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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO TÉRMICA DO PEGUILADO DE ALBUMINA HUMANA Rodrigo Albuquerque da Costa Recife 2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO TÉRMICA DO
PEGUILADO DE ALBUMINA HUMANA
Rodrigo Albuquerque da Costa
Recife
2010
i
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO TÉRMICA DO
PEGUILADO DE ALBUMINA HUMANA
Rodrigo Albuquerque da Costa
Recife
2010
Dissertação submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal de
Pernambuco, como requisito parcial para obtenção
do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas na
Área de Concentração: Produção e Controle de
Qualidade de Medicamentos.
Orientador: Prof. Dr. Rui Oliveira Macedo
Costa, Rodrigo Albuquerque da
Desenvolvimento e caracterização térmica do peguilado de albumina humana / Rodrigo Albuquerque da Costa. – Recife: O Autor, 2010.
79folhas: il., fig., tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Peguilação. 2. Análise térmica. 3. Estabilidade. 4. Caracterização. 5. Albumina humana. I. Título.
615.074 CDU (2.ed.) UFPE
615.19
CDD (20.ed.) CCS2010-124
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO TÉRMICA
DO PEGUILADO DE ALBUMINA HUMANA
BANCA EXAMINADORA:
Membros Internos Titulares
Prof. Dr. Rui Oliveira Macêdo – UFPB
Profª. Drª. Beate Saegesser Santos – UFPE
Membro Externo Titular
Prof. Dr. Celso Amorim Camara – UFRPE
Membros Suplentes
Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto – UFPE
Prof. Dr. Fábio Santos Souza – UFPB
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
REITOR
Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins
VICE-REITOR
Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro
VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. Dr. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Prof. Dr. Dalci José Brondani
VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Prof. Antonio Rodolfo de Faria
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto
VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Profª. Drª. Beate Saegesser Santos
iv
DEDICATÓRIA
v
dedicatória
Aos meus pais Geraldo Xavier e Lourdes Albuquerque, ao meu Irmão Zé Ricardo e a
minha inspiração Daniela Fernandes. A vocês, com muito amor.
vi
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Geraldo e Lourdes, pelo amor, carinho e dedicação depositados a mim
no decorrer da minha existência, minha fonte de energia, de inspiração para tudo o que
faço e pelo exemplo de vida e por terem me ensinado que as conquistas na vida só são
alcançadas por meio de muita fé, luta e honestidade.
Ao meu irmão Zé Ricardo pelas injeções de ânimo, quando pareciam que as coisas não
tinham mais jeito e por ser parte do que eu sou e junto com nossos pais configurarem
meu porto seguro.
A todos os meus familiares e amigos agradeço a força e as vibrações positivas para o
meu sucesso profissional, em especial aos tios José e Yzete partes integrantes e
essenciais da minha vida educacional e moral. Ao primo Yardan pelo carisma e espelho
de felicidade. Agradecimento especial aos tios Jayme, Clotilde, e Severina.
Agradecimento especial aos mais novos e abençoados amigos Angélica, D. Luisa e Léa.
Ao orientador, Prof. Dr. Fábio de Souza, pela orientação competente e pela amizade
demonstrada em cada ensinamento e conselho durante esta caminhada.
Ao meu amor, Daniela Fernandes Hermínio, luz da minha vida, pela cumplicidade,
amor e carinho incondicionais. Alguém que admiro e amo simplesmente por ela ser
quem ela é.
Aos meus colegas de laboratório que não mediram esforços em ajudar-me em especial a
Valdilanio pelo apoio, ensino e incentivo.
À Universidade Federal de Pernambuco
À Universidade Federal Rural de Pernambuco
À Universidade Federal da Paraíba
vii
A todos os professores do Mestrado, pelos ensinamentos.
Aos colegas de curso, companheiros e amigos, em especial ao amigo e colega de
graduação Augusto Souto, presentes nos momentos alegres e difíceis. Aos amigos do
L.T.F( muitas recordações alegres).
Ao meu orientador Rui Oliveira Macêdo, que além de brilhantemente conduzir o
trabalho, sempre esteve à disposição em todos os momentos. Muito obrigado!
À família Fernandes Hermínio que, desde o primeiro momento, me deu todo o apoio,
colaboração e carinho, me acompanhando cada dia, durante estes anos.
À batalhadora professora Tânia Maria Sarmento da Silva pela amizade e colaboração
com informações que auxiliaram na concretização deste estudo.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas de Pernambuco.
Ao CAPES pela bolsa fornecida durante o mestrado.
Agradecimento especial ao Prof. Dr. Celso de Amorim Câmara, pelo profissionalismo,
dedicação dada ao trabalho, compreensão e paciência no decorrer do projeto. Obrigado,
Celso, do fundo do meu coração! Muito obrigado!
viii
RESUMO
A instabilidade relacionada às proteínas, tanto estruturalmente quanto quimicamente,
compromete a sua utilização em formulações como um agente terapêutico, isto se deve
a um curto tempo de vida quando são submetidas a um estresse químico ou físico. Para
melhorar a estabilidade de fármacos de origem protéica foi desenvolvida uma
modificação química em aminoácidos e proteínas denominada peguilação. A
caracterização termoanalítica de proteínas bioativas e seus produtos peguilados tem
aplicação limitada na indústria farmacêutica em comparação com outras técnicas
analíticas. O presente trabalho realizou estudos de caracterização térmica da forma
natural e modificada por peguilação da albumina humana sérica (HSA). As técnicas
térmicas envolvidas foram: Termogravimetria (TG), calorimetria exploratória
diferencial (DSC) e calorimetria exploratória diferencial fotovisual (DSC fotovisual).
Os estudos termogravimétricos dinâmicos comprovaram que as formas peguiladas da
albumina humana sérica apresentaram uma melhor estabilidade térmica nas razões de
aquecimento de 10 oC/min, 20
oC/min, 40
oC/min. As curvas calorimétricas obtidas na
razão de aquecimento de 10 oC/min mostraram diferenças entre os produtos peguilados
e não peguilados em relação aos eventos endotérmicos e exotérmicos. A preparação da
albumina humana peguilada (HSA-PEG) (82-85% de rendimento) ocorreu através de
uma reação de substituição nucleofílica. A reação ocorre a partir do
metoxipolietilenoglicol Propionaldeído (75% rendimento) e o grupo alfa-amino do
aminoácido livre da HSA em meio ácido com o agente redutor hidreto de metal
complexo. Os intermediários peguilados foram caracterizados através de RMN1H e
RMN13
C.
Palavras-chave: Peguilação, análise térmica, estabilidade, caracterização, albumina
humana.
ix
ABSTRACT
The instability related protein, both structurally and chemically, compromises its use in
formulations as a therapeutic agent, this is due to a short life when subjected to a
chemical or physical stress. To improve the stability of protein drugs of origin was
developed a chemical modification of amino acids and proteins called
pegylation. Thermoanalytical characterization of bioactive proteins and their products
pegylated has limited application in the pharmaceutical industry compared with other
analytical techniques. The present work studies the thermal characterization of natural
and modified by pegylation of human serum albumin (HSA). The thermal techniques
were involved: Thermogravimetry (TG), differential scanning calorimetry (DSC) and
fotovisual differential scanning calorimetry (DSC fotovisual). Thermogravimetries
dynamic studies have shown that pegylated forms of human serum albumin showed
better thermal stability in the grounds of heating 10°C/min, 20°C/min,
40°C/min. Calorimetric curves obtained at a heating rate of 10ºC/min showed
differences between the products pegylated and non pegylated compared to endothermic
and exothermic events. The preparation of human albumin pegylated (HSA-PEG) (82-
85% yield) occurred through a nucleophilic substitution reaction. The reaction occurs
from the methoxypolyethylene Propionaldehyde (75% yield) and the alpha amino group
of amino acid free HSA in acid with the reducing agent metal hydride complex.
Intermediaries pegylated were characterized by RMN1H and RMN
13C.
Keywords: pegylation, thermal analysis, stability, characterization, human albumin.
x
ABREVIATURAS E SIGLAS
PEG – polietilenoglicol
PEGs – polietilenoglicóis
mPEG – metoxipolietilenoglicol
mPEG-ALD – metoxipolietilenoglicol propionaldeído
t-BuOK – tert-butóxido de potássio
HSA-PEG – albumina sérica humana peguilada
HSA – albumina sérica humana
SBA – albumina sérica bovina
HSA-Liof – albumina humana sérica liofilizada
HSA-n1 – albumina humana peguilada com 5M do aldeído peguilado
HSA-n2 – albumina sérica humana peguilada com 10M do aldeído peguilado
DSC – Calorimetria exploratória diferencial
TG – Termogravimetria
DTA – Análise térmica diferencial
DNPH – 2,4 dinitrofenilhidrazina
CHCl3 – clorofórmio
MeOH – metanol
CDCl3 – clorofórmio deuterado
RMN1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1
RMN13
C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13
KDa – Quilo-Dalton
US FDA – United States Food and Drug Administration
ΔH – Variação de entalpia
xi
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1. Polietilenoglicol (1) e alguns derivados peguilados ativos (2), (3) e (4) para a
síntese com biomoléculas protéicas.------------------------------------------------------------27
Figura 2. Figura ilustrativa de um modelo para o mecanismo pelo qual o PEG fornece
proteção proteolíticas. (A): acoplamento de uma protease do plasma (azul claro) em
uma molécula peguilada (azul escuro) é prejudicado pelo impedimento estérico do
domínio PEG (amarelo, com círculos brancos). O domínio PEG móvel gera diferentes
configurações que reduzem a probabilidade de uma colisão favorável levando a
interação enzima-substrato e clivagem da proteína. (B): Para a molécula-alvo (receptor)
(rosa), a maior afinidade da interação conduz o equilíbrio para aumentar a probabilidade
de uma interação produtiva e, portanto, mais configurações são possíveis para conseguir
uma eficácia biológica (FISHBURN, 2007)--------------------------------------------------30
CAPÍTULO III – ARTIGO 1: obtenção e Caracterização Térmica de Peguilados de Albumina Humana
Figura 1. Reação de obtenção do acetal (4) a partir do metoxipolietilenoglicol (1), t-
BuOK, 2-(2-Bromoetil)-1,3-dioxalano e do catalisador iodeto de potássio.--------------52
Figura 2. Mecanismo de reação de formação do alcóxido (2) e substituição do Br pelo I,
na molécula do 2-(2-bromoetil)-1,3-dioxalano (3) com formação do acetal (4).---------53
Figura 3. Reação de hidrólise ácida do acetal (4) originando o metoxipolietilenoglicol
propionaldeído (5) sob leve aquecimento (30-40oC).----------------------------------------54
Figura 4. Reação de peguilação da HSA em meio ácido com o agente redutor hidreto de
metal complexo.-----------------------------------------------------------------------------------54
Figura 5. Mecanismo de reação da albumina humana peguilada (HSA-PEG) (7) a partir
do metoxipolietilenoglicol propionaldeído (5) e HSA (6).----------------------------------55
xii
Figura 6. Curvas dinâmicas termogravimétricas (TGA 50H) obtidas na razão de
aquecimento de 10, 20 e 40 ºC min-1
sob fluxo de ar sintético de 20 mL.min-1
, usando
uma atmosfera de nitrogênio na razão de 50 mL.min-1
para a amostra de albumina
humana sérica (HSA)(1), albumina humana sérica liofilizada (HSA-Liof)(2), albumina
humana peguilada com 5 mM do aldeído peguilado (HSA-n1)(3) e albumina sérica
humana peguilada com 10 mM do aldeído peguilado (HSA-n2)(4).-----------------------57
Figura 7. Curvas DSC -50, obtidas na razão de 10 ºC min-1
e sob atmosfera dinâmica de
nitrogênio (50 mL.min-1) para as amostra de albumina humana sérica (HSA) (6),
albumina humana sérica liofilizada (HSA-Liof) (7), albumina humana peguilada com 5
mM do aldeído peguilado (HSA-n1) (5) e albumina sérica humana peguilada com 10
mM do aldeído peguilado (HSA-n2) (4). Os círculos representam os picos exotérmicos.-
-------------------------------------------------------------------------------------------------------58
Figura 8. Fotos da HSA, HSA-n1 e HSA-n2 através do processo calorimétrico por DSC
fotovisual, obtidos do sistema fotovisual, modelo VCC-520, constituído de microscópio
Olympus conectado a uma câmera Sanyo acoplada ao DSC-50, usando uma atmosfera
de nitrogênio, fluxo de ar de 50 mL.min-1
com razão de aquecimento de 10 oC/min até a
temperatura de 400oC/min.----------------------------------------------------------------------60
xiii
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Tabela 1. Principais derivados de PEGs e suas aplicações durante o desenvolvimento da
