GENETICA

DNA CODIFICANTE

Dos 20% que têm alguma função temos ainda 3 grupos.

a) GENES ÚNICOS

Cópias únicas em todo o genoma, codificando determinadas enzimas e proteínas especializadas. Quando se diz cópias únicas estamos a falar do genoma haplóide, considerando apenas metade ou se quisermos os cromossomas que constituem o par de cromossomas homólogos, ou ainda, o genoma haplóide é o que está contido nos gâmetas.

Alelo 1 Alelo 1 (par de cromossomas homólogos)

Este tipo de gene único acaba por ter 2 voltas. Tomam os dois a designação de alelo 1, pois se pusermos um alelo 1 e outro alelo 1´ ou B, queria isso dizer que são sequências de DNA diferentes. Um alelo é a designação da forma reduzida (?) de um gene.

Um determinado gene que codifica a cor de um pigmento, se ele tem 2 alelos, um para pigmento preto e outro para pigmento amarelo, esses dois alelos formam uma alternativa do mesmo gene que controla a cor do pigmento.Não esquecer que estamos a falar de genes únicos, enzimas e proteínas especializadas que se quiserem codificar o alelo 1,ou B, sobre a parte .....que são duas formas diferentes, são 2 sequências diferentes que controlam esta característica.

Os genes únicos são genes sem polimorfismo e codificam a mesma enzima sem variações.

(Há excepções. Pode ocorrer uma situação em que um gene é um gene único, pode sofrer uma mutação num alelo dá origem a um alelo diferente que dá uma proteína diferente. Não é necessariamente obrigatório que exista só um alelo para esse gene.)

b) GENES DUPLICADOS

1. 50% dos genes codificantes2. similares mas não idênticos3. famílias multigénicas: actinas, algumas histonas, queratinas, tubulinas,

globinas, imunoglobulinas, genes do MHC4. pseudogenes – não funcionais (muitas destas famílias, pensa-se que por

degeneração, ou qualquer erro da replicação do DNA originaram copias não funcionais dos genes, que se vão mantendo no genoma apesar de não funcionais)

Ao contrário dos genes únicos, existem várias cópias, e estamos aqui a falar conforme o tipo de genes que vão desde algumas cópias até genes que têm situações de genes que têm mais de um milhar de cópias espalhadas eventualmente pelo genoma.

E portanto, e diferente dos genes únicos, estes genes duplicados são similares e não idênticos. Isto é, são suficientemente similares para nós podermos englobá-los naquilo a que chamamos famílias multigénicas (exemplo, genes do complexo de histocompatiblidade, são genes mais ligados à resposta imunitária - proteínas codificadas nestes genes eram as responsáveis pela rejeição dos transplantes daí o estudo deste genes.) Há um conjunto de genes do MHC que todos eles têm uma estrutura similar em termos de sequência de nucleótidos, mas há diferenças entre os pares de genes do MHC que permitem formar uma família de genes dentro do MHC (classe 1, classe 2...)

c) GENES EM TANDEN

1. dispostos em fila sequencialmente2. idênticos ou muito similares entre si3. necessidade de grandes quantidades de produto génico4. RNAt ~ 13005. RNAr 5S ~20006. algumas histonas ~50-500

A diferença destes em relação aos genes duplicados é a seguinte: são essencialmente cópias idênticas uns dos outros. Ou muito similares.

Por outro lado estão dispostos em fila e sequencialmente.

Há uma região dos cromossomas chamada de NOR´s que vem da abreviatura organizadora globular e que são as regiões do cromossoma onde é possível corá-las especificamente dando origem a regiões bem determinadas do cromossoma. Estas regiões não são mais do que regiões de RNA ribossomais.

Cada gene apresenta n cópias

Função: quando é necessário grande quantidade de uma determinada proteína a maneira que o organismo encontrou foi transcrever o mesmo gene n vezes porque é mais fácil e mais rápido.

Além dos RNA ribossomais, os RNA de transferência utilizados no processo de tradução são também exemplos de DNA que se encontram expostos desta forma e também algumas histonas fazem parte desta classificação de DNA com genes em tanden.

Existem três classes de DNA codificante.

DNA não codificante, ou seja, o DNA que não dá origem a proteínas nem a RNA´s. – o DNA repetitivo ou não codificante. Este DNA é caracterizado pela existência de unidade de repetição, repetidas em Tandem.

