por uma matriz de colágeno somada a alguns minerais que origina uma rede de

túbulos, onde são abrigados os prolongamentos dos odontoblastos, fluidos dentinário e fibras

nervosas. Esses túbulos são uma das características mais marcantes da dentina, estando

diretamente relacionados com a permeabilidade do tecido e se estendem desde a câmara

pulpar até a junção amelodentinária e amelocementária. A composição da dentina, de forma

quantificada é de aproximadamente 50% volume mineral, 20% água e 30% de matriz

orgânica (MARSHAL et al., 1997).

Toda essa diferenciação traz algumas peculiaridades à dentina como: tecido

úmido e orgânico, aumento do número de túbulos com o aumento da profundidade, pressão

pulpar, presença de smear layer e baixa resistência coesiva/presença de minerais nos túbulos

quando afetada pela cárie, o que torna adesão mais dificultada nesse substrato (PERDIGÃO,

2010). Ao invés dos monômeros penetrarem nas fissuras do substrato inorgânico, como

ocorre em esmalte, em dentina eles adentram a malha de fibras colágenas e túbulos através de

uma complexa relação química entre material/substrato de forma que após a polimerização,

possibilitam a microretenção do bloco restaurador ao dente (VAN MEERBEEK et al. 2011;

PASHLEY et al., 2011, MUNOZ et al., 2013). É por isso que se torna importante manter a

dentina sob certas condições de umidade, para evitar o colabamento das fibras de forma a

permitir a infiltração dos monômeros originando a camada híbrida e os tags resinosos dentro

dos túbulos de forma que a microestrutura da dentina e suas propriedades são os principais

determinantes de boa parte dos procedimentos em Odontologia Restauradora (PEREIRA et

al., 2001).

A partir do desenvolvimento dos monômeros resinosos e início da sua utilização

em 1952, começaram os estudos mais importantes da adesão em esmalte e dentina. Buonocore

(1955) começou a observar maiores valores de resistência de união em esmaltes tratados com

ácido fosfórico, com posterior observação de que os monômeros podiam penetrar nos prismas

de esmalte condicionados e envolver os cristais de hidroxiapatita. Era essa incorporação dos

monômeros nos tecidos dentários, a primeira definição de camada híbrida, sendo o termo

adotado anos depois (VERMELHO, 2015).

16

A inserção dos compositos poliméricos se deu na década de 60 com o

desenvolvimento do bisfenol-A glicidilmetacrilato (Bis-GMA), por Bowen. Com a

preconização, por Fusayama et al. (1979) do condicionamento total com ácido fosfórico e

posterior caracterização da hibridização da dentina por Nakabayashi, Kojima e Masuhara

(1982), os sistemas adesivos e as resinas compostas passaram a ser materiais de uso rotineiro

para os clínicos, dando início a uma era mais conservadora e capaz de restabelecer melhor

forma, função e estética dos elementos dentários (VERMELHO, 2015). Desde então, os

sistemas adesivos passaram por grandes mudanças, numa tentativa de simplificação do uso e

menor susceptibilidade a falhas por parte do operador (VILLELA-ROSA et al., 2011). Assim,

pode-se classificar os sistemas adesivos de algumas formas, tais como: gerações (1ª, 2ª, 3ª),

tipo de solvente, presença ou não de partículas de carga, tipo de ativação (física, química ou

dual), modo de ação (autocondicionante ou não) e número de frascos (1 ou 2) (REIS;

PEREIRA; GIANNINI, 2007; VERMELHO, 2015).

A classificação por gerações vem sendo utilizada durante muitos anos e, de acordo

com esta, já estamos na 8ª geração de sistemas adesivos, assim, no mercado, atualmente,

temos disponíveis da 4ª a 8ª geração (NIRWAN et al., 2017). A quarta geração é formada

pelos adesivos em que o protocolo clínico é feito separadamente em 3 passos:

condicionamento ácido, aplicação do primer e do adesivo em frascos separados. A quinta

geração é formada pelos adesivos onde o protocolo clínico é feito em dois passos: a aplicação

do ácido e, em seguida, de um primer e adesivo em um só frasco. A sexta geração é formada

por um adesivo onde o protocolo clínico é feito em dois passos, a partir dessa geração, no

entanto, não há mais o uso do ácido em separado, dessa forma, nesta geração há aplicação de

um primer acídico seguido de um adesivo (ROSA; PIVA; SILVA, 2015). A sétima geração é

formada pelos adesivos de passo único, ou seja, todos os elementos do protocolo adesivos em

apenas um frasco, com a aplicação sendo feita em um só passo (WAGNER et al., 2014). A

oitava geração, ainda pouco estudada, é formada pela inserção de compostos bio-ativos nos

frascos para estimular respostas dos tecidos dentários.

Diante do surgimento dos adesivos autocondicionantes, a classificação

preferencial passou a ser a que se baseia na estratégia de ação, onde os adesivos podem ser

classificados como os que exigem condicionamento ácido prévio/ convencional (etch and

rinse) e aqueles que dispensam a aplicação do ácido, ou seja, são autocondicionantes (self-

etching) . Associado a isso, o número de passos da aplicação, podendo ser de três, dois ou de

17

passo único completam essa classificação (VAN MEERBEEK et al. 2011; PASHLEY et al.

2011).

Dessa maneira, o sistema adesivo clássico (ácido, primer e adesivo) é considerado

convencional de três passos. O sistema de dois passos com condicionamento prévio, ou seja,

com a junção em um frasco de primer e adesivo e aplicação do ácido separadamente,

constitui, juntamente ao sistema convencional de três passos os dois sistemas adesivos

convencionais disponíveis no mercado (ARAÚJO et al., 2017; PERDIGÃO, 2002). O de dois

passos contendo um primer acídico seguida por um adesivo e o de passo único constituem os

autocondicionantes disponíveis no mercado, ou seja, tratam o substrato dentinário através da

ação de monômeros ácidos ou ácido fosfórico que desmineralizam e infiltram nos tecidos de

forma simultânea (ROSA; PIVA; SILVA, 2015).

Desse modo, cada sistema adesivo apresenta sua composição própria, de acordo

com o que se propõe, sendo importante conhecer seus componentes básicos para melhor

indicá-los nas diferentes situações clínicas, de forma que a composição monomérica é um dos

fatores determinantes para o desempenho do sistema adesivo. Como é sabido, a dentina

possui uma umidade intrínseca (AGGARWAL et al., 2013) onde para que ocorra a união a

este substrato, é necessária a utilização de monômeros hidrófilos. Um dos monômeros

hidrófilos mais utilizados é o 2-hidroxietil metacrilato (HEMA), pois apresenta um radical

hidrófilo, com afinidade pelo substrato úmido, e um radical hidrófobo que irá promover a

polimerização com outros monômeros (MILIA et al., 2012). Por possuir baixo peso

molecular, é de fundamental importância para permitir a infiltração do adesivo, embora não

seja capaz de promover sozinho a formação de uma rede polimérica adequada para união

(BARBOSA et al., 2015).

Assim, monômeros hidrófobos bifuncionais são necessários para promover a

união. Além destes dois tipos anteriormente citados, nos sistemas autocondicionantes há,

ainda, a incorporação de monômeros ácidos/funcionais. Estes possuem radicais derivados do

ácido carboxílico, fosfórico ou seus ésteres, ou da incorporação de seus ácidos orgânicos e

minerais como aditivos que desmineralizam e penetram simultaneamente nos tecidos

dentários criando uma forte retenção micromecânica e reduzem a possibilidade de falhas, tais

como condicionamento excessivo e desidratação da dentina, evitando-se, assim, problemas na

adesão (SILVA, 2013; MOSZNER; SALZ; ZIMMERMANN, 2005; NAKABAYASHI;

KOJIMA; MASUHARA, 1982)

18

Como dito anteriormente, cada adesivo autocondicionante possui em sua

composição um monômero funcional específico, que exerce um papel fundamental na sua

performance (YOSHIDA et al., 2004; VAN LANDUYT et al., 2011). O monômero ácido

mais utilizado em sistemas adesivos atualmente é o 10-metacriloxidecil dihidrogênio fosfato

(10-MDP) (TAKAHASHI, 2014), no entanto, a tendência para o futuro são melhorias na

adesão química ao dente a partir da síntese de novos monômeros ácido-funcionais (VAN

MEERBEEK et al., 2011). Surge, nesse contexto, o GDMA-P, um monômero ácido funcional

dimetacrilato que tem habilidade de formar ligações cruzadas quando suas duplas ligações de

carbono reagem intermolecularmente com outra cadeia polimérica em crescimento ou

intramolecularmente com radicais livres na propagação da cadeia para oferecer maior grau de

conversão aos sistemas adesivos autocondicionantes e, consequentemente, menor

concentração de monômero residual.

