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RODRIGO AUGUSTO FERNANDES ESTEVÃO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE PROLIFERATIVA DO FIBROADENOMA

MAMÁRIO APÓS A ADMINISTRAÇÃO DE ANTICONCEPCIONAL

HORMONAL COMBINADO ORAL, ASSOCIADO OU NÃO AO ESTRIOL

Tese apresentada à Universidade Federal de São

Paulo para obtenção do Título de Mestre em Ciências

pelo Programa de Pós-Graduação em Ginecologia

Orientador: Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário

Co-orientadora: Prof. Dra. Ângela Flávia Logullo

São Paulo

2007

Estevão, Rodrigo Augusto Fernandes

Avaliação da atividade proliferativa do fibroadenoma mamário após a

administração de anticoncepcional hormonal combinado oral, associado ou

não ao estriol/Rodrigo Augusto Fernandes Estevão—São Paulo, 2006.

ix, 73f.

Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de

Medicina. Programa de Pós Graduação em Ginecologia.

Título em inglês: Avaliation of breast fibroadenoma proliferative activity

after administration of combined oral contraceptives associated or not to

estriol.

1. Fibroadenoma. 2. Anticoncepcional .oral 3. Estriol.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA

Chefe do Departamento: Prof. Dr. Manoel João Batista Castello Girão.

Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Edmund Chada Baracat.

iii

Dedicatória

Dedico este trabalho

À minha querida esposa Maíse que tanto colaborou na confecção desta tese,

sempre com paciência e alegria.

Aos meus pais João Fernando e Maria Aparecida pelo amor e sacrifício que me

permitiram chegar até aqui.

Ao Prof. Dr. Geraldo Rodrigues de Lima e Prof. Dr. Edmund Chada Baracat que

conduzem e lideram com brilhantismo e retidão a Ginecologia Brasileira.

Ao Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário pela sua dedicação e incentivo na

elaboração deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Cláudio Kemp pelos ensinamentos radiológicos em Mastologia.

Ao Prof. Dr. Luís Henrique Gebrim pelo apoio, dedicação e seriedade sempre

demonstrados.

Às pacientes que colaboraram imensamente na realização deste trabalho e a

quem devo reverter estes resultados.

iv

Agradecimentos

Agradeço a todos os professores de UNIFESP pela contribuição à minha

formação profissional.

Aos colegas do setor de Mastologia, médicos, enfermeira e funcionárias.

A Airlane Alencar pela análise estatística.

A Celina Oshima pela imuno-histoquímica

v

Sumário

Dedicatória............................................................................................................. iv

Agradecimentos .................................................................................................... v

Lista de quadros..................................................................................................... vii

Lista de tabelas...................................................................................................... viii

Lista de figuras....................................................................................................... ix

Resumo.................................................................................................................. x

1) INTRODUÇÃO................................................................................................... 1

2) OBJETIVO......................................................................................................... 20

3) MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 21

3.1 Casuística................................................................................................... 21

3.2 Método histopatológico............................................................................... 22

3.3 Método imunohistoquímico......................................................................... 23

3.4 Interpretação dos resultados...................................................................... 24

3.5 Método estatístico....................................................................................... 25

4) RESULTADOS................................................................................................... 26

5) DISCUSSÃO...................................................................................................... 35

6) CONCLUSÃO.................................................................................................... 45

7) ANEXOS............................................................................................................ 46

8) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 59

Abstract.................................................................................................................. 74

Bibliografia Consultada.......................................................................................... 75

vi

Lista de quadros

Quadro 1: Classificação dos anticoncepcionais hormonais orais......................... 5

Quadro 2: Componentes progestagênicos dos anticoncepcionais hormonais

orais.......................................................................................................

7

vii

Lista de tabelas

Tabela 1 – Dados epidemiológicos das pacientes do Grupo 1 (usuárias de

ACO)...................................................................................................... 26

Tabela 2 – Dados epidemiológicos das pacientes do Grupo 2 (usuárias de ACO

+ estriol)................................................................................................. 27

Tabela 3 – Média e erro padrão dos dados epidemiológicos das pacientes dos

Grupos 1 e 2.......................................................................................... 27

Tabela 4 – Medidas ultra-sonográficas dos nódulos (em mm) antes e depois da

medicação e dosagem de progesterona pós medicação (Grupo 1 –

usuárias de ACO)................................................................................... 28


medicação e dosagem de progesterona pós medicação (Grupo 2 –

usuárias de ACO + estriol)..................................................................... 29

Tabela 6 – Média e erro padrão das medidas ultra-sonográficas dos nódulos

(em mm) antes e depois da medicação dos Grupos 1 e

2.....................

30

Tabela 7 – Números de núcleos epiteliais positivos e negativos e número total

de núcleos contados no fibroadenoma para o Ki-67 no Grupo 1

(usuárias de ACO)................................................................................. 31


de núcleos contados no fibroadenoma para o c-myc no Grupo 1

(usuárias de ACO)................................................................................. 31


de núcleos contados no fibroadenoma para o Ki-67 no Grupo 2

(usuárias de ACO + estriol).................................................................... 32


de núcleos contados no fibroadenoma para o c-myc no Grupo 2

(usuárias de ACO + estriol).................................................................... 33

Tabela 11 – Média e erro padrão para os núcleos positivos marcados com Ki-67

e c-myc em ambos os grupos................................................................ 34

viii

Lista de figuras

Figura 1 – Fotomicrografia de corte histológico de fibroadenoma mamário de

paciente RAC do Grupo 1 (usuárias de ACO) (imuno-histoquímica

utilizando avidina-biotina-peroxidase).................................................... 35


paciente HSZ do Grupo 2 (usuárias de ACO e estriol) (imuno-

histoquímica utilizando avidina-biotina-peroxidase).................... 36


paciente RAC do Grupo 1 (usuárias de ACO) (imuno-histoquímica

utilizando avidina-biotina-peroxidase).................................................... 37


paciente HSZ do Grupo 2 (usuárias de ACO e estriol) (imuno-

histoquímica utilizando avidina biotina-peroxidase).................... 38

Figura 5 – Modelo de controle endócrino e parácrino do fibradenoma (adaptado

de Simomoto et al., 1996)...................................................................... 41

Figura 6 – Modelo de controle parácrino do fibradenoma em usuárias de ACO

(adaptado de Taniguchi, 2002)............................................................. 43

Figura 7 – Modelo de controle parácrino do fibroadenoma em usuárias de ACO

e estriol................................................................................................... 46

ix

Resumo

Objetivo: Avaliar a atividade proliferativa do fibroadenoma mamário, por meio da

expressão do Ki-67 e do c-myc, após a administração de anticoncepcional hormonal

combinado oral, associado ou não ao estriol.

Material e métodos: Foram estudadas 32 pacientes com fibroadenoma, das quais 10

constituíram o Grupo 1 e utilizaram anticoncepcional hormonal oral (ACO) composto de

levonorgestrel (0,15 mg) e etinilestradiol (0,03 mg), associados a um comprimido de

placebo na mesma cápsula, por quatro ciclos consecutivos, com intervalo de sete dias

entre os mesmos. As 23 restantes foram alocadas no Grupo 2 e receberam, além do

anticoncepcional oral, um comprimido de estriol, na dose de 2 mg, que foi

manufaturado conjuntamente com o anticoncepcional, em uma mesma cápsula, sendo

utilizado de igual modo que as pacientes do Grupo 1. Realizamos medidas ultra-

sonográficas dos tumores antes e após a ingestão da medicação e, ao final dos quatro

ciclos, praticou-se a exérese cirúrgica dos nódulos, com posterior envio para análise

imuno-histoquímica para Ki-67 e c-myc.

Resultados: Obtivemos diminuição significante da dimensão (largura) dos

fibroadenomas de pacientes usuárias apenas de anticoncepcional oral. No Grupo 1

(ACO com placebo), a largura média dos fibroadenomas antes do tratamento foi de

15,73 mm e, após a utilização de quatro ciclos de ACO, foi de 13,17 mm. Esta redução

foi estatisticamente significante (p = 0,043). No Grupo 2 (ACO com estriol), a largura

antes e após o tratamento foi de 15,30 e 13,76 mm, respectivamente, diferença não

estatisticamente significante (p = 0,157). Não houve alteração das outras dimensões

em nenhum dos outros grupos. A análise de Ki-67 e c-myc também não revelou

diferenças significantes entre os grupos estudados: 9,16 e 10,54 no Grupo 1 e 10,86 e

17,03 no Grupo 2, respectivamente. Houve, porém, tendência à maior expressão dos

marcadores entre as pacientes do Grupo 2.

Conclusões: Nossos resultados demonstram não haver diferença significante na

expressão de Ki-67 e de c-myc entre as pacientes que receberam ACO isolado ou

associado ao estriol. Houve apenas tendência a sua maior expressão entre as usuárias

de ACO e estriol. Notamos diminuição significante na largura dos fibroadenomas em

usuárias apenas de anticoncepcional oral.

x

1

1 - INTRODUÇÃO

Representa, o fibroadenoma, o tumor benigno mais comum da mama feminina.

Trata-se de neoplasia formada por tecidos fibroso e glandular. Aparentemente, origina-

se no estroma intralobular especializado e talvez seja esse o motivo pelo qual estas

lesões raramente ocorram em outros locais de partes moles (ROBINS, 1996). Existem

variantes especiais do padrão geral, constituindo entidades separadas, como o

hamartoma, o adenoma tubular, o adenoma de lactação, o adenolipoma, o

fibroadenoma juvenil, o adenoma gigante e o tumor filodes (PAGE, SIMPSON, 1994).

Acomete, principalmente, pacientes jovens, entre 20 e 30 anos, sendo a afecção

mamária benigna mais comum em mulheres com menos de 35 anos. É assintomática

em 25% dos casos e, múltipla, em 13 a 20% (DENT, CANT, 1989; ALLE et al., 1996;

GREENBERG et al., 1998). Coincide, pois, com o período em que há maior maturação

folicular e quando a esteroidogênese é mais exuberante. Este aspecto, associado à

demonstração de receptores de estrogênio e de progesterona no fibroadenoma,

reforçam sua estreita hormônio-dependência (LEUNG et al., 1973; ROSEN et al., 1975;

ALLEGRA et al., 1979; KUTTENN et al., 1981). Quanto à raça, é mais comum na negra

do que na branca (FUNDERBURK et al., 1972; NIGRO, ORGAN, 1976; BARTOW et

al., 1987). Estudos de autópsias mostraram que esses tumores são encontrados em 9

a 10% das mulheres e ocorrem em 50% das biópsias de mama. Quando os nódulos

são múltiplos, proporções iguais são detectadas sincrônica e metacronicamente, na

mesma mama e na mama oposta (CLARE, MORROW, 2002). Foster et al (1988)

observaram que 30% dos fibroadenomas metacrônicos desenvolvem-se no mesmo

quadrante do primeiro fibroadenoma, com intervalo médio de quatro anos.

O fibroadenoma cresce como nódulo esférico, bem circunscrito e móvel, não

aderente ao tecido mamário adjacente. Localiza-se, com maior freqüência, na mama

esquerda e nos quadrantes súpero-laterais. Seu tamanho varia desde lesões menores

de um centímetro até formas gigantes, com diâmetro de 10 a 15 cm (fibroadenoma

gigante). Ao corte, possui superfície branco-acinzentada e muitas vezes com fendas

(HAAGENSEN, 1986). Na mamografia, é visibilizado como imagem nodular

circunscrita, oval, de baixa densidade, podendo estar associada a halo periférico ou

conter calcificações grosseiras (TABAR, DEAN, 1985). À ecografia, seu aspecto é

muito variável. Suas características habituais são: forma oval, diâmetro longitudinal

maior que o ântero-posterior, margem circunscrita, podendo ter macrolobulações, e

2

ecotextura homogênea e, em alguns casos, contendo calcificações ou áreas císticas

(THONO et al., 1994). Para contornar esta variabilidade, vários pesquisadores

desenvolveram a combinação de características ultra-sonográficas ou critérios

múltiplos, evitando que lesões malignas sejam classificadas ecograficamente como

benignas, mesmo que para isto tivessem que aceitar alto índice de resultados falso-

positivos (STRAVOS et al., 1995). Os seis critérios combinados no estudo de SKAANE,

ENGENDAL (1998) foram: formato, contorno, ecotextura, ecogenicidade, transmissão

sonora e tecido adjacente. O valor de predição usando esses critérios foi de 100% em

tumores palpáveis e, de 96% nos não palpáveis.

O fibroadenoma é uma das poucas lesões benignas da mama que possui

diagnóstico citológico específico, exibindo grupos celulares epiteliais em dedo de luva e

numerosos núcleos desnudos, além de muitas células ductais coesas em

monocamadas e fragmentos de células estromais. Como características citológicas

consideradas diagnósticas de fibroadenoma alinham-se: células estromais bipolares

abundantes; lâminas planas irregulares de epitélio compostas de células uniformes,

poligonais e uniformemente espaçadas e lâminas fenestradas formadas por células

semelhantes (ROSEN, 1997).

O tríplice diagnóstico (clínica, imagem e citologia) possui sensibilidade de 99,6%,

sendo a chance de falso-negativo menor que 1%, que aumenta em mulheres acima de

35 anos (HOUSSAMI et al., 2001).