A – Repetições em Tandem • As unidades de repetição são pequenos oligonucleótidos ... 2 pares que

se repetem a seguir umas às outras e que podem ir até 500 pares de bases.

AGC GCC TCG CGG , unidade de repetição que se repete n vezes umas a seguir outras no mesmo local do cromossoma

• Repetidos em TandemEstes DNA’s foram descobertos quando se começou a fazer manipulações ou

ultra - manipulações no DNA total da célula e verificou-se que no microtubo, após a centrifugação apareciam duas bandas:

uma banda principal que continha a maioria do DNA e outras bandas, bandas satélites. E daí a designação destes DNA´s com repetições em Tandem como DNA satélite. Só mais tarde se analisou a composição deste DNA satélite ... e que este era composto na maioria dos casos por repetições da mesma sequência a seguir uma às outras.

Verificou-se também que o número de repetições também variava e daí ter-se feito uma classificação de acordo com o tamanho dessas unidades em DNA satélite, original e a partir daí verificou-se o DNA mini – satélite e DNA micro – satélite.

A diferença entre eles é o tamanho das unidades de repetição (e nº de repetições). 1. DNA satélite

- unidade de repetição 5 - 500 pares de bases;- n.º de repetições 1000 – 50 000;- grandes extensões (105 a 106).

Estes DNAs satélites são encontrados... a mesma unidade é encontrada no mesmo cromossoma, em cromossomas diferentes, e o mesmo se pode dizer para uma unidade diferente em que a frequência da unidade de repetição é diferente (e em número também é, mais pequena) e portanto pode repetir da mesma maneira em vários locais.

2. DNA mini - satélite- mais frequentes nas regiões telométricas e “hot spots” de recombinação;- unidade de repetição 10 - 100 pares de bases;- n.º de repetições 20 - 50;- pequenas extensões (102 a 103).

Ao contrário do primeiro a sua distribuição não é universal, isto é, ele encontra-se geralmente nos telómeros (é a extremidade do braço do cromossoma) dos cromossomas e também em regiões onde a recombinação (“crossing over”) é muito frequente.

Dizem que a recombinação é um processo aleatório que pode ocorrer em qualquer parte do genoma e isso tem vantagens porque digamos a troca dos genes

entre os cromossomas homólogos de origem materna e paterna é vantajosa, isto é, misturam-se características e desta maneira o indivíduo é diferente dos pais mas esse caracter aleatório não é total porque há locais onde o “crossing over” ocorre preferencialmente. Isto também sucede porque se o “crossing over” fosse completamente aleatório seria possível ocorrer no meio de um determinado gene. Esse gene ia ficar afectado... há que evitar isso. Eventualmente esse será o mecanismo, isto é, arranjar sequências que mesmo sendo...

3. DNA micro - satélite- distribuição ubíqua: em intrões ou regiões flanqueadoras 5’ ou 3’ dos

genes;- unidade de repetição 1 - 5 pb;- n.º de repetições <30.

Este DNA da mesma maneira que o DNA satélite tem uma distribuição universal ubíqua. Ele pode ser encontrado quer dentro dos próprios genes ao nível dos intrões e também ao nível das regiões a montante e a jusante desta, as regiões flanqueadoras 5’ 3’. As unidades de repetição são as mais pequenas de todas, 1 a 5 pares de bases e o número de repetições geralmente são inferiores a 30.

Há unidades de repetição de DNA microsatélite que ocorrem apenas em 2 bases.

Os DNAs micro e minisatélites vão ser falados mais uma vez mais lá para a frente. Os minisatélite ligados a uma técnica chamada DNA Fingerprints e os micro-satélites como marcadores genéticos.

Marcador tem de obedecer às Leis de Mendel (tem de ser passado pais para filhos utilizando as leis de Mendel comportando-se como um “gene”).

O marcador para se útil precisa de ser polimórfico, isto é, se olharmos para uma determinada população há variação na sequência de bases entre indivíduos. Se não houver variação diz-se que é invariante ou monomórfico, ou seja, a sequência de bases é igual em todos os indivíduos e que, portanto, não serve para marcador genético.

O marcador tem de ser ainda facilmente identificável (como por exemplo o fenótipo, pelagem)

Outros marcadores: marcadores bioquímicos sanguíneos, por exemplo, sob a forma de enzimas, ABO, AB (nos gatos).