Além dos monômeros, todo sistema adesivo possui algum tipo de solvente em sua

composição. Os mais utilizados são água, acetona e etanol onde sua principal função é

facilitar o molhamento da superfície dental pelos monômeros resinosos. Após o

condicionamento ácido, principalmente nos sistemas etch-and-rise, o solvente, por possuir

uma característica hidrófila, penetra na dentina úmida de forma a “guiar” os monômeros. Em

seguida, o solvente se une com moléculas de água que, com a aplicação de um leve jato de ar,

favorece a sua evaporação e remoção da água presente no substrato, deixando os monômeros

que serão polimerizados para formar a camada híbrida (REIS et al., 2003). Nos sistemas

autocondicionantes, o solvente utilizado é, normalmente, água e etanol. A presença de água,

nesses sistemas, é essencial para permitir a ionização dos monômeros ácidos e a

desmineralização do esmalte e dentina subjacentes, não dispensando, também, a aplicação de

um leve jato de ar para evaporação da água que pode ser prejudicial a vida clínica da

restauração (REIS; PEREIRA; GIANNINI, 2007).

Os sistemas adesivos podem ser de cura química, fotoativáveis ou duais. Estes

adesivos duais surgem a partir da adição de ativadores contendo co-iniciadores como sais de

sódio de ácidos aril-sulfínicos aos adesivos simplificados (KIM et al., 2013). Os mais

utilizados, no entanto, são os fotoativáveis e para que ocorra a reação de polimerização, são

necessárias moléculas fotoiniciadoras e de aminas aromáticas que são despertadas pela luz e

iniciam o processo (IKEMURA; ENDO, 2010). Em ocasiões onde a ativação com luz torna-se

inviável, são utilizados sistemas com cura química ou duais. Estes sistemas adesivos do tipo

“duais”, ou seja, ativados quimicamente e através da luz, são utilizados principalmente para

19

cimentação de restaurações indiretas e pinos pré-fabricados. É importante ressaltar que a

composição e concentração adequada de monômero ácido na composição de sistemas

adesivos autocondicionantes é essencial, afim de que os iniciadores e co-iniciadores não

sejam inibidos (MEEREIS et al., 2014; ZHANG; WANG, 2012; ARIKAWA et al., 2004).

Entre os fotoiniciadores, a Canforoquinona (CQ) é a mais utilizada na composição

de adesivos e é classificada como fotoiniciador tipo II (NORRISH et al, 1949) porque é

dependente de uma molécula doadora de elétrons chamada de co-iniciador, que pode ser uma

amina aromática que formam subprodutos durante a reação e são responsáveis, em parte, pelo

amarelecimento das restaurações (ALBUQUERQUE et al., 2013; STANSBURY, 2000;

ASMUSSEN, 1985). Além disso, a CQ produz um único radical livre ativo, o que diminui o

seu poder de conversão de monômeros em polímeros e favorece maior citotoxicidade de

sistemas adesivos pela presença de monômeros dispersos nos tecidos circunvizinhos, como a

polpa dentária (WEISBURGER et al., 1978; NOMURA et al., 2006).

Tentando resolver esse problema, tem se buscado fotoiniciadores alternativos

como Etil 4-dimetilamino benzoato (EDMAB), Difenilodônio hexafluorfosfato (DH) e Óxido

bis-alquil fosfínico (BAPO), por exemplo, menos citotóxicos comparados a CQ porque são

macromoléculas. O BAPO não necessita de amina terciária (tipo I) e produz quatro radicais

livres por molécula, oferecendo uma cor mais estética, bem como, maior reatividade na

formação de ligações cruzadas e propagação da rede polimérica, respectivamente.

(SALGADO et al., 2015; ALBUQUERQUE et al., 2013; SCHNEIDER et al., 2012; PRICE;

FELIX, 2009; NOMURA et al., 2006; NEUMANN et al., 2006; NEUMANN et al., 2005).

Além de monômeros, solvente e sistemas fotoiniciadores, componentes

inorgânicos, como partículas de carga, podem ser adicionados em uma tentativa de se obter

melhores características físico-mecânicas com suposta infiltração destas partículas na camada

híbrida. Análises microscópicas, no entanto, mostram que as partículas normalmente se

agregam no topo da camada híbrida, de forma a não compor completamente o corpo da

camada híbrida. Nunes, Swift e Perdigão (2001) avaliaram sistemas adesivos contendo carga

em comparação àqueles sem carga e concluíram que o sem partículas inorgânicas apresentou

maior resistência de união diante dos outros testados. Além disso, há a tentativa de inserção

de partículas de flúor para posterior liberação semelhante ao que ocorre nos materiais

ionoméricos, mas a eficácia ainda é controversa (REIS; PEREIRA; GIANNINI, 2007).

Diante de tantas particularidades exigidas para os sistemas adesivos e consequente

complexidade química que possuem, ainda se constitui um desafio a criação de materiais que

20

sejam completamente satisfatórios em todos os aspectos, necessitando de mais pesquisas e

estudos para o desenvolvimento de constituintes e uma combinação adequada.

2.2 CITOTOXICIDADE E LIBERAÇÃO DE RESÍDUOS DE SISTEMAS ADESIVOS E

SEUS COMPONENTES

Tão importante quanto proporcionar uma adesão duradoura e possuir boas

propriedades físicas, tendo em vista que os sistemas adesivos vão estar em contato com

dentina vital, eles devem estabelecer com as estruturas a que vão ser aplicados uma relação

harmônica e de biocompatibilidade (SCHWEIKL; SPAGNUOLO; SCHMALZ, 2006). Sabe-

se que a dentina, principalmente, é um tecido biológico complexo e que, por possuir túbulos,

pode ser uma via de conexão direta com a polpa dos elementos dentários, a depender da

proximidade/profundidade da restauração e da composição química dos sistemas adesivos

(GIANINNI et al., 2001).

Os túbulos apresentam formato cônico e convergem para a polpa com sua forma e

densidade variando dependendo da localização e de alterações no tecido dentário (GIANINNI

et al., 2001). A densidade tubular na dentina profunda de aproximadamente 45.000

túbulos/mm², enquanto na dentina superficial diminui para aproximadamente 20.000

túbulos/mm² (REIS; PEREIRA; GIANNINI, 2007).

Assim, apesar de existir um mecanismo biológico de defesa; o surgimento da

dentina reacionária e a diminuição do diâmetro dos túbulos nas proximidades da polpa,

eventualmente, os sistemas adesivos chegarão em maior ou menor grau às células do tecido

pulpar e causarão reações que podem ser de inflamações transitórias à necroses pulpares. Por

isso, é de grande importância que o perfil biológico dos sistemas adesivos sejam estudados

antes de ser aplicados (SCHWEIKL; SPAGNUOLO; SCHMALZ, 2006).

Como é praticamente impossível a análise das características biológicas dos

materiais in vivo, em humanos, pesquisas em animais e com cultura de células tem se tornado

comum. O estudo com animais, porém, torna-se demorado e muitas vezes inaplicável à

realidade humana devido às proporções dos modelos animais utilizados. Nesse contexto, a

cultura de células torna-se mais rápida, mais facilmente reprodutível e aplicável

(SCHUESTER et al., 2001). Entre os testes utilizados para avaliar viabilidade

celular/citotoxicidade de sistemas adesivos, os mais comuns são MTT Assay, Alamar Blue e

teste da barreira dentinária (SILVA et al., 2013; ELIAS et al., 2015).

21

Lee et al. (2016) avaliaram a citotoxicidade através do teste de MTT de células

odontoblásticas expostas a adesivos autocondicionantes e concluiu que todas as marcas

testadas induziram atividade apoptótica, variando entre os produtos testados. Lanza et al.

(2009) chegaram a resultados similares ao avaliar o poder de difusão em dentina e a

citotoxicidade de sistemas adesivos autocondicionantes através do teste MTT. Segundo os

autores, as quatro marcas testadas apresentaram poder de difusão em dentina e induziram uma

significante redução da atividade celular na linhagem testada. Kusdemir et al. (2011)

avaliaram a citotoxicidade de seis sistemas autocondicionantes em células L929 e concluiu

que todos apresentaram toxicidade em maior ou menor grau, a depender da marca. Assim, é

quase consensual o poder citotóxico dos sistemas adesivos, apontando para a necessidade e

desafio de desenvolver de novos monômeros, componentes e adesivos, em geral, com menor

potencial lesivo.

Uma das principais problemáticas no que se refere à toxicidade de sistemas

adesivos, refere-se a presença de componentes residuais na interface adesiva. Com a evolução

dos sistemas adesivos, há uma perspectiva de se adicionar mais componentes nos frascos,

como já relatado. Após a ativação e reação de polimerização, há uma taxa de monômeros e

outras substancias residuais que não participam da reação e ficam na interface adesiva

(SILVA et al., 2013). Esses monômeros, tais como HEMA, BisGMA, entre outros, são

tóxicos e podem penetrar nos túbulos dentinários e ocasionar danos pulpares (ELIAS et al.,

2015). O monômero HEMA, por exemplo, é amplamente utilizado em sistemas adesivos e

possui baixo peso molecular e uma característica hidrofílica que facilita a penetração e

difusão no complexo dentino-pulpar (BARBOSA et al., 2015).