peguilação ao longo dos anos.-------------------------------------------------------------------26
Tabela 2. Proteínas peguiladas disponíveis no mercado ou em fases de testes clínicos
(PARVEEN, 2006).-------------------------------------------------------------------------------29
CAPÍTULO II – PATENTE: Desenvolvimento de Processo de Obtenção de Peguilado de Albumina Humana (HSA)
Tabela 1. Deslocamentos de RMN1H (200 MHz, =ppm, CDCl3) e RMN
13C (50 MHz,
=ppm, CDCl3) dos produtos peguilados.-----------------------------------------------------45
CAPÍTULO III – ARTIGO: obtenção e Caracterização Térmica de Peguilados de Albumina Humana
Tabela 1. Proteínas peguiladas disponíveis no mercado ou em fases de testes clínicos
(PARVEEN, 2006).------------------------------------------------------------------------------49
Tabela 2. Deslocamentos de RMN1H (200 MHz, =ppm, CDCl3) e RMN
13C (50 MHz,
=ppm, CDCl3) dos produtos peguilados.-----------------------------------------------------55
Tabela 3. Temperatura média e ΔH médio das bandas endotérmicas das curvas DSC -
50, obtidas na razão de 10 ºC min-1
e sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL min-
1) para as amostra de albumina humana sérica (HSA), albumina humana sérica
liofilizada (HSA-Liof), albumina humana peguilada com 5 mM do aldeído peguilado
(HSA-n1) e albumina sérica humana peguilada com 10 mM do aldeído peguilado
(HSA-n2).------------------------------------------------------------------------------------------59
xiv
sUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO--------------------------------------------------------------- 18
2. OBJETIVOS------------------------------------------------------------------- 21
2.1. Objetivo geral ---------------------------------------------------------------- 21
2.2. Objetivos específicos ------------------------------------------------------- 21
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3. Revisão bibliográfica---------------------------------------------------------- 23
3.1. Albumina sérica humana -------------------------------------------------- 23
3.1.1. Aspectos gerais------------------------------------------------------------ 23
3.1.2. Funções fisiológicas da albumina--------------------------------------- 23
3.1.2.1. Pressão Osmótica Coloidal--------------------------------------------- 23
3.1.2.2. Associação de ligantes-------------------------------------------------- 24
3.1.2.3. Efeitos Antioxidantes--------------------------------------------------- 24
3.2. Peguilação-------------------------------------------------------------------- 25
3.2.1. Utilização de compostos de natureza protéica------------------------- 25
3.2.2. Desenvolvimento da Peguilação----------------------------------------- 25
3.2.3. Química da peguilação---------------------------------------------------- 27
3.2.4. Propriedades farmacológicas de produtos peguilados---------------- 28
3.2.4.1. Prolongamento do tempo de meia vida------------------------------- 29
3.3. Análise térmica--------------------------------------------------------------- 30
3.3.1. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)-------------------------- 32
3.3.2. DSC Acoplado a um Sistema Fotovisual------------------------------- 34
3.3.3. Análise térmica diferencial (DTA)-------------------------------------- 34
3.3.4. Termogravimetria (TG)--------------------------------------------------- 35
3.3.4.1. Classificação------------------------------------------------------------- 36
3.3.4.2. Aplicações---------------------------------------------------------------- 37
CAPÍTULO II
Patente: Desenvolvimento de Processo de Obtenção de Peguilado de Albumina
Humana (HSA)
1. Estado da arte------------------------------------------------------------------- 39
xv
2. Descrição do evento----------------------------------------------------------- 40
3. Detalhes do procedimento experimental químico------------------------- 40
3.1. Preparação do metoxipolietilenoglicol propionaldeído----------------- 41
3.2. Preparação da albumina humana peguilada------------------------------ 41
4. Referências---------------------------------------------------------------------- 42
5. Reivindicações----------------------------------------------------------------- 44
6. Resumo-------------------------------------------------------------------------- 46
CAPÍTULO III
ARTIGO I: Obtenção e Caracterização Térmica de Peguilados de Albumina
Humana
Resumo ---------------------------------------------------------------------------- 48
1. Introdução ---------------------------------------------------------------------- 48
2. Experimental ------------------------------------------------------------------- 49
2.1. Materiais e Métodos--------------------------------------------------------- 49
2.1.1. Obtenção dos Peguilados------------------------------------------------- 49
2.1.1.1. Preparação do metoxipolietilenoglicol propionaldeído------------ 50
2.1.1.2. Preparação da albumina humana peguilada-------------------------- 51
2.1.2. Estudos Térmicos---------------------------------------------------------- 51
3. Resultados e discussões ------------------------------------------------------ 52
3.1. Obtenção dos Peguilados--------------------------------------------------- 52
3.2. Caracterização Térmica----------------------------------------------------- 56
4. Conclusões---------------------------------------------------------------------- 60
5. Referências --------------------------------------------------------------------- 61
4. CONCLUSÕES--------------------------------------------------------------- 64
PERSPECTIVAS---------------------------------------------------------------- 66
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS-------------------------------------- 69
ANEXO I--------------------------------------------------------------------------- 75
ANEXO II-------------------------------------------------------------------------- 76
ANEXO III------------------------------------------------------------------------- 77
ANEXO IV------------------------------------------------------------------------ 78
ANEXO V------------------------------------------------------------------------- 79
INTRODUÇÃO
18
1. INTRODUÇÃO
O termo peguilação descreve uma modificação em moléculas biológicas por
uma conjugação covalente com polietilenoglicol (PEG), um polímero não tóxico e não
imunogênico (VERONESE, 2008). As razões para a peguilação de peptídeos e proteínas
são numerosas e incluem diminuição da imunogenecidade e da degradação por enzimas
do trato digestório e do plasma. A conjugação também aumenta o tamanho da estrutura
do polipeptídeo, deste modo reduzirá a filtração renal com conseqüente aumento no
tempo de meia vida do fármaco (FISHBURN, 2007).
Um importante aspecto da peguilação é a incorporação de vários derivados
peguilados, mais reativos que o PEG, em compostos de natureza protéica. Esses
derivados reagem com maior eficácia através de ligações específicas (ROBERTS,
2002). A peguilação deve ocorrer em resíduos específicos da proteína para que exerça
um efeito mínimo de alteração farmacodinâmica, ou seja, a proteína peguilada deve se
ligar nos seus respectivos receptores ou substratos de reconhecimento da mesma forma
quando não estava na forma peguilada (LEE, 2003). Sítios específicos de proteínas
estão sendo utilizados para a conjugação com derivados de PEG. Como exemplo tem-se
a peguilação no grupo N-terminal alfa-amino de um fator de crescimento epidérmico
(LEE, 2003). Derivados de PEG, que contêm um grupo funcional aldeído, são seletivos
para o N-terminal alfa-amino sob condições ácidas. Essa reação de peguilação foi
utilizada em um fator de crescimento de granulócito. A utilização de aldeídos
peguilados na literatura é encontrada para reação com o N-terminal alfa-amino de
fatores de estimulação de granulócitos em condições ácidas. Tal síntese foi realizada por
uma modificação da síntese de Williamson (ZHAO, 2009). Não há relatos na literatura
dessa síntese com o grupamento alfa-amino dos resíduos de aminoácido da albumina
sérica humana (HSA).
A HSA, amplamente estudada no campo da bioquímica, é a proteína mais
abundante no plasma sanguíneo, bem como contribui para a regulação da pressão
coloidal osmótica do sangue e também para o transporte de outros compostos
(NGUYEN, 2006). A estrutura secundária da HSA contém muitos resíduos de cisteína
que são helicoidais em grande parte da cadeia. Sua alta estabilidade e solubilidade em
água favorece seu isolamento em grandes quantidades. Consiste em um monômero com
uma massa molecular de 66 KDa (GHUMAN, 2005).
19
As interações químicas de proteínas com outras moléculas é um assunto de
especial interesse na área bioquímica, já que muitos processos celulares dependem da
dissociação daquelas interações. Novos métodos são constantemente desenvolvidos para
elucidar as interações energéticas entre proteínas e seus ligantes. A calorimetria
exploratória diferencial (DSC) mostrou ser uma ferramenta útil para caracterizar tais
interações. Entretanto, a aplicabilidade do DSC e de outras técnicas térmicas para
estudar a interação de biomoléculas não são comuns (CELEJ, 2006).
.
OBJETIVOS
21
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Caracterizar os comportamentos térmicos da HSA e de suas formas peguiladas
por calorimetria exploratória diferencial (DSC) frente aos ciclos de resfriamento e
aquecimento e termogravimetria (TG).
2.2. Objetivos Específicos
Obter derivados do polietilenoglicol e HSA peguilada em diferentes
concentrações;
Determinar os parâmetros cinéticos de estabilidade térmica da HSA e
seus produtos peguilados através dos dados termogravimétricos
dinâmicos;
Avaliar o comportamento térmico da HSA e de seus derivados
peguilados, através do sistema fotovisual.
CAPÍTULO I
Revisão bibliográfica
23
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Albumina sérica humana
3.1.1. Aspectos gerais
A albumina sérica humana é a mais abundante proteína do plasma humano,
produzida no fígado, consistindo em um monômero de 66 KDa. Estruturalmente, a
albumina é composta de vários segmentos em alfa-hélice, que se agrupam para formar
dois subdomínios (A e B) (GHUMAN, 2005). A HSA possui em sua estrutura: 18
resíduos de tirosina, 6 resíduos de metionina, 1 resíduo de triptofano, 59 resíduos de
lisina, 1 resíduo de cisteína, e 17 pontes disulfetos (WONG, 2007). Os grupos tiol estão
envolvidos em várias reações bioquímicas que inativam as espécies reativas de
oxigênio, dando à albumina um papel antioxidante importante em nosso organismo
(WONG, 2007). A albumina tem uma concentração plasmática típica de 35 - 45 g/L,
que representa 30 a 40% da albumina sintetizada no fígado, e o restante encontra-se
distribuído entre os músculos e a pele. Sua principal função fisiológica é regular a
pressão osmótica (ZUNSZAIN, 2003).
Esta proteína é caracterizada por sua habilidade de se ligar a uma ampla
variedade de moléculas hidrofóbicas, ácidos graxos, bilirrubina, hemina, tiroxina e
esteróides. Serve como um solubilizador e transportador destes compostos. HSA tem
alta afinidade pelo grupo heme (ZUNSZAIN, 2003).
Um dos fatores mais importantes que afetam a distribuição e a concentração
ativa de muitas drogas no organismo é a afinidade pela HSA. Um grau de afinidade pela
albumina é desejável, para ajudar a solubilizar substâncias que de outra forma poderiam
agregar-se e ser pobremente distribuídas. Já em relação às drogas com grande afinidade
pela proteína, seriam necessárias grandes doses para atingir uma concentração efetiva in
vivo, assim, seriam lentamente distribuídas aos sítios de ação e poderiam não ser
eficientemente eliminadas.
3.1.2. Funções fisiológicas da albumina
3.1.2.1. Pressão Osmótica Coloidal
24
A função mais importante da albumina é regular a pressão osmótica coloidal. A
albumina provê 60% da pressão osmótica coloidal. A proteína é negativamente
carregada e, por conseguinte, atrai cátions, como os íons de sódio, os quais, por sua vez,
retêm a água (NGUYEN, 2006).
3.1.2.2. Associação de ligantes
A organização estrutural globular da HSA dá a possibilidade de se ligar com
várias substâncias em múltiplos sítios da molécula, unindo-se assim a vários
componentes endógenos e exógenos. Estes compostos incluem ácidos graxos,
bilirrubina, metais, tiroxina e triptofano, assim como drogas que têm características
ácidas ou eletronegativas (warfarina, ibuprofeno e diazepan). Estas características fazem
com que a HSA seja um dos maiores transportadores de fármacos no sangue
(GHUMAN, 2005).