Do ponto de vista histopatológico, seu estroma fibroblástico, celular e delicado,

assemelha-se ao estroma intralobular, envolvendo espaços glandulares e císticos

revestidos por epitélio. Podem haver espaços glandulares redondos a ovalados

intactos, revestidos por uma ou várias camadas de células (fibroadenoma

pericanalicular). Em outras áreas, o estroma do tecido conjuntivo parece ter sofrido

proliferação mais ativa, com compressão dos espaços glandulares. Em consequência,

a luz das glândulas mostra-se colapsada ou comprimida em fendas irregulares e os

elementos epiteliais aparecem como cordões ou feixes estreitos de epitélio ao lado do

estroma fibroso (fibroadenoma intracanalicular). Células mioepiteliais estão

entremeadas no estroma (GOODMAN, TAXY, 1981). Os padrões pericanalicular e

intracanalicular podem coexistir no mesmo tumor e não possuem valor prognóstico

(ROBINS,1996).

3

Alinham-se como diagnósticos diferenciais do fibroadenoma: tumor filóide,

fibrossarcoma, gigantomastia juvenil assimétrica, galactocele, hamartoma, necrose

gordurosa, hematomas, cistos mamários e câncer de mama (DENT, CANT, 1989).

A conduta terapêutica é bastante heterogênea. Tumores menores ou iguais a um

centímetro podem sofrer regressão parcial ou total em até um terço dos casos (CARTY

et al., 1995). A conduta expectante pode, então, ser uma boa opção, principalmente em

tumores pequenos em mulheres com menos de 25 anos (CANT et al., 1998) ou de 35

anos (WILKINSON et al., 1989) e sem história familiar de câncer de mama.

A exérese cirúrgica deve ser considerada nos demais casos, existindo atualmente

alternativas menos invasivas, com o objetivo de diminuir os custos e o impacto

emocional que envolvem a cirurgia, principalmente para as lesões de tamanho

intermediário. Como exemplos de técnicas mais modernas realçam a mamotomia

(Mammotome Breast Biopsy System) (RICHARD et al., 2003) e a crioablação (The

Visica TM Treatment System) (CALEFFI et al., 2004; KAUFMAN, et al., 2004), ambas

ambulatoriais.

O “mammotome”® consiste em dispositivo gerador de vácuo acoplado a sonda

com agulha que, após incisão de 3 mm na pele, é posicionada logo abaixo do tumor

(guiada por ecografia ou mamografia estereotáxica). Aspira-se o tecido comprometido

para compartimento existente em sua extremidade, que é cortado por bisturi circular

contido em seu interior. Em seguida, o fragmento é aspirado para fora da mama e

retirado do sistema (AMBROSIO et al., 2004). Já na crioablação, após incisão na pele

também de 3 mm, coloca-se pequena sonda no centro do fibroadenoma, guiada por

ultra-sonografia. Expõe-se o tumor a temperaturas baixas (até –196° C) por 6 a 30

minutos, levando o nódulo a sofrer processo de necrose, sendo reabsorvido em até

95% de seu tamanho ao final de 12 meses (CALEFFI et al., 2004; KAUFMAN et al.,

2004).

É importante ressaltar que apenas 25% das pacientes aceitam a conduta

expectante. Destas, a metade solicita exérese do tumor após curto período, motivada

pela ansiedade e pelo medo de malignidade que o nódulo palpável suscita (CANT et

al., 1995).

Estudos ultra-estruturais e de imuno-histoquímica sugerem que a célula de origem

do fibroadenoma seria o fibroblasto, ao invés do mioepitélio (REDDICK et al., 1987).

Nota-se, ainda, que a celularidade diminui com o avançar da idade (KERN, CLARK,

1973; FOSTER et al., 1988).

4

Os estrogênios parecem estar ligados à gênese do fibroadenoma. A falta de

contraposição adequada da progesterona permitiria a exposição contínua do tecido

mamário àqueles hormônios (SITRUK-WARE et al., 1977). Embora o metabolismo dos

androgênios e a secreção da prolactina de forma não harmônica possam interferir, o

papel destes fatores permanece ainda indefinido (FENTIMAN, 1990). Apesar da

concentração de receptores de estrôgenio no fibroadenoma ser superior à de outros

tumores benignos, como os linfangiomas e os lipomas, não há diferenças significantes

em comparação com as alterações fibrocísticas (ALLEGRA et al., 1979).

A relação entre fibroadenoma e carcinoma tem sido objeto de estudo de diversos

autores. A maioria aceita que o fibroadenoma não é fator de risco para o

desenvolvimento do carcinoma e o achado deste no epitélio do fibroadenoma é raro.

Quando ocorre, o tipo histológico mais comum é o carcinoma lobular in situ, em

mulheres na faixa etária próxima aos 40 anos (PICK, IOSSIFIDES, 1984; OZZELLO,

GUMP, 1985). Entretanto, em pesquisas recentes, algumas formas de fibroadenoma

associadas a cistos, adenose esclerosante, calcificações epiteliais ou alterações

apócrinas papilares, poderiam estar relacionadas com maior risco de desenvolvimento

de neoplasia maligna, caracterizando o fibroadenoma complexo (DUPONT et al, 1994;

LEVI et al., 1994).

Como já salientado, o fibroadenoma incide principalmente em mulheres jovens,

que, com freqüência, escolhem o anticoncepcional hormonal combinado oral (ACO)

como método contraceptivo.

A maioria delas deseja controlar sua própria fecundidade. A cada ano, estima-se

que mais de meio milhão de mulheres morram por razões ligadas à gravidez. Muitas

dessas mortes ocorrem após uma gravidez indesejada, resultado de 20 a 40% de

abortamentos provocados realizados de forma inadequada. O uso de anticoncepcionais

orais permite minimizar os riscos ligados à gravidez, partos e abortamentos feitos em

condições inapropriadas. A utilização crescente de anticoncepcionais em quase todos

os países demonstra que a mulher realmente quer planejar sua gestação

(POPULATION REPORT, 1994).

Em 1960, foi comercializada a primeira pílula que recebeu o nome de Enovid ®;

continha 9,85 mg de progestagênio, o noretinodrel, e 150 µg de estrogênio, o

mestranol. Tratava-se de ACO contendo alta dose hormonal, o que resultou em

diversos efeitos colaterais, principalmente cardiovasculares. Visando a diminuir as

5

reações colaterais e minimizar o risco de sérias complicações tromboembólicas, a

dosagem hormonal, principalmente de estrogênio, foi paulatinamente reduzida nas

novas pílulas sem, no entanto, comprometer a eficácia contraceptiva; além disto,

também houve o desenvolvimento de novos progestagênios. As pílulas de baixa

dosagem caracterizam-se por conterem menos de 50 µg de estrogênio, e doses

variando entre 0,05 e 2 mg de progestagênio (DRIFE, 1996; MONTEROSSA CASTRO,

2000; ALDRIGHI et al., 2005).

No início dos anos 70, 20 a 30 milhões de mulheres eram usuárias de pílulas.

Atualmente, esse número chega a mais de 100 milhões ao redor do mundo. A taxa de

gravidez em condições de uso perfeito está estimada em 0,1 caso para cada 100

mulheres, durante 12 meses (DRIFE, 1996; POPULATION REPORT, 2000).

Os anticoncepcionais hormonais orais podem ser classificados de acordo com

sua composição e modo de agir (Quadro 1).

Quadro 1 – Classificação dos anticoncepcionais hormonais orais

1- De acordo com a composição:

- Progestagênio isolado: acetato de noretindrona/levonorgestrel/desogestrel;

- Combinados: associação de estrogênios e progestagênios.

2- De acordo com o modo de ação:

- Interceptivos ou pílula do dia seguinte;

- Mini-pílula;

- Seqüenciais;

- Combinados: trifásicos / bifásicos / monofásicos.

(Adaptado de MELO et al., 2000a)

O anticoncepcional hormonal combinado oral é composto de estrogênio e

progestagênio sintéticos. O componente estrogênico mais utilizado é o etinilestradiol,

resultante da adição de um grupo etila na posição 17 do estradiol, tornando-o, assim,

biodisponível por via oral. O mestranol foi usado nos primeiros contraceptivos e,

quando administrado por via oral, sofre desmetilação e bioativação no fígado para dar

origem ao etinilestradiol. Nos preparados posteriores, o mestranol foi substituído pelo

etinilestradiol. As doses de etinilestradiol mais utilizadas atualmente são bem menores,

oscilando entre 15 µg e 30 µg (MONTEROSSA CASTRO, 2000; MELO et al., 2000 a).

6

O componente progestagênico varia em grande número de compostos sintéticos

que mimetizam o efeito da progesterona natural e se diferenciam entre si, de acordo

com a potência de reproduzir efeitos progestagênicos. A primeira geração desses

compostos inclui a noretindrona e o diacetato de etinodiol; a segunda geração é

representada pelo levonorgestrel e norgestrel e, a terceira, consiste no desogestrel e

no norgestimate. Um dos mais novos progestagênios é a drospirenona, derivada da 17

alfa-espironolactona, que apresenta efeitos anti-mineralocorticóides e anti-

androgênicos (KRATTENMACHER, 2000; MELO et al., 2000a; BORGELT-HANSEN,

2001).

Os progestagênios usados nos ACO podem ser derivados da pregnana ou 17-

alfa-hidroxiprogesterona e da 19-nortestosterona (Quadro 2). Entre os derivados da 17-

alfa-hidroxiprogesterona, alinham-se o acetato de ciproterona, acetato de

medroxiprogesterona, megestrel, clormadinona, superlutina e quingestanol; destes,

somente o acetato de ciproterona está presente nos ACO mais modernos e destaca-se

pela sua atividade anti-androgênica. Os derivados da 19-nortestosterona estão

divididos nos grupos da estrana e da gonana. No grupo da estrana, incluem-se a

noretisterona ou noretindrona, acetato de noretisterona, diacetato de etinodiol,

linestrenol, noretinodrel, norgestrinona e norgesterona. Os derivados da gonana são o

levonorgestrel, d-norgestrel, desogestrel, dienogest, norgestimate e o gestodeno

(MELO et al., 2000 a; MONTEROSSA CASTRO, 2000).

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Quadro 2 – Componentes progestagênicos dos anticoncepcionais hormonais orais.

PROGESTAGÊNIOS SINTÉTICOS

19-NORTESTOSTERONA 17-ALFA-

HIDROXIPROGESTERONA

ESTRANA GONANA PREGNANA

noretindrona Levonorgestrel acetato de ciproterona

acetato de noretisterona d-norgestrel acetato de medroxiprogesterona

diacetato de etinodiol desogestrel megestrel

linestrenol dienogest clormadinona

noretinodrel norgestimate superlutina

norgestrinona gestodeno quingestanol

norgesterona

(Adaptado de MONTEROSSA CASTRO, 2000)

O ciclo menstrual decorre da complexa interação hormonal regida pelo eixo

córtico-hipotálamo-hipófise-ovariano. O hipotálamo produz GnRH sob a forma de

pulsos; age na hipófise e estimula a liberação de gonadotrofinas, as quais modulam a

esteroidogênese ovariana. O estradiol em doses pequenas faz diminuir a amplitude dos

pulsos de GnRH e, quando atinge valores entre 300 a 500 pg/ml, tem efeito de

retroalimentação positiva, responsável pelo pico de LH, fundamental para ocorrer a

ovulação. No decorrer da primeira fase do ciclo, o nível plasmático de estradiol cresce

progressivamente em virtude da produção ovariana; apresenta o ápice no período pré-

ovulatório; sofre queda e novo aumento na fase lútea. A progesterona, por sua vez,

encontra-se em níveis baixos na primeira fase do ciclo; elevando-se a partir do pico de

LH, até atingir valor máximo cerca de oito dias após a ovulação, ou seja, por volta do

22º ao 25º dia do ciclo (RODRIGUES de LIMA, BARACAT, 1995).

O ACO inibe a ovulação mediante o bloqueio da produção e liberação do FSH e

LH. O efeito supressivo na produção de gonadotrofinas depende de ação sinérgica dos

componentes estrogênicos e progestagênicos das pílulas, com conseqüente alteração

na amplitude dos pulsos de GnRH, como também de efeito supressivo direto sobre a

hipófise, impedindo o pico de LH e afetando os mecanismos endócrinos da ovulação.

Com a ausência da ovulação, não se forma o corpo lúteo e não se produz progesterona

8

(MISHEL Jr et al., 1977; COHEN, KATZ, 1979; LOBO, STANCZYK, 1994). Além disso,

o ACO atua em outros sítios do sistema reprodutor. No colo uterino, provoca alteração

do muco, tornando-o espesso e hostil à espermomigração. Diminui a produção de

glicogênio nas glândulas do endométrio e impede sua adequada proliferação e

maturação, dificultando a nidação. Também altera a motilidade das tubas uterinas,

interferindo no transporte ovular (MELO et al., 2000 a; 2000 b).

Age em outros órgãos, trazendo efeitos comprovadamente benéficos,.como:

- Controle do ciclo menstrual. O ACO induz níveis hormonais equilibrados e

assim estabilizam as modificações do tecido endometrial. Há redução, em média, de

60% do fluxo menstrual, o que leva a aumento das reservas de ferro, redução da

dismenorréia, da tensão pré-menstrual e da dor do meio (FRASINELLI-GUNDERSON

et al., 1985; LARSSON et al., 1992; DRIFE, 1996; POPULATION REPORT, 2000;

BORGELT-HANSEN, 2001).

- Prevenção da gestação ectópica. Decorrente do próprio efeito contraceptivo

(POPULATION REPORT, 2000; BORGELT-HANSEN, 2001).

- Controle da acne e do hirsutismo. Alguns tipos de progestagênios derivados

da testosterona podem ter alguma atividade androgênica, porém, outros ajudam a

diminuir os níveis de testosterona endógena, pelo retrocontrole negativo na hipófise e

também pela diminuição da circulação de testosterona livre pelo aumento da globulina

carreadora de testosterona (BORGELT-HANSEN, 2001).