Muito além do complexo dentino-pulpar, os monômeros residuais podem entrar

em contato com gengiva e mucosas (VAN LANDUYT et al., 2011), apresentando potencial

genotóxico, mutagênico e indutor de apoptose. Dessa forma, características básicas de

componentes químicos dos adesivos tem relação direta com a possível toxicidade do material

não apenas pelo potencial tóxico inerente da sua composição química, mas, também, pela sua

função dentro do adesivo. Fotoiniciadores com alto poder reativo, unidade fotoiniciadora

capaz de ativar adequadamente os iniciadores, monômeros com alto poder de ligação e

solventes estáveis e que não interfiram na ação dos outros constituintes, por exemplo, podem

proporcionar um maior grau de conversão de forma a diminuir o acúmulo de substâncias

residuais na interface adesiva.

22

Nesse contexto, torna-se pertinente a avaliação da citotoxicidade de forma indireta

através da avaliação e quantificação desses componentes residuais após a polimerização dos

adesivos. Para essa análise, a Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) vem sendo

empregada (ELIAS et al., 2015; DANESH et al., 2012; PONGPRUEKSA et al., 2014). Este

método se apresenta como um excelente separador dos componentes individuais com alta

confiabilidade e eficiência na análise utilizado para o controle de qualidade das drogas

produzidas na indústria farmacêutica (SOLON et al., 2016). Pongprueksa et al. (2014)

avaliaram a eluição dos monômeros HEMA e Bis-GMA através de HPLC em 8 formulações

de adesivos, com diferentes fotoiniciadores, e concluíram que o fotoiniciador utilizado possui

importante papel na concentração residual dos monômeros corroborando com outros estudos

que utilizaram HPLC para aferir a interferência de fatores como unidades fotoativadores,

fotoiniciadores e monômeros constituintes na proporção de monômeros residuais liberados.

Mais uma vez deparamos com a complexidade que é desenvolver sistemas

adesivos que associem protocolos simplificados, boas características físico-mecânicas e que

respeite os princípios biológicos do complexo sistema dentino-pulpar e tecidos adjacentes,

nos indicando a necessidade de mais pesquisas e estudos.

2.3 RESISTÊNCIA FLEXURAL E MÓDULO DE ELASTICIDADE DE SISTEMAS

ADESIVOS

Conhecer as propriedades físico-mecânicas dos sistemas adesivos e das resinas

compostas utilizadas é de grande importância para que possamos predizer o comportamento

destes materiais diante das forças mastigatórias impostas sobre estes materiais em boca.

Nesse quesito, avaliar a resistência flexural e o módulo de elasticidade nos

permite ter noção da deformação desses materiais, tendo em vista que essas propriedades nos

propicia estimar a quantidade de tensão que o material pode suportar em áreas de grande

esforço mastigatório (GORACCI et al., 2014). Reproduzir este complexo sistema de forças

mastigatórias “in vitro”, no entanto, se estabelece como um grande desafio metodológico

(KUMAR, 2013). A literatura relata alguns testes para avaliar essas propriedades nos

materiais resinosos, tais como: teste flexural de três pontos, teste flexural de quatro pontos,

teste de flexão biaxial, mini flexão, entre outros. De acordo com a International Standards

Organization (ISO), o teste de flexão com três pontos é o ideal para ser utilizado em

compósitos resinosos (KUMAR, 2013).

23

O teste de flexão em três pontos utilizar espécimes em barra (25 mm x 2 mm x 2

mm) que são colocados sobre suportes a 20 mm de distância e empurrados por um êmbolo a

uma velocidade média de 0,75 mm/min de forma que a força de flexão é feita na superfície

inferior da amostra (KUMAR, 2013). No entanto, são relatados problemas diante desse teste:

podem ocorrer falhas nas bordas que levem a fratura não necessariamente no ponto da flexão,

que pode originar vieses, além disso, devido ao tamanho longo da amostra (25mm), o

procedimento de fotoativação pode ser inadequado ou insuficiente, mesmo sendo feito de

forma padronizada como exige a ISSO 4049, pois a ativação ocorre de forma intensa no ponto

principal de foco de luz e não nas bordas, favorecendo a fratura do espécime (YAP; TEOH,

2003; PALLIN et al., 2003; PALLIN; FLEMING; MARQUIS, 2005). Um fator notório é a

discrepância de se avaliar resistência flexural de sistemas adesivos em barras com 2 mm de

espessura, uma condição inatingível clinicamente e que dificulta correlacionar os achados “in

vitro” com o que ocorre no ambiente bucal.

O teste flexural de quatro pontos utiliza espécimes semelhante ao de três pontos,

no entanto, as amostras recebem carga em dois pontos, com distância padronizada, de forma

que neste teste a flexão máxima ocorre entre os dois pontos de carga, ao contrário do de três

pontos que ocorre na superfície inferior do espécime (KUMAR, 2013). Um ponto positivo

deste teste é geração de forças uniformes em todo o espécime e não apenas próximo ao ponto

de carga, podendo ser mais representativo, diante de que um maior volume da amostra é

estressado (HAMMANT et al., 1971). Apesar disso, é pouco utilizado devido à dificuldade

metodológica comparado ao de três pontos.

O teste biaxial é comumente utilizado para avaliar resistência flexural de materiais

cerâmicos (ADDISON; MARQUIS; FLEMING, 2007). Para este teste, em geral, se utiliza

um espécime circular com 12 mm de diâmetro, que representa o que seria o diâmetro médio

de um molar e permite uma fotoativação homogênea no centro do espécime, e 1 mm de

espessura e a principal vantagem desse teste é que o estresse máximo feito pela carga de força

é colocado no centro do espécime, eliminando as possíveis falhas que ocorrem no teste de

resistência a flexão de três pontos (KUMAR, 2013).

Além destes testes, uma metodologia que pode ser utilizada é o teste de mini

flexão. Tal método utiliza mecanismos idênticos ao teste de flexão de três pontos, no entanto,

o espécime possui 12 mm de comprimento, tentando chegar mais próximo das dimensões

dentárias, ao invés de 25 mm, como preconiza a ISSO 4049. Uma vantagem dessa

24

metodologia é que permite uma fotoativação única no espécime, fato que inviabiliza a

problemática referida ao teste de três pontos (YAP; TEOH, 2003).

Yap e Teoh (2003) compararam a resistência flexural de materiais resinosos

usando o teste de três pontos e o de mini-flexão e chegaram à conclusão de que há uma alta

correspondência entre os valores apresentados por ambos os testes. No entanto, por se

apresentar mais fácil de ser feito, o teste de mini-flexão se mostrou mais adequado. Além de

ser mais simples de ser feito o espécime, o teste de mini-flexão se mostra vantajoso, pois o

tamanho do espécime se assemelha mais às dimensões dentárias reais (aproximadamente 12

mm, correspondente ao que seria um molar), usa menos material para construção do espécime

e, de forma geral, consegue se aproximar mais do que acontece clinicamente, nos permitindo

estender os resultados para nos guiar quanto a escolha dos materiais usados em consultório.

Um outro ponto levantado pelos pesquisadores sobre os testes que mensuram

resistência flexural e módulo de elasticidade é o material utilizado como matriz para a

construção dos espécimes. De acordo com Kamur (2013), diferentes materiais podem

proporcionar uma dissipação diferente da luz no material e alterar propriedades, tais como

grau de conversão, que sabidamente tem influência nas propriedades físico-mecânicas. Dessa

maneira, a literatura tem se mostrado vasta quanto aos testes possíveis para avaliar a

resistência a flexão/módulo de elasticidade dos materiais resinosos se que, apesar da ISO

4049 ser bastante aceita, as pesquisas mostram que outros testes talvez se adequem mais a

realidade clínica. Cabe, portanto, ao pesquisador selecionar o teste a ser utilizado devendo

sempre preconizar aqueles que nos propiciem resultados mais fidedignos ao que ocorre no

ambiente bucal.

25

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o comportamento físico e biológico de sistemas adesivos experimentais a

base de GDMA-P.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Mensurar influência da concentração de GDMA-P/UDMA na liberação de

monômeros residuais, citotoxicidade e resistência flexural/módulo de elasticidade.

b) Avaliar a influência do tipo de fotoiniciador CQ + EDMAB, BAPO e CQ +

BAPO + EDMAB na liberação de monômeros residuais, citotoxicidade e resistência

flexural/módulo de elasticidade.