A HSA pode facilitar a ativação de várias sustâncias, tais como hormônios ou
drogas, ou diminuir a presença de toxinas no plasma. Por exemplo, a ligação do
triptofano à HSA regula a deposição daquele nos tecidos. Em pacientes com uma
avançada cirrose e hipoalbuminemia, a diminuição dos sítios de ligação gera uma
quantidade adicional de triptofano livre o qual pode gerar o desenvolvimento de
encefalopatia hepática. A ligação de HSA também afeta a farmacocinética e eficácia de
muitas drogas. Por exemplo, drogas com alta afinidade pelo HSA têm que ser
administradas em altas doses para atingir uma efetiva concentração in vivo; sua
distribuição nos sítios de ação poderia ser reduzida ou mesmo eliminada. Apesar disso,
uma alta ligação da droga com a HSA poderia ser desejável porque ajudaria a
solubilizar compostos que de outra forma originariam agregados e seriam pobremente
eliminados (GRECO, 2000).
3.1.2.3. Efeitos Antioxidantes
Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio são extremamente voláteis e capazes
de reagir com outras moléculas, que dão origem à acumulação de produtos tóxicos
finais e dano celular. Estudos in vivo têm mostrado que o HSA pode ligar e, por
conseguinte, remover espécies reativas de oxigênio que foram gerados indiretamente
por neutrófilos, regulando a sinalização celular que é ativada nos processos
25
inflamatórios (KOUCH, 1999). HSA também influencia o status redox do plasma ao
ligar metais como o ferro e o cobre que de outra forma se transformariam em formas
redox-ativas. Desta forma o HSA tem um papel antioxidante importante em situações de
inflamação (KRAGH-HANSEN, 2002).
3.2. Peguilação
3.2.1. Utilização de compostos de natureza protéica
A utilização de proteínas e peptídeos na terapia clínica está em crescimento
devido a alguns fatores como: descoberta de novos peptídeos e proteínas, novas
descobertas em relação ao mecanismo farmacológico in vivo, otimização das condições
para que ocorram as sínteses de natureza protéica e aperfeiçoamento nas formulações
farmacêuticas e de tecnologias que liberem as proteínas e peptídeos próximo ao sítio de
ação com um ganho farmacocinético e farmacodinâmico (ROBERTS, 2002).
Apesar de muitos produtos biofarmacêuticos estarem sendo desenvolvidos,
muitos ainda apresentam problemas durante o tratamento que incluem um curto tempo
de meia vida entre as administrações, imunogenicidade, suscetibilidades a degradação
proteolítica por enzimas e problemas em relação à solubilidade. Diversas estratégias
estão sendo desenvolvidas para aumentar as propriedades farmacocinéticas e
farmacodinâmicas desses produtos, entre elas destacam-se: manipulação da seqüência
de aminoácidos para diminuir problemas imunogênicos, incorporação de veículos nas
formulações para melhorar a proteção e a liberação de fármacos e a conjugação natural
ou por via sintética de polímeros e biomoléculas (MATEO, 2000).
A formação de uma ligação covalente entre o PEG e biomoléculas protéicas
utilizadas em tratamentos vêm crescendo e diversos fatores devem ser considerados
durante a peguilação como: o número de moléculas de PEG que reagiram com o
polipeptídeo, o peso molecular e a estrutura do PEG, a localização do PEG no peptídeo
e as condições químicas utilizadas durante a reação com o polipeptídeo (HARRIS,
2003).
3.2.2. Desenvolvimento da Peguilação
26
Desde 1970 foram publicados diversos artigos referentes à modificação química
das proteínas pela conjugação com macromoléculas sintéticas, que são derivadas do
PEG (KODERA, 1998).
Os estudos pioneiros que obtiveram sucesso na conjugação de polímeros foram
iniciados com ABUCHOWSKI et al. na década de 70, que foram sendo aperfeiçoados
ao longo dos anos (Tabela 1). Esses estudos levaram a aprovação do PEG pelo US FDA
como polímero para uso interno devido as suas propriedades atóxicas e não
imunogênicas. Até a década de 80 realizaram-se estudos em relação à utilização do PEG
em formulações farmacêuticas devido as suas características anfifílicas, apresentando
uma boa solubilidade em água e solventes orgânicos (VERONESE, 2008). Entre os
anos de 1980 e 1990 estudos biológicos demonstraram que os compostos que formavam
ligações com o PEG adquiriam suas propriedades físico-químicas o que acarretou
também em uma boa solubilidade entre as membranas biológicas. Estes estudos
observaram que os produtos peguilados apresentavam resistência a anticorpos e a
enzimas proteolíticas bem como eram eliminados mais lentamente do organismo
(KODERA, 1998). Em meados do ano 2000 ocorreram diversas reações de peguilação
com compostos de origem não protéica como nucleotídeos e alguns produtos naturais
utilizados na terapia do câncer. A tabela abaixo mostra a evolução da peguilação desde
1970.
Período PEGs Observação geral Aplicação
1970-80
PEG-clorotriazina
PEG-succimilsucinato
Estudos pioneiros
Enzimas
1980-90
PEG-aldeído
PEG-pNO2-fenil carbonato
PEG-carbonilimidazol
PEG-AA-NHS
Estudos
farmacocinéticos;
Acoplamento dos
derivados em sítios
específicos
Terapia de reposição
enzimática
1990-2000
PEG-NHS
PEG-maleimida
PEG-OPSS
Derivados de PEGs mais
seletivos
Hormônios;
Drogas
antineoplásicas
2000-atual
Acoplamento enzimático
Caracterização química e
biológica dos conjugados,
descoberta de novas
drogas, combinação da
engenharia genética e da
peguilação
Drogas de origem não
protéicas
(nucleotídeos)
AA= Aminoácidos; NHS=N-hidroxisuccinimida; OPPS= Orto-piridildisulfeto
Tabela 1 – Principais derivados de PEGs e suas aplicações durante o desenvolvimento
da peguilação ao longo dos anos.
27
3.2.3. Química da peguilação
O PEG (1) (Figura 1) é um polímero anfifílico que possui em sua estrutura
química unidades repetidas de óxido de etileno e em suas terminações existem grupos
hidroxilas que podem ser ativados. Os compostos (2), (3) e (4) (Figura 1) são exemplos
de derivados de PEG. Os compostos (2) e (3) reagem, através de reações de substituição
nucleofílica com o grupo funcional amino livre em proteínas. O composto (4) reage com
resíduos de cisteína em proteínas, com formação de pontes dissulfeto (VERONESSE,
2008).
O NO2
O
OmPEG
N
NN
O
O
OmPEGSSmPEG
Grupos funcionais responsáveis pela síntese de novos derivados de PEG.
Unidades repetidas de óxido de etileno
(1)
H-(OCH2CH2)n-OH
H-(OCH2CH2)n-OH
(1)
(2)
(3)
(4)
mPEG=CH3-(OCH2CH2)n-OH
Figura 1. Polietilenoglicol (1) e alguns derivados peguilados ativos (2), (3) e (4) para a
síntese com biomoléculas protéicas.
A peguilação está classificada em duas gerações. A primeira geração
apresenta as seguintes características: reações envolvendo formação de derivados de
PEG impuros, as moléculas envolvidas na peguilação possuem baixos pesos
moleculares, as ligações formadas no produto peguilado são instáveis e falta
28
direcionamento para a formação de ligações em grupos específicos no reagente que será
peguilado. Exemplos de PEG derivados de primeira geração incluem: PEG-
diclorotriazina, PEG-tresilato, PEG-succimil carbonato, PEG-benzotriazol carbonato,
PEG-p-nitrofenilcarbonato, PEG-triclorofenil carbonato e PEG-carbonilimidazol. A
segunda geração de PEGs foi desenvolvida para superar os problemas envolvidos na
primeira geração. Um típico exemplo de PEG derivado de segunda geração é o
metoxipolietilenoglicol propionaldeído (mPEG-ALD). Este é mais fácil de ser obtido
que o PEG-acetaldeído, devido ao acetaldeído ser mais suscetível a dimerização via
condensação aldólica (ROBERTS, 2002). Um dos métodos de obtenção do mPEG-ALD
ocorre primeiramente por formação de alcóxidos para a reação de Williamson, tal
alcóxido é obtido entre a reação de um composto contendo um grupo funcional
hidroxila sob condições básicas. Posteriormente, já na reação de Williamson, ocorre o
deslocamento do íon haleto por ataque do alcóxido nucleofílico e formação de um
acetal. O acetal é hidrolisado por técnicas corriqueiras de laboratório (refluxo em meio
ácido) através de uma reação de hidrólise originando o metoxipolietilenoglicol
propionaldeído. Um dos métodos para a peguilação de proteínas é a utilização de
derivados peguilados com o grupo funcional aldeído, devido este ser seletivo no N-
terminal de aminoácidos de proteínas. Esta reação ocorre sob condições ácidas na
presença de um agente redutor (ZHAO, 2008).
3.2.4. Propriedades farmacológicas de produtos peguilados
As reações de peguilação estão sendo aplicadas em compostos de natureza
protéica que possuem excelentes atividades biológicas. Alguns desses compostos já
estão disponíveis para o mercado ou em fase de teste clínico (Tabela 2) (PARVEEN,
2006). Destaca-se também o avanço no sentido do desenvolvimento de novas
moléculas, especialmente a forma monopeguilada de interferon α-2a (Tabela 2), que foi
conjugada com polietilenoglicol através da lisina (FOSER, 2003) observando-se que a
proteína peguilada conservava a atividade antiviral, aprimorando os parâmetros
farmacocinéticos (ARDUINI, 2004).
29
Produto PEG Ligação
formada
Nome
comercial Laboratório Status Indicação
PEG-denosina
deaminase 5 kDa NI Adagen®
Enzon
Pharmaceuticals lançado Imunodeficiência
PEG-
asparaginase 5 kDa Amida Oncaspar®
Enzon
Pharmaceuticals lançado Leucemia
PEG-IFNα2a 40 kDa Amida Pegasys® Hoffmann-La
Roche Fase II Melanoma e hepatite C
PEG- IFNα2b 12 kDa Carbamato PEG-Intron® Schering-Plough lançado Hepatite C
PEG-arginina
deaminase 20 kDa NI Hepacid®
Phoenix
Pharmacologics Fase I Carcinoma hepático
PEG-hGH 5 KDa Amida Somavert® Pfizer lançado Acromegalia PEG-hGH = Hormônio humano do crescimento peguilado; IFN= Interferon; NI= Não informado
Tabela 2 - Proteínas peguiladas disponíveis no mercado ou em fases de testes
clínicos (PARVEEN, 2006).
3.2.4.1. Prolongamento do tempo de meia vida
O aumento no tempo de residência de proteínas peguiladas no organismo dá-se
através de dois efeitos principais: (1) diminuição na taxa de depuração do rim e (2)
aumento na proteção contra a degradação proteolítica. PEGs são altamente hidratados,
com duas moléculas de água por unidade de etilenoglicol, isto acarreta em um aumento
no tamanho molecular do PEG conjugado (HARRIS, 2003). PEGs com peso molecular
abaixo de 20 KDa são excretados do organismo pelos rins. Acima de 20 KDa, a
filtração renal diminui em favor da excreção hepatobiliar (YAMAOKA, 1994).
Para muitas proteínas e peptídeos, a rápida degradação proteolítica por enzimas
circulantes representa um dos principais desafios na produção de terapêutica viável. O
PEG fornece proteção às biomoléculas protéicas por dificultar o acesso de proteases e
peptidases. O modelo mais provável para explicar a proteção contra a proteólise envolve
um processo dinâmico no qual o PEG cria um impedimento estérico sobre o domínio da
proteína que serve como um substrato da enzima proteolítica, reduzindo a freqüência de
colisões favoráveis. Apesar do PEG criar uma obstrução ao domínio da proteína que
serve como sítio para o ataque das proteólises, isto não se observa em relação à ligação
das biomoléculas protéicas e aos seus receptores biológicos. As duas situações (Figura
2) são distinguidas pela afinidade de interação. Assim, para a protease há uma menor
afinidade para uma ligação e a clivagem é feita consideravelmente mais difícil pela
presença do domínio PEG (Figura 2). Para a ligação do agonista a molécula-alvo
(receptor, substrato da enzima ou macromolécula), a maior afinidade da interação
30
aumenta a probabilidade de uma interação produtiva, e, assim, a eficácia biológica é
alcançada; assim, a presença de PEG não cria impedimento estérico para essa interação,
e isso se reflete na comparação das moléculas peguiladas com suas moléculas nativas
(FISHBURN, 2007).