Estes marcadores ... têm vindo a ser substituídos por marcadores moleculares que vão sendo descobertos com a determinação ... Marcador – sequência de bases, sequências nucleóticas O DNA micro-satélite é detectado geralmente por PCRs amplificando aquela região determinando o tamanho...

B – Elementos genéticos móveis – TGE

- As terminações são repetições invertidas (IR) – Panlindromas, nas enzimas de restrição;

- Formação de “loops” importantes no mecanismo de excisão dos TGE;- Movimentação no mesmo ou para outro cromossoma; - Tranposição de TGE’s com ou sem cópia;

- Mutações por inserção: disrupção génica ou alteração da expressão génica

5’ AGCC.............GGCT 3’ 3’ TCGG.............CCGA 5’

Estes elementos genéticos móveis são, como o próprio nome indica,

sequências de DNA que se movem no genoma do indivíduo o que põe um pouco de lado a ideia de imortalidade (imobilidade) do genoma, isto é, além da... que provoca as variações da sequência do genoma há outras fontes de variação, nomeadamente estas sequências que ... quer no mesmo cromossoma quer em cromossomas diferentes e que são caracterizadas pela existência de repetições invertidas nas extremidades.

Uma sequência de um elemento genético móvel tem digamos uma série de pares a nível da ... central e depois geralmente tem repetições invertidas que são lidas numa direcção (AGCC) e que quando lidas na direcção contrária na cadeia complementar têm a mesma sequência (AGCC).

Portanto, isto constitui sequências panlindrómicas. Estas sequências vão ser importantes no mecanismo de excisão dos elementos genéticos móveis, isto é, quando eles abandonam o local do DNA geralmente fazem-no pela ansa...

Como já disse, a movimentações podem ser feitas ou não no mesmo cromossoma e há situações em que os TGEs abandonam o local deixando uma cópia (transposição replicativa?) ou, pelo contrário, abandonam esse local sem deixar uma cópia (transposição conservativas?).

A importância destes TGEs terá eventualmente a ver com uma evolução mais rápida do genoma. A mutação é algo que faz evoluir o genoma de uma espécie mas de uma forma lenta e com este sistema é possível que determinadas alterações se tornem vantajosas para um indivíduo visto que se alteram, de uma só vez e subitamente, regiões bastante grandes – mais rápido. E também pode ter o efeito contrário, isto é, as alterções podem não ser válidas podendo causar assim, a morte do indivíduo (há sequências que se movem podendo ter consequências graves uma vez que, se um destes elementos moveis se vai inserir dentro de um gene, pode levar a uma alteração tal que o gene deixa de ser funcional). De uma maneira ou de outra, é possível que os TGEs sejam importantes na evolução das espécies. Existem dois tipos de elementos genético móveis os transposões e os retroposões.

Transposões – a movimentação do TGE faz-se usando a própria sequência de DNA

TGE TGE

TGE

A sequência de DNA é removida de um determinado local e ela própria é que se move inserindo-se noutra posição do genoma mantendo-se na mesma a sua característica de dupla hélice de DNA. Pelo o contrário o retroposões movimentam-se no genoma através de cDNA existindo o intermédio de uma molécula de mRNA. Portanto, o que acontece é que a RNA polimerase lê o retroposão, sintetiza o mRNA complementar que vais ser depois lida pela enzima transcriptase reversa (existente nos retrovírus) que vai sintetizar uma cópia de DNA, o cDNA a partir deste mRNA. Isto

porque o genoma do retrovírus é o RNA. É este cDNA (de cadeia dupla) que vai inserir noutro local do genoma completando a movimentação.

Retroposões – movimentam-se através de cDNA e por intermédio de mRNA

TGE TGE

sintese

mRNA cDNA ou DNA complementar

transcriptase reversa

C – Repetições dispersas (diferentes das Tandem porque só se repetem uma única vez - a unidade de repetição só se encontra numa copia única em cada local do genoma, ou seja, as unidades tb se repetem mas estão localizadas em zonas distintas, não existindo na msm zona unidades repetidas, mas sim, em zonas longe dentro do msm cromossoma)

- constitui 20% do DNA dos mamíferos

Há muitas cópias da transcriptase reversa que não estão activas; sequências não funcionais sem intrões (cDNAs . pseudogenes não funcionais)

1. LINES – Long interspersed elements- cDNA’s. pseudogenes não funcionais;- unidade de repetição >1000pb;- n.º total no genoma 10 000.