26

4 MÉTODO

4.1 CARACTERÍSTICAS DA PESQUISA

Este estudo é caracterizado como um ensaio laboratorial “in vitro”, cujas

variáveis de resposta são citotoxicidade, resistência flexural/módulo de elasticidade e

liberação de monômeros residuais. Os fatores em estudo são a concentração de GDMA-

P/HEMA/UDMA(10/30/30; 20/30/20 e 30/30/10) e o sistema fotoiniciador utilizado: (CQ

+ EDMAB + DH); (BAPO + DH) e (CQ+ BAPO + EDMAB + DH).

4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

A presente pesquisa foi submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa

CEP/UFRN, CAAE 85587317.3.0000.5537, tendo seu parecer (2.628.345) liberado como

aprovado, estando, assim, de acordo com as normas e diretrizes regulamentadoras de

pesquisas envolvendo seres humanos regidas pela resolução nº 466/2012 – CNS.

4.3 SÍNTESE DO MONÔMERO ÁCIDO

O monômero dimetacrilato de 1,3-glicerol fosfato (GDMA-P) foi sintetizado

de acordo com o método previamente descrito (LEAL et al., 2011; OGLIARI et al., 2008).

Pentóxido de fósforo (Vetec, Duque de Caxias, RJ, Brasil) foi lentamente adicionado

dentro de um balão de vidro, por meio de um funil de adição, com uma mistura de GDMA

diluído em solvente, o cloreto de metileno (DIST Indústria Comércio e Serviços Ltda,

Florianópolis, SC, Brasil), agitado magneticamente (IKA RCT, Rio de Janeiro/RJ) durante

6 h e resfriado em banho de gelo. Em seguida, o banho de gelo foi removido e a reação

continuou à temperatura ambiente durante 24 h.

O produto final (GDMA-P) foi filtrado, adicionado hidroxibutil tolueno

(inibidor) e, então, o solvente foi evaporado em um evaporador rotativo à vácuo (Modelo

MA 055, Marconi – Equipamentos para laboratório, Piracicaba, SP, Brasil) por 9 h a uma

temperatura de 50°C. Para confirmar a síntese do monômero ácido (Figura 2 - seção

Apêndices), o produto final da reação foi avaliado através da espectroscopia

27

infravermelha por transformada de Fourier (Prestige21 Spectrometer, Shimadzu, Tóquio,

Japão) (LEAL et al., 2011).

Figura 1 - Imagem caracterizando a reação de síntese do monômero GDMA-P

Fonte: o autor (2018).

4.4 FORMULAÇÃO DOS SISTEMAS ADESIVOS EXPERIMENTAIS SIMPLIFICADOS

Nove sistemas adesivos experimentais simplificados foram preparados variando a

composição monomérica e o sistema fotoiniciador baseado no estudo de Loguercio et al.

(2013) (figura 2). Três comonômeros (70% em massa) compostos de 1,3-dimetacrilato de

glicerol fosfato (GDMA-P, monômero ácido), metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA,

monômero hidrofílico) e uretano dimetacrilato (UDMA, monômero hidrofóbico) foram

utilizados, variando apenas a proporção de GDMA-P e UDMA. Os solventes utilizados foram

etanol e água destilada na proporção de 1:1(p/p) (MACEDO et al., 2015).

Neste estudo, foi utilizado 12% em massa de solvente, que equivale ao solvente

residual presente após evaporação (MORAES et al., 2012). Três sistemas iniciadores foram

testados, contendo Canforoquinona (CQ, fotoiniciador), Óxido bis-alquil fosfínico (BAPO,

fotoiniciador alternativo), Etil 4-dimetilamino benzoato (EDMAB, co-iniciador/amina

terciária) e Difenilodônio Hexafluorfosfato (DH, co-iniciador) em diferentes combinações.

Descrição detalhada das proporções de cada componente presente nas 9

formulações está contida na figura 2. Com exceção do BAPO (Ciba-Geisy,Basel,

Swirtizeland), todos os fotoiniciadores e co-iniciadores foram obtidos através da Sigma-

Aldrich (Milwaukee, Wisconsin, USA) e os monômeros através da Esstech Inc. (Essington,

28

Pennsylvania, EUA), com exceção do GDMA-P que foi sintetizado tal como descrito

anteriormente (LEAL et al., 2011; OGLIARI et al., 2008).

Figura 2 - Imagem com detalhamento da formulação dos sistemas adesivos.


Legenda: GDMA-P: 1,3-dimetacrilato de glicerol fosfato, HEMA: metacrilato de 2-hidroxietilo,

UDMA: uretano dimetacrilato, CQ: Canforoquinona, BAPO: Óxido bis-alquil fosfínico, EDMAB: Etil

4-dimetilamino benzoato, DH: Difenilodônio Hexafluorfosfato.

4.5 ANÁLISE DA CITOTOXICIDADE

Para avaliar a citotoxicidade, seguiu-se o método descrito por Elias et al.

(2015) com algumas adaptções. Para os ensaios de citotoxicidade foram utilizados

fibroblastos da linhagem NIH/3T3, obtidos a partir de camundongos NIH/Swiss e

comercializadas pela American Type Culture Collection (ATCC, USA). As células foram

expandidas em garrafas de cultivo celular (TTP, Switzeland) contendo meio de cultivo

DMEM enriquecido com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos e antimicóticos

(todos da Gibco, USA). A citotoxicidade foi avaliada pelos ensaios do MTT e do Alamar

Blue. Para tanto, as células foram previamente cultivadas em placas de 96 poços, na

29

densidade de 5x103 células por poço, para garantir a adesão celular à superfície do plástico de

cultivo.

Foram utilizados discos de papel absorvível (diâmetro de 6 mm). Para cada

adesivo, n=8, foram dispensadas sobre os discos de papel gotas padronizadas de 5 µL com

auxílio de uma micropipeta de alta precisão (Digipet, Paraná, Brasil), colocada uma tira de

poliéster sobre, uma lâmina de vidro e em seguida fotoativadas durante 20 s com uma unidade

fotoativadora LED de terceira geração geração Bluephase (G2, Ivoclar Vivadent, Schaan,

Liechtenstein) colocada exatamente sobre a lâmina de vidro. Após isso, os círculos foram

colocados no fundo dos poços da placa de 96 poços, de forma que a superfície que recebeu a

gota ficasse voltada para cima, e o meio contendo a cultura foi vertido sobre estes papéis de

forma a ficar 24 h a 37ºC em contato com as células e seguiram para os testes. Todos os

experimentos foram realizados em duplicata (Figura 3, seção Apêndices).

O ensaio do Alamar Blue (Invitrogen, USA) consiste em um método

colorimétrico que permite a detecção da atividade metabólica das células a partir da redução

da resazurina (7-hidroxi-3H-fenoxazina-3-ona 10-óxido), um corante azul fracamente

fluorescente, em resorufina, um corante rosa com altíssima fluorescência em vermelho.

Decorridas 24 h de contato com os adesivos, o meio foi removido e as células foram

cultivadas com 10 µL de Alamar blue (Invitrogen, USA) e 90 µL de meio DMEM, a 37°C em

atmosfera úmida com 5% de CO2, por 4 h, de acordo com o protocolo do fabricante. Após

quatro horas, as absorbâncias das soluções foram medidas em leitor de microplaca (Epoch-

Biotech Instruments, USA) nos comprimentos de onda de 570 nm (forma reduzida) e 600 nm

(forma oxidada).

O ensaio de MTT avalia a atividade metabólica das células quantificando a

redução do MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] por

desidrogenases mitocondriais, que resulta na produção de cristais de formazam intensamente

corados no interior das células. Decorridas 24 h de contato com os adesivos, as células foram

incubadas com 100 µL de meio de cultura contendo 1mg/mL de MTT por 4 h e em seguida o

produto colorimétrico (formazan) foi solubilizado com 100 µL de dimetilsufóxido (DMSO).

A absorbância das amostras foi medida em espectofotômetro (Epoch-Biotech Instruments,

USA) no comprimento de onda de 570 nm.

O meio de cultura puro, sem adição de células, foi considerado como branco do

ensaio e o meio contendo 10% de Alamar Blue o controle negativo. A redução do Alamar

Blue foi então calculada a partir da equação fornecida pelo fabricante.

30

Figura 3-Imagem ilustrativa de metodologia da análise da citotoxicidade.


Legenda: A: círculos de papel após corte; B: gotejamento de gota padronizada dos sistemas adesivos;

C: cobertura com tira de poliéster + lâmina de vidro + fotoativação por 20 s; D: inserção do papel com

adesivo fotoativado no fundo do poço; F: inserção do meio de cultura DMEM + células sobre os

papéis impregnados com adesivos e manutenção durante 24h; G: análise de citotoxicidade através dos

testes MTT Assay e Alamar Blue.

4.6 LIBERAÇÃO DE MONÔMEROS RESIDUAIS

Para avaliação da liberação de monômeros residuais foi utilizado como

base, com algumas adaptações, o método descrito por Miletic, Santini e Trkulka (2009).