Figura 2. Figura ilustrativa de um modelo para o mecanismo pelo qual o PEG fornece
proteção proteolítica. (A): O acoplamento de uma protease do plasma (azul claro) em
uma proteína peguilada (azul escuro) é prejudicado pelo impedimento estérico do
domínio PEG (amarelo, com círculos brancos). O domínio PEG móvel gera diferentes
configurações que reduzem a probabilidade de uma colisão favorável levando a uma
menor interação enzima-substrato (clivagem da proteína). (B): Para a molécula-alvo
(receptor) (rosa), a maior afinidade da interação conduz o equilíbrio para aumentar a
probabilidade de uma interação produtiva e, portanto, mais configurações são possíveis
para conseguir uma eficácia biológica (FISHBURN, 2007).
O mesmo efeito estérico da cadeia de PEG que dificulta o acesso de enzimas
proteolíticas também paralelamente reduz a imunogenicidade de proteínas peguiladas. A
molécula de PEG minimiza a exposição de determinadas proteínas que em algumas
pessoas são reconhecidas como antígenos, dessa forma reduzem e impedem a produção
de anticorpos neutralizantes. A toxicidade de proteínas, quando peguiladas, também é
reduzida. O PEG foi aprovado pelo FDA para uso em alimentos e cosméticos, e é
considerado essencialmente atóxico (WEBSTER, 2007).
3.3. Análise térmica
31
Métodos térmicos são técnicas em que as variações de propriedades físicas de
uma substância são medidas em função da temperatura.
Conceitua-se análise térmica como um conjunto de técnicas que permite medir
as mudanças de propriedades físicas de uma substância ou material em função da
temperatura ou tempo, enquanto a substância é submetida a uma programação
controlada da temperatura (IONASHIRO, 2004).
As áreas de aplicação da análise térmica incluem os seguintes estudos:
decomposição térmica; determinação de umidade, de voláteis, de resíduos e de teor de
cinzas; oxidação térmica; cinética de reação e cristalização; diagrama de fases;
determinação de calor específico; determinação de transição vítrea, de fusão, de tempo
de armazenamento; dentre outros (MOTHE & AZEVEDO, 2002).
As vantagens da Análise Térmica são muitas como, necessidade de uma pequena
quantidade de amostra para os ensaios, variedade de resultados em um único gráfico,
não há necessidade de preparo da amostra. Sua aplicabilidade ocorre em diversas áreas:
alimentícia, catálise, cerâmica, engenharia civil, farmacêutica, inorgânica, petroquímica,
polímeros, vidros, dentre outras.
Segundo Kent (1971) para uma técnica ser considerada termoanalítica ela deverá
atender a três critérios básicos:
a) Medir uma propriedade física;
b) Expressar a medida em função da temperatura;
c) Realizar a medida sob um controle de temperatura.
Os métodos que envolvem mudanças no peso ou na energia se enquadram nesta
definição (AULTON, 2005).
De acordo com Holler & Niemen (1998), algumas das vantagens que a análise
térmica possui em relação a outros métodos analíticos são:
A amostra pode ser estudada sobre ampla grande faixa de temperatura
usando vários programas de temperatura;
Quase todas as formas físicas da amostra (sólido, líquido ou gel);
Uma pequena quantidade da amostra (0,1 µm – 10 mg);
A atmosfera na vizinhança pode ser padronizada;
O tempo requerido para completar o período de experimento é de alguns
minutos a horas;
Os instrumentos de análise térmica apresentam preços razoáveis.
32
A implementação da análise térmica na indústria farmacêutica surge como um
método analítico, quantitativo e comparativo, capaz de produzir resultados rápidos e
reprodutíveis, podendo ser utilizada no controle de qualidade de medicamentos, visando
à análise integral do produto final e a determinação de parâmetros de qualidade
tecnológica (MACÊDO, 1996; GOMES, 2002).
Dentre as técnicas termoanalíticas utilizadas na análise térmica podemos citar a
calorimetria exploratória diferencial (DSC), a análise térmica diferencial (DTA) e a
termogravimetria (TG).
3.3.1. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
A técnica DSC mede a diferença de energia cedida a uma substância e a um
material de referência em função da temperatura, quando a substância e a referência são
submetidas a um processo térmico controlado. Dependendo do método de medida,
podem ser distinguidos dois procedimentos de DSC: com compensação de energia e
com fluxo de calor (IONASHIRO, 2004).
As amostras de DSC são analisadas em pequenas panelinhas de metal, designadas
pela ótima condutividade térmica e reações mínimas com as amostras (por ex.,
alumínio, platina, prata, liga e aço inoxidável).
Os picos da calorimetria exploratória diferencial resultam tanto de modificações
físicas como reações químicas induzidas por variações de temperatura da amostra. Os
processos físicos endotérmicos incluem fusão, vaporização, absorção e desorção. A
adsorção e a cristalização geralmente são exotérmicas. As reações químicas podem ser
também exotérmicas ou endotérmicas. As reações exotérmicas incluem oxidação no ar
ou na presença de oxigênio, polimerização e reações catalíticas. As reações
endotérmicas incluem desidratação, redução em uma atmosfera gasosa e decomposição.
I) Vantagens do DSC (MOTHÉ & AZEVEDO, 2002):
Rápido tempo de análise;
Fácil preparo da amostra;
Pode ser aplicado para sólidos e líquidos;
Larga faixa de temperatura;
Medidas quantitativas.
33
II) Desvantagens e limitações do DSC:
Redução da sensibilidade quando a linha de base está em inclinação ou
curvatura;
Algumas transições observadas são complexas e apresentam dificuldade
para interpretação (por exemplo, temperatura de transição vítrea, fusão e
cristalização).
III) Principais aplicações:
Determinação do ponto de fusão;
Determinação do calor de fusão;
Determinação de pureza;
Caracterização de polimorfismo;
Caracterização de pseudopolimorfismo;
Estudo de diagramas de fase;
Evaporação e vaporização de substâncias;
Transição vítrea;
Estudo de compatibilidade droga-excipientes;
Estudo de estabilidade térmica;
Estudo da cinética de decomposição.
Pesquisas sobre o efeito dos estudos termoanalíticos em proteínas peguiladas,
são praticamente inexistentes, os estudos são normalmente referentes às proteínas
isoladas ou em misturas lácteas. Michnik et al (2006) realizaram um estudo
comparativo em relação a desnaturação térmica entre a HSA e a SBA (albumina
bovina). O método aplicado foi realizado em temperaturas até 100ºC e as amostras das
albuminas foram caracterizadas por DSC em solução aquosa. O estudo demonstrou que
a albumina do soro em seres humanos apresentou uma melhor estabilidade térmica em
relação à albumina bovina.
Michnik et al (2007) estudaram o efeito do etanol sobre a estabilidade do soro de
albumina humana em solução aquosa através da utilização de calorimetria diferencial de
varredura. Os resultados sugerem que o etanol, em concentrações baixas, estabiliza a
estrutura natural da albumina, devido à sua ligação com o estado nativo de proteínas.
34
Gauche et al (2010) realizaram um estudo comparativo da influência da enzima
transglutaminase em proteína de leite por DSC. As amostras, na forma de gel,
demonstraram que as proteínas do leite não polimerizadas pela enzima apresentaram
uma melhor estabilidade térmica.
3.3.2. DSC Acoplado a um Sistema Fotovisual
O sistema DSC–fotovisual é uma técnica termoanalítica, recentemente
introduzida na análise de medicamentos que combina a microscopia por imagem com os
dados DSC (LACHMAN, LIEBERMAN & KANIG, 2001). Essa técnica permite
visualizar os processos entálpicos em tempo real (SOUZA, 2005).
Os estudos realizados com DSC fotovisual demonstram a sua aplicabilidade
em controle de qualidade, desde comparações do comportamento térmico entre o
fármaco e seus excipientes até diferenças existentes entre uma matéria-prima e outra
(MACÊDO, 2001).
Muitos pesquisadores têm utilizado o DSC acoplado a um sistema fotovisual
para confirmar transições de fase e ponto de fusão ocorrido nas curvas calorimétricas.
A determinação da pureza de um fármaco pode ser feita por DSC, pois
impurezas numa substância considerada pura podem diminuir seu ponto de fusão
(WELLS, 1988).
O pico de fusão de uma substância pura, material cristalino, deverá ser exato,
mas impurezas ou defeitos na estrutura do cristal ampliarão a faixa de fusão e baixarão
o ponto de fusão final para temperaturas mais baixas (FORD, 1989).
O DSC também pode ser utilizado para quantificação da cristalinidade de um
fármaco, pois se sabe que durante a formação de um fármaco cristalino algumas
conversões para formas amorfas podem ocorrer durante o processamento da
formulação, o que afetará a estabilidade química e física do fármaco. Outra importante
aplicação do DSC é no estudo de compatibilidade fármaco-excipiente, no qual é
observado se há ou não interação entre uma mistura ou formulação.
3.3.3. Análise térmica diferencial (DTA)
35
A diferença de temperatura entre a amostra e uma substância de referência é
medida em função da temperatura. Enquanto a amostra e a referência são submetidas a
um programa de temperatura controlada (SKOOG, HOOLER & NIEMAN, 1998).
Um instrumento de DTA típico compreende um forno, tendo célula de amostra
e referência, um controlador do diferencial de temperatura com amplificador associado
e sistema de registro com controle de temperatura e atmosfera programada do forno
(FORD & TIMMINS, 1989).
A referência utilizada é a α-alumina, substância termicamente inerte, que não
exibe mudanças de fase com variações de temperaturas.
Os primeiros trabalhos termoanalíticos fizeram uso do DTA com o objetivo de
avaliar a compatibilidade farmacêutica, uma vez que esta técnica permite detectar
diversas situações de interações físicas e químicas (SHATTAWY, KILDSIG & PECK,
1982).
O DTA é utilizado na determinação do comportamento térmico e composição
de produtos industrializados. Como também, na formação de diagramas de fase e no
estudo de transições de fase. Esse método também fornece um caminho simples e
preciso para determinação do ponto de fusão, ebulição e decomposição de compostos
orgânicos (SKOOG, HOLLER & NIEMAN, 1998).
3.3.4. Termogravimetria (TG)
É uma técnica termoanalítica na qual se analisa continuamente a massa da
amostra, em uma atmosfera controlada, em função da temperatura ou do tempo. O
método termogravimétrico fornece informações sobre decomposição e oxidação, e de
processos físicos como vaporização, sublimação e desorção (SKOOG, HOLLER &
NIEMAN, 1998; HATAKEYAMA & QUINN, 1997).
O registro de análise é representado pela curva TG ou termogravimétrica,
sendo a massa colocada no eixo das ordenadas, com valores decrescentes de cima para
baixo e o tempo (t) ou temperatura (T) no eixo das abscissas, com valores crescentes da
esquerda para a direita (SOUZA, 2001).
As curvas de variação de massa em função da temperatura permitem tirar
conclusões sobre a estabilidade térmica da amostra e sobre a composição do resíduo
(IANOSHIRO, 1996).
36
O equipamento termogravimétrico possui uma termobalança moderna, a qual
consiste em uma microbalança eletrônica, um programador de temperatura, um suporte
para a amostra, um acessório para estabelecer a atmosfera adequada e um registrador. A
sensibilidade da balança é em torno de microgramas, com uma capacidade total em
torno de cem miligramas. O forno pode ser programado a temperatura de até 1.000ºC,
com velocidade de aquecimento de até 100ºC/minuto. A atmosfera do forno é
controlada, principalmente, para garantir que o ambiente seja o mais constante possível
durante o experimento. Os materiais do suporte da amostra comumente utilizados
incluem: platina, sílica e alumina (UNITED STATES PHARMACOPOEIA, 2006).
Uma curva da termogravimetria em preparações farmacêuticas pode demonstrar:
Componentes voláteis, como misturas, solventes, etc;
Perda de água de cristalização;
Decomposição;
Resíduos (como cinzas), resíduos carbonáceos enegrecidos, formados
durante a decomposição numa atmosfera inerte (MEDEIROS, 2001).
