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Unesp - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CÂMPUS DE JABOTICABAL

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

Departamento de Patologia Veterinária

ROTEIRO DE AULAS TEÓRICO-PRÁTICAS EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

HÉLIO JOSÉ MONTASSIER (Professor Titular - Disciplina de Imunologia Veterinária )

JABOTICABAL - SP - 2017 -

Prof. Hélio José Montassier FCAV – UNESP - Jaboticabal

1

ÍNDICE

Introdução as técnicas de laboratório em Imunologia...................................................... 3

Preparo de antígenos para imunização de camundongos e cobaias para a obtenção de

soros precipitantes e aglutinantes....................................................................................

8

Purificação parcial dos anticorpos presentes no soro normal através da precipitação da

fração gama-globulina com sulfato de amônio................................................................

13

Purificação de IgG através de cromatografia de troca iônica.......................................... 17

Reação quantitativa de soroprecipitação.......................................................................... 20

Caracterização da fração gama globulina precipitada por imunoeletrofores................ 24

Imunohemólise - experiência de Erlich Morgenroth Modificada.............................. 28

Técnica de Imunodifusão Dupla em Gel de Agar para Titulação de Soro Anti-Gama

Globulina.....................................................................................................................

31

Reação de Soroaglutinação para Titulação de Anticorpos Anti-Hemácias de

Carneiro.......................................................................................................................

34

Método indireto de ELISA para detecção e titulação de anticorpos de cobaia anti-

gamaglobulina bovina.....................................................................................................

37

Técnicas de SDS-PAGE e de WESTERN-BLOTTING……………………………... 41

Testes Rápidos de Sorodiagnóstico – Testes Imunocromatográficos 43


2


3

INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS DE LABORATÓRIO EM IMUNOLOGIA

São imprescindíveis para o estudo e o desenvolvimento do conhecimento em

Imunologia a experimentação e a manipulação de materiais denominados antígenos, cuja

principal propriedade é a capacidade de induzir respostas imunes (no caso de serem antígenos

completos) e de reagir com os produtos de tais respostas imunes (sejam antígenos completos

ou incompletos/haptenos), particularmente com anticorpos. Os antígenos mais utilizados na

experimentação em Imunologia são provenientes de fontes naturais, como proteínas séricas ou

de ovos de galinha (soro albumina, gama globulina e ovoalbumina, etc.), eritrócitos

(eritrócitos de carneiro, eritrócitos de galinha etc.) e microrganismos (bactérias e vírus). A

maioria desses antígenos naturais possuem muitos sítios antigênicos diferentes, em uma única

molécula; e se forem considerados os antígenos presentes em uma membrana ou parede

celular (eritrócitos e bactérias) há um número muito maior de sítios antigênicos, que fazem

parte da estrutura de cada molécula, a qual faz parte da constituição de tal membrana ou

parede celular. Os exercícios apresentados a seguir descrevem o preparo de dois tipos básicos

de preparações antigênicas: um de natureza macromolecular solúvel (soro albumina bovina) e

o outro de natureza particulada (eritrócitos de carneiro). Deve ser salientado que esses dois

tipos de antígenos representam dois grupos importantes (um de natureza solúvel e o outro de

natureza particulada) e para efeito de estudo e experimentação se constituem em ótimos

modelos de trabalho, substituindo muito bem preparações antigênicas de microrganismos que

podem oferecer riscos quando são manipulados por indivíduos não experientes.

Principais preparações antigênicas usadas em atividades experimentais em

imunologia:

Antígenos particulados: apresentam dimensão de uma célula e, ao se adicionar

um diluente apropriado, forma-se uma suspensão. Ex: bactérias e células eucariontes, como

hemácias (carneiro, galinha).

Antígenos solúveis: apresentam dimensão de macro-molécula e, ao se

adicionar um diluente apropriado, forma-se uma solução. Ex: proteínas (ovoalbumina,

gamaglobulina) e polissacarídeos.


4

Tipos de diluentes

Solução salina (NaCl 0,15 M)

PBS ou Tampão Fosfato Bicarbonato

01. Preparo de suspensão de hemácias de carneiro a 2%: (Antígeno Particulado

Indutor de Anticorpos Soroaglutinantes).

Os eritrócitos de uma dada espécie animal revelam propriedades antigênicas marcantes

quando são injetados em animais de uma outra espécie. Os anticorpos anti-eritrocitários são

induzidos diretamente contra determinantes antigênicos presentes nas membranas dessas

células. Essas membranas celulares se constituem, por sua vez, de misturas complexas de

proteínas fibrosas, lipídeos e mucopolissacarídeos, sendo que os lipídeos são ligados mais ou

menos firmemente a algumas dessas proteínas. As variações na estrutura molecular das

proteínas, lipídeos e carboidratos nas membranas celulares dos eritrócitos de diferentes

espécies animais e mesmo entre indivíduos de uma mesma espécie são os principais

responsáveis pelo amplo espectro de determinantes antigênicos diferentes que essas células

apresentam.

Além de serem usados como antígenos particulados para a produção e titulação de

anticorpos específicos aglutinantes, os eritrócitos podem ser empregados na montagem da

técnica de hemaglutinação passiva condicionada e para a detecção de anticorpos contra

antígenos solúveis que, nesse caso, são ligados à superfície de eritrócitos.

As suspensões de eritrócitos podem ser padronizadas volumetricamente e

espectrofotometricamente. A primeira técnica é suficiente para se prepararem suspensões de

hemácias para serem usadas na imunização de animais, mas a técnica de padronização

espectrofotométrica é necessária para preparar suspensões de hemácias que são empregadas

em reações de imuno-hemólise, ou na detecção/titulação de anticorpos hemolíticos, isto é,

fixadores do complemento. Em virtude de sua grande sensibilidade a mudanças do ambiente

físico e químico, os eritrócitos recém-colhidos devem ser manipulados com muito cuidado e

as suspensões preparadas para serem usadas nas titulações de anticorpos não devem ser

armazenadas por mais de um dia, em temperatura de geladeira.

1.- Materiais e Métodos:


5

1.1. Sangue de carneiro colhido em solução anti-coagulante de Alsever1 (v : v)

(Figura01)

1.2. Filtrar em Algodão hidrófilo.

1.3. Centrifugar a 2500 rpm/4 minutos.

1.4. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 15 volumes de solução

salina 0,l5M. (Figura 02)

1.5. Centrifugar a 2500 rpm/4 minutos.

1.6. Repetir os ítens l.4. e l.5. mais uma vez.

1.7. Preparar a suspensão de hemácias a 2% em solução salina(v:v), aferição e

padronização volumétrica.

1.8. Para aferição ou padronização espectrofotométrica de uma suspensão de

eritrócitos a 1%, proceder como no protocolo abaixo descrito:

1.8.1. Pipete 4 ml de água destilada em 1 tubo e adicione 1 ml de uma suspensão de

eritrócitos a 2%. Misture bem para promover a lise, invertendo o tubo, previamente coberto

com papel filme sobre o polegar.

1.8.2. Leia a densidade óptica (DO) da solução de lisado de eritrócitos contra um

branco de água destilada, no espectrofotômetro, e no comprimento de onda de 550 nm. A

seguir, aplique a fórmula abaixo: Vf = Vi x DO / 0,300 e Vf - Vi = Volume de diluente que

deve ser acrescentado para proporcionar uma suspensão de eritrócitos de carneiro com

concentração padronizada de 1%.

Figura 01

1 Tipos de soluções anti-coagulantes: solução de Alsever (citrato de sódio + glicose + NaCl + ácido cítrico),

oxalato, EDTA, heparina.

Sangue

+

Anti- Coagulante

Após passos 1.2

e 1.3

Sobrenadante

Salina

4ml


6

02. Preparo de solução de soroalbumina bovina a l,0% e 5%, considerando que você

vai usar um volume de 5ml para inocular os animais

(Exercício teórico) (Antígeno Solúvel Indutores de Anticorpos Soroneutralizantes)

03. Técnica de diluições seriadas:

3.1. Séries com razão constante e diluições sucessivas. Nesta técnica, transferem-se

volumes sucessivamente de um tubo para outro seguinte, ao qual se adicionou quantidade

adequada de diluente.