- Proteção contra doença inflamatória pélvica. Devido ao muco cervical

tornar-se mais espesso em vigência do uso de ACO (BORGELT-HANSEN, 2001).

- Redução do risco de câncer epitelial de ovário. A diminuição ou bloqueio da

ovulação deixa o ovário menos suscetível a essa neoplasia. Diminui o risco relativo em

40%, efeito que perdura por 10 a 15 anos após a interrupção da medicação (The

CANCER and STEROID HORMONE of the CDC and NICHD, 1987 a; The WHO

COLLABORATIVE STUDY of NEOPLASMS and STEROID CONTRACEPTIVES,

1989).

- Redução do risco de câncer de endométrio. Com um ano de uso, o risco se

reduz em cerca de 50%. O efeito protetor maior é adquirido quando a utilização é

superior a três anos, permanecendo por 15 anos ou mais após a sua descontinuação

(The CANCER and STEROID HORMONE of the CDC and NICHD, 1987b).

- Redução na incidência de doenças benignas da mama. Ocorre diminuição

da incidência de doenças benignas na mama; entretanto, com as pílulas com doses

9

muito baixas de hormônios, ainda não se provou tal benefício (ORY et al., 1976;

BRINTON et al, 1981; LEONARDI, 1997; BORGELT-HANSEN, 2001).

- Possível regressão de cistos funcionais (HATCHER et al., 1999).

- Prevenção de gestação indesejada Entre os benefícios dos anticoncepcionais hormonais orais combinados de baixa

dose destaca-se a eficácia em prevenir a gravidez. Relatam-se taxas de falhas de

menos de uma gestação por 100 mulheres/ano, sendo que a maioria delas se deve a

incorreção em sua tomada (BOUNDS et al., 1979; KETTING, 1988; The WHO

SPECIAL PROGRAMME OF RESEARCH, DEVELOPMENT AND RESEARCH

TRAINING in HUMAN REPRODUCTION, 1988).

Apesar dos efeitos benéficos, os contraceptivos podem provocar efeitos

colaterais como irregularidade menstrual, náusea e, em alguns casos, ganho de peso,

mastalgia e cefaléia. Usualmente esses efeitos tendem a melhorar após três ciclos

(BORGELT-HANSEN, 2001). Os maiores riscos, entretanto, estão associados ao

sistema cardiovascular, como o tromboembolismo, a hipertensão arterial, o acidente

encéfalo-vascular e o infarto agudo do miocárdio. Os novos ACO, por possuírem menor

dosagem hormonal, reduziram a ocorrência destas afecções (BORGELT-HANSEN,

2001).

Os mecanismos nos quais a pílula pode estar associada aos fenômenos

cardiovasculares são: ação dos estrogênios sobre o sistema de coagulação; ação dos

progestagênios sobre o metabolismo dos lipídios e efeito da combinação dos dois

hormônios na pressão arterial e no metabolismo dos carboidratos (MONTEROSSA

CASTRO, 2000). Os primeiros estudos de tromboembolismo associado às pílulas com

mais de 59 mcg de etinilestradiol evidenciaram risco relativo de 4,4 a 9 de apresentar

aquela doença quando comparado com não usuárias (POPULATION REPORT, 1988).

Vários estudos posteriores com pílulas de baixa dose evidenciaram que o risco ainda

permanece aumentado, porém, pequeno, de tromboembolismo entre as usuárias de

ACO, mas significativamente menor que quando comparado com as pílulas mais

antigas (WINKLER et al., 1996; DARNEY, 1996). As usuárias de ACO de baixa dose,

sem outros fatores de risco para doença cardiovascular, apresentam ligeiro aumento do

risco de desenvolver acidente encéfalo-vascular (AEV) e infarto agudo do miocárdio. O

risco de desenvolver AEV com pílulas de baixa dosagem é de 2 em 100.000

10

mulheres/ano (WORLD HEALTH ORGANIZATION COLLABORTATIVE STUDY of

CARDIOVASCULAR DISEASE and STEROID HORMONE CONTRACEPTION, 1996).

Em relação às doenças benignas da mama, como já salientado, os

anticoncepcionais diminuem de 50% a 75% o risco de desenvolvimento de

fibroadenomas, alterações císticas e mastodínia (ORY et al., 1976; BRINTON et al.,

1981; LEONARDI, 1997). No entanto, os mecanismos pelos quais esses hormônios

interagem, diminuindo a incidência destas afecções, não são ainda totalmente

conclusivos. Além disso, com os ACO atuais que contêm concentração baixa de

esteróides, este benefício ainda não foi comprovado.

De fato, a inibição do crescimento dos fibroadenomas com o uso de ACO ou de

hormonioterapia de reposição ainda é tema controverso (BARROS et al., 1999).

Enquanto RAVIHAR et al. (1979) demonstraram ser a terapia hormonal um fator de

proteção, SITRUK-WARE et al. (1989) não observaram tal influência.

O aspecto mais controverso em relação à contracepção hormonal oral é a

associação com o risco de desenvolver câncer de mama. Os estudos epidemiológicos

apresentam conclusões conflitantes e é importante salientar que devido ao grande

número de usuárias de ACO, mesmo um pequeno aumento de risco pode representar

um número substancialmente maior de casos deste câncer. O estudo The CANCER

and STEROID HORMONE (CASH), publicado em 1986, não mostrou associação entre

contracepção hormonal oral e câncer de mama. MARCHBANKS et al. (2002)

realizaram estudo caso-controle entre mulheres com idade de 35 a 40 anos e

obtiveram o risco relativo de 1,0 para mulheres que estavam fazendo uso de ACO e 0,9

para aquelas que o usaram previamente. O risco relativo não aumentou

consistentemente com períodos maiores de uso ou com maiores doses de estrogênio,

nem houve associação de maior risco com início de utilização em idades mais jovens,

nem em mulheres com história familiar de câncer de mama.

Entre as dificuldades metodológicas para se avaliar o risco epidemiológico de

câncer da mama em pessoas tomando pílulas, destacam-se a tendenciosidade, a

heterogeneidade das amostras, a mudança constante das formulações dos

anticoncepcionais e o fato deste câncer permanecer sem ser diagnosticado por 15 a 20

anos após a exposição ao agente causal.

11

A epidemiologia do câncer da mama é muito complexa e são conhecidos

inúmeros fatores de risco, o que torna necessária a comparação dos vários subgrupos

conhecidos, como a idade da menarca, da menopausa e da primeira gestação a termo;

em relação ao último fator, a simples possibilidade da pílula retardá-la, poderia

influenciar de forma indireta o risco da doença. O mesmo ocorre com a paridade, os

antecedentes de abortamentos e de doenças benignas das mamas, com a

ooforectomia, a história familiar positiva, o tipo de dieta, o consumo de álcool, o

tabagismo e o índice de massa corpórea, entre outros. Desta maneira, a

heterogeneidade das amostras dificulta sobremaneira a comparação epidemiológica

(MALONE et al., 1993). Embora existam algumas evidências epidemiológicas que

relacionam o uso de ACO ao câncer de mama, ainda não se conhece de fato como age

o ACO no epitélio e no estroma glandular.

Tendo em vista as dificuldades metodológicas apontadas, de forma geral,

considera-se que o risco relativo é pequeno, em torno de 1,1. Aumenta para 1,4

quando se considera o uso antes da primeira gestação a termo e para 1,7 quando este

período é superior a quatro anos (ROMIEU et al., 1990; THOMAZ, 1991). Após os 40

anos de idade, o risco relativo oscila entre 1,6 e 4,0 (THOMAS, NOONAN, 1991).

Em estudo de meta-análise, que avaliou 53.297 mulheres com câncer de mama

e 100.239 controles, realizado pelo COLLABORATIVE GROUP on HORMONAL

FACTORS in BREAST CANCER (1996) em 25 países, concluiu-se que havia discreto,

mas significante aumento do risco relativo (1,24) entre as usuárias de ACO e que esse

risco se manifestava até 10 anos após a interrupção da pílula.

Embora ainda haja polêmica quanto ao risco, é consenso entre a maioria dos

autores que o anticoncepcional hormonal oral combinado não protege contra o câncer

da mama (MALONE et al., 1993; PIKE et al., 1993).

Aplicando-se conhecimentos da doutrina celular em patologia, fica claro que o

comportamento celular está relacionado às características nucleares. Estes

conhecimentos evoluíram de forma a que se descobrisse que seria o núcleo, a sede

das informações genéticas a serem transmitidas através das células. A importância e o

papel do ácido desoxirribonucléico (DNA) na transmissão de informações é indiscutível

(KRUTMAN-ZVEIBIL, 1995).

No fibroadenoma, a proliferação celular foi estudada por alguns autores.

MEYER, em 1977, notou que o índice de timidina tritiada foi significativamente maior no

fibroadenoma do que no epitélio normal, independente da fase do ciclo menstrual,

12

diferença esta atribuída à menor média de idade das pacientes com aquela afecção.

De fato, levando-se em consideração que a síntese de DNA pode durar até 12 horas, a

média de tempo de substituição das células dos ductos terminais normais seria de

aproximadamente 22 dias em mulheres com 20 anos, com ciclos eumenorréicos,

podendo aumentar até 147 dias aos 40 anos de idade. Nos fibroadenomas, o tempo de

duplicação seria de aproximadamente 33 dias, porém em tumores antigos, este tempo

poderia se prolongar. Para o autor, a comparação com células ductais terminais

normais em pacientes da mesma idade, sugere que o crescimento anormal dos ductos

do fibroadenoma poderia representar maior longevidade das células, ao invés do

aumento da proliferação. Outra possibilidade seria a existência de diversos tipos de

clones celulares intratumorais, contrapondo-se com a distribuição regular do lóbulo

mamário. Contraceptivos hormonais orais não influíram em ambos os grupos.

SIMOMOTO et al., em 1996, estudaram a cinética do epitélio do fibroadenoma

durante o ciclo menstrual pela análise morfométrica. O índice mitótico e o volume

nuclear médio não mostraram diferenças significantes entre as fases, contrariando a

possível ciclicidade do epitélio do fibroadenoma, como ocorre na mama normal.

Sugeriram, pelo comportamento proliferativo díspar do epitélio lobular normal, que o

fibroadenoma seria modulado por mecanismos parácrinos, justificando seu crescimento

auto-limitado.

ALVES, em 1997, analisou o índice de DNA e a percentagem de células na fase

S, tanto do epitélio quanto do estroma do fibroadenoma, nas diferentes fases do ciclo

menstrual, por meio da citometria digital. Concluiu que o índice de DNA, tanto no

epitélio quanto no estroma, não apresentou diferenças nas duas fases do ciclo, mas

encontrou maior índice de DNA nas células epiteliais na fase folicular, em comparação

às do estroma. Quanto à fase S, não houve diferenças na porcentagem de células

epiteliais e estromais quando se analisou separadamente as fases folicular e lútea,

mas, essa taxa foi maior no epitélio em ambas as fases do ciclo.

HUEB (2000) comparou a expressão do PCNA no epitélio do fibroadenoma, em

usuárias de dois ciclos de contraceptivos orais e em não usuárias. Não registrou

diferenças significantes; entretanto, houve tendência à maior expressão nas não

usuárias. Pairou ainda a dúvida se apenas dois ciclos de anticoncepcionais seriam

suficientes para aquilatar a real influência do fármaco na cinética celular do

fibroadenoma.

13

TANIGUCHI (2002) utilizando a mesma metodologia, porém por quatro ciclos

consecutivos, também não detectou diferença significativa na expressão do PCNA

entre as usuárias e não usuárias de anticoncepcional hormonal combinado oral.

Os resultados destes dois últimos pesquisadores sugerem que a atividade

proliferativa do epitélio do fibroadenoma não é inibida pelo ACO, pelo menos por quatro

ciclos. Seria interessante avaliar se algum fármaco, utilizado de forma concomitante

com ACO, pudesse inibir a cinética celular daquela neoplasia. Neste sentido,

aventamos a hipótese do estriol bloquear o efeito do ACO sobre o fibroadenoma.

O estriol é, na verdade, o metabólito periférico da estrona e do estradiol e não

produto secretório do ovário. Sua formação é típica da “destoxificação” metabólica em

geral, isto é, da conversão de substâncias biologicamente ativas em formas menos

ativas. Dados epidemiológicos e de outras fontes continuam a sugerir algum tipo de

função protetora do câncer de mama relacionado a este estrogênio. O estriol não

produz câncer de mama em roedores e até protege a rata contra tumores mamários

induzidos por vários carcinogênicos químicos, provavelmente porque bloquearia os

efeitos mais potentes da estrona e do estradiol (SPEROFF et al., 2004).

Constatou-se que mulheres asiáticas sadias na pré-menopausa têm menor risco

de desenvolver câncer de mama do que as brancas e, curiosamente, também têm taxa

mais alta de excreção de estriol urinário. Quando as asiáticas migram para os EUA, no

entanto, a incidência de câncer aumenta, enquanto a excreção urinária de estriol

diminui (DICKINSON et al., 1974).

Não se sabe, entretanto, se o fator hormonal mais importante para a promoção do

câncer seria a quantidade total de estrogênio, a proporção entre estriol e estradiol ou

alguma outra combinação (SPEROFF et al.,2004).

Lembramos que os estrogênios podem ser produzidos a partir de androgênios

localmente, como ocorre no câncer de mama. De fato, os tumores mamários contêm

tanto aromatases quanto enzimas hidrolíticas. Assim como outros hormônios

esteróides, os estrogênios regulam a expressão gênica, pois ultrapassam a membrana

celular por difusão passiva, ligando-se a receptores presentes no núcleo da célula. A

resposta ao estrogênio ocorrerá por ativação direta ou transcrição de genes, cujo

produto irá regular a cascata de eventos envolvida numa resposta tecidual (GILMAN,

1996).