3.3.4.1. Classificação
Os métodos termogravimétricos são classificados em:
A. Termogravimetria Dinâmica ou Não-Isotérmica – Faz-se uma avaliação da massa,
de forma contínua, à medida que vai ocorrendo aumento da temperatura (KENT, 1971).
Este método tem sido muito utilizado para o estudo de decomposição térmica
de sólidos (MEDEIROS, 2001).
B. Termogravimetria Isotérmica – A medida da variação de massa da amostra é
registrada em função do tempo, mantendo-se a temperatura constante (CONCEIÇÃO,
2000).
Permite o cálculo da energia de ativação desde que se utilize repetição em
diferentes temperaturas (MEDEIROS, 2001).
C. Termogravimetria Quase-isotérmica – A partir do momento em que começa a perda
de massa da amostra, a temperatura é mantida constante até que a massa se estabilize
37
novamente, assim recomeça-se o aquecimento e este procedimento pode ser repetido em
cada etapa da decomposição (YOSHIDA, 1993).
3.3.4.2. Aplicações
As principais aplicações da Termogravimetria são as seguintes (MEDEIROS,
2001):
Estudo da decomposição e da estabilidade térmica de substâncias
orgânicas e inorgânicas, de fármacos, minerais, metais, polímeros,
produtos alimentícios entre outros;
Determinação da pureza e da estabilidade térmica de reagentes analíticos,
inclusive padrões primários e secundários;
Desenvolvimento de processos analíticos gravimétricos;
Estudo sobre a velocidade de destilação e evaporação de líquidos por
diferentes gases e em faixas amplas de temperatura;
Estudos sobre a velocidade de destilação e evaporação de líquidos e da
sublimação de sólidos;
Estudo cinético de reações no estado sólido;
Os estudos termogravimétricos referentes a compostos de origem protéica são
escassos. Lu et al (2007) demonstraram, através de termogravimetria, que misturas de
proteínas a excipientes como sacarose e trealose, após liofilização, mantinham a
estabilidade física das proteínas em formulações. Ciesla et al (2010) avaliaram, por
termogravimetria, a influência de radiação gama em alfa e beta globulina. Tal estudo
demonstrou que a decomposição térmica das globulinas, em suspensão aquosa, ocorre
em temperaturas mais elevadas do que quando comparado com a suspensão não
irradiada.
CAPÍTULO II
Patente
TÍTULO: Desenvolvimento de Processo de Obtenção de Peguilado de Albumina
Humana (HSA)
Depósito de pedido de Patente ao Instituto Nacional de Propriedade Industrial -
INPI.
39
RELATÓRIO DESCRITIVO
DESENVOLVIMENTO DE PROCESSO DE OBTENÇÃO DE PEGUILADO DE
ALBUMINA HUMANA (HSA)
1. Estado da arte
No final dos anos 50, a modificação de proteínas tornou-se uma prática comum e foram
desenvolvidas técnicas para facilitar a análise das relações entre estrutura e atividade das
moléculas de proteína. Existem resíduos de aminoácidos com diferentes reatividades em
uma proteína, dependendo de sua localização na estrutura da proteína nativa1.
Desde 1970 foram publicados diversos artigos referentes à modificação química das
proteínas pela conjugação com macromoléculas sintéticas, que são derivadas do
polietilenoglicol (PEG)1. Os objetivos destas modificações protéicas incluíram a redução
da imunoreatividade ou da imunogenicidade e a supressão da produção de
imunoglobulina. Provavelmente, uma das características mais marcantes da modificação
molecular usando o PEG é o aumento do tempo de meia vida e da concentração das
proteínas terapêuticas no plasma sanguíneo. Estas características podem ser atribuídas,
em parte, pelo aumento do peso molecular da molécula conjugada com o PEG, alterando
o sistema de filtração renal e também pela redução da proteólise enzimática2. As reações
de peguilação estão sendo aplicadas em compostos de natureza protéica que possuem
excelentes atividades biológicas. Alguns desses compostos já estão disponíveis para o
mercado ou em fase de teste clínico3. Destaca-se também o avanço no sentido do
desenvolvimento de novas moléculas, especialmente a forma monopeguilada de
interferon α-2a, que foi conjugada com polietilenoglicol através da lisina4 observando-se
que a proteína peguilada conservava a atividade antiviral, aprimorando os parâmetros
farmacocinéticos5. Tais modificações também foram aplicadas na catalase na qual
apresentaram redução da imunoreatividade para anticorpos1.
A proteína utilizada neste trabalho foi a albumina sérica humana (HSA),
amplamente estudada no campo da bioquímica. A HSA é a proteína mais abundante no
plasma sanguíneo, bem como contribui para a regulação da pressão coloidal osmótica
do sangue e também para o transporte de outros compostos endógenos e exógenos. A
estrutura secundária da HSA contém muitos resíduos de cisteína e são helicoidais em
grande parte da cadeia. Apresenta fácil isolamento em grandes quantidades favorecendo
sua alta estabilidade e solubilidade em água. Consiste em um monômero com uma
massa molecular de 66 KDa9.
5
10
15
20
25
30
40
A HSA passa por notáveis mudanças reversíveis na conformação, usualmente sob
condições não fisiológicas6. Derivados peguilados na forma de amina foram
desenvolvidos para reagir com carbonilas de albumina bovina por amidação em pH
alcalino7.
A utilização de aldeídos peguilados na literatura é encontrada para reação com o N-
terminal alfa-amino de fatores de estimulação de granulócitos em condições ácidas. Tal
síntese é uma reação de substituição nucleófílica e não há relato na literatura dessa
síntese com o grupamento alfa-amino dos resíduos de aminoácido da HSA.
2. Descrição do evento
Este pedido de patente aplica-se a um processo inédito de preparação da albumina
humana peguilada (HSA-PEG) através de uma reação de substituição nucleofílica, uma
vez que não há relato na literatura dessa síntese com o grupamento alfa-amino dos
resíduos de aminoácido da HSA. A síntese ocorre a partir do metoxipolietilenoglicol
propionaldeído (8) e HSA em meio ácido com o agente redutor hidreto de metal
complexo.
A preparação do metoxipolietilenoglicol propionaldeído (8) deu-se da seguinte maneira:
Primeiramente ocorre uma reação ácido-base entre o PEG 2000 (1) e o tert-butóxido de
potássio 95% (tBuOK)(6) com formação de um nucleófilo (2). Preferencialmente pode-
se utilizar como catalisador para a reação SN2 um haleto metálico adicional. O
nucleófilo haleto substitui o bromo na molécula do 2-(2-bromoetil)-1,3-dioxalano (3),
originando o 2-(2-haloetil)-1,3-dioxalano(4), mais reativo. O haleto formado é melhor
grupo abandonador, favorecendo a reação com o alcóxido originando o acetal (5). O
acetal (5) é então hidrolisado em ácido mineral aquoso resultando no aldeído (8).
A síntese da albumina humana peguilada (HSA-PEG) ocorre através do ataque dos
resíduos amina nucleofílicos (7) (pares de elétrons disponíveis no nitrogênio do resíduo
alfa-amino dos aminoácidos livres da proteína) no carbono eletrofílico do aldeído
peguilado (8) com formação de um intermediário deficiente de elétrons no nitrogênio
(9), que sofre eliminação de água com a formação de um intermediário estável imina
(10). Esta sofre uma redução pela ação do cianoboridreto de sódio em meio ácido e
resultando na amina peguilada (11).
3. Detalhes do procedimento experimental químico
5
10
15
20
25
30
41
3.1. Preparação do metoxipolietilenoglicol propionaldeído
2g de metoxipolietilenoglicol (2000 KDa) (mPEG) (1) foram dissolvidos em 25 mL de
solvente dipolar aprótico não-nitrogenado e adicionados em pequenas porções sob
agitação magnética vigorosa 0,308 g de tert-butóxido de potássio 95% (tBuOK) (6) à
temperatura ambiente. Após 2 horas o solvente foi removido em rotaevaporador e bomba
de vácuo. O sólido obtido foi solubilizado com igual volume de solvente dipolar aprótico
não-nitrogenado e foram adicionados 0,15 mL de 2-(2-Bromoetil)-1,3-dioxalano 96%
(3), e 0,018 g de haleto metálico. A mistura reacional ficou em temperatura ambiente e
sob agitação magnética durante 5 horas. O solvente foi rotoevaporado e o sólido obtido
foi dissolvido em diclorometano (50 mL). Fez-se três extrações de 10 mL de água, e o
extrato orgânico submetido à secagem com sulfato de sódio anidro, filtrado e
concentrado em rotaevaporador. O produto foi cromatografado em coluna flash com
clorofórmio-metanol 95:5. A formação do acetal (5) (rendimento 80 %) foi acompanhada
em cromatografia de camada delgada analítica utilizando como eluente CHCl3 95:
MeOH 5 e o consumo do mPEG foi acompanhado com auxílio do revelador de vanilina.
O acetal (5) purificado foi solubilizado em 10 mL de etanol P.A. e submetido a hidrólise
sob refluxo com 1 mL de ácido mineral aquoso 10% e leve aquecimento (30-40oC) até a
formação do aldeído (8). A formação do aldeído peguilado (8) (75% de rendimento) foi
acompanhado em cromatografia de camada delgada analítica utilizando como eluente
CHCl3 95: MeOH 5 e revelador DNPH (2,4 dinitrofenilhidrazina 0.1% w/v em HCl 0.4%
v/v). Tal síntese foi desenvolvida para aumentar o rendimento do metoxipropionaldeído
peguilado8.
3.2. Preparação da albumina humana peguilada
1 a 10 mM de metoxipolietilenoglicol propionaldeído (8) foram solubilizados em 10 mL
de tampão fosfato de sódio (0,1M) (pH= 4,0) e adicionados 1mM de albumina humana
(7) e 20 mM de NaCNBH3, a qual ficaram sob agitação magnética durante 3 horas e sob
temperatura ambiente. A peguilação foi realizada com uma razão molar de 1 e 10 do
aldeído (8). A formação da HSA-PEG (11) foi acompanhado pelo consumo do aldeído
peguilado em cromatografia de camada delgada analítica utilizando como eluente CHCl3
95: MeOH 5 e revelador DNPH ( 2,4 dinitrofenilhidrazina 0.1% w/v em 0.4% HCl v/v).
42
Posteriormente a mistura reacional foi liofilizada. Os rendimentos da reação foram
obtidos em torno de 45 a 90%. Os produtos peguilados foram caracterizados por RMN1H
e RMN13
C. Os dados dos principais deslocamentos de RMN1H (200 MHz, =ppm,
CDCl3) e RMN13
C (200 MHz, =ppm, CDCl3) estão listados na tabela 1.
4. REFERÊNCIAS
1. KODERA, Y.; MATSUSHIMA, A.; HIROTO,M.; NISHIMURA, H.; ISHII, A.;
UENO, T.; INADA, Y. PEGylation of proteins and bioactive substances for medical and
technical applications. Progress Polymer Science, v.23, p. 1233-1271, 1998.
2. GRENNWALD, R. B. PEG drugs: an overview. Journal of Controlled Release. v. 74,
p.159-171, 2001.
3. PARVEEN, SUPHIYA; SAHOO, SANJEEB K. Clinical Applications of Polyethylene
Glycol Conjugated Proteins and Drugs. Clinical Pharmacokinet. v. 45 (10), p. 965-988.
2006.
4. FOSER, S.; SCHACHER, A.; WEYER, K. A.; BRUGGER, D.; DIETEL, E.; MARTI,
S.; SCHREITMÜLLER, T. Isolation, structural characterization, and antiviral activity of
positional isomers of monopegylated interferon α-2a (PEGASYS). Protein Expression
and Purification. v.30, p. 78-87, 2003.
5. ARDUINI, R. M.; LI, Z.; RAPOZA, A.; GRONKE, R.; HESS, D. M.; WEN, D.;
MIATKOWSKI, K.; COOTS, C.; KAFFASHAN, A.; VISEUX, N.; DELANEY, J.;
DOMON, B.; YOUNG, C. N.; BOYNTON, R.; CHEN, L. L.; CHEN, L.;
BETZENHAUSER, M.; MILLER, S.; GILL, A.; PEPINSKY, R. B.; HOCHMAN, P. S.;
BAKER, D. P. Expression, purification, and characterization of rat interferon-β and
preparation of an N-terminally PEGylated form with improved pharmacokinetic
parameters. Protein Expression and Purification. v. 34, p. 229-242, 2004.