Exemplo 1. Diluições sucessivas com razão constante igual a 2 (figura 03)

1) Distribuir numa série de tubos com l ml de diluente.

2) Ao tubo l adicionar l ml do material.

3) Transferir l ml do tubo l para o tubo 2.

Figura 02

4) Transferir l ml do tubo 2 para o tubo 3.

5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série.

As diluições obtidas serão: l:2; l:4; l:8; l:l6; l:32;l:64

Exemplo 2. Diluições sucessivas com razão constante igual a l0 (figura 04)

1) Distribuir 9ml de diluente numa série de tubos.

2) Ao tubo 1 adicionar 1 ml do material não diluído.

3) Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2.

1/2

2 3 4 5

1ml 1ml 1ml 1ml

1/4 1/8 1/16 1/32 1/64

6 1

1ml

Material

1ml

1ml de

salina em

todos


7

4) Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3.

5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série.

As diluições obtidas serão: 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10.000; e 1:100.000.

Figura 03

Problemas:

1. Como você faz para diluir um soro a 1/50;1/100;1/200;1/400 e 1/800?

2. Como você procede para diluir um vírus de 10-3

a 10-8

?

Perguntas:

1. Qual o procedimento geral para se preparar uma suspensão antigênica bacteriana a

5%?

2. Como se faz para preparar uma solução antigênica de gamaglobulina bovina a 0,1%,

num volume final de 5ml?

3. Qual das preparações antigênicas acima (exercícios 1 e 2) será usada para a

obtenção de soros:

a) Precipitantes b) Aglutinantes

4. Qual(is) a(s) principal(is) finalidade(s) de se fazer uma escala de diluições seriadas?

5. O que são:

a) Solução anti-coagulante de Alsever

b) Solução salina d) Soro

c) Plasma e) Solução salina tamponanda

1/10

2 3 4 5 1ml 1ml 1ml 1ml

1/100 1/1.000 1/10.000 1/100.000

1

1ml

Material

Assunto 01- figura 03


8

PREPARO DE ANTÍGENOS PARA IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS

E COBAIAS PARA A OBTENÇÃO DE SOROS PRECIPITANTES E

AGLUTINANTES

ESTUDAR AS BASES DA IMUNOLOGIA

ESTUDAR MODELOS DE FENÔMENOS IMUNOLÓGICOS

Antígeno + Estímulo do Sistema Imune = Resposta Imune (Resposta Imune

Humoral e/ou Resposta Imune Celular)

Características fundamentais das respostas imunes:

Reconhecimento

Especificidade

Memória

I - PREPARO DE SOLUÇÃO DE GAMA GLOBULINA BOVINA

1. Preparar uma solução de Gama Globulina Bovina (GGB) a 2 ml/ml. (figura01)

2. Após a dissolução misturar 1ml da solução de GGB com 1ml de adjuvante completo

de Freund (ACF) ou com 1ml de adjuvante incompleto de Freund (AIF).(figura 02)

3. Misturar a solução de GGB com a de hidróxido de alumínio a 2,5% na proporção de

7 volumes da primeira para 3 volumes da segunda.(figura 03)

4. Imunizar a cada 15 dias durante 30 dias as cobaias, sendo cada grupo para um

adjuvante diferente. Imunizar um grupo só com a solução de antígeno sem adjuvante. A via de

injeção é subcutânea, devendo-se inocular 0,5ml por animal.

5. Sangrar os animais 2 semanas após o início e, ao final, l semana após a

reimunização. Separar os soros, nos 2 casos e fazer a titulação deles por imunodifusão dupla

em gel de ágar.


9

5ml da solução

1ml de ACF ou 1ml deAIF

7 volumes de GGB 3 volumes de Hidróxido

de sódio

Figura 04

GGB a 2mg/ml


10

II - PREPARO DE SUSPENSÃO ANTIGÊNICA DE ERITRÓCITOS DE

CARNEIRO

1. O sangue é retirado previamente com anticoagulante (solução de alsever) de um

carneiro, conforme o descrito no roteiro anterior. (figura 04)

2. Passar o sangue colhido por um funil com algodão hidrófilo.

3. Recolher o sangue filtrado e centrifugá-lo a baixa rotação por 5 minutos.

4. Dispensar o sobrenadante com pipeta pasteur ou com trompa de vácuo.

5. Colocar cerca de l0ml de salina, homogeneizar e centrifugar novamente, para lavar

as hemácias.

6. Repetir os ítens (4) e (5) mais 2 vezes, ou até quando o sobrenadante estiver claro.

7. Preparar a suspensão de hemácias a l0% (v/v) em solução salina. Homogeneizar

bem.

8. Injetar 3 grupos de camundongos de 5 camundongos cada, por via subcutânea

(0,1ml/animal). Em 5 camundongos injetar hemácias de carneiro com adjuvante completo de

Freund, em outros 5 camundongos injetar a mistura de hemácias de carneiro mais adjuvante

incompleto de Freund e nos outros 5 camundongos restantes injetar a suspensão de hemácias

sem adjuvante. (figura 05)

9. Repetir as imunizações depois de l5 dias, e sangrar 20 dias depois da última

imunização. (figura 06)

Figura 05

Hemácias Hemácias Hemácias

+ + sem Adjuvante

ACF Grupo 1 AIF Grupo 2 Grupo 3

Figura 06

Sangue

+

Anti- Coagulante


11

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

0,1 ml 0,1 ml 0,1ml

Figura 07

Espera-se que ocorra:

Antígeno Sistema Imunológico Respostas Imunológicas

Estímulo

Figura 08

Inoculados

Organismos

Macrófagos ou Células

dendríticas

Fragmentos

Peptídicos Lisossoma

Antígeno

MHC II + Fragmentos

Peptídicos

B T

Fragmentos

Peptídicos

Lisossoma

Estímulo Secundário

1ª Etapa

2ª Etapa


12

Principais fatores que interferem na imunogenicidade dos Ags:

Peso molecular

Complexidade molecular

Concentração

Digestibilidade

Adjuvantes

São imunomodeladores, ou seja, substâncias capazes de potenciar, inespecificamente,

as respostas imunes contra os antígenos.

Tipos:

Minerais – Ex: Al(OH)3, óleo mineral/emulsionante (Adjuvante Incompleto de

Freund – AIF)

Orgânicos – Ex: Saponina, óleos vegetais e lecitina de soja

Produtos derivados de microrganismos – Ex: bactérias (Mycobacterium spp.;

Propyonabacterium acnes; bactérias gram negativas - LPS), fungos (Sacharomyces cerevisae

- Glucana)

OBS: O Adjuvante Completo de Freund (ACF) é composto de óleo mineral +

emulsionante + Mycobacterium spp.

Efeitos principais dos Adjuvantes:

Efeito depósito

Aumentar resposta inflamatória no local da inoculação

Ativação de células imunocompetentes ou apresentadoras de antígenos

PERGUNTAS

1. Em quais formas principais podem-se apresentar os antígenos e qual a natureza

química deles?

2. O que são adjuvantes, quais as principais formas e para que eles são usados?

3. Quais as principais vias de administração de um antígeno no organismo normal?

4. Por que são feitas várias inoculações de um antígeno, durante o processo de

imunização?

5. Após o término da imunização, qual a modalidade de Resposta Imune que será

avaliada?


13

PURIFICAÇÃO PARCIAL DOS ANTICORPOS PRESENTES NO SORO

NORMAL ATRAVÉS DA PRECIPITAÇÃO DA FRAÇÃO

GAMA-GLOBULINA COM SULFATO DE AMÔNIO.

1. INTRODUÇÃO - GENERALIDADES

Para estudar a estrutura dos Acs é necessário purificá-los previamente. Tal purificação

é de grande interesse prático, pois diminui consideravelmente as reações produzidas pelos

soros quando eles são utilizados com finalidades profilática ou terapêutica.

Os métodos usados para purificação dos Acs se filiam a duas modalidades: métodos

não específicos e específicos. Os primeiros se baseiam em técnicas de fracionamento físico ou

físico-químico e não permitem separar as gamaglobulinas normais dos Acs. Os métodos

específicos, por outro lado, baseiam-se na dissociação ou eluição dos imunocomplexos e

permitem obter os Acs em alto grau de pureza, livres de imunoglobulinas (Igs) inespecíficas.