2. SINES – Short interspersed elements- cDNA’s. genes não funcionais para tRNA;- unidade de repetição <500pb;- n.º total no genoma 100 000.

DNA não-codificante de cópia única DNA de conexão

- não classificado- situado entre as unidade de transcrição.

Tecnologias de Genética molecular. Metodologias moleculares de detecção do polimorfismo

Variações do PCR:

O PCR foi inicialmente utilizado como técnica de amplificação de determinadas sequências.

Existem diferentes tipos de PCR:

• PCR multiplex – Utilização simultânea de vário pares de primers com vista a amplificar diferentes sequências. Assim, no mesmo tubo vão-se usar diferentes pares de primers e o que se pretende é a amplificação de diferentes regiões de DNA.

• RAPD – usam-se primers aleatórios (as suas sequências são ao acaso), logo não saberemos qual será o resultado. O que se pretende é testar esses primers em diferentes indivíduos para procurar variações individuais. Assim, ou nada é amplificado ou testam-se pares de primers até que haja amplificação. Uma vez que isso acontece, ou o primer utilizado dá origem a um produto igual em todos os indivíduos (igual significa que tem o mesmo tamanho) o que não é a situação desejada ou, pelo contrário, obtêm-se regiões de diferentes tamanhos o que evidencia o polimorfismo. Pode ser considerado como um marcador genético pois é baseado na sequência nucleotídica e transmitido de pais para filhos.

• RT-PCR- está relacionado com a transcrição reversa do DNA pela enzima transcriptase reversa. Esta enzima é capaz de sintetizar o DNA a partir de RNAm. Isolando-se RNAm das células, a enzima sintetiza cDNA.

Uma das vantagens desta técnica é o estudo dos genes activos na célula num determinado momento. O cDNA é uma versão simplificada uma vez que já não contém intrões nem as sequências reguladoras que os genes possuem. Outra vantagem é a utilização desta técnica para sequenciação de nucleótidos (seq. Cíclica).

Técnicas utilizadas em genética molecularA sequenciação cíclica baseia-se, numa fase inicial, na realização de um

PCR dito assimétrico em que um dos primers está em grande quantidade e o outro em baixa concentração. Numa primeira fase decorre de forma normal, a partir de determinada altura ou ciclo um dos primers esgota-se, o que significa que só uma das cadeias vai ser amplificada – DNA de cadeia simples. A vantagem é que a técnica de sequenciação necessita de DNA de cadeia simples para que a DNA polimerase se possa ligar.

A vantagem deste método é que se pode partir de pequenas quantidades de DNA inicial, pois não é necessário clonar o DNA (a seq. Clássica necessita de grandes quantidades).

Outro tipo de Biblioteca é a do DNAc que correspondem ao isolamento dos RNAm da célula com posterior transformação pela transcritase reversa. Vantagem das blibliotecas de cDNA é que elas representam todos os genes que se expressam.

Sequenciação de DNA – Método de Sanger (introdução à bioquímica)

Análise de Southern Blot – consiste na análise de hibridação de DNA com sondas marcadas. Mas antes da hibridação é necessário seguir uma série de passos:

separação por electroforese do DNA;

fragmentos ficam retidos na agarose (é necessário retirar as bandas da agarose mas de maneira que elas mantenham as mesmas posições relativas);

transferência do DNA para uma membrana de nylon ou nitrocelulose que são substâncias que não deixam passar o DNA e o fixam. Para esta “passagem” pode ser realizada uma electroforese vertical ou então, recorrendo aos fenómenos de capilaridade as bandas são arrastadas. Obtém-se assim uma fotocópia do gel maleável;

desnaturação de DNA (para que as cadeias fiiquem sobre a forma de uma hélice simples e se permita a ligação de uma sonda);

adiciona-se a sonda que pode estar marcada com um isótopo radioactivo ou com produtos que quando incididos com luz emitem uma fluorescência visível que irá impressionar a película de raio x;

Lavar o excesso (permanece apenas a sonda complementar à banda em causa) e secar;

realização da autoradiografia.