Foram utilizados 54 terceiros molares humanos, n=6, livres de rachaduras e defeitos,

desinfetados em timol (0,1%) a 40ºC por uma semana. O esmalte da face oclusal foi

seccionado transversalmente ao sentido do longo eixo do dente com discos diamantados

refrigerados à água (South Bay Technology, San Clement, CA) acoplados a uma máquina de

corte (Isomet 1000; Buehler, Lake Forest) de forma deixar apenas a dentina logo abaixo da

junção amelodentinária exposta. Na sequência, foi feita outra secção paralela à anterior com

31

os mesmos discos diamantados, rente ao teto da câmara pulpar, de forma a proporcionar uma

pastilha de tecido dentinário rodeada por esmalte correspondentes as faces vestibular, mesial,

lingual/palatina e distal. O esmalte que margeia toda essa pastilha de dentina foi recortado em

cortes retos de forma a tornar essa superfície retangular e em seguida, essa fatia de dentina foi

lixada com discos de granulação 400 e 600 (Labopol-21, Copenhagen, Denmark). A partir da

divisão desse substrato de dentina obtido, foram feitas amostras com dimensões padronizadas

de 5 mm x 6 mm.

As amostras foram impregnadas com os sistemas adesivos experimentais (n=6)

através da dispensão de uma gota de volume padronizado com 5 µL com auxílio de uma

micropipeta de alta precisão (Digipet, Paraná, Brasil), friccionada durante 20 s com

microbrush (KG Sorensen, Cotia, SP, Brasil), colocada uma tira de poliéster sobre a face e

fotoativada durante 20 s, com uma unidade fotoativadora LED de terceira geração geração

(Bluephase G2, Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein). Após fotoativados, os espécimes

foram armazenados em uma solução de metanol (75%)/ água (25%) durante 24 h para

liberação dos monômeros residuais que não participaram do processo de polimerização

(Figura 4).

A liberação de monômeros residuais foi analisada por cromatografia líquida de

alta eficiência com detector do tipo “diode array detector” (CLAE-DAD), para separação dos

monômeros HEMA, UDMA e GDMA-P. Foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta

eficiência da marca Shimadzu (Tóquio, Japão), composto por bomba analítica binária (LC-

20A3 XR), injetor automático (SIl-20AD XR), desgaseificador ( DGU- 20A3), forno para

colunas (CTO- 20AC) e, detector de arranjo de diodos (SPD-M20A), com sistema controlado

pelo software LC Solution®. A coluna utilizada foi do tipo Shimpack XR-005 SOL x 3.0

Shimadzu ®, C18, 50 x 50 mm; a 40ºC. Anteriormente a injeção, a amostra foi solubilizada

em metanol/H2O na concentração de 1:1, foram injetados 2 µL. A fase móvel utilizada foi um

gradiente de eluição com os solventes H2O e Acetonitrila (0:7min 35% acetonitrila/ 65% H2O

- fase A) e (7:18min 80% acetonitrila/0%H2O - fase B). O fluxo utilizado na coluna foi de 0,2

mL/min.

Para ser feita a porcentagem de monômeros liberados, foi dispensada uma gota de

5 µl de cada um dos nove adesivos em um eppendorf com mesmo eludato em que foram

colocados os espécimes. Os adesivos não foram fotoativados. Os 9 espécimes foram

submetidos a análise em cromatografia líquida de alta eficiência para separação dos

monônomeros estudados e, dessa forma, foi obtido um referencial de 100% de monômeros

32

que podem ser liberados. A proporção foi feita, assim, dividindo-se o valor liberado dos

espécimes por esse valor total máximo obtido.

Figura 4-Imagem ilustrativa com metodologia para análise de liberação de monômeros residuais.


Legenda: A: cortes transversais ao longo eixo para obtenção de fatia de tecido dentário; B: corte das

bordas mesial, distal, vestibular e lingual/palatina para obtenção de substrato apenas dentinário; C:

secção de substrato dentinário para obtenção de espécime de tamanho padronizado; D: acabamento e

padronização do espécime; E: gotejamento de gota padronizada de cada sistema adesivo manipulado;

F: fricção com microbrush durante 20 s; G: cobertura com tira de poliéster + lâmina de vidro +

fotoativação durante 20 s; H: imersão em meio 25% água / 75% metanol durante 24h e na sequência

submissão dos eludatos a avaliação em HPLC.

4.7 RESISTÊCIA FLEXURAL E MÓDULO DE ELASTICIDADE

A resistência flexural e módulo de elasticidade foram avaliados de acordo com a

norma ISO 4049 de 2009. Sete corpos de prova de cada adesivo foram confeccionados numa

matriz de aço inoxidável com as medidas de 25 ±0,2 mm x 2 ±0,1mm x 2 ±0,1mm resultando

um total de 63 amostras. Foram dispensadas gotas dos adesivos na matriz e coberta com uma

fita de poliéster, mas comprimida suavemente, na extremidade superior, com uma lâmina para

microscopia, com a finalidade de formar uma superfície regular.

A fotoativação foi realizada durante 20 s com com uma unidade fotoativadora

LED de terceira geração (Bluephase G2, Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein), a ponta do

LED foi colocada diretamente sobre a lâmina acima da matriz, em três lugares distintos do

espécime. As faces superior e inferior das amostras foram lixadas com lixas de granulação

33

400 e 600 (Labopol-21, Struers, Copenhagen, Denmark) e mantidas em uma estufa a 37°C

durante 24 h até a realização do teste.

Para mensurar a Resistência flexural e o Módulo de elasticidade, foi realizado o

teste de flexão em três pontos, realizado em uma Máquina de Ensaios Universal (Instron

4111, Instron Corp., Dayton, OH, USA) onde a amostra em barra foi colocada sobre dois

suportes (dois pontos) e um embolo (terceiro ponto e responsável pela aplicação da carga) foi

pressionado perpendicularmente sobre a amostra, à uma velocidade de 0,75 mm/min com uma

carga de 50N até a ruptura. Para calcular os valores, foi utilizado o software Bluehill 2

(Illinois Tool Works, Inc., Glenview, IL, USA).

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados são apresentados como médias + erro padrão da média. Os valores finais

das amostras de cada teste foram submetidos ao teste de normalidade através do teste de

Kolmogorv – Sminorv e, em seguida, submetidos a análise de variância (ANOVA) a dois

fatores, seguida pelo teste de Tukey (p <0,05) através do software GraphPad Prism 7.

34

5 RESULTADOS

5.1 ANÁLISE DA CITOTOXICIDADE

5.1.1 ALAMAR BLUE

Houve diferença estatisticamente significativa entre as porcentagens de GDMA-P

(p<0,001), entre os fotoiniciadores (p<0,0001) e na interação % de GDMA-P versus tipo de

foto iniciador (p<0,001). Ao comparar entre grupos de fotoiniciadores iguais para as

diferentes proporções de GDMA-P, para os três grupos, a concentração de 10% proporcionou

maior taxa de viabilidade celular. A proporção que apresentou maior citotoxicidade foi a de

30% para os três grupos de fotoiniciador. Comparando entre as mesmas concentrações e

diferentes fotoiniciadores, não houveram diferenças estatisticamente significativas.

Tabela 1 - Resultados das médias do percentual de redução de Alamar Blue em células NH3-T3 ±

desvio padrão para concentração de GDMA-P utilizada versus tipo de fotoiniciador comparados ao

grupo controle.

Concentração de GDMA-P

Fotoiniciador 10% 20% 30% 0%

CQ 33,47 ± 0,89 Bb 29,32 ± 1,66 Cb 25,13 ± 4,27 Db 60,63 ± 3,38 Aa

BAPO 32,00 ± 1,87 Bb 29,55 ± 2,34 CBb 27,73 ± 1,16 Cb 60,63 ± 3,38 Aa

CQ+BAPO 32,94 ± 1,71 Bb 29,78 ± 2,25Cb 25,56 ± 3,28 Db 60,63 ± 3,38 Aa

0% 60,63 ± 3,38 Aa 60,63 ± 3,38 Aa 60,63 ± 3,38 Aa 60,63 ± 3,38 Aa

Diferença entre letras maiúsculas expressam diferença estatisticamente significativa nas linhas.

Diferenças entre letras minúsculas expressam diferença estatisticamente significativa nas colunas.


5.1.2 MTT ASSAY



foto iniciador (p<0,0021). Para todos os grupos, não houve diferenças entre os grupos para as

diferentes concentrações de GDMA-P e grupos de fotoiniciador.

35

Tabela 2 - Resultados das médias do percentual de sobrevida de células NH3-T3 em MTT Assay ±

desvio padrão para concentração de GDMA-P utilizada versus tipo de fotoiniciador comparados ao

grupo controle.