14

Ao revisarmos a literatura, surpreendeu-nos o fato de não termos encontrado

nenhum estudo que havia avaliado o efeito do estriol, utilizado de forma isolada ou

associado ao ACO, sobre o fibroadenoma e, em particular, sobre a atividade

proliferativa daquela neoplasia.

De fato, antes que a divisão celular ocorra, processa-se uma série complexa de

eventos que culminam com a duplicação do material genético. Esta duplicação ocorre

horas antes da mitose propriamente dita iniciar-se. Este período é denominado de

interfase (ORFAO et al., 1993) e pode ser subdividido em quatro fases seqüenciais:

G0, onde as células se encontram em “repouso”; G1, onde ocorre o aumento do

volume celular por acúmulo de água para o início da síntese de DNA; a fase S, em que

há síntese de DNA, com duplicação do material genético, e a fase G2, intervalo que

antecede o início da mitose celular. As fases G1 e G2 representam momentos críticos

na regulação do ciclo celular, uma vez que a interrelação das ciclinas com as ciclinas-

quinases determinam o prosseguimento do processo de divisão celular (ORFAO et al.,

1993).

Sabe-se que, em todos os tecidos, inclusive na mama, a composição celular

depende de um equilíbrio entre as células que se encontram no ciclo celular, as que

estão em G0 e aquelas que estão em processo apoptótico. Quanto maior a quantidade

de células que se encontrem nas fases G1, S, G2 e mitose, maior será o índice de

proliferação celular, e, ainda, um tecido com alto índice de proliferação celular,

certamente seria mais susceptível à carcinogênese (RUSSO, RUSSO, 1987;

PRESTON-MARTIN et al., 1990).

A atividade proliferativa pode ser avaliada por diversas técnicas como a

contagem de mitoses, a análise imuno-histoquímica do PCNA (antígeno nuclear de

proliferação celular), do Ki-67 e do c-myc, além do conteúdo de DNA avaliado pela

incorporação de timidina tritiada e pela citometria de fluxo (HALL, LEVISON, 1989). A

identificação de antígenos nucleares, por meio de análise imuno-histoquímica,

presentes nas células em processo de proliferação e ausentes nas células em repouso,

permite medir a taxa de proliferação de determinado tecido. Dentre esses antígenos,

está o Ki-67, descrito por GERDES et al. (1983). É detectado pelo anticorpo

monoclonal Ki-67, da classe IgG1, que reage com um antígeno nuclear expresso em

todas as fases do ciclo celular. Foi obtido após imunização de ratos com extrato

nuclear de linfoma de Hodgkin da linhagem celular L428 e seu nome provém da

elaboração do clone original na posição 67 do prato de cultura (SAWHNEY, HALL,

15

1992). Este anticorpo reage com proteína não-histona cuja clonagem completou-se em

1993, sendo substituída por duas proteínas com massa molecular de 320 e 359 KDa,

que contêm região central de 16 elementos repetitivos e codificados por exon composto

de 6.845 pares de bases (SCHLÜTER et al., 1993).

O antígeno nuclear Ki-67 acha-se presente no final da fase G1, S, G2 e durante

a mitose e ausente na fase G0, sendo sua maior expressão observada em G2 e S até

atingir o máximo na mitose. Após a mitose, o antígeno é rapidamente degradado

(GERDES et al., 1984). No final da fase G1, o antígeno Ki-67 encontra-se presente

somente na região perinucleolar; na fase S, está distribuído homogeneamente no

carioplasma e, na fase G2, mostra-se como finos grânulos no carioplasma e também

na região perinucleolar. Durante a mitose, ocorre uma redistribuição do antígeno,

sendo observado na cromatina condensada e na metáfase, recobrindo a superfície dos

cromossomos. Após a quebra da membrana nuclear, parte do antígeno pode ser

detectado no citoplasma de forma difusa (BRAUN et al., 1988; VAN DIERENDONCK et

al., 1989; VERHEIJEN et al., 1989; STARBORG et al., 1996).

A grande limitação da primeira geração de anticorpos Ki-67 era a necessidade

de material fresco congelado para sua execução, isto porque o epítopo era

rapidamente destruído após a fixação com formaldeído (GERDES et al., 1983). A

segunda geração de anticorpos foi desenvolvida com o intuito de facilitar a

aplicabilidade clínica; entre eles realçam o Ki-S3, Ki-S5, MIB-1 e o MIB-3, que podem

ser usados em tecidos fixados e parafinados com a mesma equivalência do Ki-67 de

primeira geração (LEERS et al., 1997).

Apesar do desconhecimento da função exata do antígeno Ki-67, o anticorpo foi

largamente utilizado em patologia para avaliar a fração de crescimento de tecidos

normais e neoplásicos, particularmente em estudos envolvendo o seu possível valor

prognóstico. Nos tumores sólidos, comprovou-se associação entre a alta taxa de

proliferação e a sua agressividade. O estado nutricional da célula pode influenciar a

expressão do Ki-67, de tal sorte que as células localizadas na área central de tumores

com grande quantidade de necrose apresentam a imunoexpressão de Ki-67

subavaliada. BROWN, GATTER (2002) realizaram extensa revisão da literatura e

puderam constatar a associação entre a taxa de proliferação celular e o prognóstico de

tumores linfoproliferativos, do sistema nervoso central, do tecido conectivo e da mama.

BOUZUBAR et al. (1989) estudaram 136 casos de neoplasia mamária com seguimento

de 30 meses e obtiveram valores de Ki-67 elevados associados com recorrência

16

precoce, grau histológico indiferenciado e atividade mitótica maior, porém sem relação

com o tamanho do tumor, estado linfonodal e expressão de receptores de estrogênio.

SCHOLZEN, GERDES (2000) contabilizaram 4.600 casos de tumores de mama, em

publicações recentes, e também constataram haver associação entre o índice de Ki-67

e o prognóstico tumoral.

GERDES et al. (1986) encontraram índices de 3% para lesões mamárias

benignas e 16,6% para os carcinomas; da mesma forma, LELLÉ et al. (1987)

registraram também valores similares. Houve, porém, sobreposição entre os dois

grupos, sendo que algumas lesões benignas apresentaram índices altos em

comparação com alguns tumores malignos, que exibiram taxas baixas, prejudicando,

assim, os resultados.

O mesmo grupo de pesquisadores que descreveu o anticorpo monoclonal Ki-67

em 1983, buscou elucidar a função do antígeno Ki-67 no ciclo celular. Embora não

totalmente compreendida, o antígeno parece estar envolvido na regulação do ciclo

celular. Estudo recente demonstrou que a proteína Ki-67 é fosforilada durante a mitose

e que esta fosforilação marca o breve espaço de tempo entre a passagem pela prófase

e a transição da metáfase para a anáfase, dois eventos críticos na mitose. Além do

mais, foi demonstrado que a forma fosforilada da proteína nuclear Ki-67 reage com o

anticorpo monoclonal MPM-2. A fosforilação dos antígenos MPM-2 está envolvida na

transição da fase G2 para a mitose (ENDL, GERDES, 2000 a; 2000 b).

Já o c-myc, descrito como um oncogene retroviral em galinhas (vírus

mielocitomatoso), inicialmente por BISHOP em 1982, posssui papel central na

proliferação e transformação maligna de células humanas e de animais (AMATI et al.,

1998). Foi descoberto como seqüência transformante no retrovírus aviário MC29

(DUESBERG et al., 1977) e, subseqüentemente, identificado em genoma de

vertebrados. O oncogene c-myc e as seqüências N-myc, L-myc e B-myc, são

relacionadas estruturalmente e estão presentes no genoma de mamíferos, constituindo

a família do gene myc. A proteína myc humana normal exibe significante homologia na

seqüência de aminoácidos, mas o comprimento de suas cadeias peptídicas são

diferentes: c-myc contém 439, n-myc 456 e l-myc 364 resíduos de aminoácidos (De

PINHO et al., 1991).

O oncogene c-myc humano está localizado na porção distal do braço longo do

cromossomo 8, na região 8q24 (NEEL et al., 1982). A estrutura genômica é constituída

por somente três exons. O comprimento do gene é de 5000 pares de bases, distando

17

0,005 centiMorgans. O intervalo entre os exons 1 e 2 é de 1.616 pares de base e, entre

os exons 2 e 3, de aproximadamente 1.300 pares de bases. O gene c-myc humano

codifica para duas fosfoproteínas p67/68 e p64/65 (HANN et al., 1988).

A maioria dos tumores malignos humanos apresentam amplificação ou

superexpressão desse gene, segundo vários estudos (NESBIT et al., 1999).

Atualmente, sabe-se que o gene c-myc participa de várias funções celulares, tais como

replicação, crescimento, metabolismo, diferenciação e apoptose (PRENDERGAST,

1999).

O gene c-myc, após sua transcrição, origina três proteínas principais conhecidas

como c-myc 1, c-myc 2 and c-mycS (XIAO et al., 1998). A c-myc 2 é uma proteína de

62 kDa, constituindo-se na forma principal das três proteínas c-myc e é referida como

“c-myc” na maioria dos estudos.

Em situações fisiológicas, o papel do c-myc é promover a replicação celular em

resposta a sinais extracelulares, levando células quiescentes a entrarem no ciclo

celular através, principalmente, da ativação da transcrição de genes alvos reguladores

do ciclo celular, como as ciclinas D1 e D2 (AMATI et al., 1998) .

Além disso, atua também no ciclo celular ao suprimir a transcrição de genes

inibidores de crescimento (ALEXANDROW, MOSES, 1998).

A transformação de uma célula pode não se dever apenas à função fisiológica

do c-myc, mas, ao invés disso, ocorrer quando for expresso de maneira aberrante ou

geneticamente alterado (AMATI et al., 1998).

Observações conflitantes sugerem que o c-myc é capaz tanto de induzir como

de suprimir a apoptose. Para induzir um tumor, além de promover a proliferação

celular, também, simultaneamente, inibe o processo da apoptose, aumentando assim o

número de células no tumor, formando então uma massa (CORY et al., 1999). Já o

modo pelo qual o c-myc induz a apoptose ainda é desconhecido, e geralmente apenas

é obtido através de modelos experimentais; entretanto, pode estar relacionado a

caminhos de apoptose p53 dependentes (PRENDERGAST, 1999).

Quanto ao envolvimento do gene c-myc com o câncer mamário, em estudo de

metanálise realizado por DEMING et al. em 2000, constatou-se que, em média, 15,5%

das biópsias de câncer de mama apresentavam amplificações do gene c-myc

superiores a três vezes. Já muitos estudos utilizando imuno-histoquímica

demonstraram que em 50 a 100% dos casos havia níveis aumentados de proteínas c-

myc (AGNANTIS et al., 2002), principalmente no citoplasma. Independentemente da

18

localização do c-myc, há maior porcentagem de casos de câncer com níveis de

proteínas c-myc aberrantes do que de casos demonstrando amplificação gênica. Isto

implica que a alteração na estabilidade do RNA mensageiro (RNAm) ou de sua

proteína poderia ser o mecanismo de aumento dos níveis de c-myc, consistente com os

relatos iniciais de que a super-expressão precede a amplificação do gene, levando a

instabilidades cromossômicas (MAI, 1994).

Muitos estudos in vitro e alguns in vivo demonstraram que a expressão de

RNAm é induzido pelo tratamento com estrogênios (SCHUCHARD et al., 1993).

Entretanto, permanece obscuro o modo pelo qual o estrogênio regula a expressão de

c-myc nos tumores mamários humanos (MILLER et al., 1993).

Pacientes com tumores mamários receptores positivos para estrogênios que

receberam tratamento com tamoxifeno mostraram um decréscimo em seu nível de

RNAm do c-myc, quando comparados com os pacientes que não receberam a droga

(LE ROY et al., 1991). Este resultado sugere que o tamoxifeno antagoniza o efeito dos

estrogênios na expressão de c-myc .

Quanto à progesterona, que é o progestogênio de pílulas anticoncepcionais e da

terapia de reposição hormonal, observou-se que, em cultura de células de câncer

mamário, provoca aceleração transitória da fase G1, seguida por inibição de

crescimento e parada do ciclo, que seria mediada pela proteína c-myc (MACMAHON et

al., 1998).

Postula-se, então, que o c-myc seria uma proteína nuclear que atua como fator

de transcrição e contribuiria em todos os estágios do processo carcinogênico,

transformando a célula normal em outra progressivamente mais maligna (GARTE,

1993). Assim, sua positividade nos ensaios imuno-histoquímicos refletiria pior

prognóstico. Entretanto, altos níveis de c-myc em tumores que já atingiram

determinadas dimensões poderiam induzir à apoptose ou aumentar a sensibilidade a

fatores apoptóticos, como as ciclinas. Também há evidências experimentais de que

seria importante repressor de transcrição, que impossibilitaria o tumor sobreviver em

ambiente hostil (LIAO, DICKSON, 2000). Como se pode depreender, há a necessidade

de novos ensaios para descobrir sua real função.

Devido aos poucos estudos sobre os reais efeitos dos ACO sobre o

fibroadenoma mamário, propusemo-nos a avaliar a proliferação celular do epitélio deste

tecido através da expressão dos antígenos de proliferação celular (Ki-67 e c-myc) em

19

usuárias de ACO com ou sem associação com estriol, para verificar seus efeitos sobre

aquela neoplasia.