Variação da Técnica de Southern – Esta técnica não implica electroforese. O DNA total é colocado sob a forma de um ponto sobre uma tira e sobre essa tira é colocada a sonda para hibridação. Se houver hibridação há impressão da chapa de raio x (ponto escuro).

Outra das variações é a utilização de sondas ASO (Allele Specific Oligonucleotides). Estas são específicas de alelos e são capazes de hibridar apenas com uma das formas alélicas de um determinados gene. Coloca-se um ponto de DNA sobre a tira, a sonda actua, revela-se a chapa. A utilização destas sondas permite a genotipagem, o problema é que não há sondas para a maioria dos genes. Para se produzir uma sonda destas é necessário conhecer toda a sequência do gene e as várias variações alélicas.

Biblioteca genómica define-se como um conjunto de clones de DNA recombinante que representam todo, ou quase todo o genoma de uma espécie. Se fosse possível unir todo o genoma de uma espécie em vez de estar definido em cromossomas. O primeiro passo é cortar o genoma em diferentes fragmentos, o que tanto pode ser efectuado através de meios físicos (ultra sons) ou químicos (enzimas de restrição) cada um desses fragmentos vai ser clonado por um vector apropriado. Às vezes numa biblioteca genómica há pequenos fragmentos, há sempre pequenas regiões que não se conseguem obter. O conjunto dos vários clones de bactérias (plasmídeos recombinantes) constitui uma biblioteca genómica.

Há um tipo de biblioteca genómica especial, designada por contig. A diferença é que cada um dos fragmentos se sobrepõe ao restante, o que facilita o ordenamento dos vários clones.

Técnicas para detecção do polimofismo O polimorfismo é fundamental em todas as espécies porque senão não havia

variação genética e a evolução não seria possível.

RFLP (Restriction Fragment Lengh Polymorf)

Fragmentos de restrição são os fragmentos gerados pelas enzimas de restrição.

Com uma mesma enzima de restrição, na mesma região, mas em indivíduos diferentes se houver polimorfismo na região de reconhecimento da enzima são obtidos

fragmentos de diferentes tamanhos. O fragmento de restrição configura uma situação de marcador genético na medida em que é baseado na sequência de DNA, é facilmente identificável com a enzima de restrição e é transmitido de pais a filhos.

Como detectar um RFLP? Através do PCR ou Southern Blot (ver esquema de “Genética Veterinária”)

Southern Blot - Após extracção de DNA de um indivíduo, adiciona-se a enzima. È possível distinguir indivíduo heterozigótico (metade do DNA é cortado e outra metade não) e homozigótico para uma mutação (não há corte). Realiza-se electroforese, adiciona-se sonda para hibridação.

PCR – o procedimento é similar. É necessário a existência de primers que se liguem à volta da região de reconhecimento e depois dá-se a amplificação.

Utilizando a técnica de PCR aparecem todas as bandas (uma nada por fragmento), enquanto que com Southern depende da sonda que se utilizar.

- ANÁLISE DE LIGAÇÃO GÉNICA “LINKAGE”; LIGAÇÃO FACTORIAL (ENTRE DOIS GENES)

“Linkage”, em termos simples, trata-se do facto de alelos de genes diferentes, quando estão próximos num cromossoma, têm tendência a ser herdados em conjunto. Quer isto dizer, se tivermos um cromossoma ou um par homólogo com o gene A e os seus dois alelos A e a e o gene B com os dois alelos B e b, sempre que os homólogos A e B estiverem próximos um do outro então, os alelos A e B terão tendência a ser herdados em conjunto e os alelos a e b a mesma coisa.

A a B b

• •

Primeiro vamos rever o que se passa a nível da meiose para explicar o fenómeno da segregação génica, por uma das leis de Mendel, e que explica quais são os gâmetas produzidos por um indivíduo que vamos admitir não ser atípico. Vamos também admitir que existem dois cromossomas. Portanto, o genótipo deste indivíduo, é duplamente heterozigótico.