Fotoiniciador 10% 20% 30% 0%

CQ 0,067 ± 0,008 Bb 0,060 ± 0,007 Bb 0,063 ± 0,011Bb 0,107 ± 0,026 Aa

BAPO 0,060 ± 0,004 Bb 0,064 ± 0,009 Bb 0,063 ± 0,008 Bb 0,107 ± 0,026 Aa

CQ+BAPO 0,060 ± 0,004 Bb 0,056 ± 0,002Bb 0,059 ± 0,006 Bb 0,107 ± 0,026 Aa

0% 0,107 ± 0,026 Aa 0,107 ± 0,026 Aa 0,107 ± 0,026 Aa 0,107 ± 0,026 Aa




5.2 LIBERAÇÃO DE MONÔMEROS RESIDUAIS

5.2.1 HEMA

Houve diferença estatisticamente significativa entre as porcentagens de HEMA


foto iniciador (p<0,0001).

Para a liberação de monômeros HEMA, a concentração 10% de GDMA-P liberou

mais monômeros quando em associação com os fotoiniciadores CQ e CQ+BAPO. Quando

utilizado o fotoiniciador BAPO, não houve diferença entre as diferentes concentrações para

liberação de HEMA. Para as mesmas concentrações de GDMA-P e diferentes fotoiniciadores,

os grupos de fotoiniciadores contendo BAPO liberaram menos monômeros HEMA para as

concentrações de 10% e 30%. Para a concentração de 20%, não houve diferença entre os tipos

de fotoiniciador utilizado.

Tabela 3 - Resultados das médias do percentual monômeros HEMA liberados ± desvio padrão, de

acordo com a porcentagem de GDMA-P, versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle.


Fotoiniciador 10% 20% 30%

CQ 62,84 ± 2,50 Aa 26,93 ± 13,46 Ba 35,86 ± 2,00 Ba

BAPO 31,83 ± 4,19 Ab 27,89 ± 4,84 Aa 24,01 ± 3,33 Ab

CQ+BAPO 26,30 ± 3,79 Ab 31,76 ± 3,63 ABa 36,84 ± 7,81 Ba

36




5.2.2 UDMA




Para liberação de UDMA, para os mesmos fotoiniciadores e diferentes

concentrações de GDMA-P, apenas CQ apresentou diferença significativa, sendo a

concentração 10% a que mais liberou monômero UDMA. Para CQ, a concentração que menos

liberou UDMA foi 20% de GDMA-P. Entre as mesmas concentrações, para 10% e 30% CQ

proporcionou maior liberação de monômeros. Independente da concentração: BAPO e

CQ+BAPO não alteraram a liberação de UDMA.

Tabela 4 - Resultados das médias do percentual monômeros UDMA liberados ± desvio padrão, de

acordo com a porcentagem de GDMA-P, versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle.



CQ 44,43 ± 1,96 Aa 15,92 ± 2,19 Ca 36,76 ± 1,57 Ba

BAPO 16,11 ± 3,92 Ab 17,89 ± 3,33 Aa 14,79 ± 1,90 Ab

CQ+BAPO 13,26 ± 0,54 Ab 14,38 ± 1,80 Aa 13,44 ± 2,29 Ab




5.2.3 GDMA-P




Para os mesmos grupos de fotoiniciadores e diferentes concentrações, todos os

grupos apresentaram diferenças significativas. Entre os mesmos fotoiniciadores e diferentes

concentrações de GDMA-P, para CQ a concentração 10% liberou mais GDMA-P e a 20% se

37

apresentou com menor liberação entre as 3. Para BAPO, a concentração 20% se apresentou

com maior liberação de GDMA-P. Para o grupo CQ+BAPO, 20% apresentou menor liberação

de GDMA-P. Entre as mesmas concentrações e diferentes fotoiniciadores, todos os grupos

apresentaram diferenças significativas. CQ apresentou maior liberação de GDMA-P para 10%

e 30%. Para a concentração de 20%, BAPO apresenta maior liberação de GDMA-P.

Tabela 5 - Resultados das médias do percentual monômeros GDMA-P liberados ± desvio padrão,

versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle.



CQ 34,97 ± 1,31 Aa 9,45 ± 0,28 Cb 26,95 ± 3,36 Ba

BAPO 9,39 ± 2,11 Bc 15,27 ± 2,63 Aa 10,37 ± 2,18 Bc

CQ+BAPO 14,72 ± 2,52 Ab 11,00 ± 0,76 Bb 13,98 ± 2,10 ABb




5.3RESISTÊNCIA FLEXURAL


(p<0,001) e na interação % de GDMA-P versus tipo de foto iniciador (p=0,001). Comparando

entre os mesmos fotoiniciadores para diferentes concentrações, apenas os grupos BAPO e

CQ+BAPO apresentaram diferenças. Para o grupo BAPO, a concentração que permitiu maior

resultado de resistência flexural foi 10%. Para CQ+BAPO, as concentrações de 20% e 30%

proporcionaram maiores valores de resistência flexural. Entre as mesmas concentrações e

diferentes fotoiniciadores, o único grupo que apresentou diferenças foi 10% de GDMA-P.

Neste grupo, BAPO proporcionou o maior valor de resistência flexural.

Tabela 6 - Resultados das médias do módulo de Resistência Flexural (MPa) ± desvio padrão para

concentração de GDMA-P utilizada versus tipo de fotoiniciador.



CQ 345,24 ± 10,02 Ab 345,62 ± 7,91Aa 330,86 ± 22,65Aa

BAPO 398,62 ± 38,27 Aa 363,25 ± 26,28 ABa 351,33 ± 32,57 Ba

CQ+BAPO 302,00 ± 56,86 Bc 383,44 ± 43,03Aa 369,32 ± 14,89 Aa

38




5.4 MÓDULO DE ELASTICIDADE


(p<0,001) e na interação % de GDMA-P versus tipo de foto iniciador (=0,001). Para o módulo

de elasticidade, o único grupo que apresentou estatística significativamente diferente foi o de

concentração 30% GDMA-P, sendo que a combinação de fotoiniciadores BAPO/CQ

possibilitou o maior valor de módulo de elasticidade.

Tabela 7 - Resultados das médias do módulo de elasticidade (MPa) ± desvio padrão para concentração

de GDMA-P utilizada versus tipo de fotoiniciador.



CQ 20,2 ± 0,89 Aa 19,00 ± 1,29 Aa 12,2 ± 2,19Bb

BAPO 20,0 ± 3,31 Aa 18,31 ± 1,33 Aa 10,8 ± 2,11 Bb

CQ+BAPO 18 ± 2,64 Aa 19,00 ± 3,51Aa 16,4 ± 2,55 Aa




39

6 DISCUSSÃO

A hipótese de que as formulações de adesivos experimentais com diferentes

concentrações de GDMA-P/fotoiniciadores não apresentariam diferenças para as variáveis de

resposta testadas foi negada porque tanto para citotoxicidade, quanto para liberação de

monômeros residuais e resistência flexural/módulo de elasticidade, os grupos se expressaram

de formas diferentes. Apenas para a avaliação da citotoxicidade através do teste MTT Assay

os nove sistemas adesivos testados não apresentaram diferenças entre si.

Um sistema adesivo ideal deve apresentar-se como biocompatível, não tóxico,

apresentar uma baixa dispersão entre os tecidos e fluidos corporais e possuir um baixo

potencial alergênico, no entanto, essas características tem se apresentado controversas para os

adesivos autocondicionantes de um passo (SUN et al., 2016). Assim, ao avaliar os sistemas

adesivos autocondicionantes de um passo utilizados neste estudo, com relação à

citotoxicidade avaliada através do teste Alamar Blue (Tabela 1), ao comparar entre grupos de

fotoiniciadores iguais para as diferentes proporções de GDMA-P, a concentração de 10% para

os três grupos de fotoiniciadores testados proporcionou maior taxa de viabilidade celular. Esta

concentração, entre as três estudadas, é a que possui menos monômeros ácidos.

A quantidade de monômeros ácidos é um fator predominante para o pH dos

sistemas adesivos (YASUDA et al., 2008; COSTA et al., 1999), de forma que quanto menor a

concentração, menos ácido e menor o potencial de agressividade ao tecido pulpar e tecidos

circunvizinhos. Sun et al. (2016) avaliaram adesivos autocondicionantes de um passo e

perceberam que a acidez dos quatro sistemas adesivos testados foi diretamente proporcional a

citotoxicidade apresentada, de forma que, quanto mais ácido, mais citotóxico. Dessa forma, a

concentração de 10% de GDMA-P ter apresentado uma menor citotoxicidade corrobora com

os achados na literatura e nos aponta para uma necessidade de monômeros ácidos cada vez

mais dinâmicos e capazes de exercer a função de desmineralização/infiltração nos substratos

dentários sem ser necessárias grandes concentrações que podem tornar o material

biologicamente inadequado aos tecidos.