20

2 - OBJETIVO

Avaliar a atividade proliferativa do epitélio do fibroadenoma mamário, por meio da

expressão do Ki-67 e do c-myc, após a administração de anticoncepcional hormonal

combinado oral, associado ou não ao estriol.

21

3 - MATERIAL E MÉTODOS

3.1 - Casuística

Foram, inicialmente, selecionadas 70 mulheres atendidas no ambulatório do Setor

de Doenças Mamárias Benignas da Disciplina de Mastologia do Departamento de

Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo-Escola Paulista de Medicina

(UNIFESP-EPM), no período de março de 2001 a janeiro de 2005.

Essas pacientes foram selecionadas segundo os seguintes critérios:

- Critérios de inclusão

- Mulheres hígidas, portadoras de nódulo mamário benigno pelo diagnóstico clínico,

citológico e imagenológico;

- Idade entre 19 e 35 anos;

- Ciclos eumenorreicos pelo menos durante os últimos seis meses, com data da última

menstruação conhecida;

- Exames ginecológico e colpocitológico normais.

- Critérios de Exclusão

- Endocrinopatias;

- Gestação;

- Puérperas;

- Suspeita de carcinoma.

Todas as pacientes foram avaliadas por exames clínicos e subsidiários,

compreendendo anamnese, exame físico dirigido, punção aspirativa com agulha fina,

citologia oncológica, ultra-sonografia e, quando indicada, mamografia.

Durante a realização do exame ultra-sonográfico, obtivemos medidas do

comprimento, largura e altura dos nódulos, antes e após o uso da medicação usada

pela paciente. Estas medidas foram anotadas em uma ficha de protocolo, juntamente

com as outras informações acima citadas (Anexo 1).

22

O projeto de estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa

da UNIFESP-EPM, cujo número do protocolo é 702/00 (Anexo 2). Todas as pacientes

foram devidamente esclarecidas quanto aos objetivos do trabalho e suas respectivas

etapas, sendo que concordaram em participar e assinaram termo de consentimento

pós- informado (Anexos 3 e 4).

Foram excluídas 37 pacientes devido à interrupção do uso da medicação

fornecida, geralmente por seus efeitos colaterais (21 pacientes), ou pela dificuldade em

comparecer ao ambulatório para o acompanhamento (10 pacientes) e até mesmo pela

não diminuição do tamanho do nódulo durante o uso da medicação (6 pacientes).

Restaram, então, 33 pacientes, que foram divididas da seguinte forma: Grupo 1

(controle), composto por 10 mulheres com nódulo mamário circunscrito e que utilizaram

anticoncepcional oral composto de levonorgestrel (0,15 mg) e etinilestradiol (0,03 mg),

associados a um comprimido de placebo na mesma cápsula, durante 21 dias, com

pausa de 7 dias, até um total de quatro ciclos consecutivos. Já o Grupo 2 (23

pacientes) foi constituído por mulheres com igual afecção mamária e que tomaram,

além do anticoncepcional oral (já descrito acima), um comprimido de estriol de 2 mg,

que foi manufaturado conjuntamente com o anticoncepcional em uma mesma cápsula

e ingerido da mesma forma que os das pacientes do grupo 1.

As biópsias foram realizadas ao término da ingestão da medicação, ao final dos

quatro ciclos. Todos os procedimentos foram ambulatoriais, realizados sempre no

mesmo horário, pela manhã, com anestésico local (lidocaína a 1%), sem

vasoconstritor.

O desenho do estudo foi duplo cego, o que explica a disparidade do número de

pacientes entre os dois grupos, já que a divisão dos mesmos só foi conhecida após a

coleta de todo material, durante a análise estatística.

Em todos os casos, foi dosada a progesterona sérica por técnica de

radioimunoensaio no dia da biópsia, para comprovar o efeito anovulatório do

anticoncepcional hormonal oral.

As amostras obtidas pelos procedimentos cirúrgicos sofreram procedimentos

histopatológicos e imunohistoquímicos.

3.2 - Método histopatológico

23

As amostras coletadas foram fixadas em formol tamponado a 10%, encaminhadas

ao Departamento de Patologia da UNIFESP-EPM, sendo desidratadas em álcool

etílico, diafanizados em xilol e então incluídas em blocos de parafina. Realizaram-se

cortes seriados por microtomia, os quais foram montados em lâminas. Uma série delas

foi submetida à coloração pela técnica de Hematoxilina-Eosina (HE) para confirmar o

diagnóstico de fibroadenoma, conforme o preconizado pela Organização Mundial de

Saúde (1981). As lâminas restantes foram encaminhadas para estudo imuno-

histoquímico, avaliando a expressão do Ki-67 e do c-myc.

3.3 - Método Imuno-histoquímico

Secções de 3µm de espessura foram aderidas em lâminas tratadas com 3-

aminopropiltrietoxisilano (Sigma, Co.-USA-A3648) e deixadas em estufa a 56o C por

doze horas. A desparafinização foi realizada em dois banhos de xilol por quinze

minutos, com posterior hidratação em dois banhos de etanol absoluto, um banho de

etanol 95%, um banho de etanol 80%, um banho de etanol 70% e um banho em água

corrente.

A recuperação antigênica para o anticorpo c-myc foi realizada com o uso de

microondas, em tampão citrato pH 6,0, em potência alta por vinte minutos, deixando-se

esfriar à temperatura ambiente por pelo menos mais vinte minutos. Para o anticorpo Ki-

67, a recuperação antigênica foi feita com o uso de panela de pressão, em tampão

citrato pH 6,0 por cinco minutos, deixando-se esfriar à temperatura ambiente por pelo

menos vinte minutos.

Após lavagem em água corrente foi realizado o bloqueio da peroxidase

endógena pela aplicação de água oxigenada 20 volumes, quatro vezes, durante cinco

minutos cada, lavando-se em seguida em água corrente e tampão PBS pH 7,4.

A incubação com o anticorpo monoclonal mouse anti-human Ki-67, clone

MIB-1 (DAKO – USA), título de 1:100 e mouse anti-human c-myc (DAKO – USA), título

de 1:100, em solução de BSA 1% em tampão PBS, foi feita em câmara úmida a 4o C,

por 16 a 18 horas.

Após três lavagens em tampão PBS efetuou-se a incubação com o anticorpo

secundário biotinilado do kit DAKO LSAB-HRP (Dako A/S – Denmark - K 492) por

quinze minutos, em câmara úmida, à temperatura ambiente. Em seqüência, três

24

lavagens em tampão PBS pH 7,4 e incubação com o conjugado streptoavidina-

peroxidase do kit DAKO LSAB-HRP por quinze minutos, em câmara úmida e, por fim,

três lavagens com tampão PBS, no pH 7,4.

A revelação foi feita com o uso do substrato cromogênico (3,3’-

diaminobenzidina-Sigma Co-USA-D5637) e água oxigenada 20 volumes 1% em tampão

PBS pH 7,4, por cinco minutos a 37o C, e lavagem extensiva em água corrente.

A Hematoxilina de Harris foi utilizada para a contra-coloração. A desidratação

foi processada com um banho em etanol 70%, um banho em etanol 80%, um banho em

etanol 95%, três banhos em etanol absoluto e a diafanização com três banhos de xilol.

Posteriormente, as secções foram montadas com lamínula em resina Entellan (Sigma).

O padrão de positividade do Ki-67 e do c-myc foi o aparecimento de

coloração marrom-acastanhada no núcleo da célula.

3.4 - Interpretação dos resultados

O anticorpo monoclonal Ki-67 reage com o antígeno nuclear presente em

células com atividade proliferativa, apresentando positividade nuclear, atingindo níveis

máximos nas fases G2 e M. A expressão antigênica é negativa em células quiescentes,

nas fases G0 e G1 precoce do ciclo celular (GERDES et al., 1984). Já o c-myc promove

a replicação celular em resposta a sinais extracelulares, levando células quiescentes a

entrarem no ciclo celular pela ativação de genes alvos transcritores (AMATI et al., 1998).

Foi usado, como controle positivo, lâmina com corte histológico de amígdala

comprovada anteriormente como Ki-67 e c-myc positivas. Esta mesma lâmina serviu

como controle negativo, subtraindo-se o anticorpo primário da reação.

O índice de proliferação celular de Ki-67 no epitélio foi determinado pela

razão (em porcentagem) entre o número total dos núcleos corados pela somatória de

núcleos corados e não corados analisados. Da mesma forma, calculamos o índice para

o c-myc.

A análise quantitativa foi realizada por meio de análise digital de imagem,

utilizando-se o programa IMAGE-PRO Plus, versão 3,0. As imagens foram geradas por

um microscópio Olympus conectado a uma Camera Adaptor CMA-D2 da Sony que

alimentava um computador, através de placa digitalizadora de imagem Image Capture

Board.

25

3.5 - Método estatístico

A comparação das médias das variáveis quantitativas nos dois grupos foi

realizada com o teste t de Student para duas amostras independentes, após o teste de

igualdade de variâncias de Levene (NETER et al., 1990). Também comparamos as

medidas realizadas nos dois grupos por meio do teste não paramétrico de Mann-

Whitney (CONOVER , 1980).

As medidas realizadas antes e depois do tratamento foram comparadas por meio

do teste t pareado de Student (NETER et al., 1990) e com o teste não paramétrico de

Wilcoxon (CONOVER, 1980).

Adotamos o nível de significância de 5% para a conclusão de todos os testes

realizados.

26

4 - RESULTADOS

As Tabelas 1 a 3 mostram os dados epidemiológicos das pacientes em estudo.

Apresentam-se a idade cronológica, a idade da menarca e o número de gestações,

partos e abortamentos, além do antecedente de amamentação. Os grupos mostraram-

se homogêneos quanto a essas variáveis.

Tabela 1 – Dados epidemiológicos das pacientes do Grupo 1 (usuárias de ACO)

Paciente Idade (anos)

Menarca(anos)

N.° de

GestaçõesParidade

N.° de

Abortamen-tos

Amamen-tação

IS 25 14 0 0 0 0

RAC 17 11 0 0 0 0

EAP 18 13 0 0 0 0

MCN 22 11 1 1 0 0

PCJ 29 11 0 0 0 0

VCAJ 18 13 0 0 0 0

VSN 19 13 0 0 0 0

MPSS 20 12 0 0 0 0

ACS 23 11 0 0 0 0

IVSS 18 12 0 0 0 0

27

Tabela 2 – Dados epidemiológicos das pacientes do Grupo 2 (usuárias de ACO + estriol)

Paciente Idade (anos)

Menarca (anos)

N.° de

GestaçõesParidade

N.° de

Aborta-mentos

Amamenta-ção

MMC 29 12 0 0 0 0

PPS 20 10 0 0 0 0

CAS 25 13 1 1 0 30 meses

LSA 23 12 0 0 0 0

ACCM 15 11 1 0 1 0

MAL 20 14 0 0 0 0

RNS 34 16 3 3 0 36 meses

RPP 33 15 0 0 0 0

SRA 21 13 0 0 0 0

ROR 18 12 0 0 0 0

FLR 24 13 5 5 0 0

RGLN 26 13 1 1 0 48 meses

HSZ 18 13 0 0 0 0

SMS 18 13 0 0 0 0

NRG 14 9 0 0 0 0

SSS 30 12 3 2 1 26 meses

RALS 30 10 2 2 0 24 meses

SLOC 16 12 0 0 0 0

RMN 17 12 0 0 0 0

DT 24 13 1 0 1 0

JBS 23 15 0 0 0 0

RMM 29 13 0 0 0 0

JMPS 20 15 0 0 0 0

28

Tabela 3 – Média e erro padrão dos dados epidemiológicos das pacientes dos Grupos 1 e 2

Grupo 1 – ACO + placebo

Grupo 2 - ACO + estriol Nivel descritivo (p)

Variáveis

Média Erro padrão Média Erro

padrão teste t Mann Whitney

Idade 20,9 1,22 22,91 1,21 - 0,365

Gestações 0,10 0,10 0,74 0,28 0,144 0,127

Paridade 0,10 0,28 0,61 0,26 0,224 0,261

Abortamentos 0,00 0,00 0,13 0,07 0,244 0,238

As Tabelas 4 e 5 mostram as medidas ultra-sonográficas dos nódulos mamários

que as pacientes apresentavam à época do estudo. Foram feitas medidas de

comprimento, largura e altura antes e após a ingestão da medicação.