São os métodos de escolha para estudos experimentais, porém, não podem ser aplicados aos

soros terapêuticos em virtude de baixo rendimento inerente ao processo de purificação.

O método de precipitação com sais neutros ("Salting-out") é de uso corrente e utiliza,

sobretudo, o sulfato de amônio e o sulfato de sódio.

De modo geral, quando se deseja precipitar todas as globulinas de um soro sanguíneo,

adiciona-se sulfato de amônio a 50% de saturação ou sulfato de sódio a 22% de saturação (a

37ºC) permanecendo solúvel apenas a fração albumina. Outra maneira é precipitar as frações

Gama e Beta globulina que contêm praticamente a maior parte das proteínas com função de

Acs com sulfato de amônio a 40% de saturação ou com sulfato de sódio a l9% de saturação (a

37ºC).

No nosso caso, será utilizado o método de precipitação das frações gama e beta

globulina com sulfato de amônio a 40% de saturação.


14

2. MATERIAL

- 5ml de soro sanguíneo

- 5ml solução salina tamponada com fosfatos (PBS)

- solução de sulfato de amônio a l00% de saturação

- becker de 50ml

- pipeta de lml, 2ml, 5ml, l0ml

- tubos cônicos plásticos de centrífugas

- bastões de vidro pequenos e grandes

- provetas de 25, 50ml e 1000ml

- saco de diálise, cordonê

- becker de 2 litros

- pipeta pasteur e tetina

- erlenmeyer de 125 e 250 ml

Figura 09

3. MÉTODOLOGIA

3.1. Juntar 5ml de soro com 5ml de P.B.S.

3.2. Calcular o volume de sulfato de amônio a l00% de saturação que deverá ser

acrescentado a mistura de soro mais P.B.S. no volume final de l0ml; volume de sulfato de

amônio a l00% de saturação onde:

V - volume final de soro + PBS

C - A saturação do sulfato de amônio desejado (40%)

V x C

X = -------

l00-C

10ml de

solução


15

3.3. Sob agitação cuidadosa, acrescentar gota a gota o volume calculado do sulfato de

amônio a l00% de saturação, para dar uma saturação final de 40%.

Figura 10

3.4. Continuar agitando por mais 30 minutos.

3.5. Transferir o volume para os tubos de centrífuga e levar a centrífuga a 3000rpm

por l5 minutos.

Figura 11

3.6. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com solução de sulfato de amônio a

42% de saturação, isto é deve-se centrifugar e descartar o sobrenadante, ressuspender com

cuidado o sedimento na solução de sulfato de amônio a 42% de saturação.

Obs.: Cálculo da solução do sulfato de amônio a 42% de saturação:

X = V x C X = Vol. de sulfato de amônio a 100% de saturação

100 - C

X = 30 x 42 V = Vol. desejado da solução (30 mL)

100 – 42

C = Saturação final do sulfato de amônio (42% de saturação)

X = 21,72 mL de sulfato de amônio a 100% de saturação + 30 mL de água destilada

Soro + PBS

Proteínas solúveis

Proteína

O

H H

Proteína /

Globulinas

Camada de Solvatação

+ Sulfato de Amônio

Precipitação das Globulinas

Remoção da Camada de Solvatação


16

Figura 12

3.7. Após a última lavagem, descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em

1 mL de PBS com cuidado e com o uso de pipeta Pasteur.

3.8. O sedimento ressuspenso deve ser colocado dentro do saco de diálise, esse deve

ser fechado e se coloca para dialisar contra salina. Deixa-se dialisar por 2 dias a 4ºC, com

duas trocas de líquido de diálise ao dia.

4. Retira-se a fração precipitada do saco de diálise e guarda-se em congelador a -20ºC

para ser testada por imunodifusão.

PERGUNTAS

1) O que são imunoglobulinas e quais as suas principais propriedades físico-químicas

e biológicas?

2) Qual o objetivo de se purificar anticorpos?

3) Como atua o sulfato de amônio sobre moléculas de imunoglobulinas e por que é

importante se conhecer o grau de saturação sulfato de amônio para fazer a separação das

imunoglobulinas?

4) O que é diálise, e por que esse processo é empregado nesse caso?


17

PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA

IÔNICA

1.- INTRODUÇÃO E GENERALIDADES

São reconhecidos, no mínimo, dois métodos diferentes que podem ser usados,

separadamente ou combinados, para se obter uma preparação de IgG ou de IgM com grau de

elevada pureza. Um desses métodos é a cromatografia de troca iônica e o outro é a filtração

em gel. A cromatografia de troca iônica é um dos métodos mais conhecidos para se fazer a

separação de proteínas séricas e o isolamento de imunoglobulinas. Esse método se

fundamenta no fato de as proteínas apresentarem cargas elétricas e poderem se ligar

eletrostaticamente na matriz de troca iônica, a qual possui uma carga oposta à das proteínas. A

força de interação com que as proteínas se ligam a esse tipo de matriz de troca iônica depende

da densidade de cargas elétricas da proteína bem como do pH e da força iônica do meio onde

a proteína se encontra. Dessa forma, para se eluir (“desligar”) as proteínas adsorvidas

eletrostaticamente a esse tipo de matriz, deve-se aumentar a força iônica do meio,

aumentando-se a concentração dos sais do tampão de eluição, uma vez que os sais

adicionados vão competir com as proteínas pelos sítios carregados dessa mesma matriz. Outra

forma de se promover a eluição é alterar o pH do tampão de eluição, pois, à medida em que o

pH do meio onde se encontra a proteína se aproxima do ponto isoelétrico dessa mesma

proteína, a somatória da carga elétrica da mesma se aproxima de zero, de forma que essa

proteína perde a capacidade de continuar ligada à matriz de troca iônica.

Há dois tipos básicos de matrizes de troca iônica: uma delas é recomendada para a

interação com proteínas carregadas positivamente, sendo a matriz trocadora de cátions, como

é o caso do carboxi-metil-celulose (CM-celulose), enquanto que o outro tipo é recomendado

para a interação com proteínas carregada negativamente, sendo a matriz trocadora de ânions,

como o dietil-amino-etil-celulose (DEAE-celulose). No caso de se fazer a separação de IgG, a

resina ou matriz recomendada é DEAE-celulose.

O método mais indicado para se conseguir um melhor grau de pureza e de rendimento

da fração IgG é se fazer primeiramente a precipitação da fração gama-globulina de um soro

sanguíneo com sulfato de amônio ou sulfato de sódio, tal como foi feito na aula anterior. Essa

fração gama globulina depois de dialisada para se eliminar o excesso de sais usados na

precipitação, depois de ter a sua concentração protéica determinada, é colocada em uma

coluna previamente montada de DEAE – celulose.


18

2.- Método para preparação da coluna deDEAE–celulose para a separação de Ig G

2.1.- Materiais

2.1.1- DEAE – celulose previamente embebido e carregado por tratamento com

soluções de ácido (HCl) em seguida álcali (NaOH).

2.1.2- Fração gamaglobulina previamente precipitada com sulfato de amônio e

dialisada com o mesmo tampão de eluição a ser usado na coluna de DEAE – celulose. A

concentração protéica dessa coluna deve ser previamente determinada.

2.1.3.- Coluna cromatográfica pequena (seringa de 10ml) já montada e preparada para

ser preenchida com DEAE-celulose e acompanhada de cânulas de pequenas pinças para

regulagem do fluxo da coluna.

2.1.4.- Tampão fosfato 0,01M pH 8,0.

2.1.5.- Frascos pequenos de coleta (frascos do tipo penicilina), rotulados com a

numeração de 1 a .

2.2.- Método

2.2.1.- Deixe o volume de tampão imediatamente acima da coluna abaixar abrindo

cuidadosamente a coluna, e aproveite para regular o fluxo da coluna para 12 gotas por minuto.

