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Rubéola IgM

Código: Formato: 3 x 12 testes 60401002 Versão: 401/P6

P

O kit ImmunoComb

® II Rubéola IgM é um teste EIA rápido para

a determinação qualitativa de anticorpos IgM para o vírus da Rubéola em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com o kit.

Introdução O vírus da Rubéola é um membro da família Togaviridate, encontrado principalmente em populações humanas. A transmissão se dá principalmente por aerossóis ou por contato direto, com um pico de incidência da doença na faixa etária de 5-14 anos. Em geral, a infecção se manifesta como uma doença benigna e autolimitante, caracterizada por erupção maculopapoular (sarampo), febre tênue e linfoadenopatia. Podem ocorrer ocasionalmente artralgia provisória e artrite suave. Ao contrário, a infecção primária por Rubéola contraída durante o início da gravidez, pode resultar em danos severos ao feto, natimorto ou aborto. Os sintomas de crianças com infecção congênita incluem anormalidades anatômicas e neuro-sensoriais sérias, tais como surdez, defeitos cardíacos, catarata, glaucoma e retardo mental. O retardo no crescimento e a diabete mellitus também foram associados com complicações posteriores da rubéola congênita. A vacinação em massa tem reduzido significativamente a incidência de Rubéola em todas as faixas etárias. Entretanto, 10 a 20% de jovens adultos ainda são suscetíveis ao vírus. Em infecção aguda, anticorpos IgM específicos para o vírus da Rubéola aparecem como uma erupção diminuida e geralmente não persistem além de 4 a 5 semanas. Os anticorpos IgM não são produzidos na reinfecção. Entretanto, a determinação de IgM anti-rubéola é particularmente útil para a distinção efetiva entre infecção recente ou vacinação e imunidade adquirida ou reinfecção em mulheres grávidas. A produção de anticorpos IgM anti-rubéola por crienças infectadas congenitamente pode demorar aproximadamente um ano pós-parto. A medida de anticorpo IgM específico em recém nascido permite o diagnóstico de infecção congênita pelo vírus da Rubéola.

Princípio do Teste O teste ImmunoComb® II Rubella IgM é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um pente com doze projeções (“dentes”). Cada dente é sensibilizado em duas posições: Ponto superior – IgM humana (Controle Interno). Ponto inferior – Antígenos de Rubéola inativados. A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas

do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, amostras de soro ou plasma são pré-tratadas com anti-IgG humana (absorvente), de forma a previnir interferentes como resultado da competição pela IgG anti-rubéola e pelo fator reumatóide. Amostras pré-tratadas são posteriormente incubadas com a solução nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O pente é então inserido nas cavidades da fileira A. Anti-rubéola IgM se presente nas amostras, irá ligar-se especificamente aos antígenos de Rubéola nos pontos inferiores dos dentes do Pente (Figura 1). Os componentes não ligados são removidos por lavagem na fileira B. Na fileira C, os IgM anti-rubéola capturados nos pontos inferiores dos dentes, e a IgM humana dos pontos superiores (Controle Interno), reagirão com anticorpos anti-IgM humanos marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com componentes cromogênicos. Os resultados são visíveis como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente.

Figura 1. Princípio do Teste O kit inclui um Controle Positivo (IgM anti-Rubéola) e um Controle Negativo para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza-azulados. O dente utilizado com o Controle Negativo deve mostrar o ponto superior e nenhum ponto inferior, ou um ponto bem claro. O ponto superior deve aparecer também em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente.

Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior – IgM humano (Controle Interno). Ponto inferior – Antígenos de Rubéola inativados.

Figura 2. Pente Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Diluente de amostra, contendo anticorpos de cabra

anti-IgG humano

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Fileira B Solução de lavagem

Fileira C Anticorpos de cabra anti-IgM humano marcados com fosfatase alcalina.

Fileira D Solução de lavagem

Fileira E Solução de lavagem

Fileira F Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT)

Figura 3. Placa Reveladora Controle Positivo – 1 frasco (tampa vermelha) de 0,5 mL de plasma humano, contendo anticorpos IgM para o vírus da Rubéola. Controle Negativo – 1 frasco (tampa verde) de 0,5 mL de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anticorpos para o vírus da Rubéola. Solução absorvente – 1 frasco (tampa transparente) contendo 4 mL de anticorpos de cabra diluídos para IgG humano. Perfurador – para perfurar a folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora.

Segurança e Precauções • Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro.

• Os materiais de fonte humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não-reativos para o antígeno de superfície de hepatite B e para anticorpos para hepatite C e para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes.

• Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos de laboratório para trabalhar com soro ou plasma.

• Não pipetar com a boca.

• Descartar todas as amostras, Pentes (a menos que sejam guardados para documentação posterior), Placas Reveladoras e outros materiais usados com o kit como resíduo bioinfectante.

• Não misturar reagentes de lotes diferentes.

• Não usar o kit após o vencimento.

Armazemamento do Kit Armazenar o kit em sua embalagem original de 2 - 8ºC. Nestas condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do rótulo. Não congelar o kit.

Manipulação das amostras Tanto o soro como o plasma podem ser testados. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2 - 8ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a –20ºC ou inferior. Centrifugar as amostras após o descongelamento. Testar o sobrenadante. Evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento.

Procedimento do Teste Material Necessário

• Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar

25 µL e 100 µL.

• Tesoura.

• Cronômetro ou relógio de laboratório.

• Microtubos ou cavidades de microtitulação. Preparando o Teste Trazer todos os reagentes, Placas Reveladoras, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste a temperatura de 22 – 26º C. Preparando a Placa Reveladora

1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos.

2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante ao final do teste.

3. Misturar os reagentes agitando a Placa reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado, nas instruções do Teste.

Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar o saco de alumínio do Pente na extremidade

marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou

parcialmente. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as

amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número “01” do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados.

b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes incluindo 2 controles).

c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a embalagem de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 – 8ºC para uso posterior.

Figura 4. Quebrando o Pente

Instruções do Teste Pré-tratamento de Amostras e Controles

1. Para cada amostra e controle, dispensar 100 µL da solução absorvente em um microtubo ou cavidade de microtira.

2. Para cada microtubo ou cavidade, adicionar 25 µL de uma amostra ou do Controle Positivo ou Controle Negativo fornecido no kit. Misturar aspirando e dispensando a solução repetidamente.

3. Ajustar o cronômetro e incubar por 10 minutos a temperatura ambiente (22 – 26º)

Adicionando as amostras pré-tratadas à Placa Reveladora Nota: Realizar as incubações a 37ºC. As lavagens devem ser realizadas a temperatura ambiente (22 – 26ºC).

4. Pipetar 25 µL de uma amostra pré-tratada. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar aspirando e dispensando repetidamente a ponteira com a solução. Descartar a ponteira da pipeta.

5. Repetir o passo 4 para as outras amostras e os dois controles pré-tratados. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle.

6. Ajustar o cronômetro e incubar para 10 minutos a 37ºC. Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 7. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas

cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Misturar: Inserir e retirar o Pente nas cavidades várias

vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 30 minutos a 37ºC. Ajustar o cronômetro. Próximo ao final dos 30 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 30 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes.

Primeira lavagem (Fileira B) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Inserir e

retirar o Pente vigorosamente das cavidades e deixar

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inserido por pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem correta. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 7c.

Ligação de Conjugado (Fileira C) 9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Agitar como no

passo 7a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos a 37ºC. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 20 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual.

Segunda lavagem (Fileira D) 10. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar

repetidamente por 2 minutos, como no passo 8. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual.

Terceira Lavagem (Fileira E) 11. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar

repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual.

Reação de Cor (Fileira F) 12. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Agitar. Ajustar o

cronômetro para 10 minutos e incubar a Placa Reveladora com o Pente a 37ºC. Após 10 minutos retirar o Pente.

Reação de Parada (Fileira E) 13. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar

o Pente e deixar secar ao ar livre. Descarte do lixo Descartar as Placas Reveladoras, ponteiras, microtubos ou cavidades de microtitulação, papel absorvente e luvas usadas, como lixo bioinfectante.

Armazenamento da parte não usada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso posterior:

• Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva de forma que nada possa respingar de dentro delas, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada.

Outros materiais do kit:

• Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, Controles, perfurador, diluente de amostra e instruções de uso à caixa original. Armazenar entre 2 – 8ºC.

Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as quatro condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5). 1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do

Pente. 2. O sinal do ponto inferior do Controle Positivo deve estar no

mínimo 35 quando medido utilizando o programa 91 do

refletômetro CombScan (aproximadamente igual à segunda escala de cor iniciando da esquerda, se avaliada utilizando o

CombScale). 3. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior

(Controle Interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados.

4. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle interno).

Caso alguma destas condições não seja cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados.

Figura 5. Validação dos testes. Interpretação Qualitativa dos Resultados interpretação Visual Comparar a intensidade do ponto inferior de cada dente de amostra com o ponto inferior do dente do Controle Positivo (Figura 6).