6. NAKAMURA, K.; ERA, S.; OZAKI, Y.; SOGAMI, M.; HAYASHI, T.;
MURAKAMI, M. Conformation changes in seventeen cystine disulfide bridges of
5
10
15
20
25
30
43
bovine serum albumin proved by raman spectroscopy. Federation of European
Biochemical Societies Letters. v. 417, p.375-378, 1997.
7. WANG, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.
International Journal of Pharmaceuticals. v. 203, p. 1-60, 2000.
8. ZHAO, YONG-JIANG, ZHAI, YAN-QIN. SU. ZHI-GUO. Kinetic analysis and
improvement of the Williamson reaction for the synthesis of (polyethylene glycol)
propionaldehyde. Journal of Applied Polymer Science, vol.111, p. 1638-1643. 2009
9. GHUMAN J, ZUNSZAIN PA, PETITPAS I, BHATTACHARYA AA, OTAGIRI M,
AND CURRY S. Structural basis of the drug-binding specificity of human serum
albumin. Journal Molecular Biological. v. 353, p. 38-52, 2005.
5
10
44
5. Reivindicações
A. Uso do processo de obtenção da albumina (HSA) peguilada com
metoxipolietilenoglicol propionaldeído nas proporções de 1 a 10 M do aldeído para 1 M
da HSA;
B. Uso da tecnologia de liofilização para a obtenção da HSA peguilada com o
metoxipolietilenoglicol propionaldeído;
C. Uso do produto liofilizado do HSA peguilado obtido com o metoxipolietilenoglicol
propionaldeído e HSA nas proporções de 1 a 10M do aldeído para 1 M de HSA.
D. Uso do catalisador haleto metálico na etapa de substituição nucleofílica para
aumentar o rendimento da alquilação do mPEG com 2-(2-Bromoetil)-1,3-dioxalano.
5
10
45
DERIVADOS PEGUILADOS 1HNMR (CDCl3,
200MHz)
13CNMR (CDCl3,
50MHz)
CH3
OOn
O
O
a
bc
d
e
f
g
(7)
OMe – 3,33 ppm (s)
a b – 3,6 ppm (m)
c – 3.7 ppm (t)
d- 1.59 ppm (q)
e- 4.9 ppm (t)
f g – 4.13 ppm (m)
OMe – 58,68 ppm
a b- 72,23 e 71,15 ppm
c- 66.8 ppm
d- 34,12 ppm
e- 102.7 ppm
f g- 64.83 ppm
CH3
OOn
O
Ha
bc
d
e
( 2 )
OMe – 3,33 ppm (s)
a b – 3,6 ppm (m)
c- 3.52 ppm (t)
d- 2.09 ppm (q)
e- 9.18 ppm (t)
OMe – 58,68 ppm
a b- 72,23 e 71,15 ppm
c- 62,8ppm
d- 43.1ppm
e- 210 ppm
(s)-singleto (m)-multipleto (t)-tripleto (q)-quarteto
Tabela 1. Deslocamentos de RMN1H (200 MHz, =ppm, CDCl3) e RMN
13C (50
MHz, =ppm, CDCl3) dos produtos peguilados.
46
6. Resumo
Patente de invenção: DESENVOLVIMENTO DE PROCESSO DE OBTENÇÃO DE
PEGUILADO DE ALBUMINA HUMANA (HSA)
A presente invenção refere-se a um processo de síntese inédito de preparação da
albumina humana peguilada (HSA-PEG) através de uma reação de substituição
nucleofílica. A reação ocorre a partir do metoxipolietilenoglicol propionaldeído (8) e o
grupo alfa-amino do aminoácido livre da HSA em meio ácido com o agente redutor
hidreto de metal complexo.
5
CAPÍTULO III
ARTIGO I
TÍTULO: Obtenção e Caracterização Térmica de Peguilados de
Albumina Humana
Artigo a ser submetido no Journal Thermal Analysis and Calorimetry
48
Obtenção e Caracterização Térmica de Peguilados de
Albumina Humana
Rodrigo Albuquerque da Costa (PG), Celso de Amorim Camara (PQ), Sérgio Luiz Dalmora (PQ),
Tania Maria Sarmento da Silva (PQ), José Valdilanio Virgulino Procópio (PG), Daniela Fernandes
Hermínio (PG) e Rui Oliveira Macedo (PQ*)
[email protected] e [email protected]
*Laboratórios Unificados de Desenvolvimento e Ensaios de Medicamentos ,
LUDEM/DCF/CCS/UFPB, Campus I, CP 5009, CEP 58051970, João Pessoa-PB
RESUMO
A caracterização termoanalítica de proteínas bioativas e seus produtos peguilados tem
aplicação limitada na indústria farmacêutica em comparação com outras técnicas
analíticas. O presente trabalho realizou estudos de caracterização térmica da forma
natural e modificada por peguilação da albumina humana sérica (HSA). As técnicas
térmicas envolvidas foram: Termogravimetria (TG), calorimetria exploratória
diferencial (DSC) e calorimetria exploratória diferencial fotovisual (DSC fotovisual).
As curvas calorimétricas demonstraram que as formas peguiladas da HSA detiveram
uma melhor estabilidade térmica nas razões de aquecimento de 10 oC/min, 20
oC/min,
40 oC/min. As curvas calorimétricas mostraram diferenças entre os produtos peguilados
e não peguilados em relação aos eventos endotérmicos e exotérmicos. A preparação da
albumina humana peguilada (82-85% de redimento) ocorreu através de uma reação de
substituição nucleofílica. A reação ocorre a partir do metoxipolietilenoglicol
propionaldeido (75% redimento) e o grupo alfa-amino do aminoácido livre da HSA em
meio ácido com o agente redutor hidreto de metal complexo. Os intermediários
peguilados foram caracterizados através de RMN1H e RMN
13C.
Palavras Chave: Peguilação, calorimetria, albumina, caracterização, Williamson.
1. INTRODUÇÃO
A instabilidade relacionada às proteínas tanto estruturalmente quanto
quimicamente compromete a sua utilização em formulações como um agente
terapêutico, isto se deve a um curto tempo de vida quando são submetidas a um estresse
químico e ou físico (JONES, 2010). Para melhorar a estabilidade de fármacos de origem
protéica em relação à termodinâmica foi desenvolvida uma modificação química em
aminoácidos e proteínas denominada peguilação (VERONESE & MERO, 2008). No
início da peguilação não havia polietilenoglicóis com estrutura química definida e os
existentes possuíam muitas impurezas. Atualmente existem diversos derivados do
polietilenoglicol com excelentes reatividade e pureza para reação com sítios específicos
de aminoácidos e proteínas. As reações de peguilação estão sendo aplicadas em
compostos de natureza protéica que possuem excelentes atividades biológicas. Alguns
49
desses compostos já estão disponíveis para o mercado ou em fase de teste clínico
(Tabela 1) (PARVEEN, 2006). Destaca-se também o avanço no sentido do
desenvolvimento de novas moléculas, especialmente a forma monopeguilada de
interferon α-2a (Tabela 1), que foi conjugada com polietilenoglicol através da lisina
(FOSER, 2003) observando-se que a proteína peguilada conservava a atividade
antiviral, aprimorando os parâmetros farmacocinéticos (ARDUINI, 2004).
Recentes trabalhos demonstraram que a peguilação da alfa-quimotripsina
melhorou sua estabilidade termodinâmica em relação a sua forma natural
(RODRIGUEZ-MARTINEZ, 2009). Entretanto a caracterização termoanalítica de
proteínas bioativas e seus medicamentos têm aplicação limitada na indústria
farmacêutica em comparação com outras técnicas analíticas. Deste modo o presente
trabalho realizou estudos de caracterização térmica da forma natural e modificada por
peguilação da albumina humana (HSA) contribuindo, desta maneira, para o domínio de
tecnologias que aprimorem as áreas farmacêutica e de saúde pública do País.
A albumina humana foi sintetizada com o metoxipropionaldeído-
polietilenoglicol em duas concentrações diferentes, em pH ácido e temperatura
ambiente.
PRODUTO PEG LIGAÇÃO
FORMADA
NOME
COMERCIAL LABORATÓRIO STATUS INDICAÇÃO
PEG-denosina
deaminase 5kDa NI Adagen® Enzon Pharmaceuticals Lançado Imunodeficiência
PEG-asparaginase 5kDa Amida Oncaspar® Enzon Pharmaceuticals Lançado Leucemia
PEG-IFNα2a 40kDa Amida Pegasys® Hoffmann-La Roche Fase II Melanoma e hepatite C
PEG- IFNα2b 12 kDa Carbamato PEG-Intron® Schering-Plough Lançado Hepatite C
PEG-arginina
deaminase 20kDa NI Hepacid® Phoenix Pharmacologics Fase I Carcinoma hepático
PEG-hGH 5KDa Amida Somavert® Pfizer Lançado Acromegalia
PEG-hGH = Hormônio humano do crescimento peguilado; IFN= Interferon; NI= Não informado
Tabela 1. Proteínas peguiladas disponíveis no mercado ou em fases de testes
clínicos (PARVEEN, 2006).
2. EXPERIMENTAL
2.1. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1.1. Obtenção dos Peguilados
50
Metoxipolietilenoglicol 2000MW, 2-(2-Bromoetil)-1,3-dioxalano 96%, 1,4-Dioxano
anidro 99,8%, Iodeto de potássio p.a 99,5% e albumina humana HSA 66 KDa, foram
adquiridos da SIGMA –ALDRICH.
Duas metodologias principais foram utilizadas para a obtenção dos derivados
peguilados planejados. A metodologia utilizada para obtenção do
metoxipolietilenoglicol propionaldeído deu-se através da reação de Williamson. Os
alcóxidos necessários para a reação de Williamson são normalmente preparados pela
reação de um composto contendo grupamento hidroxila livre com uma base forte.
A metodologia utilizada para o processo de obtenção da albumina humana
peguilada (HSA-PEG) (7), deu-se através de uma reação de substituição nucleofílica,
adaptada de ZHAO (2008). A condensação ocorreu a partir do metoxipolietilenoglicol
propionaldeído (5) e o grupo alfa-amino do aminoácido livre da HSA (6).
2.1.1.1. Preparação do metoxipolietilenoglicol propionaldeído
2g de metoxipolietilenoglicol (2000 KDa) (mPEG) (1) foram dissolvidos em 25 mL de
dioxano p.a e adicionados em pequenas porções sob agitação magnética vigorosa 0,308
g de terc-butóxido de potássio 95% (t-BuOK) à temperatura ambiente. Após 2 horas, o
sólido obtido foi solubilizado com igual volume de dioxano e foram adicionados 0,15
mL de 2-(2-Bromoetil)-1,3-dioxalano 96% (3), e 0,018 g de iodeto de potássio. A
mistura reacional ficou em temperatura ambiente e sob agitação magnética durante 5
horas. O dioxano foi rotaevaporado e o sólido obtido foi dissolvido em diclorometano
(50 mL). Fez-se três extrações de 10 mL de água, e o extrato orgânico submetido à
secagem com sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado em rotaevaporador. O
produto foi cromatografado em coluna flash com clorofórmio-metanol 95:5. A formação
do acetal (4) (rendimento 80 %) foi acompanhada em cromatografia de camada delgada
analítica utilizando como eluente CHCl3 95: MeOH 5 e o consumo do mPEG foi
acompanhado com auxílio do revelador de vanilina. O acetal (4) purificado foi
solubilizado em 10 mL de etanol P.A. e submetido a hidrolise sob refluxo com 1 mL de
ácido mineral aquoso 10% e leve aquecimento (30-40oC) até a formação do aldeído (5).
A formação do aldeído peguilado (5) (75% de rendimento) foi acompanhado em
cromatografia de camada delgada analítica utilizando como eluente CHCl3 95: MeOH 5
e revelador DNPH (2,4 dinitrofenilhidrazina 0.1% w/v em HCl 0.4% v/v).