Essa citotoxicidade reduzida na concentração de 10% de GDMA-P, além de ter

relação com a própria acidez dos monômeros, pode ter relação com a inibição dos

fotoiniciadores e consequentemente o grau de conversão (CG). O GC é a porcentagem de

monômeros que se unem para formar polímeros durante a reação de polimerização

(GALVÃO et al., 2013). Quanto maior a porcentagem, melhores são as propriedades de

40

estabilidade de cor, dureza superficial, módulo de elasticidade, resistência flexural e

resistência ao desgaste (LOVELL; NEWMAN; BOWMAN, 2003). Para iniciar a conversão,

as moléculas fotoiniciadoras são ativadas por luz e inicia-se, assim, a reação (GANGLIONE

et al., 2012). A literatura, no entanto, tem relatado que a estabilidade destas moléculas

fotoiniciadoras depende, também, da acidez da solução de forma que com acidez elevada, elas

podem ser inativadas (MEEREIS et al., 2014; ZHANG; WANG, 2012; ARIKAWA et al.,

2004). Com a inativação dos fotoiniciadores, o grau de conversão acaba sendo menor e,

consequentemente, a taxa de monômeros residuais na interface adesiva fica aumentada.

Os estudos relatam que uma das principais causas de citotoxicidade para o tecido

pulpar e circunvizinhos é a presença de monômeros residuais e subprodutos (SILVA et al.,

2013), pois estes monômeros não ligados a cadeias poliméricas podem deslocar-se e difundir-

se através dos túbulos para a polpa (ELIAS et al., 2015; GIANINNI et al., 2001; COSTA;

HEBLING; HANKS, 2000) ou tecidos vizinhos e induzir a morte celular, sendo necessária

uma fotoativação adequada para que a conversão ocorra de forma satisfatória e a presença

exacerbada desses monômeros residuais seja evitada (FERRACANE, 2006; SPAHL;

BUDZIKIEWICZ; GEURTSEN, 1998). Dessa maneira, a ligação entre menor concentração

de monômeros ácidos, menor inativação das moléculas iniciadoras e grau de conversão

possivelmente adequado pode explicar a menor citotoxicidade apresentada pela concentração

de 10% de GDMA-P.

Corroborando com essa suposição, no mesmo teste, vemos que a concentração de

30% foi a que apresentou maior citotoxicidade, reforçando a ideia de que o aumento da

concentração de monômeros ácidos pode induzir a morte de células de fibroblastos gengivais

testados (SUN et al., 2016). Diante da análise do poder citotóxico, a concentração de 20%

manteve-se intermediária as outras duas concentrações testadas corroborando com a

suposição da correlação positiva entre acidez e maior citotoxicidade.

O teste MTT Assay, ao contrário do que foi observado no Alamar blue, não foi

capaz de detectar diferenças na citotoxicidade para os grupos de adesivos testados (Tabela 2).

Apesar de não haver diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, percebemos

que após o contato de todos os adesivos experimentais com as células, houve uma redução

média de 40% na viabilidade celular o que corrobora com os achados de Lee et al. (2016) e

Lanza et al. (2009) que avaliaram a atividade de citotóxica de sistemas adesivos através de

MTT Assay e perceberam uma diminuição considerável da atividade celular. Para o Alamar

Blue, a redução na viabilidade celular ultrapassou os 50%, o que nos atenta para o potencial

41

tóxico dos sistemas adesivos e necessidade de elaboração de materiais menos danosos

biologicamente (SCHWEIKL; SPAGNUOLO; SCHMALZ, 2006). Uma suposição para a

diferença do resultado entre os dois testes que avaliaram citotoxicidade é que os sistemas

adesivos tenham inibido cadeias enzimáticas detectáveis ao Alamar blue e não detectáveis ao

teste do MTT Assay nessas primeiras 24 h.

Como é conhecido, o teste do Alamar Blue detecta a transformação de resazurina

(7-hidroxi-3H-fenoxazina-3-ona 10-óxido), um corante azul fracamente fluorescente, em

resorufina, já o teste do MTT Assay identifica a atividade metabólica das células

quantificando a redução do MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]

por desidrogenases mitocondriais, que resulta na produção de cristais de formazam

intensamente corados no interior das células. Como a redução dessas duas substâncias é feita

por diferentes vias metabólicas, os adesivos experimentais podem ter inibido a atividade

celular por vias diferentes neste intervalo de 24 h, estas detectáveis ao ensaio do Alamar e não

detectáveis ao MTT Assay.

Apesar de ser considerado o padrão ouro para avaliar citotoxicidade, Tonder,

Joubert e Cromarty (2015) avaliaram uma série de fatores para testes que avaliam atividade

celular e perceberam que o MTT Assay não é o melhor ensaio para avaliar esse parâmetro, em

comparação a outros testes. Da mesma forma, Hamid et al. (2004) compararam a detecção de

citotoxicidade através dos ensaios MTT Assay e Alamar blue de 117 drogas e também

perceberam diferença entre os testes para algumas das substâncias testadas. Estes autores

concluíram que o ensaio Alamar blue se mostra mais sensível para detectar a citotoxicidade

de pequenas concentrações das substâncias testadas, o que vai de encontro com os resultados

apresentados nesta pesquisa. Este fato ressalta a importância da realização de mais de um

teste de avaliação da viabilidade celular nas pesquisas para que se tenha um resultado mais

fidedigno ao que se acontece no ambiente bucal.

Diante destes resultados, tem-se que atentar para as possíveis implicações clínicas

destes achados. O uso de sistemas adesivos autocondicionantes vem sendo preconizado como

padrão ouro para procedimentos restauradores das cavidades, principalmente classe V e

restaurações anteriores (HEINTZE; ROUSSON; HICKEL, 2015). Grande parte destas lesões

possuem conhecidamente uma proximidade com os tecidos gengivais, assim, ao se utilizar

sistemas adesivos com porcentagens mais elevadas de monômeros ácidos ou que possuam

grau de conversão inadequado pode permitir uma maior concentração de monômeros

residuais na interface adesiva (SUN et al., 2016) e, através da difusão, estimular com o

42

potencial genotóxico, mutagênico e indutor de apoptose a morte e a recessão ou inflamação

gengival (VAN LANDUYT et al., 2011) que é justamente o contrário do que se almeja ao

restaurar lesões do tipo classe V.

Ao se avaliar a liberação de monômeros residuais para o monômero HEMA,

percebe-se que os grupos que contém CQ apresentaram uma maior liberação de monômeros.

A CQ, muito utilizada na composição de adesivos, é classificada como fotoiniciador tipo II

(NORRISH et al, 1949) porque é dependente de uma molécula doadora de elétrons chamada

de co-iniciador, que pode ser uma amina aromática, alifática ou piperidina (ALBUQUERQUE

et al., 2013; JAKUBIAK et al., 2003; STANSBURY, 2000). As aminas formam subprodutos

que causam o amarelecimento das restaurações a longo prazo (ASMUSSEN, 1985). Além

disso, a CQ produz um único radical livre ativo, o que diminui o seu poder de conversão de

monômeros em polímeros fato que pode ter favorecido a maior liberação de monômeros

HEMA nos grupos em que este fotoiniciador foi utilizado (WEISBURGER et al., 1978;

NOMURA et al., 2006). Nesse sentido, Pongprueksa et al. (2014) avaliaram a eluição dos

monômeros HEMA e Bis-GMA através de HPLC em 8 formulações de adesivos, com

diferentes fotoiniciadores, e concluíram que o fotoiniciador utilizado possui importante papel

na concentração residual dos monômeros.

Ainda analisando a liberação de monômeros HEMA, ao se observar o

comportamento do fotoiniciador BAPO para as diferentes concentrações de GDMA-P (Tabela

3), não houve diferenças estatisticamente significativas para as três concentrações. O BAPO é

um fotoiniciador alternativo à CQ que não necessita de amina terciária (tipo I) (NORRISH et

al, 1949) e produz quatro radicais livres por molécula, fato que proporciona cor mais estável,

maior reatividade na formação de ligações cruzadas e propagação da rede polimérica,

respectivamente. (SALGADO et al., 2015; ALBUQUERQUE et al., 2013; SCHNEIDER et

al., 2012; PRICE; FELIX, 2009; NOMURA et al., 2006; NEUMANN et al., 2006;

NEUMANN et al., 2005). Além disso, o BAPO tem sido associado a ser menos citotóxico

comparado a CQ por ser macromolécula, o que diminui a capacidade de difusão

transdentinária. Esse desempenho favorável de BAPO pode ser explicado diante da maior

reatividade atrelada a este fotoiniciador, sua capacidade de ter mais radicais livres e

proporcionar maior grau de conversão, deixando menos monômeros livres (MEEREIS et al.,

2014).