Concomitantemente, são apresentados níveis séricos de progesterona, que

comprovaram que as pacientes encontravam-se em anovulação na época da exérese

de seus nódulos.


medicação e dosagem de progesterona pós-medicação (Grupo 1 – usuárias de ACO)

Paciente Medidas Pré

(mm) Medidas Pós

(mm) Progesterona

(ng/ml)

IS 18x11x10 23x9x9 0,5

RAC 14x12x14 14x11x11 1,4

EAP 17x9x15 18x11x15 0,3

MCN 36x35x16 33x32x14 0,5

PCJ 13x8x6 13x6x5 0,3

VCAJ 30x15x24 30x16x25 0,4

VSN 24X18x21 25x14x23 < 0,2

MPSS 20x16x20 18x12x17 < 0,2

ACS 23x16x20 28x15x24 0,3

IVSS 21x17x13 22x12x20 0,3

29


medicação e dosagem de progesterona pós-medicação (grupo 2 – usuárias de ACO +

estriol)

Paciente Medidas Pré

(mm) Medidas Pós

(mm) Progesterona

(ng/ml)

MMC 28x26x13 28x14x27 0,3

PPS 23x12x9 22x16x10 0,8

CAS 28x27x11 32x14x11 0,3

LSA 12x9x9 11x6x8 0,2

ACCM 38x22x30 40x21x28 0,3

MAL 24x10x18 20x9x19 0,5

RNS 40x19x33 41x16x34 0,4

RPP 17x10x17 20x10x19 < 0,2

SRA 24x16x18 25x16x20 0,9

ROR 15x14x9 14x13x8 < 0,2

FLR 20x9x20 20x9x20 12,6

RGLN 28x12x25 29x22x12 1,6

HSZ 20x8x12 18x8x13 0,5

SMS 60x15x60 55x16x51 0,2

NRG 27x21x25 27x23x26 0,3

SSS 21x16x18 22x16x17 0,4

RALS 33x19x28 32x17x27 0,3

SLOC 19x15x10 22x13x21 0,3

RMN 21x10x18 24x12x15 0,4

DT 22x11x19 25x12x17 0,4

JBS 23x10x22 28x9x27 0,5

RMM 22x15x17 23x15x19 0,3

JMPS 29x9x20 25x12x18 0,4

A Tabela 6 demonstrou haver resultado significante para a medida da largura

dos nódulos mamários nas pacientes que fizeram ingestão apenas de ACO e placebo,

nomeadas como Grupo 1 (conforme célula hachurada em cinza na tabela), fato que

não ocorreu nas usuárias de ACO com estriol (Grupo 2). Tal resultado foi atestado pelo

teste de paridade t e também pelo teste não paramétrico de Wilcoxon. Quanto às

outras medidas, não houve diferença significante em nenhum dos grupos estudados.

30

Tabela 6 – Média e erro padrão das medidas ultra-sonográficas dos nódulos (em mm)

antes e depois da medicação dos Grupos 1 e 2

ANTES DEPOIS Nivel descritivo (p)GRUPO 1

(ACO+PLACEBO) Média

(mm) Erro

padrão

Média

(mm) Erro

padrão

teste t

Wilcoxon

Comprimento 21,66 2,24 20,05 2,84 0,364 0,575

Largura 15,73 2,40 13,17 2,63 0,043 0,036

Altura 15,94 1,74 15,67 2,62 0,854 1,000

ANTES DEPOIS Nivel descritivo (p)GRUPO 2

(ACO+ESTRIOL) Média

(mm) Erro

padrão

Média

(mm) Erro

padrão

teste t

Wilcoxon

Comprimento 25,10 2,22 26,44 1,89 0,158 0,122

Largura 15,30 1,23 13,76 1,08 0,157 0,146

Altura 20,79 2,47 20,93 2,30 0,913 0,926

As Tabelas 7 a 10 apresentam a porcentagem de núcleos de células epiteliais

corados na pesquisa da antígenos Ki-67 e c-myc em relação ao total de núcleos

contados (núcleos positivos + núcleos negativos) de cada paciente em estudo.

Deslevam-se também as médias e o erro padrão das medidas para os Grupos 1 e 2.

31

Tabela 7 – Números de núcleos de células epiteliais positivos e negativos e número

total de núcleos contados no fibroadenoma em pesquisa imuno-histoquímica de

antígenos Ki-67 no Grupo 1 (ACO + Placebo) (n=10)

Paciente Núcleos

Positivos Núcleos

Negativos Total de Núcleos

Contados Porcentagem (%)

IS 16 3205 3221 0,50

RAC 186 2692 2878 6,46

EAP 67 3481 3548 1,89

MCN 164 2486 2650 6,19

PCJ 53 3128 3181 1,67

VCAJ 1231 3053 4284 28,73

VSN 431 3637 4068 10,59

MPSS 212 2944 3156 6,72

ACS 445 3072 3517 12,65

IVSS 641 3313 3954 16,21

Média 9,16

Erro padrão 2,69

Tabela 8 – Números de núcleos de células epiteliais positivos e negativos e número total

de núcleos contados no fibroadenoma em pesquisa imuno-histoquímica de antígenos c-

myc no Grupo 1 (ACO + Placebo) (n=10)

Paciente Núcleos

Positivos Núcleos



IS 1681 2713 4394 38,26

RAC 17 2660 2677 0,64

EAP 13 1999 2012 0,65

MCN 1395 3180 4575 30,49

PCJ 159 3454 3613 4,40

VCAJ 159 2525 2684 5,92

VSN 485 4434 4919 9,86

MPSS 57 3544 3601 1,58

ACS 480 2882 3362 14,28

IVSS 60 2333 2393 2,51

Média 10,86

Erro padrão 4,19

32


total de núcleos contados no fibroadenoma em pesquisa imuno-histoquímica para o

antígeno Ki-67 no Grupo 2 (ACO + estriol) (n=23)

Paciente Núcleos

Positivos Núcleos



MMC 623 3517 4140 15,05

PPS 537 3376 3913 13,72

CAS 297 2994 3291 9,02

LSA 140 3205 3345 4,19

ACCM 336 1972 2308 14,56

MAL 1103 3738 4841 22,78

RNS 19 4497 4516 0,42

RPP 1287 4118 5405 23,81

SRA 449 2908 3357 13,38

ROR 608 3077 3685 16,50

FLR 95 3357 3452 2,75

RGLN 232 3293 3525 6,58

HSZ 909 4308 5217 17,42

SMS 38 3903 3941 0,96

NRG 661 3680 4341 15,23

SSS 495 3579 4074 12,15

RALS 98 3819 3917 2,50

SLOC 397 2695 3092 12,84

RMN 661 4141 4802 13,77

DT 238 2719 2957 8,05

JBS 136 3829 3965 3,43

RMM 653 4638 5291 12,34

JMPS 30 3157 3187 0,94

Média 10,54

Erro padrão 1,43

33


total de núcleos contados no fibroadenoma em pesquisa imuno-histoquímica para o

antígeno c-myc no Grupo 2 (ACO + estriol) (n=23)

Paciente Núcleos

Positivos Núcleos



MMC 354 2514 2868 12,34

PPS 1026 1872 2898 35,40

CAS 1674 3209 4883 34,28

LSA 50 2696 2746 1,82

ACCM 252 2664 2916 8,64

MAL 1023 2231 3254 31,44

RNS 1681 2427 4108 40,92

RPP 877 2556 3433 25,55

SRA 39 2723 2762 1,41

ROR 48 2863 2911 1,65

FLR 517 2586 3103 16,66

RGLN 810 3201 4011 20,19

HSZ 100 3133 3233 3,09

SMS 647 4230 4877 13,27

NRG 399 3486 3885 10,27

SSS 1262 1765 3027 41,69

RALS 12 2717 2729 0,44

SLOC 855 1600 2455 34,83

RMN 177 4086 4263 4,15

DT 573 3679 4252 13,48

JBS 34 3824 3858 0,88

RMM 94 4385 4479 2,10

JMPS 1452 2460 3912 37,12

Média 17,03

Erro padrão 3,09

34

A Tabela 11 indica que não houve diferença estatisticamente significante no

fibroadenoma entre a porcentagem de núcleos de células epiteliais corados sobre o

total de núcleos contados na pesquisa dos antígenos Ki-67 e c-myc em ambos os

grupos, fato atestado pelos testes t pareado e de Mann-Whitney.

Tabela 11 – Média e erro padrão para os núcleos positivos marcados com Ki-67 e c-myc

em ambos os grupos

ACO ACO + ESTRIOL Nivel descritivo (p) Marcadores

Média Erro padrão Média Erro padrão teste t Mann Whitney

Ki-67 9,161 2,694 10,858 4,189 0,625 0,389

c-myc 10,539 1,429 17,027 3,086 2,666 0,256

35

5 - DISCUSSÃO

O fibroadenoma constitui neoplasia mista, com quantidade variável de tecidos

epitelial e conjuntivo; reveste-se de grande importância, pela freqüência com que

acomete pacientes que se encontram no menacme. Alguns autores consideram-no

como uma forma localizada de hiperplasia nodular do estroma e do componente

glandular, ou seja, variante da doença fibrocística conhecida como hiperplasia

adenomatosa (ROBINS, 1996). Entretanto, a afecção é difusa, o que contrasta com as

formas tipicamente localizadas e nodulares do fibroadenoma (VERONESI, 2002).

SAWHNEY et al. (1992) estudaram o epitélio e o estroma no fibroadenoma e no

tumor filodes, demonstrando haver relação espacial entre as mitoses do estroma e a

concentração do tecido epitelial. Utilizando modelo morfométrico computadorizado,

quantificaram a distribuição do epitélio em anéis concêntricos sucessivos, que

circundavam as mitoses dos fibroblastos. Observaram que, quando a distância entre o

estroma e o epitélio era maior que 200 µm, a atividade mitótica estromal era

desprezível, estando, pois, limitada a este raio de ação. Esta distância corresponderia

ao alcance da difusão passiva do oxigênio, reforçando a hipótese de que o controle da

proliferação no fibroadenoma depende mais de fatores humorais locais, de natureza

parácrina, do que de mecanismos endócrinos. Assim, em regiões do estroma com

maior atividade proliferativa, a concentração do epitélio era maior, enquanto em áreas

estromais em que o tecido epitelial encontrava-se distante, a atividade mitótica nos

fibroblastos era menor.

HASEBE et al. (1999) estudaram, mediante a análise de expressão do PCNA

(antígeno nuclear de proliferação celular), fibroadenomas comuns, que apresentavam

baixa atividade estromal; fibroadenomas hipercelulares, que mostravam maior atividade

deste compartimento histológico, assim como alguns tumores filodes, com grau

máximo de atividade estromal. Obtiveram, como resultados, baixa expressão do PCNA

nos fibroblastos de fibroadenomas comuns e, à medida que aumentava a celularidade

estromal, como no fibroadenoma hipercelular e no tumor filodes, havia aumento na

expressão do PCNA, cujo acme ocorreu neste último tipo de tumor. Sugeriram, assim,

que a celularidade estromal seria regulada pela expressão do fator de crescimento do

fibroblasto e de seu receptor, através de via de estimulação de crescimento parácrina,

isto é, o crescimento dos fibroadenomas decorreria da proliferação do compartimento

estromal, a qual seria induzida pelo fator de crescimento de fibroblastos produzido no

36

epitélio. Também postularam que a celularidade estromal seria importante variável para

diferenciar as diferentes variedades de fibroadenomas, sugerindo que o crescimento do

componente mesenquimal nos tumores fibroepiteliais dependeria da ação moduladora

do elemento epitelial, via fatores de crescimento/inibição de fibroblastos, assim como a

contrapartida também poderia ocorrer, ou seja, o crescimento do epitélio também

dependeria do componente estromal através da produção na mesma medida de fatores

de crescimento/inibição neste compartimento, levando à interdependência entre o

epitélio e o estroma através de mecanismo parácrino.

Constata-se que, nos tumores fibroepiteliais, os elementos epiteliais estão

embebidos em estroma que exibe grau de proliferação anormal, mas com padrão

uniforme. Se a atividade mitótica estromal, por mecanismo parácrino, depende de

fatores humorais locais produzidos pelo epitélio, seria de se esperar que a atividade

proliferativa fosse tanto maior quanto mais próximo estivesse o epitélio, o que

realmente foi observado por SAWHENEY et al. (1992). Estes autores preconizaram,

então, que o epitélio teria a capacidade de produzir fatores de crescimento, como o

derivado das plaquetas (PGDF), o de crescimento epidermal (EGF) e o insulinóide tipo

1 (IGF-1), que atuariam sobre os fibroblastos, estimulando a síntese de DNA e

induzindo o seu crescimento. O epitélio ainda teria a capacidade de produzir fatores de

angiogênese e desencadear a neovascularização típica destas neoplasias, que

também promoveria o seu crescimento.

Estes fatos levaram alguns autores, como SAWHENEY et al. (1992) e

PASQUALINI et al. (1997), a admitirem a existência de uma alça de controle local,

onde fatores de crescimento produzidos no epitélio agiriam no estroma, levando-o a

proliferar e, o estroma proliferado, por sua vez, produziria novos fatores de

crescimento, necessários ao crescimento epitelial, levando ao surgimento dos

fibroadenomas. Esta interdependência se perderia nas neoplasias malignas, mas

estaria parcialmente preservada nos tumores fibroepiteliais, que tratar-se-iam de lesões

especializadas do estroma mamário com capacidade de estimular o crescimento do

epitélio circunvizinho, mas permaneceriam com relativa dependência do componente

epitelial, atingindo certo grau de equilíbrio entre os fatores de crescimento e de inibição.

Daí se explicaria o crescimento lento dos fibroadenomas e também a estabilização de

seu crescimento após atingir determinado tamanho em número significativo de

pacientes (HAAGENSEN, 1986). Em pequena parcela de casos, esta dependência

seria perdida, havendo transformação sarcomatosa quando o epitélio não freasse o

37

crescimento estromal, ou transformação carcinomatosa se o componente estromal não

bloqueasse a proliferação epitelial via fatores inibitórios de crescimento (Figura 5).

E + P vaso sanguíneo FCEt (1) epitélio estroma (fibroblasto) FCEp(2)

FIEt (3)

estroma proliferado epitélio proliferado

? ?

desequilíbrio equilíbrio desequilíbrio

fibroadenoma complexo

carcinoma fibroadenoma tumor filodes

sarcoma

FCEp: fatores de crescimento epiteliais FCEt: fatores de crescimento estromais FIEt: fatores inibitórios de crescimento estromal E + P: estradiol e progesterona Assinaladas em (1), (2) e (3), as etapas seqüenciais do desenvolvimento do fibroadenoma. Figura 5 – Modelo de controle endócrino e parácrino do fibroadenoma (adaptado de Simomoto

et al., 1996).