• Um ponto com intensidade maior ou igual a do controle positivo indica a presença de anticorpos IgM para o vírus da Rubéola.

• Um ponto com uma intensidade ligeiramente menor que o ponto do controle positivo deve ser considerado um resultado indeterminado e a amostra deve ser retestada.

• Nenhum ponto ou um ponto claro deve ser considerado um resultado negativo.

Figura 6. Resultado do Teste Leitura no Equipamento O refletômetro CombScan

TM (ver o Manual do Usuário do

CombScan para instruções detalhadas) permite uma leitura rápida e objetiva da intensidade da cor dos pontos do ImmunoComb. Ler os resultados dos testes como absorbância relativa usando o programa # 92 do CombScan, designando a leitura do ponto inferior digitando “1” quando aparecer a mensagem “pontos: 1,2,3” na tela.

• Uma amostra com leitura igual ou maior que 700 é considerada positiva para a presença de anticorpos IgM para o vírus da Rubéola.

• Uma amostra com leitura entre 600 e 700 deve ser considerada como resultado indeterminado para a presença de anticorpos IgM para Rubéola e deve ser retestada.

• Uma amostra com leitura menor que 600 indica um resultado negativo.

Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser armazenados para documentação posterior.

Limitações

Como em outros testes destinados ao uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros dados laboratoriais realizados para o paciente.

Características de Desempenho*

A sensibilidade e a especificidade do kit ImmunoComb II Rubella IgM foram avaliadas em um painel de 360 amostras de soro, em comparação com um teste EIA de referência.

Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Resultados dos Testes

Foram calculadas as seguintes características de desempenho:

• Sensibilidade – 91,8%

• Especificidade – 100%

Bibliografia Chernesky MA. Mahony JB. 1991. Rubella Vírus. In: Balows A, Hausler WJ, Hermann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds. Manual of Clinic microbiology, Fifth Edition. American society for Microbiology, Washington, DC, pp. 918-923. Enders G. 1984. Problems of Rubella diagnosis by verious IgM techniques and the need for test combinetions. In: Habermehl K-O, ed. Rapid methods and Automation in Microbiology and Immunology. Springer Verlag, Berlin, pp. 146-161. Frenkel LD, Bellanti JA. 1982. Immunology of measles, mumps and rubella virusars. In:Nahmias AJ, O’Reilly RJ, eds. Immunology of Human Infection. Part II: Virusars and parasites;

ImmunoComb II Rubella IgM Teste de Referência

Positivo Negativo

Positivo 170 15

Negativo 0 175

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Immunodiagnosis and Prevention of Infectious Diseases. Plenum Medical Book Co., New York. Pp. 135-163. Ray CG. 1984. Virusars of mumps and childhood exanthemes. In: SherrisJC, ed. Medical Microbiology- na introduction to Infectious Diseases, Elsevier, New York. Pp. 383-387. Produzido por: ORGENICS LTD. P.O.Box 360, Yavne 70650 - ISRAEL Registro e Distribuição: ORGENICS DO BRASIL LTDA. Alameda dos Ubiatans, 257 - Planalto Paulista 04070-030 São Paulo - SP CNPJ : 01.767.606/0001-10 Atendimento ao consumidor SAC: (11) 5589-4622 FAX: (11) 5581-3279 e-mail: orgenics@uol.com.br Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Registro ANVISA nº 10348680026 Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva CRF-SP 13020 CONSERVAR ENTRE 2 - 8ºC

P.O.Box 360 Yavne 70650, Israelh t t p : / / w w w . o r g e n i c s . c o m

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Resumo dos Principais Procedimentos do Teste

Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II Rubella IgM. (Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo). 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora por 45 minutos a 37ºC.

2. Pré-tratar 25 µL de cada amostra e controle com 100 µL de solução absorvente. Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente (22 – 26ºC).

3. Dispensar 25 µL de cada amostra e controle pré-tratados nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. Misturar e incubar por 10 minutos a 37ºC.

4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1: Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste.

Etapa Fileira Proceder como a seguir

Reação antígeno-anticorpo

A Misturar; incubar 30 minutos a 37ºC; absorver.

Lavagem

B Agitar; incubar 2 minutos; absorver.

Ligação do Conjugado

C Misturar; incubar 20 minutos a 37ºC; absorver.

Lavagem

D Agitar; incubar 2 minutos; absorver.

Lavagem

E Agitar; incubar 2 minutos; absorver.

Reação de cor

F Misturar; incubar 10 minutos a 37ºC.

Reação de parada

E Incubar 1 minuto; secar ao ar livre.