ROTEIRO DE AULA PRÁTICA

METABOLISMO DE CARBOIDRATOS

A demonstração de Buckner, em 1897, de que extratos de células rompidas podem catalisar as

mesmas transformações químicas que ocorrem na célula íntegra, abriu amplas perspectivas, permitindo

estudar as reações, e com isso identificar as diversas vias metabólicas.

Com o avanço tecnológico na purificação e identificação das diversas enzimas pode-se, passo a

passo, estabelecer a sequência e identificação das diversas enzimas metabólicas. Em geral, células podem

utilizar diversos substratos para fazer a fermentação (degradação oxidativa dos metabólitos energéticos em

presença de oxigênio, liberando energia).

A prática de hoje permite analisar visualmente, a atividade metabólica celular em presença de

oxigênio, utilizando-se alguns substratos e inibidores enzimáticos, tendo-se como indicador desta atividade

o Azul de Metileno. Esta substância orgânica apresenta-se azul na forma oxidada e incolor na forma

reduzida, sendo a oxidação-redução facilmente reversível.

MATERIAL E MÉTODO

Utilizaremos o sistema multienzimático encontrado na levedura Saccharomyces cerevisae

(fermento de panificação) na sua forma intacta, isto é, sem rompimento das paredes celulares.

Preparação: Aproximadamente 20g de fermento são suspensos em 100 ml de solução tampão fosfato 50

mM e pH 7,4. Com o repouso prolongado as células sedimentam, sendo necessário para o

uso que elas sejam suspensas por agitação do frasco.

Suspensão celular, substratos, inibidores e indicadores serão distribuídos em tubos de ensaio,

conforme tabela abaixo:

REAGENTES TUBOS

I II III IV V VI

Suspensão celular 6 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Iodoacetato 50 mM - - 1 - - -

Malonato 0,3 M - - - - 1 -

Etanol absoluto - - - - - 3

Agitar os tubos e deixar em repouso por 5 minutos

Água destilada 2 6 5 6 5 3

Azul de Metileno 0,05mM 6 3 3 3 3 3

Glicose 250 mM 6 0,5 0,5 - - 0,5

Succinato 250 mM - - - 0,5 0,5 -

Os números se referem ao volume dos reagentes em ml.

PROCEDIMENTO: Inicialmente agita-se a suspensão de células de levedura, contidas no frasco, e adiciona-se aos tubos

os volumes indicados. Em seguida distribuem-se os inibidores (iodoacetato, malonato e etanol) agitando

bem os tubos e deixando em repouso por aproximadamente 5 minutos. Adicionar os substratos (glicose,

succinato, água e azul de metileno) agitando novamente os tubos.

Retirar suspensão do primeiro tubo, encher um tubo menor e invertê-lo novamente dentro do

primeiro tubo. Deixar todos os tubos em repouso e observar periodicamente a produção de gás dentro do

pequeno tubo invertido e o descoramento ou não dos demais tubos (onde houver descoramento observar a

coloração azulada na superfície dos líquidos).

Agitar os tubos onde houver descoloração e registrar os resultados.