Ao se observar os resultados de liberação de monômeros residuais para o UDMA

(Tabela 4), para os mesmos fotoiniciadores e diferentes concentrações, a concentração de

43

10% + CQ liberou mais monômeros os outros grupos de fotoiniciadores não sofreram

alteração na liberação de UDMA, independente da concentração. Ao se observar a imagem 2,

com a formulação dos adesivos experimentais, observamos que para o grupo 10% de GDMA-

P, temos a concentração de 30% de UDMA, ou seja, quantitativamente maior, fato que

justifica a liberação alta de UDMA para este grupo. Assim como para os outros, para este

monômero, os grupos contendo CQ apresentaram uma maior liberação e o que continham

BAPO foram capazes de promover uma menor liberação de monômeros. Isso pode estar

associado às características destes fotoiniciadores que, como dito anteriormente, já vê sendo

relatadas na literatura: CQ apresenta menos radicais livres que a tornam menos reativa e

maior reatividade do BAPO, que não necessita de aminas terciárias e permite uma maior

reatividade (MEEREIS et al., 2014).

Com relação a liberação de GDMA-P (Tabela 7), mais uma vez, a menor

liberação no grupo 10%+ BAPO pode estar associada ao maior percentual de conversão que o

BAPO permite associado a menor inibição devido a menor acidez. Diante do comportamento

apresentado por BAPO para a concentração de 30%, podemos deduzir que a Canforoquinona

é mais sensível a ser inibida pela acidez dos monômeros ácidos, embora não necessariamente

isso obedeça uma ordem crescente. BAPO, por exemplo, se mostrou possivelmente mais

sensível a uma acidez intermediária (concentração de 20%).

De forma geral, a concentração de 20% de monômeros ácidos, neste caso em

estudo o GDMA-P, destoa das outras concentrações com relação ao seu comportamento

diante da liberação dos monômeros. A concentração de 10% e 30% apresentaram uma certa

homogeneidade para os três monômeros, bem como os grupos fotoiniciadores, onde BAPO

tem uma tendência a apresentar valores mais favoráveis, ou seja, permitir uma liberação

menor de monômeros, e CQ apresenta uma tendência a liberar mais monômeros. No entanto,

na concentração de 20% há uma certa variação entre os grupos de fotoiniciadores de forma a

não ser estabelecido um padrão.

Observando um panorama geral dos resultados para a liberação de monômeros e

citotoxicidade, podemos supor um perfil de monômeros mais citotóxicos, ao se avaliar as três

tabelas de resultado para a liberação dos monômeros e o resultado da citotoxicidade

apresentada pelo Alamar Blue. Por possuir baixo peso molecular e ser considerado o

“monômero hidrofílico” dos sistemas adesivos (MILIA et al., 2012), ou seja, aquela que

adentra o tecido úmido da dentina e permite a criação da rede polimérica (BARBOSA et al.,

44

2015), o monômero HEMA é tido como com alto poder citotóxico e comumente atrelado aos

resultados de toxicidade apresentado pelos sistemas adesivos.

Chang et al. (2005) relataram que o HEMA pode estimular a depleção da

glutationa, produção de espécies reativas de oxigênio e parada do clico celular em células

pulpares e epiteliais gengivais. Da mesma forma, Sun et al. (2016) afirmaram que HEMA

pode induzir uma supressão do crescimento celular e alterações morfológicas nas células e

afetar a fosforilação da tirosina intracelular e interromper a progressão do ciclo celular no

G2/M. No entanto, ao comparar-se os resultados da citotoxicidade e LMR deste estudo,

observa-se que, não necessariamente o HEMA carrega, neste caso, tanta influência sobre este

fator.

Dessa maneira, a influência dos outros monômeros na citotoxicidade deve ser

avaliada, tais como o monômero UDMA onde, Ratanasathien et al. (1995) já afirmavam

possuir citotoxicidade notável. A literatura relata que UDMA pode induzir alterações

morfológicas nas células pulpares, aumentar citotoxicidade e induzir a parada do ciclo celular

em G0/G1 e G2/M e induzir apoptose. Além disso, UDMA estimula a expressão de RNA

mensageiro (mRNA) da ciclo-oxigenase-2 (COX-2), heme-oxigenase-1 (HO-1) e

carboxilesterase-2 (CES-2) em células pulpares (SUN et al., 2016). Deste modo, a redução da

viabilidade celular apresentada pelo ensaio Alamar Blue pode se dever, em parte, ao potencial

citotóxico do monômero UDMA.

A influência do monômero ácido funcional na citotoxicidade deve ser avaliada,

diante da observação de que os grupos que apresentaram maior toxicidade são os com a

concentração de 30% de GDMA-P, ou seja, a mais elevada dentre as estudadas. Um fator que

pode explicar essa maior citotoxicidade, além da relação com a maior acidez (YASUDA et

al., 2008), pode ter relação com a presença do grupamento fosfato na molécula do GDMA-P.

Sun et al. (2016), ao avaliar adesivos autocondicionantes de um passo, comparando adesivos

similares em sua composição percebeu que o adesivo que tinha apenas o grupamento fosfato-

éster de diferente em sua composição apresentou maior citotoxicidade, dessa forma, a

presença do grupamento fosfato pode ser um fator responsável pela diminuição da viabilidade

celular em concentrações mais altas de GDMA-P.

Para resistência flexural, entre os mesmos fotoiniciadores e diferentes

concentrações, apenas os grupos BAPO e CQ+BAPO apresentaram diferenças. Para estes

dois grupos, a concentração de 10% proporcionou maior valor de resistência flexural.

Comparando entre as mesmas concentrações e diferentes fotoiniciadores, apenas a

45

concentração de 10% apresentou diferenças significativas, onde o BAPO apresentou maior

valor de resistência flexural. Isso ratifica o que vem sendo encontrado nos testes anteriores

onde a concentração 10% associada a BAPO tem permitido melhores resultados para a

citotoxicidade e menor taxa de liberação de monômeros, indicando uma maior conversão.

Dessa forma, sabe-se que o grau de conversão está diretamente ligado as propriedades físico-

mecânicas dos sistemas adesivos e que esta pode ser a justificativa do melhor resultado

apresentado por essa combinação de concentração e fotoiniciador (MEEREIS et al., 2014).

Os resultados para o módulo de elasticidade corroboram, também, com o que vem

sendo encontrado nos testes anteriores, onde a concentração de 10% vem desempenhando

bons resultados. A de 30%, no entanto, apresenta resultados menos favoráveis. Tais como

maior citotoxicidade, por exemplo, que pode estar associada a presença de monômeros

residuais/menor grau de conversão que têm relação direta nas propriedades físico-mecânicas

dos sistemas adesivos. Assim, de uma forma geral, a concentração de 10% associada ao

fotoiniciador BAPO apresentou comportamento adequado diante das propriedades testadas.

A escolha para avaliação da liberação de monômeros residuais através da Ultra

Cromatografia líquida de Alta Performance foi feita tendo em vista que este método se

apresenta como um excelente separador dos componentes individuais com alta confiabilidade

e eficiência na análise utilizado para o controle de qualidade das drogas produzidas na

indústria farmacêutica (SOLON et al., 2016), nos permitindo separar com segurança os tipos

de monômeros liberados e mensurar sua porcentagem. Porém, a respeito das limitações deste

estudo, são necessários outros testes para que se possa traçar um panorama melhor do

comportamento dos sistemas adesivos autocondicionantes, da influência do monômero ácido

funcional e do GDMA-P. Propriedades como grau de conversão, resistência de união,

avaliação do pH, entre outras, podem nos proporcionar melhor suporte para embasar as

suposições diante dos resultados apresentados neste estudo. Além disso, para avaliação da

citotoxicidade, foram utilizados fibroblastos camundongos NIH/Swiss, no entanto, a avaliação

com células pulpares seria extremamente pertinente para avaliar melhor a influência destes

materiais adesivos nesse intricado complexo.

Portanto, tendo em vista a complexidade exigida para a formulação de um sistema

adesivo que consiga abranger boas características biológicas, químicas e físico-mecânicas

consiste, ainda assim, em um desafio a formulação de um que atenda a todos estes pré-

requisitos. São necessários, assim, mais estudos e mais pesquisas para o desenvolvimento de

46

mais monômeros ácidos funcionais e sistemas fotoiniciadores que possam atender as

perspectivas dos dentistas clínicos.

47

7 CONCLUSÕES

Para avaliação da citotoxicidade, a concentração de 10% de GDMA-P

apresentou-se menos citotóxica, entre as três testadas, e a de 30% de GDMA-P apresentou

maior redução da viabilidade celular (maior citotoxicidade). Para a liberação de monômeros

residuais, foi observado que o fotoiniciador possui papel importante, de forma que os grupos

contendo CQ liberaram mais monômeros residuais e BAPO mostrou-se mais reativo,

liberando menos monômeros. Para RF e ME, a concentração de 30% de GDMA-P apresentou

piores resultados. Assim, de maneira geral, a combinação de 10% de GDMA-P em associação

com o fotoiniciador BAPO mostra-se a mais adequada para proporcionar boas características

para os testes de citotoxicidade, liberação de monômeros residuais e resistência

flexural/módulo de elasticidade.

48

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RODOLFO XAVIER DE SOUSA-LIMA...seria impossível realizar este sonho. A minha tia/irmã Andréia e...

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