Quando não houver mais tampão acima da resina e com a coluna fechada, deve ser adicionada

a solução de gama globulina, com muito cuidado e com o auxílio da micropipeta. Em seguida,

abrir vagarosamente a coluna para deixar o solução de gama globulina entrar na resina,

fechando a coluna quando isso ocorrer. Adicionar, a seguir, com muito cuidado, um volume

de tampão de eluição. Conectar com o frasco de tampão com cânula e sifonado de modo a

permitir um fluxo continuado de tampão para a coluna de resina. Abrir o fluxo da coluna,

começar a colher as frações de 3 ml cada uma, aferindo o fluxo novamente para 12 gotas por

minuto.

2.2.2.- Faça a leitura das frações colhidas em espectrofotômetro UV, no comprimento

de onda de 280nm, contra um branco de tampão fosfato 0,005M pH 8,0.

2.2.3.- Faça um pool das frações com maior concentração proteíca e armazene a -20ºC

para ser testada na próxima aula, por imunoeletroforese.


19

Figura 13

PERGUNTAS

1.- Qual o fundamento do processo de purificação de IgG por cromatografia de troca

iônica?

2.- A obtenção de IgG em alto grau de pureza poderia contribuir em quais aspectos ou

em que técnicas ?

3.- Que outros métodos são também indicados para a separação de imunoglobulinas

em elevado grau de pureza?

4.- Para a separação de IgG é indicado o uso de coluna cromatográfica trocadora de

ânions (DEAE-celulose). No caso da necessidade de separar uma proteína com cargas opostas

a da IgG, qual resina seria então recomendada?

Gama-Globulina

3ml

12 gotas/min Assunto 04- figura 01


20

REAÇÃO QUANTITATIVA DE SOROPRECIPITAÇÃO

Uma das primeiras observações da interação antígeno-anticorpo (Ag-Ac) é a formação

de precipitados que aparecem em um tubo de reação em meio líquido depois que tais

reagentes tenham-se combinado em determinadas proporções relativas.

A reação quantitativa de soro-precipitação se fundamenta nesse fato. Este teste se

constituiu com base de todos os estudos que foram feitos sobre os fenômenos decorrentes da

interação Ag-Ac.

Nesse tipo de reação, via de regra, quantidades crescentes de Ags são adicionadas a

diferentes tubos de ensaio apropriados contendo uma concentração constante de Ac e, ao

final, são determinadas as concentrações do precipitado Ag-Ac formado em cada tubo da

reação.

Nesse experimento, você determinará:

a-) A concentração de Acs de um soro teste

b-) O número de determinantes antigênicos (sítios que ligam os anticorpos) presentes

em uma molécula de Ag.

Materiais:

Soro de Coelho anti-BSA com um título desconhecido (concentração) - fonte de

Acs.

Soro Albumina Bovina (4mg/ml) - o Ag.

Salina tamponada com fosfatos (PBS) pH 7,2.

NaOH 0,1M.

8 tubos de ensaio para precipitação.

Micropipetadores de volume ajustável de 1000, 100 e 10l.

Banho-Maria

Geladeira

Espectrofotômetro UV e cuvetas de quartzo para UV.

Metodologia:

Marque cada um dos tubos de uma série de 6 com o volume de Ag que será a ele

adicionado.

Adicone os seguintes volumes de Ag em cada tubo: 0, 5, 20, 35, 50, 100l.

Adicione PBS a cada tubo para completar um volume de 300 l.

Adicione 100µl de antissoro a cada tubo e misture bem.


21

Incube por 1h a 37ºC em Banho-Maria e a seguir a 4ºC em geladeira por 1h.

Centrifugue os tubos testes a 4000 (2000g) rpm/10 min.

Remova o sobrenadante e transfira-o para um outro tubo devidamente identificado

como estava o tubo inicial.

Conserve o precipitado (pellet).

Para calcular a concentração de Ac no antissoro:

Lave o precipitado, ressuspendendo-o em PBS e re-centrifugando a 4000 (2000g)

rpm/10 min.

Remova o PBS do sobrenadante e descarte-o.

Ressuspenda o pellet colocando cada um dos tubos em um vórtex.

Adicione 1ml de NaOH 0,1M a cada precipitado e leve para solubilizar no vórtex e

conserve mais 1ml de NaOH 0,1M para servir como branco no espectrofotômetro.

Faça a leitura da absorbância no comprimento de onda de 280nm (A280) em um

espectrofotômetro UV.

Calcule a quantidade de Acs específicos contra BSA/ml de antissoro:

A partir do gráfico, anote a quantidade de antígeno no ponto de equivalência, (o

ponto onde a quantidade máxima de precipitado se forma). Vide o exemplo abaixo:

a) A280 = 0,100 0l de Ag.

b) A280 = 0,370 5l de Ag.

c) A280 = 0,850 20l de Ag.

d) A280 = 1,08 35l de Ag***.

e) A280 = 0,740 50l de Ag.

f) A280 = 0,170 100l de Ag.

Quantidade de Ag usado = 0,035ml (= 35l) x 4 (mg/ml BSA) = 0,140mg.

Transformar essa quantidade de antígeno em A280nm, considerando que 1,9mg/ml

de BSA dá um A280nm = 1,0, então (0,140 x 1)/1,9= 0,073.

Subtraia este valor da A280nm total do precipitado para obter a A280 da concentração

de Ac: A280 / Ac = A280(ppt) - A280(Ag). 1,08 – 0,073 = 1,007

Transformar essa A280nm em quantidade de anticorpo, isto é IgG (mg/ml),

considerando que 0,7 mg de IgG corresponde a uma A280 = 1,0, você pode calcular


22

a concentração de Acs no ponto de equivalência (não se esqueça de levar em conta

todas as diluições que foram feitas):

A280 (Ac) = 1,08 (= A280(pptado.) - 0,073 (=A280(Ag) = 1,007.

1,007 x 0,7 (mg IgG=A280 1,0) = 0,705mg.

100µl de antissoro foram usados em cada tubo, portanto a concentração de

anticorpos no soro original é 0,705 x 10= 7,05mg/ml.

Estimativa do Número de Determinantes Antigênicos na Molécula de Soroalbumina

Bovina:

O número de determinantes antigênicos em cada molécula de Ag pode ser estimado

quando se considera que em uma condição de extremo excesso de anticorpos todo

determinante antigênico vai estar ligado com pelo menos uma molécula individual de Ac. Se a

quantidade de Ac no precipitado formado sob essas circunstâncias é calculada, então os

números relativos de moléculas de Ac e Ag podem ser calculados, isto é:

Em soros hiperimunes a maior parte dos Acs são do isótipo IgG que tem P.M de cerca

de 150.000 D. O Ag, BSA, apresenta um P.M. de 68.000. A relação entre as concentrações

molares de Ac para a molécula de Ag na sua menor concentração de Ag fornecerá uma

estimativa do número de determinantes antigênicos presentes em uma determinada molécula

de Ag.

Portanto há 2 sítios ligantes na molécula de Ag (BSA), considerando um erro

experimental de aproximação de 2,28 para 2.

Concentração de Ag : Concentração de Ac

P.M. Ag P.M. Ac

Concentração de Ag : Concentração de Ac

P.M. Ag P.M. Ac

= 0,14 : 0,705 .

68.000 150.000

2,058 Moles BSA : 4,693 Moles IgG

Razão = 1 : 2,28, ou

aproximadamente 1 : 2


23

PERGUNTAS

1.- Como os Ags e Acs interagem?

2.- Responda verdadeiro (V) ou falso (F):

a) A maioria dos Acs reage com estruturas topográficas que dependem da conformação nativa

da molécula do Ag (epítopos conformacionais) ( )

b) Ags e Acs interagem através de ligações covalentes. ( )

c) Cada determinante antigênico em uma molécula de Ag representa um agrupamento de

epítopos dominantes. ( )

d) As forças de ligação que mantém ligado um Ag a um Ac são inversamente proporcionais à

distância entre essas moléculas. ( )

e) A especificidade do reconhecimento do Ac para o Ag é absoluta. ( )


24

- +

- +

CARACTERIZAÇÃO DA FRAÇÃO GAMA-GLOBULINA PRECIPITADA

POR IMUNOELETROFORESE.