51
2.1.1.2. Preparação da albumina humana peguilada
5 mM e 10 mM de metoxipolietilenoglicol propionaldeído (5) foram solubilizados,
separadamente, em 10 mL de tampão fosfato de sódio (0,1M) (pH= 4,0) e adicionados 1
mM de albumina humana (6) e 20 mM de NaCNBH3, a qual ficaram sob agitação
magnética durante 3 horas e sob temperatura ambiente. A peguilação foi realizada com
uma razão molar de 5 e 10 do aldeído (5). A formação da HSA-PEG (7) foi
acompanhado pelo consumo do aldeído peguilado em cromatografia de camada delgada
analítica utilizando como eluente CHCl3 95: MeOH 5 e revelador DNPH ( 2,4
dinitrofenilhidrazina 0.1% w/v em 0.4% HCl v/v). Posteriormente a mistura reacional foi
liofilizada.
2.1.2. Estudos Térmicos
Os estudos térmicos da albumina humana (HSA), albumina humana liofilizada
(HSA-Liof) (a HSA-Liof foi liofilizada nas mesmas condições reacionais que a HSA-n1
e HSA-n2, com exceção da presença do aldeído peguilado) e albumina humana
peguilada (HSA-n1 e HSA-n2) foram conduzidos com as técnicas térmicas:
Termogravimetria (TG), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) e Calorimetria
Exploratória Diferencial acoplada a sistema fotovisual (DSC fotovisual).
As curvas DSC para a HSA, HSA liofilizada e HSA peguiladas foram obtidas
utilizando um calorímetro exploratório diferencial de marca Shimadzu, modelo DSC-
50, em atmosfera de nitrogênio de 50 mL.min-1
com massa em torno de 2,0 (+-0,5) mg,
acondicionados em um cadinho de alumínio nas razões de aquecimento de 5, 10 e
20oC/min até 400
oC. Os dados calorimétricos foram analisados usando um software
TASYS da Shimadzu.
As fotos do processo calorimétrico foram obtidas no DSC acoplado a um
sistema fotovisual, constituído de microscópio Olympus conectado a uma câmera Sanyo
modelo VCC-520, usando uma atmosfera de nitrogênio com fluxo de 50 mL.min-1
com
razão de aquecimento de 10 oC/min até a temperatura de 400
oC/min.
As curvas termogravimétricas do HSA, HSA liofilizada e HSA peguilados foram
obtidas utilizando uma termobalança Shimadzu, modelo TGA 50H, sob fluxo de ar
52
sintético de 20 mL.min-1
, usando uma atmosfera de nitrogênio na razão de 50 mL.min-1
,
com razão de aquecimento de 10, 20 e 40 oC/min até 900
oC. As amostras foram
acondicionadas em cadinho de alumina com uma massa em torno de 5,0mg (+ - 0,5).
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1. Obtenção dos Peguilados
O acetal (4) foi obtido com um rendimento máximo de 80% (Figura 1). A reação
de obtenção do alcóxido (2) (Figura 2) necessário para a síntese de Williamson foi
desenvolvida com a utilização de duas bases para a desprotonação do grupo hidroxi do
metoxipolietilenoglicol (1). Inicialmente utilizou-se sódio metálico como base para
formação de um sal de sódio do metoxipolietilenoglicol, no entanto, o alcóxido obtido
forneceu rendimentos baixos (30% de rendimento) durante a reação de Williamson para
formação do acetal (4). Posteriormente utilizou-se como base para a formação do
alcóxido o terc-butóxido de potássio (t-BuOK) (Figura 1). Tal mudança resultou em um
maior rendimento do acetal (4) (80% de rendimento).
CH3
OOHn
CH3
OOn
O
O
Br O
OkI
tBuOK
(1)
R=80%
Tempo de reação : 5 horas
(4)(3)
, dioxano
Figura 1. Reação de obtenção do acetal (4) a partir do metoxipolietilenoglicol (1), t-
BuOK, 2-(2-Bromoetil)-1,3-dioxalano e do catalisador iodeto de potássio.
Uma possível explicação para o baixo rendimento do acetal (4) por utilização do
sódio metálico, estaria relacionada a sua grande reatividade no meio reacional, o que
acarretaria na formação de impurezas levando a menos alcóxido disponível para
originar o acetal (4). Outra explicação para o baixo rendimento estaria relacionada com
a força da ligação iônica. A ligação O-K
+ é mais iônica que a ligação O
-Na
+, isto
deixaria o oxigênio ligado ao Na menos nucleofílico e mais impedido.
Mecanisticamente ocorre uma reação ácido-base entre o PEG 2000 KDa (1) e o
t-BuOK com formação de um alcóxido nucleófilo (2) (Figura 2). Observou-se, também,
que a reação de Williamson sem iodeto de potássio apresentou um rendimento da reação
de formação do acetal (4) inferior a 49%. Com o iodeto de potássio o rendimento foi de
53
cerca de 80%. O tempo de reação para formação do acetal (4) sem o iodeto foi de 19
horas, enquanto que na presença do iodeto de potássio o tempo de reação foi de 5 horas.
Uma explicação plausível para esse ganho de rendimento e menor tempo de reação,
estaria relacionada a substituição do iodeto (nucleófilo) pelo bromo na molécula do 2-
(2-bromoetil)-1,3-dioxalano (3) originando o 2-(2-iodoetil)-1,3-dioxalano (8), mais
reativo. O iodeto formado é melhor grupo abandonador, favorecendo a reação com o
alcóxido originando o acetal (4) com um melhor rendimento (Figura 2).
CH3
OOHn
CH
3
CH3
CH3
OKCH
3
OOKn
CH3
OOn
I O
O
Br O
O
CH3
OOn
O
O
- + - +
-
KI K + I-+
K Br
+ -
+
+
(2)
(3)
(8 )
(1)(2)
(4)
Figura 2. Mecanismo de reação de formação do alcóxido (2) e substituição do Br pelo I,
na molécula do 2-(2-bromoetil)-1,3-dioxalano (3) com formação do acetal (4).
O acetal (4) foi hidrolisado em HCl aquoso resultando no aldeído (5) com rendimento de
75% (Figura 3). Os produtos peguilados foram caracterizados por RMN1H e RMN
13C,
utilizando um equipamento da Varian de 200 MHz. Os dados dos principais
deslocamentos de RMN1H (200 MHz, =ppm, CDCl3) e RMN
13C (200 MHz, =ppm,
CDCl3) estão listados na Tabela 2.
54
CH3
OOn
O
HCH
3
OOn
O
O
HCl, 10%
R=75%
Tempo de reação : 4 horas
(5)
(4)
Figura 3. Reação de hidrólise ácida do acetal (4) originando o metoxipolietilenoglicol
propionaldeído (5) sob leve aquecimento (30-40oC).
A obtenção da albumina humana peguilada (7) (Figura 4) com
metoxipolietilenoglicol propionaldeído (5) nas proporções de 5 mM e 10 mM do
aldeído para 1 mM da HSA, forneceu rendimentos brutos de 82 e 85 % de rendimento,
respectivamente.
CH3
OOn
O
H NaBH3CN
CH3
OOn
N
H
HSA
pH=4.0
(5)(7)
Tempo de reação : 3 horas
, HSBA
Figura 4. Reação de peguilação da HSA em meio ácido com o agente redutor hidreto de
metal complexo.
Mecanisticamente os pares de elétrons disponíveis no nitrogênio do resíduo alfa-amino
dos aminoácidos livres da HSA (6) atacam o carbono eletrofílico do aldeído peguilado
(5) com formação de um intermediário deficiente de elétrons no nitrogênio (9), que
sofre eliminação de água com a formação de um intermediário estável imina (10). Este
sofre uma redução pela ação do cianoboridreto de sódio em meio ácido, resultando na
amina peguilada (7) (Figura 5).
55
CH3
OOn
O
H
HSA-NH2
CH3
OOn
H
OH2
NH-HSA -H2O
NaBH3CN
CH3
OOn
N-HSA
CH3
OOn
N
H
HSA
+..
TRANSFER. DE PRÓTON
(6)
(5)
+
(9)
(7)
pH=4,0
(10)
Figura 5. Mecanismo de reação da albumina humana peguilada (HSA-PEG) (7) a
partir do metoxipolietilenoglicol propionaldeído (5) e HSA (6).
DERIVADOS PEGUILADOS 1HNMR (CDCl3,
200MHz)
13CNMR (CDCl3,
50MHz)
CH3
OOn
O
O
a
bc
d
e
f
g
(7)
OMe – 3,33 ppm (s)
a b – 3,6 ppm (m)
c – 3.7 ppm (t)
d- 1.59 ppm (q)
e- 4.9 ppm (t)
f g – 4.13 ppm (m)
OMe – 58,68 ppm
a b- 72,23 e 71,15 ppm
c- 66.8 ppm
d- 34,12 ppm
e- 102.7 ppm
f g- 64.83 ppm
CH3
OOn
O
Ha
bc
d
e
( 2 )
OMe – 3,33 ppm (s)
a b – 3,6 ppm (m)
c- 3.52 ppm (t)
d- 2.09 ppm (q)
e- 9.18 ppm (t)
OMe – 58,68 ppm
a b- 72,23 e 71,15 ppm
c- 62,8ppm
d- 43.1ppm
e- 210 ppm
(s)-singleto (m)-multipleto (t)-tripleto (q)-quarteto
Tabela 2. Deslocamentos de RMN1H (200 MHz, =ppm, CDCl3) e RMN
13C (50
MHz, =ppm, CDCl3) dos produtos peguilados.
56
3.2. Caracterização Térmica
A análise termogravimétrica dinâmica mostrou que as curvas da HSA e HSA-
Liof apresentaram 7 etapas de decomposição térmica, enquanto que as dos produtos
peguilados mostraram 6 etapas.
As curvas termogravimétricas dinâmicas mostraram que nas diferentes razões de
aquecimento (Figura 6) os produtos apresentaram a seguinte ordem de estabilidade
HSA-n1 = HSA-n2 > HSA > HSB-Liof. A primeira etapa correspondente a perda de
água ocorre em temperaturas diferentes para os produtos peguilados (28 - 140 o
C) e os
não peguilados (28 - 80 o
C). As etapas seguintes representam o início da decomposição
propriamente dita e iniciam em temperaturas maiores para os produtos peguilados
(superior 60 o
C) em relação aos não peguilados. Tal fato mostra claramente a maior
estabilidade térmica dos produtos peguilados que resistem bem ao aumento de
temperatura do que os produtos não peguilados. Os dados termogravimétricos
confirmam a melhoria da estabilidade química dos produtos peguilados, fato já
verificado nos estudos farmacocinéticos efetuados com diferentes proteínas peguiladas
(HARRIS, 2003).
57
Figura 6. Curvas dinâmicas termogravimétricas (TGA 50H) obtidas na razão de aquecimento de 10, 20 e
40ºC min-1
sob fluxo de ar sintético de 20 mL.min-1
, usando uma atmosfera de nitrogênio na razão de 50
mL.min-1
para a amostra de albumina humana sérica (HSA)(1), albumina humana sérica liofilizada (HSA-
Liof)(2), albumina humana peguilada com 5 mM do aldeído peguilado (HSA-n1)(3) e albumina sérica
humana peguilada com 10 mM do aldeído peguilado (HSA-n2)(4) (Anexos I, II, III e IV).
58
As curvas calorimétricas (Figura 7) obtidas na razão de aquecimento de
10oC/min, mostraram diferenças significativas para os diferentes produtos peguilados e
não peguilados (Tabela 3). As curvas DSC para a HSA e HSA-Liof mostram a presença
de um pico endotérmico em 170,69oC para o HSA e 171,98
oC para o HSA Liof,
enquanto que nos produtos peguilados as temperaturas foram deslocadas para 221,30oC
para HSA-n1 e 221,74oC para a HSA-n2. As proteínas peguiladas apresentam mais 02
eventos térmicos, sendo um exotérmico e outro endotérmico, em temperaturas
superiores a 310 o
C, sendo que HSA-n1 apresentou os 02 eventos em temperaturas
maiores do que HSA-n2. Tais eventos devem estar relacionados aos processos de
separação do PEG com a proteína.