KUIJPER et al. (2002) também estudaram fibroadenomas e tumores filodes e

tentaram criar, por meio da investigação da clonalidade destes tumores, modelo no

qual o fibroadenoma poderia progredir tanto na direção epitelial, como na estromal.

Tanto no epitélio como no estroma, obtiveram policlonalidade para os fibroadenomas,

enquanto para carcinomas “in situ” obtidos da vizinhança destes fibroadenomas

durante sua exérese, obtiveram monoclonalidade para o compartimento estromal. Nos

38

tumores filodes, o epitélio era policlonal enquanto o estroma monoclonal, da mesma

forma que nas variantes de fibroadenomas hipercelulares que apresentavam áreas

com aparente expansão estromal. Utilizando-se a teoria de evolução clonal de Nowell

(NOWELL, 1976), os tumores evoluiriam de um estágio policlonal (de baixa

malignidade) para um oligoclonal (de mais alta malignidade). Assim, o componente

epitelial policlonal dos fibroadenomas, ao progredir para o estágio monoclonal, poderia

propiciar sua transformação em carcinoma invasivo, assim como a progressão

monoclonal do estroma dos fibroadenomas poderia predispor a sua evolução para o

tumor filodes. Estes achados evidenciam a importância da análise dos componentes

epitelial e estromal dos fibroadenomas.

UMEKITA, YOSHIDA (1999) estudaram a expressão imuno-histoquímica do

anticorpo Ki-67 (MIB-1), outra proteína que está relacionada ao ciclo celular e, portanto,

à taxa de proliferação em fibroadenomas e tumores filodes, com o intuito de

correlacioná-lo com o potencial de malignidade desses tumores. Evidenciaram, durante

seu estudo, que o aumento do índice estromal de MIB-1 se correlacionava com a

elevação em seu grau de malignidade, mas que, entretanto, sua expressão no epitélio

era igual em todos os tipos de fibroadenomas. Também observaram aumento de 2,5

vezes na expressão do MIB-1 no estroma das variedades hipercelulares, em relação ao

fibroadenoma comum. Quanto aos tumores filodes, constataram menor expressão do

anticorpo no epitélio e maior expressão em nível estromal, com o progredir de sua

malignidade, evidenciando a importância da atividade estromal para o crescimento

desses tumores.

Os estudos de HUEB (2000) e de TANIGUCHI (2002), que avaliaram a

expressão do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) no epitélio do

fibroadenoma mamário em mulheres tratadas com ACO por dois e por quatro ciclos,

respectivamente, não revelaram diferenças estatísticas entre os grupos em estudo,

sugerindo que amostra maior ou aumento do tempo de exposição ao ACO seriam

necessários.

Sabemos que o componente estrogênico do ACO usado no nosso estudo, o

etinilestradiol, é 100 a 200 vezes mais potente que o estradiol, que é o estrogênio

normalmente presente na circulação (GILMAN, 1996). Assim, o primeiro estimularia o

compartimento epitelial de forma mais intensa que o último e essa atuação seria

mediada por receptores de estrogênio, que estão presentes em mais alta proporção no

fibroadenoma que no tecido normal (PASQUALINI et al., 1997).

39

A maior ação do etinilestradiol sobre o epitélio levaria-o a proliferar, propiciando

maior expressão de proteínas relacionadas ao ciclo celular, como o Ki-67 e o c-myc

usados em nosso estudo, além de maior produção de fatores inibitórios de crescimento

estromais que, via controle parácrino, induziriam menor proliferação do estroma. O

efeito final seria a diminuição nas dimensões do fibroadenoma (Figura 6), uma vez que

é o compartimento estromal o principal responsável por suas dimensões (KUIJPER et

al., 2002). Essa teoria é condizente com os achados de nosso estudo, onde

encontramos diminuição nas dimensões dos fibroadenomas ao exame ultra-

sonográfico, conforme demonstrado nas Tabelas 4 e 6, assim como expressão baixa

de Ki-67 e c-myc de 9,2 e 10,5 para as usuárias apenas de ACO e placebo (Grupo 1),

conforme demonstrado na Tabela 11.

FCEt (1) epitélio estroma (fibroblasto)

FCEp(2)

FIEt (3)

estroma proliferado

epitélio proliferado (+) (4)

ACO diminuição estromal

fibroadenoma diminui

ACO: anticoncepcional combinado oral FCEp: fatores de crescimento epiteliais FCEt: fatores de crescimento estromais FIEt: fatores inibitórios de crescimento estromal Assinaladas em (1), (2), (3) e (4), as etapas seqüenciais do efeito protetor do ACO sobre o fibroadenoma. Figura 6 – Modelo de controle parácrino do fibroadenoma em usuárias de ACO (adaptado de

Taniguchi., 2002).

Entretanto, a influência dos ACO no fibroadenoma é ainda tema controverso,

tanto no aspecto epidemiológico como no que diz respeito à proliferação celular, já que

40

na literatura, os trabalhos não são uniformes e os resultados são conflitantes. Assim,

alguns estudos relatam ação protetora com o seu uso, como os de CANNY et al. (1988)

e ROHAN, MILLER, (1999), enquanto em outros, o ACO levou ao aumento da sua

incidência, como no estudo de YU et al. (1992). Assim, aventamos a possibilidade de

que o uso de um estrogênio fraco como o estriol, poderia bloquear competitivamente as

ações mais potentes do etinilestradiol presente no ACO. Assim, poderíamos

demonstrar, de forma indireta, o importante papel protetor do ACO sobre os tumores

benignos das mamas, dirimindo as dúvidas ainda existentes na literatura.

Embora o fulcro do nosso trabalho tenha sido a avaliação imuno-histoquímica do

epitélio do fibroadenoma entre usuárias de ACO e placebo e de ACO associado ao

estriol, é interessante observar que obtivemos, durante a fase clínica de nosso estudo,

diminuição de tamanho nas medidas ultra-sonográficas em uma das dimensões do

fibroadenoma (largura) em usuárias de ACO e placebo (Grupo 1), sendo esta

diminuição estatisticamente significante. Já no grupo de usuárias de ACO e estriol

(Grupo 2) não encontramos redução nas medidas do tumor após o término da tomada

da medicação.

Nossos resultados apontam que o uso de ACO levando a diminuição do

fibroadenoma nas pacientes do Grupo 1, constituir-se-ia, possivelmente, em fator

protetor, o que já não ocorre quando analisamos os resultados obtidos no Grupo 2, ou

seja, usuárias de ACO e estriol, as quais, conforme já salientado, não apresentaram

variação nas dimensões ultra-sonográficas do tumor. Isto talvez ocorra pelo fato do

estriol bloquear o efeito protetor do etinilestradiol, presente nos anticoncepcionais,

conforme discorreremos adiante.

De fato, no Grupo 1 (usuárias de ACO e placebo), após quatro ciclos de uso da

medicação, houve diminuição nas dimensões ultra-sonográficas dos fibroadenomas,

mais especificamente na largura, diferença que foi estatisticamente significante, com

nível descritivo de 0,043. Supomos que a explicação para tal achado baseia-se no fato

de que, embora o etinilestradiol atue tanto no estroma quanto no epitélio do

fibroadenoma, seu efeito é predominante no epitélio, por este compartimento possuir

receptores esteroídicos em maior número (PASQUALINI et al., 1997). Além disto,

quando se compara ao estradiol endógeno, o etinilestradiol é muito mais potente. Essa

atuação se daria de forma a estimular a produção de fatores de inibição de crescimento

pelo compartimento epitelial, que por mecanismo parácrino de controle, atuariam sobre

o compartimento estromal, freando seu crescimento. Com isto, ocorreria a inibição do

41

crescimento estromal pelo epitélio do fibroadenoma e, com o uso prolongado do ACO

por quatro ciclos, o estroma gradualmente atrofiaria, levando à diminuição do tumor,

uma vez que este é o principal compartimento responsável pelas suas dimensões

(KUIJPER et al., 2002) (Figura 6). Tal fato foi comprovado em nosso estudo pelo

achado de diminuição na largura dos fibroadenomas entre as pacientes do Grupo 1.

O estriol é um estrogênio com potência menos intensa, já que se trata de

produto do seu metabolismo (GILMAN, 1996). O possível antagonismo seletivo entre

ele e outros estrogênios mais potentes, como o estradiol e a estrona, levou-nos a usá-

lo em nosso estudo, onde poderia vir a bloquear competitivamente o etinilestradiol

presente nos ACO. Presumimos que esse antagonismo levaria à diminuição do efeito

protetor do etinilestradiol sobre o epitélio do fibroadenoma.

Sabemos que o estriol é muito menos potente (cerca de 1000 vezes) que o

etinilestradiol do ACO (GILMAN, 1996). Seu mecanismo de ação faz-se por

antagonismo competitivo, isto é, bloqueia o receptor estrogênico exercendo efeito

hormonal discreto. O epitélio do fibroadenoma possui esses receptores em maior

quantidade do que o estroma (UMEKITA, YOSHIDA, 1999). Assim, seria de se esperar

que o bloqueio induzido pelo estriol fosse mais intenso no epitélio do que no estroma.

Teríamos, então, menor proliferação epitelial, o que diminuiria a produção de fatores

inibitórios de crescimento, que, via mecanismo parácrino, inibiriam de forma menos

intensa o estroma, liberando-o para proliferar e impedindo a diminuição global do

fibroadenoma. Tal fato foi constatado na primeira fase de nosso estudo pela

manutenção das dimensões do fibroadenoma nas pacientes usuárias de ACO e estriol

(Grupo 2).

Por outro lado, o estroma proliferado, além de manter as dimensões do tumor,

levaria, com o passar dos ciclos, à produção de fatores de crescimento que

retroalimentariam o epitélio, levando-o a se proliferar, causando tendência à maior

expressão de proteínas relacionadas ao ciclo celular (Ki-67 e c-myc) em usuárias de

ACO e estriol (Grupo 2), em comparação ao Grupo 1 (usuárias de ACO e placebo)

(Figura 7).

42

FCEt (1) epitélio estroma (fibroblasto) FCEp(2)

FIEt (3)

estroma proliferado epitélio proliferado

(-) (-) (4) E3 estroma permanece

proliferado ACO (5)

aumenta c-myc / Ki-67

aumento da proliferação epitelial

fibroadenoma mantém dimensões

ACO: anticoncepcional combinado oral E3: estriol FCEt: fatores de crescimento estromais FIEt: fatores inibitórios de crescimento estromal ACO: anticoncepcional combinado oral FIEt: fatores inibitórios de crescimento estromal Assinaladas em (1), (2), (3), (4) e (5), as etapas seqüenciais do bloqueio do efeito protetor do ACO sobre o fibroadenoma pelo estriol. Figura 7 – Modelo de controle parácrino do fibroadenoma em usuárias de ACO e estriol.

Nossos resultados obtidos no epitélio não puderam corroborar essa premissa

pela avaliação imuno-histoquímica, uma vez que, apesar de termos obtido tendência à

significância, os resultados não foram estatisticamente significantes. Dando

continuidade a esta linha de pesquisa, pretendemos, em novo estudo, ampliar o

tamanho da amostra e avaliar também o estroma do fibroadenoma.

Assim, podemos supor que no Grupo 2 (usuárias de ACO e estriol), não se

observou diminuição nas dimensões ultra-sonográficas dos fibroadenomas, pela

43

hipótese de que o estriol tenha bloqueado competitivamente o etinilestradiol, impedindo

a sua ação no epitélio. Desta feita, o epitélio não logrou inibir o estroma, que então

manteve suas dimensões, o que propiciou, como resultado final, medidas ultra-

sonográficas sem variações Tabelas 5 e 6).

No tocante aos marcadores imuno-histoquímicos, não houve diferença

estatisticamente significante entre os Grupos 1 (ACO e placebo) e 2 (ACO e estriol),

tanto para a expressão de Ki-67, quanto para a de c-myc, mas observou-se tendência à

maior expressão dos mesmos no grupo 2. Postulamos que o estriol, ao bloquear

competitivamente o etinilestradiol do ACO principalmente em nível epitelial, induziria à

menor proliferação deste compartimento, o que provocaria menor produção de fatores

inibitórios de crescimento sobre o estroma, que se manteria proliferado. Por fim, o

estroma proliferado produziria fatores de crescimento que atuariam no epitélio,

mantendo-o em estado de maior proliferação, denotado pela tendência à maior

expressão de proteínas relacionadas à proliferação entre as usuárias de ACO e estriol

(Grupo 2). Tal fato encontra-se demonstrado nos valores obtidos na Tabela 11, onde

obtivemos valores de Ki-67 e c-myc de 9,2 e 10,5 para o Grupo 1 (ACO e placebo) e

10,8 e 17 para o Grupo 2 (ACO e estriol) respectivamente, que apesar de não ter

alcançado significância estatística, revelam a tendência desse comportamento.

Saliente-se que o presente estudo restringiu-se à avaliação do epitélio dos

fibroadenomas. Como essa neoplasia é composta de componentes epitelial e estromal,

e, segundo os estudos já citados, o último compartimento é que teria importância

primordial no tamanho dos fibroadenomas (HASEBE et al., 1999; UMEKITA, YOSHIDA,

1999). Desse modo, seria interessante, em próximo estudo, avaliar o estroma, de modo

a aquilatar a real influência de fatores de crescimento e inibição sobre as dimensões

dos fibroadenomas.