1) REAÇÃO DE DE IMUNOELETROFORESE DE FRAÇÃO PURIFICADA

DE ANTICORPOS

1.1. Introdução e Generalidades

A imunoeletroforese é a combinação de eletroforese e de dupla difusão em gel de ágar;

é uma técnica que permite a discriminação de substâncias com base na carga elétrica, peso

molecular, tamanho, forma, concentração e propriedades antigênicas. O método original de

Grabar e William (l953-54) é feito em gel de ágar, procedendo-se na primeira etapa à

separação eletroforética dos componentes e, a seguir, cada componente se difunde, a partir de

seu centro de difusão, contra o imune-soro, formando, como na dupla imunodifusão, uma

linha ou arco de precipitação.

Somente na eletroforese teríamos:

Posição do soro antes da eletroforese

Posição do soro após a eletroforese

Albumina Alfa Beta Gama

Figura 15

Centro

Gama-

Globulina


25

Assim, este método permite a caracterização de uma substância simultaneamente por 3

parâmetros:

a) Características eletroforéticas (mobilidade em campo elétrico)

b) Velocidade de difusão (coeficiente de Difusão)

c) Especificidade imunoquímica (estrutura e composição dos determinantes

antigênicos).

Este método é atualmente aplicado a todos os ramos da pesquisa biológica, por seu

alto poder resolutivo, bastando mencionar que, enquanto a eletroforese permite a evidenciação

de 5 a 6 componentes no soro sanguíneo, a imunoeletroforese permite distinguir cerca de 30

componentes. Não se trata de maior sensibilidade, mas de maior poder discriminativo.

No micro-método são aplicados 2 a 5ul de soro sanguíneo ou de mistura protéica no

orifício do gel. Ao se passar a corrente elétrica, o soro se separa nos 5 componentes clásicos

da eletroforese de Tiselius: Albumina, Alfa-l, Alfa-2, Beta e Gama-globulinas de acordo com

suas cargas elétricas. Em função de seus coeficientes de difusão e da concentração, cada

componente difunde-se encontrando o Ac que lhe corresponde, forma-se um precipitado em

forma de arco de maior ou menor curvatura dependendo da dispersão dos Ags e cuja

intensidade é função da concentração do Ag e também da relação Ag/Ac.

1.2. Material

a) Solução de Bacto Ágar (Difco) a 1% em tampão Tris-Acetato pH 8,2 e

força iônica = 0,06;

b) Lâminas de Microscopia;

c) Pipetas de 5ml;

d) Micropipetadores e ponteiras para 10ul e 50ul;

e) Molde perfurador para imunoeletroforese;

f) Bomba de vácuo aplicada com kitassato, cânulas e pipetas Pasteur;

g) Placa de Preti com gaze umidecida e suportes para lâminas (Câmara

úmida);

h) Tampão tris-acetato pH 8,2 e força iônica de 0,113;

i) Fonte e cuba para eletroforese;

j) Antissoros anti-proteínas totais séricas de bovinos e de cobaias;

l) Tiras de papel de filtro;

m) "Cotonete" com gaze;


26

1.3. Técnica

a) Fundir o ágar em água fervente;

b) Aplicar com um cotonete sobre a lâmina uma camada de ágar, esperar secar;

c) Colocar, com pipeta, 2ml de ágar sobre as lâminas previamente revestidas com ágar

e tomar cuidado para não formar bolhas nem deformidades, esperar esfriar e solidificar;

d) Com o molde perfurador adequado, fazer os orifícios no gel e, em seguida, retirar os

fragmentos de ágar com a trompa de vácuo; (figura 03)

e) Cortar tiras de papel de filtro da largura da lâmina para fazer a ponte entre o tampão

e as lâminas;

f) Montar dentro da cuba, previamente preenchida com tampão, as lâminas, fazendo as

pontes entre os polos de cuba com tiras de filtro;

g) Aplicar em cada cavidade do ágar de 5 a 10ul da amostra a ser submetida à

eletroforese;

h) Fechar a cuba, ligar a fonte e regular a corrente para 6ml/lâmina, o que dá cerca de

50v/lâmina. Deixar a corrida prosseguir por 2h; (figura 04)

i) Desligar a fonte e retirar as lâminas. Em seguida, remover, com o auxílio da tampa

de vácuo, a canaleta de gel e adicionar dentro da canaleta o antissoro específico;

j) Levar as lâminas, com cuidado, para a câmara úmida e fazer a leitura 24-48 horas

depois;

Figura 16

IgG Bovina

Soro Total

Bovino


27

Albumina alfa beta Gama

Figura 17

PERGUNTAS

1) Como podemos identificar imunologicamente a fração gama-globulina precipitada

e da IgG purificada por cromatografia de troca iônica?

2) Quais os princípios da prova de imunodifusão dupla em gel de ágar e qual a sua

utilidade dentro da imunologia e, nesse caso, em particular?

3) Quais os princípios da prova de imunoeletroforese e qual a sua principal utilidade

dentro da imunologia e, nesse caso, em particular?

4) Qual dessas 2 técnicas (Imunodifusão dupla em gel de ágar e Imunoeletroforese)

fornece respostas mais completas e esclarecedoras, a respeito das características

imunoquímicas de uma mistura antigênica?

V

+ -

Fonte de Energia

Tampão

de Corrida

Papel

IgG Bovina Soro Total

Bovino

Soro anti

soro bovino

IgG

Assunto 05- figura 04


28

IMUNOHEMÓLISE - Experiência de Erlich Morgenroth Modificada

I. OBJETIVOS

Demonstrar os elementos que participam da reação de imunohemólise de hemácias de

carneiro: (figura 01)

(Ag) Antígeno - Hemácias de carneiro (E)

(Ac) Anticorpos - Hemolisina de coelho anti-E

(C) Complemento - Soro normal de cobaia

Figura 18

II. MATERIAL

l) Estante para tubo de hemólise (l2x75mm)

2) 3 tubos de ensaio l2x75mm

3) 4 pipetas de lml com graduação centesimal

4) Suspensão de hemácias de carneiro a 5%

5) Hemolisina (já diluída)

6) Complemento (soro normal de cobaio) já titulado

7) Solução fisiológica

III. TÉCNICA

l) Numerar os tubos l, 2 e 3

2) Pipetar 0,lml de suspensões de hemácias nos 3 tubos

3) Pipetar 0,lml de hemolisina nos tubos l e 2

4) Pipetar 0,5ml de complemento nos tubos l e 3

5) Pipetar solução fisiológica: (figura 02)

C

Ac

Ag


29

- 0,8ml no tubo l

- l,3ml no tubo 2

- 0,9ml no tubo 3

6) Incubar em B.M. a 37ºC por 30 minutos

1 2 3

Figura 19

IV - RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO

Uma vez realizada a leitura da experiência procedente, prosseguir do seguinte modo:

(figura 03)

7) Centrifugar os tubos 2 e 3

8) Abandonar o sobrenadante do tubo 2

9) Decantar o sobrenadante do tubo 3 sobre as hemácias do tubo 2 e agitar este tubo

para ressuspender as hemácias

10) Sobre o sedimento do tubo 3, colocar hemolisina (0,lml) e solução salina (l,3ml).

Agitar para ressuspender as hemácias

11) Incubar os tubos 2 e 3 em B.M. a 37ºC por 30 minutos (figura 04)

Solução Tampão

Complemento

Hemolisina

Hemácia

s

0,5ml

0,8ml

0,1ml

0,1ml

1,3ml

0,1ml

0,1ml

0,5ml

0,9ml

0,1ml


30

Figura 20 Tubo 1 Figura 21 Tubo 2

Figura 22 Tubo 3

V. RESULTADOS FINAIS E INTERPRETAÇÃO

2 3

Tubo 2 Tubo 3

Figura 23

PERGUNTAS

1) Quais os elementos que participam de uma reação de imunohemólise e qual o papel

de cada um deles nessa reação?

2) O que é Sistema Complemento?

3) Em que circunstâncias o Sistema Complemento é ativado na ausência de

anticorpos?

4) Explique o que ocorreria com a reação de imunohemólise se o soro normal de

cobaia tivesse sido incubado por 30 min a 56ºC?


31

TÉCNICA DE IMUNODIFUSÃO DUPLA EM GEL DE AGAR PARA

TITULAÇÃO DE SORO ANTI GAMA-GLOBULINA

Imunodifusão: Termo utilizado para designar testes sorológicos realizados em meio

gelificado, no qual os reagentes só se misturam por difusão.