Figura 7 - Curvas DSC -50, obtidas na razão de 10 ºC min-1 e sob atmosfera dinâmica
de nitrogênio (50 mL.min-1) para as amostra de albumina humana sérica (HSA) (6),
albumina humana sérica liofilizada (HSA-Liof) (7), albumina humana peguilada com
5M do aldeído peguilado (HSA-n1) (5) e albumina sérica humana peguilada com
10M do aldeído peguilado (HSA-n2) (4). Os círculos representam os picos
exotérmicos.
59
A Figura 8 mostra as fotos do DSC fotovisual onde se pode avaliar visualmente
o comportamento térmico dos produtos peguilados e não peguilado. As características
dos produtos são diferentes do ponto de vista da coloração. Verifica-se, também, a
mudança de coloração na HSA não peguilada em 172 o
C e nos produtos peguilados em
221 o
C. A transição de fase correspondente aos picos endotérmicos em 172 e 221 o
C,
respectivamente para albumina não peguilada e peguilada deve estar relacionada com
mudanças na estrutura da proteína, possivelmente nos grupos contendo enxofre que
resultaria na formação do pigmento amarelado. A degradação mais evidente começa
em 318 e 313 o
C, respectivamente para HSAn1 e HSAn2, mostrando uma maior
estabilidade para HSAn1.
RAZÃO 10 oC/min
1a BANDA ENDOTÉRMICA 2
a BANDA ENDOTÉRMICA
AMOSTRA Temp.
média(oC)
ΔH médio(J/g) Temp.
média(oC)
ΔH médio(J/g)
HSA 170,69 -20,82 ----------------- -----------------
HSA Liof 171,98 -36,24 ----------------- -----------------
HSA-n1 221,30 -23,11 319,77 -7,78
HSA-n2 221,74 -41,31 313,83 -39,60
Tabela 3. Temperatura média e ΔH médio das bandas endotérmicas das curvas DSC -50,
obtidas na razão de 10 ºC min-1
e sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (50 mL min-1
) para as
amostra de albumina humana sérica (HSA), abumina humana sérica liofilizada (HSA-Liof),
albumina humana peguilada com 5 mM do aldeído peguilado( HSA-n1) e albumina sérica
humana peguilada com 10M do aldeído peguilado (HSA-n2).
60
4. CONCLUSÕES
As reações planejadas até o momento foram executadas, permitindo a síntese em
rendimentos considerados bons, utilizando-se a metodologia de Williamson 80% para o
acetal (4) e 75% para o aldeído (5). Através de reações de substituição nucleofílica
foram sintetizadas albuminas peguiladas com redimentos brutos de 82% (HSA-n1) e
85% (HSA-n2).
Os produtos peguilados quando submetidos aos estudos termogravimétricos
apresentaram uma melhor estabilidade em relação a HSA e HSA-Liof apresentando a
ordem de estabilidade de HSA-n1 = HSA-n2 > HSA > HSB-Liof. As curvas
calorimétricas obtidas na razão de aquecimento de 10 oC/min mostraram diferenças
entre os produtos peguilados e não peguilados em relação aos eventos endotérmicos e
exotérmicos. As fotos DSC fotovisual mostraram diferenças entre os produtos
peguilados e não peguilados do ponto de vista da coloração.
Figura 8- Fotos da HSA, HSA-n1 e HSA-n2 através do processo calorimétrico por DSC fotovisual,
obtidos do sistema fotovisual, modelo VCC-520, constituído de microscópio Olympus conectado a uma
câmera Sanyo acoplada ao DSC-50, usando uma atmosfera de nitrogênio, fluxo de ar de 50 mL.min-1
com
razão de aquecimento de 10 oC/min até a temperatura de 400
oC/min.
61
5. REFERÊNCIAS
ARDUINI, R. M.; LI, Z.; RAPOZA, A.; GRONKE, R.; HESS, D. M.; WEN, D.;
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CONCLUSÕES
64
4. CONCLUSÕES
O acetal, inicialmente, foi obtido em rendimentos mais baixos (30%), em virtude
da utilização de sódio metálico como base para formação do alcóxido. Posteriormente
utilizou-se como base para a formação do alcóxido o terc-butóxido de potássio (t-
BuOK) que resultou em um maior rendimento do acetal (4) (80% de rendimento).
Conseguiu-se obter através do uso do catalisador haleto metálico na etapa de
substituição nucleofílica o acetal com um melhor rendimento (80%), bem como uma
redução no tempo de reação de 19 horas para 5 horas. Através de reações de
substituição nucleofílica foram sintetizadas albuminas peguiladas com rendimentos
brutos de 82% (HSA-n1) e 85% (HSA-n2). Os intermediários peguilados foram
caracterizados por RMN1H e RMN
13C.
Os estudos de caracterização térmica submetidos aos produtos peguilados, por
análise termogravimétrica, apresentaram uma melhor estabilidade em relação à HSA e
HSA-Liof apresentando a ordem de estabilidade de HSA-n1 = HSA-n2 > HSA > HSB-
Liof. As curvas calorimétricas obtidas na razão de aquecimento de 10 oC/min
mostraram diferenças positivas do ponto de vista da estabilidade térmica entre os
produtos peguilados e não peguilados em relação aos eventos endotérmicos e
exotérmicos. As fotos DSC fotovisual mostraram diferenças entre os produtos
peguilados e não peguilados do ponto de vista da coloração.
PERSPECTIVAS
66
PERSPECTIVAS
Determinar os parâmetros cinéticos de estabilidade térmica através dos dados
termogravimétricos isotérmicos.
Avaliar o comportamento dos produtos peguilados através da pirólise acoplada à
cromatografia gasosa capilar e espectrometria de massa (PIR/GC/MS).
Avaliação da toxicidade da HSA-PEG por ensaio de cultura de células.
Obtenção de novas proteínas peguiladas pela reação de Williamson.
68
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
69
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
75
ANEXO I
Figura 6. Curvas dinâmicas termogravimétricas (TGA 50H) obtidas na razão de aquecimento de 10, 20 e 40
ºC min-1
sob fluxo de ar sintético de 20 mL.min-1
, usando uma atmosfera de nitrogênio na razão de 50
mL.min-1
para a amostra de albumina humana sérica (HSA), albumina humana sérica liofilizada (HSA-Liof),
albumina humana peguilada com 5 mM do aldeído peguilado (HSA-n1) e albumina sérica humana peguilada
com 10 mM do aldeído peguilado (HSA-n2).
76
ANEXO II
Razão 10
oC/min
Produto
1a etapa
% massa
(faixa temp)
2a etapa
% massa
(faixa temp)
3a etapa
% massa
(faixa temp)
4a etapa
% massa
(faixa temp)
5a etapa
% massa
(faixa temp)
6a etapa
% massa
(faixa temp)
7a etapa
% massa
(faixa temp)
HSA
1,577
(28,93 –
70,87oC)
6,940
(70.87-
208,82oC)
10,450
(208,82 –
280,86oC)
30,994
(280,86 –
375,04oC)
13,979
(375,04 -478 oC)
15,418
(478 –
571,75oC
7,315
( 571,75-
890oC
HSA-Liof
5,399
(28,71 -
74oC)
5,591
(74 - 204oC)
10,682
(204 –
276oC)
29,645
(276 -
366oC)
15,10
(366 - 478oC)
13,948
(478 -
568oC)
7,147
(568 -
890oC)
HSA-n1 4,533
(30 - 138oC)
8,287
(138 -
279oC)
28,634
(279 –
369oC)
9,245
(369- 438oC)
16,534
(438- 590oC)
28,015
(590- 890oC)
---------
HSA-n2 5,477
(28 - 132oC)
9,454
(132 -
282oC)
24,00
(282 –
352oC)
16,276
(352 -
448oC)
13,605
(448- 588oC)
28,728
(588- 850oC)
---------
Tabela 4. Percentagem de perda de massa em suas respectivas faixas de temperatura das
etapas de decomposição térmica das curvas termogravimétricas dinâmicas (TGA50)
obtidas na razão de aquecimento de 10 ºC min-1
sob fluxo de ar sintético de 20 mL.min-1
,
usando uma atmosfera de nitrogênio na razão de 50 mL.min-1 para as amostra de
albumina humana sérica (HSA), albumina humana sérica liofilizada (HSA-Liof),
albumina humana peguilada com 5 mM do aldeído peguilado( HSA-n1) e albumina
sérica humana peguilada com 10 mM do aldeído peguilado (HSA-n2).
77
ANEXO III
Razão 20 oC/min
Produto 1a etapa
% massa
(faixa temp)
2a etapa
% massa
(faixa temp)
3a etapa
% massa
(faixa temp)
4a etapa
% massa
(faixa temp)
5a etapa
% massa
(faixa temp)
6a etapa
% massa
(faixa temp)
7a etapa
% massa
(faixa temp)
HSA 2,652
(33,55 –
78oC)
5,651
(78- 210oC)
13,223
(210 –
301oC)
28,330
(301–
390oC)
15,126
(390 -517 oC)
12.973
(517– 596oC
8,879
( 596-890oC
HSA-Liof 2,882
(25,57-
80oC)
6,398
(80 - 220oC)
9,683
(220- 286oC)
29,93
(286 -220oC)
13,602
(376 - 480oC)
16,88
(480 -
597oC)
8,050
(597 -
890oC)
HSA-n1 5,215
(31,42 -
133oC)
8,928
(133 -
289oC)
24,668
(289 -
358oC)
15,432
(358- 448oC)
12,296
(448- 608oC)
31,537
(608- 890oC)
---------
HSA-n2 4,823
(30,78 -
144oC)
8,570
(144 -
287oC)
26,941
(287 -
362oC)
15,2
(362 -
444oC)
11,068
(444- 596oC)
31,072
(596- 890oC)
---------
Tabela 2. Percentagem de perda de massa em suas respectivas faixas de temperatura das
etapas de decomposição térmica das curvas termogravimétricas dinâmicas (TGA50)
obtidas na razão de aquecimento de 20 ºC min-1 sob fluxo de ar sintético de 20 ml.min-1
,
usando uma atmosfera de nitrogênio na razão de 50 mL.min-1 para a amostra de albumina
humana sérica (HSA), albumina humana sérica liofilizada (HSA-Liof), albumina humana
peguilada com 5 mM do aldeído peguilado( HSA-n1) e albumina sérica humana
peguilada com 10 mM do aldeído peguilado (HSA-n2).
78
ANEXO IV
Razão 40 oC/min
Produto
1a etapa
% massa
(faixa temp)
2a etapa
% massa
(faixa temp)
3a etapa
% massa
(faixa temp)
4a etapa
% massa
(faixa temp)
5a etapa
% massa
(faixa temp)
6a etapa
% massa
(faixa temp)
7a etapa
% massa
(faixa temp)
HSA
3,771
(34,58 –
83,09oC)
5,637
(83,09-
219,86oC)
12,639
(219,86 –
310,87oC)
28,549
(310,87–
400oC)
13,351
(400 -532 oC)
14,717
(532,07–
627,67oC
9,388
( 627,67-
890oC
HSA-Liof 4,712
(30- 90oC)
5,251
(90 - 220oC)
13,118
(220- 310oC)
31,391
(310 -
410oC)
12,349
(410 - 535oC)
13
(535 -
637oC)
9,117
(637 -
890oC)
HSA-n1
4,842
(31,83 –
154,11oC)
8,782
(154,11 –
299,01oC)
28,843
(299 –
372,64oC)
17,256
(372,64 –
453oC)
11,779
(453- 598oC)
26,384
(598- 890oC)
---------
HSA-n2
4,631
(33,22 -
155oC)
8,878
(155 -
298oC)
28,497
(298 -
370oC)
16,084
(370 -
451oC)
12,625
(451- 597oC)
27,037
(597- 890oC)
---------
Tabela 3. Percentagem de perda de massa em suas respectivas faixas de temperatura das
etapas de decomposição térmica das curvas termogravimétricas dinâmicas (TGA50)
obtidas na razão de aquecimento de 40 ºC min-1
sob fluxo de ar sintético de 20 ml.min-1
,
usando uma atmosfera de nitrogênio na razão de 50 mL.min-1 para a amostra de albumina
humana sérica (HSA), albumina humana sérica liofilizada (HSA-Liof), albumina humana
peguilada com 5 mM do aldeído peguilado (HSA-n1) e albumina sérica humana
peguilada com 10 mM do aldeído peguilado (HSA-n2).
79
ANEXO V