FERRIÈRES et al., (1997), ao estudarem o processo de morte celular em

pacientes com doenças mamárias benignas através da expressão de bcl-2 em ductos e

lóbulos mamários de fibroadenomas, evidenciaram a maior expressão deste gene anti-

apoptótico nestas neoplasias, em comparação com o tecido mamário normal. Esses

resultados sugeriram haver potencial perda de controle do bcl-2 em pacientes com

fibroadenomas, com decréscimo em sua apoptose, propiciando o surgimento da

neoplasia. Como em nosso estudo obtivemos tendência à menor expressão de

marcadores tumorais nas usuárias de ACO do que nas usuárias de ACO e estriol,

aventamos a hipótese de que o uso de ACO (Grupo 1) possa ter levado à ativação da

44

apoptose, com mais morte celular, propiciando a diminuição do tamanho dos tumores

nas pacientes deste grupo, corroborando a proteção conferida pelos ACO em tumores

mamários benignos, já descrita na literatura (BORGELT-HANSEN, 2001). O uso de

estriol pelas pacientes do Grupo 2 bloquearia competitivamente a atuação do

etinilestradiol, não havendo estímulo ao processo apoptótico, impedindo a diminuição

do tamanho dos tumores neste grupo, fato constatado em nosso estudo, pela não

diminuição das dimensões ultra-sonográficas para as pacientes do Grupo 2. Desta

maneira, na continuação desta linha de pesquisa, procuraremos aferir a expressão do

bcl-2 ou outros fatores relacionados à apoptose nos dois grupos, podendo trazer

importante contribuição na compreensão da gênese do fibroadenoma e do potencial

efeito protetor do ACO na modulação do crescimento dessa neoplasia.

Outra possibilidade de investigação a ser realizada, será avaliar o efeito do ACO

no volume do fibroadenoma a longo prazo. Alguns estudos sugerem que, mesmo sem

realização de qualquer tipo de tratamento, os fibroadenomas tendem a diminuir com o

passar do tempo, ou, ao menos, permanecer com suas dimensões inalteradas após

atingir um determinado tamanho (CANT et al., 1998). Assim, desperta-nos curiosidade

saber se o efeito que o tempo parece exercer sobre essa neoplasia poderia ser, de

alguma forma, intensificado pelo uso prolongado do ACO.

Concluindo, obtivemos resultados que corroboram que o estriol bloquearia o

efeito protetor do ACO sobre o fibroadenoma, uma vez que houve constatação clínica

desse fato pela diminuição das dimensões dos fibroadenomas nas pacientes do Grupo

1 (ACO e placebo) e não do Grupo 2 (ACO e estriol). Além disso, aventamos a

possibilidade de que, a longo prazo, o uso concomitante de estriol e ACO poderia

predispor à hiperplasia do epitélio do fibroadenoma, como observamos pelo aumento

na tendência da expressão dos marcadores tumorais Ki-67 e c-myc após quatro ciclos.

Tal hipótese talvez se confirme através de seu uso por período mais prolongado,

constituindo-se na próxima fase de nossa linha de pesquisa.

45

6 - CONCLUSÃO

As mulheres que fizeram uso de anticoncepcional hormonal combinado oral

associado a estriol por quatro ciclos consecutivos, apresentaram expressão das

proteínas Ki-67 e c-myc no epitélio do fibroadenoma mamário semelhante à de

mulheres com a mesma afecção e que utilizaram apenas anticoncepcional hormonal

combinado oral pelo mesmo período, apesar de haver tendência à maior expressão

entre as usuárias da associação anticoncepcional oral e estriol.

46

7) ANEXOS

ANEXO 1

PROTOCOLO – FIBROADENOMA

Paciente:

RG:

Idade:

Telefone:

1.a Consulta ( / / )

Menarca:

G P A Último parto:

Lactação:

DUM: Ciclos:

Uso de medicações:

Exame mamário: nódulo: cm

USG: x x mm

PAAF:

1.o Retorno (30 dias pós início da medicação)

Início da medicação em:

Queixas:


USG: x x mm

47

2.o Retorno (90 dias pós início da medicação)

Queixas:


USG: x x mm

Cirurgia ( / / )

Último dia de medicação:

Cirurgiões:

Intercorrências:

Processamento do material em:

48

ANEXO 2

CÓPIA DO PROTOCOLO DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA MÉDICA

49

ANEXO 3

Carta de informação à paciente de participação no estudo clínico: “Avaliação da atividade proliferativa do fibroadenoma mamário após administração de anticoncepcional hormonal combinado oral, associado ou não a estriol”.

1) O objetivo deste estudo é saber se o uso de estriol por via oral pode apresentar

efeito anti-proliferativo no epitélio mamário e no fibroadenoma, se utilizado

conjuntamente com anticoncepcionais orais.

2) O anticoncepcional será fornecido gratuitamente por quatro ciclos e é composto de

0,15 mg de levonorgestrel e 0,03 mg de etinilestradiol, comercialmente chamado

Microvlar ou Nordette. Já o estriol é composto de comprimidos de 2 mg,

comercialmente chamado de Ovestrion.

3) Os anticoncepcionais agem inibindo a ovulação e alteram o muco cervical. Já o

estriol é usado para controle de sintomas/sinais climatéricos (atrofia genito-urinária,

dispareunia, fogachos e sudorese noturna).

4) Os anticoncepcionais previnem a gravidez de forma eficaz e não sofrerão alteração

de sua eficácia pelo estriol.

5) Benefícios não contraceptivos dos anticoncepcionais: diminuem a chance de doença

benigna da mama, anemia, câncer de útero (endométrio) e de ovário, gravidez nas

tubas e inflamação pélvica.

6) Reações adversas: a) para os anticoncepcionais: náuseas ou vômitos,

empachamento, cólica abdominal, aumento da sensibilidade mamária ou secreção,

alteração de peso, candidíase vaginal, dor de cabeça, trombose, pressão alta; b) para o

estriol: sensibilidade ou dores mamárias, náusea, vômito, sangramento intermenstrual,

retenção hídrica, hipersecreção cervical, e mais raramente, cefaléia, hipertensão,

cãimbras e distúrbios visuais.

50

7) Os riscos dos efeitos colaterais dos ACO aumentam com o tabagismo e com a idade

avançada.

8) A retirada (biópsia) do nódulo de mama será realizada no ambulatório, como de

rotina, com anestesia local após exame clínico das mamas, punção e outros exames

(ultra-som), indicando benignidade. A data será marcada antecipadamente de acordo

com a agenda do serviço.

9) No dia da biópsia será coletada uma amostra de sangue para exame por punção

periférica da veia do antebraço. Será fornecido o resultado a você, se assim o desejar.

10) Possíveis desconfortos poderão ocorrer durante o procedimento cirúrgico na mama

e durante a punção da veia do antebraço.

11) Não há benefício direto para você. Trata-se de estudo experimental testando a

hipótese de que o estriol bloqueará a ação do etinilestradiol sobre o epitélio mamário e

sobre o fibroadenoma. Somente no final do estudo, poderemos concluir a presença de

algum benefício.

12) Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais responsáveis

pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas. O principal investigador é o

Dr. Rodrigo Estevão que pode ser encontrado na rua Botucatu, 527 fone: (0xx11) 5576-

4618. Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre

em contato com o Comite de Ética em Pesquisa (CEP) situado à rua Pedro de Toledo,

715 - 10 andar - Presidente Prof. Dr José Osmar Medina Pestana - fone: (0xx11) 5576-

4564.

13) É garantida liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e deixar

de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu tratamento na

instituição.

14) As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outros pacientes, não

sendo divulgado a identificação de nenhum paciente.

51

15) Você será mantido atualizado sobre os resultados parciais das pesquisas, se assim

o desejar.

16) Não há despesas pessoais para você em qualquer fase do estudo, incluindo

exames e consultas. Também não há compensação financeira relacionada à sua

participação. Se existir qualquer despesa adicional, ela será absorvida pelo orçamento

da pesquisa.

17) Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos ou

tratamentos propostos neste estudo (nexo causal comprovado), você tem direito a

tratamento médico na Instituição, bem como às indenizações legalmente estabelecidas.

Declaro ter lido e entendido as informações presentes neste documento.

______________________________

assinatura da paciente Data: ______/_______/_______

52

ANEXO 4

Termo de consentimento, pós informação, de participação no estudo clínico: “AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE PROLIFERATIVA DO FIBROADENOMA MAMÁRIO APÓS ADMINISTRAÇÃO DE ANTICONCEPCIONAL HORMONAL COMBINADO ORAL, ASSOCIADO OU NÃO A ESTRIOL.”

Acredito ter sido suficientemente informada a respeito das informações

que li ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo “Avaliação da atividade

proliferativa do fibroadenoma mamário após administração de anticoncepcional

hormonal combinado oral, associado ou não a estriol”.

Eu discuti com o Dr. Rodrigo Estevão sobre a minha decisão em participar

nesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do mesmo, os

procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de

confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha

participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso a tratamento

hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e

poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo,

sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter

adquirido.

______________________________________

Assinatura do paciente/representante legal

Data: ______/_______/_______

______________________________________

Assinatura da testemunha

Data: ______/_______/_______

53

ANEXO 5

Fotomicrografias

Para a visibilização da expressão dos antígenos Ki-67 e c-myc nos lóbulos

mamários, apresentam-se a seguir quatro fotomicrografias de duas pacientes.

A Figura 1 apresenta a fotomicrografia de corte histológico de fibroadenoma

mamário da paciente RAC, pertencente ao Grupo 1, onde se observa grande

número de núcleos Ki-67 corados em castanho, pela técnica imuno-histoquímica em

grande aumento (100 vezes), conforme indicado pelas setas.

Figura 1 – Fotomicrografia de corte histológico de fibroadenoma mamário da paciente RAC do Grupo 1

(usuária de ACO), mostrando os núcleos Ki-67 corados em castanho (setas) (imuno-histoquímica

utilizando avidina-biotina-peroxidase e contracorado por hematoxilina-eosina, em aumento de 100

vezes).

54

Na Figura 2 está representada a fotomicrografia de corte histológico de

fibroadenoma mamário da paciente HSZ (Grupo 2) que mostrou pequeno número de

núcleos Ki-67 corados em castanho, pela técnica imuno-histoquímica em pequeno

aumento (10 vezes).

Figura 2 – Fotomicrografia de corte histológico de fibroadenoma mamário da paciente HSZ do Grupo 2

(usuária de ACO e estriol), mostrando os núcleos Ki-67 corados em castanho (seta) (imuno-histoquímica

utilizando avidina-biotina-peroxidase e contracorado por hematoxilina-eosina, em aumento de 10 vezes).

55

Já a Figura 3 ilustra a fotomicrografia de corte histológico de fibroadenoma

mamário da paciente RAC (Grupo 1), com grande número de núcleos c-myc corados

em castanho, pela técnica imuno-histoquímica em médio aumento (40 vezes),

conforme indicado pelas setas.

Figura 3 – Fotomicrografia de corte histológico de fibroadenoma mamário da paciente RAC do Grupo 1

(usuária de ACO), revelando os núcleos c-myc corados em castanho (setas) (imuno-histoquímica


56

Por fim, a Figura 4 apresenta a fotomicrografia de corte histológico de

fibroadenoma mamário da paciente HSZ, pertencente ao Grupo 2, onde há ausência de

coloração de núcleos para c-myc, pela técnica imuno-histoquímica em pequeno

aumento (10 vezes).

Figura 4 – Fotomicrografia de corte histológico de fibroadenoma mamário da paciente HSZ do Grupo 2

(usuária de ACO e estriol), mostrando ausência de núcleos corados pelo c-myc (imuno-histoquímica


57

ANEXO 6

Declarações de artigos aceitos em Periódicos indexados.

59

8) REFERÊNCIAS

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Abstract

Objective: Evaluate proliferate activity of breast fibroadenomas, by expression of Ki-67

and c-myc, after administration of combined oral contraceptives combined or not to

estriol.

Material e methods: We studied 32 patients with fibroadenomas, which 10 constituted

Group 1 and used oral contraceptive compound by levonorgestrel (0,15 mg) and

etinilestradiol (0,03 mg), associated to one pill of placebo, manufactured in the same

capsule, for four consecutive cycles, with seven days of pause between them. The

another 23 patients were distributed in Group 2 and received, besides oral

contraceptives, one pill of estriol, 2 mg, which were manufactured with the

contraceptive, in the same capsule, and it was taken in the same fashion of Group 1

patients. We took ultrasonic measures of the tumors before and after medication intake

and, by the end of the four cycles, we promote the extraction of these tumors, sending

them to imunohistochemistry analysis of Ki-67 and c-myc.

Results: We observed a significant decrease in fibroadenomas width in patients who

take oral contraceptives only. In Group 1 (oral contraceptives with placebo), the average

width of fibroadenomas before treatment was 15,73 mm and, after use of four cycles of

oral contraceptives, was 13,17 mm. This decrease was statistically significant

(p=0,0043). In Group 2 (oral contraceptives with estriol), the width before and after

treatment was 15,30 e 13,76 mm, respectively, which is not statistically significant

(p=0,157). We did not observe changes in other measures in any of the groups. The

analysis of Ki-67 and c-myc did not show either any significant difference between the

studied groups: 9,16 and 10,54 in Group 1 and 10,86 and 17,03 in Group 2,

respectively. We observed a tendency to a bigger expression of these antigens in

patients of Group 2.

Conclusions: Our results did not demonstrate significant difference in expression of Ki-

67 and c-myc in patients who takes oral contraceptives only, but show a tendency to a

bigger expression in users of oral contraceptives with estriol. We realize a significant

decrease in width of fibroadenomas in oral contraceptives only users.

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Bibliografia consultada Rother ET, Braga MER. Como elaborar sua tese: estrutura e referências. 2.a ed.

São Paulo; 2005.

RODRIGO AUGUSTO FERNANDES ESTEVÃO AVALIAÇÃO DA … · (ACO com placebo), a largura média dos...

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