Este teste foi introduzido para substituir o teste de precipitação em meio líquido, que

tem alguns inconvenientes, por um teste de difusão e precipitação em gel de ágar que tem

algumas vantagens.

- Difusão simples em uma dimensão - Oudin

- Difusão dupla em duas dimensões - Ouchterlony

Dupla difusão em gel de ágar: Reação de precipitação entre o Ag e o Ac específico

em meio gelificado, onde ambos os reagentes se difundem um contra o outro, formando uma

linha ou arco de precipitação (figura 01) na área de reação.

Essa técnica permite avaliar com relativa facilidade os "componentes antigênicos"

encontrados em misturas complexas. Permite também revelar se duas ou mais substâncias são

imunologicamente idênticas ou independentes.

Essa prova geralmente é feita sobre lâminas de microscopia ou placas de Petri,

revestida com uma camada de gel de ágar em solução fisiológica ou tamponada. Vários

fatores influem na velocidade da difusão, entre as quais, o tamanho dos poros de gel, a

temperatura, a concentração e pureza do ágar e, os mais importantes, as concentrações das

substâncias reagentes e o tamanho e forma molecular dos reagentes.

Figura 26

Material


32

1) Solução de ágar a l% em solução fisiológica

2) Lâmina de microscopia

3) Pipeta graduada de 5ml

4) Micropipetadores de 10 e 20 ul

5) Solução do Ag (Gama Globulina a lmg de proteína por/ml)

6) Soros de cobaios imunizados com Gama Globulina e adjuvante completo de Freund

ou com adjuvante incompleto de Freund ou com Al(OH)3 mais saponina e com Al(OH)3

contendo, portanto, Acs anti-Gama Globulina.

7) Molde perfurador de ágar

8) Placas de Petri com algodão umidecido (Câmara úmida)

9) l5 tubos de hemólise e estantes

10) Pipetas de lml

11) Solução salina

Metodologia:

1) Fundir o ágar em banho-maria de água fervente;

2) Aplicar com cotonete sobre a lâmina uma camada de ágar. Esperar secar;

3) Colocar, com a pipeta, 3ml de ágar sobre as lâminas previamenrte revestidas com

cuidado para não formar bolhas, nem deformidades. Esperar esfriar e solidificar. Manter as

lâminas em câmara úmida para não dessecar o gel;

4) Com o molde perfurador adequado, fazer os orifícios no gel e, em seguida, retirar os

fragmentos de ágar com uma agulha hipodérmica. Manter a lâmina em câmara úmida para

evitar o dessecamento do gel;

5) Diluir os soros de cobaio anti-gama globulina a l/2, l/4, l/8, l/l6 e l/32, distribuindo

em cada um dos 5 tubos 0,5ml de solução salina e, depois, no lº tubo colocar 0,5ml de soro.

Homogeneizar bem e passar 0,5ml para o 2º tubo e assim sucessivamente até o último tubo;

6) Aplicar, usando um micropipetador, 10 ul para cada amostra, Ag, gama globulina

(lmg/ml), as diluições do soro de cobaio anti-gama globulina de acordo com o seguinte

esquema (figura 02):


33

0,5ml salina 0,5 ml salina 0,5ml salina 0,5ml salina 0,5ml salina

0,5ml soro

Figura 27

No centro, colocar o Ag (Solução de gamaglobulina na concentração de 1mg/ml), nos

poços numerados e periféricos, colocar o soro: no nº lº - soro puro, nº 2 - soro diluído 1/2, no 3

- diluído1/4, nº 4 – diluído 1/8, no5 – diluído 1/16 e no n

o 6 – diluído 1/32. (figura 02)

7) Colocar a lâmina dentro de uma placa de Petri com um algodão molhado dentro

para manter a umidade;

8) Fazer a leitura após 24-48 horas, anotando até que diluição houve reação.

PERGUNTAS

1) Que tipos de antígenos são revelados pela reação de soroprecipitação?

2) Qual o mecanismo da reação de soroprecipitação?

3) Quais as utilidades do emprego da reação de imunodifusão dupla em gel de Agar,

em medicina veterinária?

4) Como se faz para titular anticorpos de um soro precipitante?

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32

0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml

1/2

1/4 1/8

1/16

1/32 Soro puro

Ag


34

REAÇÃO DE SOROAGLUTINAÇÃO PARA TITULAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-

HEMÁCIAS DE CARNEIRO

As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno é

constituído por suspensão homogênea de células. Estas células podem ser bactérias, hemácias

etc, que normalmente são vistas no microscópio, mas quando aglutinadas, elas formam flocos

ou flóculos que são aglomerados visíveis a olho nu. Um dos requisitos essenciais para se

proceder a reação de aglutinação é que se possua uma suspensão celular estável. É óbvio,

também, que tal reação se verifica somente com antígenos que estão situados na superfície

celular.

Características dos antígenos e anticorpos envolvidos na reação de soroaglutinação:

Antígenos aglutinantes – de natureza particulada (insolúveis), como células

procariotas e eucariotas.

Devem ser, no mínimo, bivalentes.

Características dos anticorpos envolvidos na reação de soroaglutinação:

Depende da classe isotípica – Ig M tem maior atividade aglutinante, enquanto

que a Ig G tem menor atividade.

Anticorpos devem ser, no mínimo, bivalentes quanto à capacidade de se ligar

aos antígenos específicos.

Explicação do fenômeno da aglutinação:

Duas explicações são mais correntemente aventadas:

1) Revestimento da superfície do antígeno pelo anticorpo o que transformaria a

suspensão celular de hidrófila em hidrófoba e daí a aglutinação. (figura 01)

Figura 29

Antígenos

particulados

hidrófilos

Perda da camada

de solvatação

Hidrófobo Agregação - Aglutinação


35

2) Teoria "das malhas" da qual os aglomerados seriam constituídos de células ligadas entre si

pelos anticorpos. (figura 02)

Excesso de Anticorpos Excesso de Antígenos

Zona de Equivalência

Figura 30

Técnicas das reações de aglutinação:

As reações de aglutinação podem ser executadas sobre lâminas de microscopia ou

placas de vidro, em tubos de ensaio e em microplacas. Elas podem ser:

1) Reações qualitativas.

2) Reações quantitativas.

Na aula prática, os alunos terão uma demonstração sobre reação de aglutinação

quantitativa feita em placas (micrométodo) usando soros anti-hemácias de carneiro e

suspensão antigênica de hemácias de carneiro.

Material necessário:

1) Microplacas plásticas para hemaglutinação.

2) Soros de camundongos (imunização feita em aula prática pelos grupos 2, 6, 3 e 7).

3) Suspensão de hemácias de carneiro a 1%.

4) Solução salina (0,l5M).

5) Micropipetadores de 25 ul


36

Técnica da Reação:

1) Adicionar um volume de 25ul de diluente (PBS) em todas as cavidades das fileiras

A e B da microplaca (0,025ml).

2) Colocar na primeira cavidade da fileira A1 e B1 25ul (0,025ml) do soro positivo de

camundongos

3) Com uma micropipeta de 25ul , começar a homogeneizar a primeira cavidade da

fileira A, contendo o soro e, sem tocar na superfície ou na borda da placa, transferir 25ul para

a segunda cavidade da fileira A2. Novamente homogeneizar bem e, com os mesmos cuidados,

transferir 25ul para a terceira cavidade e assim sucessivamente até a 11ª cavidade (A11), pois

para a última não será transferida nenhum volume da diluição dos soros e esta cavidade

servirá como controle da suspensão antigênica de hemácias. No final, portanto, teremos as

seguintes diluições dos soros: l/2, l/4, l/8, l/l6, l/32, l/64, l/l28, l/256, l/5l2, l/l024, l/2048.

4) Repetir a mesma operação para a fileira B.

5) Colocar em todas as cavidades das duas fileiras 25ul (0,025ml) da suspensão de

hemácias de carneiro.

6) Agitar com cuidado a placa e incubar por 40-60 minutos à temperatura ambiente.

7) Fazer a leitura da reação e, comparando os resultados dos soros e fazer a

interpretação dos resultados.

Figura 31

PERGUNTAS

1) Quais os mecanismos da reação de soroaglutinação?

2) Que tipos de antígenos participam da reação de soroaglutinação?

3) Qual(is) a(s) utilidade(s) da reação de soroaglutinação, no sorodiagnóstico em

medicina veterinária?

4) Como se procede para titular anticorpos de um soro aglutinante?

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

Controle


37

MÉTODO INDIRETO DE ELISA PARA DETECÇÃO E TITULAÇÃO DE

ANTICORPOS DE COBAIA ANTI-GAMAGLOBULINA BOVINA

Trata-se de um método extensivamente usado para detecção e/ou titulação de

anticorpos específicos presentes em soros sangüíneos. A especificidade desse ensaio

imunoenzimático é direcionada pelo antígeno presente na fase sólida (superfície da

microplaca), o qual pode ser uma preparação altamente purificada, ou então preparações

semi-purificadas, ou até mesmo brutas. Após adição e incubação do antígeno (Ag), as

cavidades da microplaca serão lavadas para eliminar o excesso e os antígenos não ligados à

superfície dessas mesmas cavidades. Os soros contendo os anticorpos contra esse Ag podem

ser então adicionados, diluindo-os em tampão apropriado que impeça a ligação não específica

dos anticorpos a sítios livres presentes na superfície da microplaca, os quais não foram

ocupados pelas molécula de Ag. Os soros podem ser adicionados com diluição única, ou com

diluição seriada. Após incubação das diluições séricas, as cavidades devem ser novamente

lavadas para se eliminar o excesso de anticorpos não ligados.

Os anticorpos combinados ao Ag são então detectados após incubação com o

conjugado imunoenzimático anti-imunoglobulinas ou anti-Ig G da espécie cujos anticorpos se

pretende titular. O conjugado deve ser diluído no mesmo tampão em que foram diluídos os

soros. Após incubação e lavagem das cavidades da microplaca, é adicionada às cavidades uma

solução de substrato imunoenzimático (água oxigenada) e cromógeno (orto-fenilenodiamina),

incubando-se a reação para desenvolvimento de cor e, ao final, depois de bloqueada a reação

enzimática, devem ser lidas as densidades ópticas (DOs),em leitor de microplacas no

comprimento de onda de 490nm.

O esquema básico do método indireto do Elisa é o seguinte:

Ag + Ac (?) + conjugado I.E. + S leitura de Dos

Ag – preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina

Ac – soros-teste de cobaia

Conjugado I. E. – conjugado de Ig G de coelho anti-Ig G de cobaia com peroxidase

S – substrato

Observar esquema abaixo (figura 01):


38

Antígeno Soro Antiglobulina Substrato Reação

Marcada com enzimático de cor

enzima

Lavagem Lavagem Lavagem

Figura 34

Material

Preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina

Soros-teste de cobaias imunizadas anteriormente com antígeno citado +

adjuvantes distintos (ACF – Adjuvante Completo de Freund; AIF – Adjuvante Incompleto de

Freund; Al(OH)3 – Hidróxido de alumínio)

Conjugado de Ig G de coelho anti-Ig G de cobaia com peroxidase (enzima)

Peróxido de hidrogênio (H2O2 – água oxigenada) a 3% (substrato)

Orto-Fenileno-Diamina – OPD (cromógeno)

Microplacas para Elisa

Tampão Carbonato-Bicarbonato pH 9,6 a 0,05M

Tampão PBS pH 7,4

Tampão PBST pH 7,4 + 10% de LPD (Leite em Pó Desnatado)

Solução de HCl concentrado 2N

Antígeno

Anticorpo

Substrato Enzimático

Antiglobulina marcada com

enzima

Bloqueador


39

Procedimento

1. Adicionar volumes de 50L da solução antigênica em sua diluição ideal de uso

(1g/mL) preparada em Tampão Carbonato-Bicarbonato (1:12500). Incubar a reação over-

night, em geladeira. Ao final, lavar as cavidades da microplaca 4 – 5 vezes com PBS.

2. Bloquear as cavidades da microplaca através da adição de LPD a 10% em

TCB, incubar a reação por 45 minutos a 37ºC. Ao final, lavar a microplaca como no item

anterior.

3. Adicionar as diluições das amostras de soros-teste preparadas em tampão

PBST + LPD. Incubar a reação por 60 minutos a 37ºC. Ao final, lavar novamente, conforme

já descrito.

4. Adicionar o conjugado em sua diluição ideal de uso (1:2000) preparada em

tampão PBST + LPD. Incubar por mais 60 minutos a 37ºC. Ao final, lavar novamente.

5. Adicionar a solução de substrato (H2O2) + OPD. Incubar, sob proteção da luz,

por 15 minutos e, então, bloquear a reação com HCl.

6. Fazer a leitura (figura 02) das DOs. Determinar a DO média dos controles para

obtenção dos títulos de Acs presentes nos soros.

Figura 35

1/100

1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/25600 1/100240 1/12800 1/51200

8 1

2 3 4 5 6 7 9 10 11 12

A

B

D

E

F

C

G

H

ACF

AIF

AlOH

Sem

Adjuvante


40

PERGUNTAS

1) Em que se baseia e quais são os mecanismos / passos principais da reação

imunoenzimática de ELISA?

2) Que tipos de antígenos e anticorpos participam da reação imunoenzimática de

ELISA?

3) Qual(is) a(s) utilidade(s) do teste de ELISA, no sorodiagnóstico em medicina

veterinária?

4) Como se procede para titular anticorpos de um soro no teste de ELISA?


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SDS-PAGE e Western blotting

Soro normal de bovino, gamaglobulina bovina e IgG bovina

1. Preparo do gel (gel a 12%) No preparo do gel, são feitos dois géis, um para ser corado com Comassie blue

e outro para ser transferido para a membrana de PVDF, na quais era feito o

western blotting. Obs: Um gel é o espelho do outro.

Gel de separação

Gel de empilhamento

Separating gel buffer (pH8,8) – 4 mL

Stacking gel buffer (pH6,0) – 3 mL

Acrilamida-bisacrilamida – 3,2 mL


Água MilliQ – 0,8 mL

Persulfato de amônio 10% - 80 µL

Persulfato de amômio 10% - 120 µL

TEMED – 8 µL

TEMED – 12 µL

Preparo da amostra

60 µL da amostra (proteína a ser testada) (soro normal bovino, gamaglobulina

bovina e IgG bovina)

20 µL tampão da amostra 4X

8 µL de ß-mercaptoetanol

Ferver por 2 minutos e aplicar no gel 30µg de proteína a ser testada.

2. Eletroforese do gel de poliacrilamida

A corrida é feita em média por 2 horas a 100 V, logo após este período um dos

géis é corado com Comassie blue e o outro é tranferido para a membrana.

3. Transferência para a membrana

Tampão de transferência

100 mL de CAPS 10X

100 mL de metanol

800 mL de Água MilliQ

Cortar 2 papéis Watmann de 3mm nas seguintes medidas: 10X7cm

Técnicas de SDS-PAGE e de Western-Blotting

SDS-PAGE e Western blotting

Soro normal de bovino, gamaglobulina bovina e IgG bovina

1. Preparo do gel (gel a 12%) No preparo do gel, são feitos dois géis, um para ser corado com Comassie blue

e outro para ser transferido para a membrana de PVDF, na quais era feito o

western blotting. Obs: Um gel é o espelho do outro.

Gel de separação

Gel de empilhamento

Separating gel buffer (pH8,8) – 4 mL

Stacking gel buffer (pH6,0) – 3 mL



Água MilliQ – 0,8 mL

Persulfato de amônio 10% - 80 µL

Persulfato de amômio 10% - 120 µL

TEMED – 8 µL

TEMED – 12 µL

Preparo da amostra

60 µL da amostra (proteína a ser testada) (soro normal bovino, gamaglobulina

bovina e IgG bovina)

20 µL tampão da amostra 4X

8 µL de ß-mercaptoetanol

Ferver por 2 minutos e aplicar no gel 30µg de proteína a ser testada.

2. Eletroforese do gel de poliacrilamida

A corrida é feita em média por 2 horas a 100 V, logo após este período um dos

géis é corado com Comassie blue e o outro é tranferido para a membrana.

3. Transferência para a membrana

Tampão de transferência

100 mL de CAPS 10X

100 mL de metanol

800 mL de Água MilliQ

Cortar 2 papéis Watmann de 3mm nas seguintes medidas: 10X7cm

Técnicas de SDS-PAGE e de Western-Blotting


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Cortar a membrana de PVDF: 9X6cm

Para a transferência deve-se montar um “sanduíche” onde todos os materiais

envolvidos (papel Watmann, esponjas, cassete de transferência, membrana de PVDF) devem

ser embebidos no tampão de transferência.

O “sanduíche” deve obedecer a seguinte seqüência:

- placa preta, - esponja, - papel watmann, - gel, - membrana de PVDF, - papel

watmann, - esponja, - placa branca

Após a montagem do sanduíche este é colocado no cassete de transferência, e esta é

feita por 45 minutos, a 4ºC, a 90V.

1. Western blotting

Após a transferência das proteínas do gel para a membrana de PVDF, segue-se o

western blotting:

1. Retirar a membrana e colocar Ponceau sob agitação para detectar a transferência.

2. Lavar com água MilliQ sob agitação, para retirar o Ponceau

3. Bloquear a membrana com PBS-T + 2% BSA (0,5g de BSA + 10 mL de PBS-

T), incubar por 2 horas sob agitação.

4. Adicionar o conjugado anti-IgG bovina, na diluição de 1:1000 (10 µL do

conjugado anti-IgG bovina + 5 mL de PBS-T), incubar por 1 hora sob agitação.

5. Lavar a membrana 4X com PBS-T por 5 minutos

6. Lavar a membrana 1X com PBS por 10 minutos

7. Diluir 3 comprimidos de DAB e 3 comprimidos de uréia em 3 mL de água

MilliQ, sob agitação. Adicionar esta solução a membrana, esperar alguns

minutos até que apareça algum sinal, no máximo 5 minutos, e após este período

bloquear a reação com água MilliQ.

2. Coloração do gel de poliacrilamida

- Retirar o gel da cuba e depois do suporte com a ajuda dos espaçadores. Cortar o

gel de empilhamento.

- Mergulhar o gel na solução descorante-corante sob agitação por 5 minutos.

- Passar para a solução corante (Comassie Blue) sob agitação por 15 minutos.

- Transferir para a solução descorante. Deixar por 3 horas, trocando a solução

quando esta estiver saturada.

PERGUNTAS

1) Em que se baseia e quais são os passos principais das técnicas de poliacrilamida

gel-eletroforese (PAGE) e de Western-blotting (W.B.)?

2) Que tipos de antígenos e anticorpos participam da técnica de Western-blotting?

3) Qual(is) a(s) utilidade(s) das técnicas de PAGE e de W.B., no sorodiagnóstico em

medicina veterinária?

4) Como se procede para caracterizar um antígeno proteico pelas técnicas de PAGE e

de W.B.?


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TESTES RÁPIDOS DE SORODIAGNÓSTICO –

TESTES IMUNOCROMATOGRÁFICOS

A ampliação do acesso ao diagnóstico é um desafio aos programas de saúde humana e

veterinária. Os testes laboratoriais convencionais de sorodiagnóstico são operacionalmente

complexos, requerem profissionais especializados e infraestrutura laboratorial apropriada.

Além disso, o prazo para entrega dos resultados desses testes pode ser longo, levando o

indivíduo a se desinteressar pelo resultado do teste e à consequente perda deste pelo sistema

de saúde, ou não atender a demanda por decisões mais rápidas para o estabelecimento de

procedimentos terapêuticos e, principalmente, medidas mais efetivas de controle.

No início da década de 1990, uma nova estratégia diagnóstica surgiu. Chegaram ao

mercado, os testes rápidos. Com o avanço das tecnologias de desenvolvimento e produção,

esses testes revelaram-se eficientes na investigação de doenças infectocontagiosas. Desde

2005, a utilização dos testes rápidos permite atender à crescente demanda pelo diagnóstico de

agravos relevantes à saúde publica, visto que sua utilização aumenta a agilidade da resposta

aos indivíduos e permite seu rápido encaminhamento para assistência médica e início de

tratamento.

Testes rápidos são aqueles cuja execução, leitura e interpretação dos resultados são

feitas em, no máximo, 30 minutos. Além disso, são de fácil execução e não necessitam de

estrutura laboratorial.

Testes rápidos são, primariamente, recomendados para exames presenciais de

sorodiagnóstico. Podem ser feitos com amostra de sangue total obtida por punção venosa ou

da polpa digital, ou com amostras de fluido oral. Dependendo do fabricante, podem também

ser realizados com soro e (ou) plasma. A execução dos testes rápidos, habitualmente, é muito

simples e a capacitação de pessoal pode ser realizada presencialmente, ou por meio de ensino

a distância.

A primeira vantagem significativa dos testes rápidos é que eles possibilitam a

liberação dos resultados e a tomada de decisões sobre o diagnóstico em uma única ocasião em

que se obtém amostras de um paciente ou de um indivíduo suspeito de ter sido acometido por

uma doença infecciosa.

Os testes rápidos não necessitam de estruturas laboratoriais ou de profissionais

graduados para sua execução, assim como dispensam o transporte de amostras e a necessidade

de coleta de sangue venoso. Além disso, a aplicação de testes rápidos auxilia na prevenção da

transmissão vertical de agentes infecciosos, facilita o diagnóstico em populações-chave.

Esses testes, que podem ser realizados durante atendimento ou consulta em qualquer

local, aumentam a probabilidade de solucionar os diagnósticos de doenças infecciosas aos

indivíduos acometidos e também podem fornecer dados importantes sobre a situação

imunológica desses indivíduos.

Dentre os testes rápidos de sorodiagnóstico destaca-se a técnica de testes

imunocromatográficos, que é uma metodologia de detecção baseada na utilização de tiras de

um material de suporte (nitrocelulose) impregnadas com reagentes dessecados / liofilizados

(anticorpos ou antígenos conjugados a partículas coloridas constituídas por ouro ou prata

coloidais) que são ativadas, interagem com os analitos das amostras testes e migram por


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cromatografia pelos microcanais da membrana do suporte após a aplicação de amostras testes

fluidas, revelando ao final resultados em locais do suporte sólido nos quais estão imobilizados

anticorpos de captura para cada sistema ou alvo do analito que se busca detectar. Aplicações

desta metodologia incluem testes para detecção de patógenos e/ou de seus anticorpos

específicos, drogas, hormônios e metabolitos presentes em amostras médicas, veterinárias,

alimentos, e de análises ambientais e outros.

Como funciona para a detecção de anticorpos anti-antígenos específicos?

1. A amostra de soro teste é colocada no local indicado, na membrana (área A).

2. A solução tampão é colocada sobre a amostra.

3. Os anticorpos da amostra fluem lateralmente pela membrana, passando pela área I,

onde se inicia a ligação com o conjugado e prosseguem em direção à área de teste (T).

4. Na área T, o complexo anticorpo-conjugado liga-se aos antígenos do agente

infeccioso investigado que está imobilizado em uma linha da membrana do suporte,

formando uma linha (ou banda) colorida.

5. O conjugado não ligado ao anticorpo e o excesso do complexo imune continuam a

migração, ao longo da membrana de nitrocelulose, em direção à área C, onde são capturados

por anticorpos anti-imunoglobulina, formando outra linha (ou banda) colorida.

Detecção de Ag do vírus da cinomose pelo teste imunocromatográfico:-

Amostra: mucosa nasal, conjuntiva, saliva, urina, soro e plasma;

Kit: diluente, swab esterilizado, conta-gotas (pipeta) e dispositivo teste;

Materiais necessários não fornecidos: solução salina e cronômetro.

Quando o teste começar a reagir , deve-se observar uma cor rosa se movendo através

da janela de resultado no centro do dispositivo de teste.

Se esta não for visualizada após 1 minuto, adicionar mais uma gota da amostra +

diluente no orifício;

Interpretar o resultado do teste entre 5 e 10 minutos. Não interpretar o resultado em

um tempo superior a 12 minutos.


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