A a

• • • • B b

Par 10 Par 14

São quatro tipos diferentes de gâmetas que este indivíduo produz sendo eles: AB, Ab, aB e ab. Face aos gâmetas produzidos pelo outro indivíduo que se ia acasalar

com este, determinava-se o genótipo da descendência. Espera-se ter 25% de probabilidade de obter cada um dos quatro gâmetas diferentes. A razão disto está na tal lei de Mendel (lei da segregação independente- transmissão independente?) que refere que os cromossomas são repartidos de forma aleatória pelos gâmetas. Ou seja, durante a meiose, cada um dos membros do par 10 vai ser separado de forma aleatória para cada um dos gâmetas, isto é, um dos membros do par vai para um gâmeta e o outro vai para outro gâmeta e o mesmo acontece para o cromossoma 14. Esta separação vai originar os tais quatro tipos diferentes de gâmetas. A proporção esperada de 25% de cada um deles resulta dos acontecimentos da meiose, isto é, da separação dos homólogos e, por outro lado, da migração aleatória de cada um dos membros do par de homólogos para os gâmetas. Relembrar que cada gâmeta tem de ter sempre um representante de todos os pares de cromossomas que a espécie possui.

Voltando agora ao início, vamos imaginar que os genes A e B estão no mesmo cromossoma. Quais são os gâmetas produzidos por este indivíduo?

Este indivíduo vai produzir igualmente os quatro tipos de gâmetas referidos anteriormente pois durante a meiose ocorrem fenómenos de crossing-over que se encarregam de trocar e baralhar os alelos entre membros do mesmo par de homólogos. Quando ocorre o fenómeno de crossing-over, os cromossomas já passaram pela fase de síntese do DNA e, portanto, aparecem com dois cromatídeos finos.

A A a a A A a a B B b b B b B b

Crossing-over

O crossing-over vai estabelecer pontes entre dois cromatídeos finos, promovendo a troca de segmentos. No fim da meiose (quando os cromossomas homólogos se separam e vai o cromossoma de origem materna para um lado e o de origem paterna para o outro) e ainda a seguir, na segunda mitose da meiose (quando ocorre a separação dos cromatídeos finos) o resultado final vai ser: um cromatídeo filho igual ao do progenitor (AB); um outro cromatídeo filho exactamente igual ao do progenitor e que tem (ab), e cada um destes vai para um gâmeta diferente; temos ainda outro cromatídeo (Ab) e o outro que vai ter (aB).

Lembrando que cada um deles migrou para uma célula diferente, neste caso um gâmeta diferente, temos que as possibilidades de formação de gâmetas são exactamente aquelas que tínhamos referido há pouco. O número de crossing-overs por par de homólogos é variável conforme a espécie e conforme o sexo. Podem ser 3; 4; 5; 6; 7(no limite) no mesmo par de homólogos. Por outro lado, o local do acontecimento do crossing-over é aleatório, ou seja, pode ocorrer em qualquer ponto do cromossoma e pode afectar qualquer um dos quatro cromatídeos envolvidos, ocorrendo sempre entre cromatídeos que pertencem a cromossomas de origem diferente. Quando o número de crossing-overs é par não gera os chamados gâmetas trocados ou recombinantes. Quando falamos em grandes números (formação de gâmetas) vai existir um equilíbrio entre as situações de não

crossing-over, e formação de gâmetas iguais aos progenitores, e, por outro lado, o número de gâmetas recombinantes resultantes do crossing-over.

Não se pode afirmar que o crossing-over só afecta dois dos cromatídeos filhos nem que só há um crossing-over entre quaisquer genes que consideremos, pois podem haver mais e, se forem pares, anula-se o efeito de crossing-over.

Dizemos que os genes são independentes quando estão localizados em cromossomas diferentes ou quando estão suficientemente afastados para que entre eles ocorra crossing-over, neste caso a produzem, ao nível dos gâmetas, todas as combinações possíveis em proporções iguais.

Existem, no entanto, situações em que os genes estão localizados muito próximos, tendo tendência para serem herdados em conjunto.

Se tivermos um cromossoma com o gene A numa ponta e o gene B na outra ponta, em qualquer local que ocorra um crossing-over, é suficiente para gerar os tais gâmetas recombinantes. Mas se os genes estiverem “colados” um ao outro, a probabilidade do crossing-over ocorrer exactamente entre a e B é mínima. Neste caso formar-se-ão somente gâmetas (AB) e (ab) que denominar-se-ão de gâmetas não recombinantes.Esta situação pode ser quantificada por uma fórmula que nos dá a frequência de recombinação (Fr):

Fr = Proporção de gâmetas recombinantes

Nº total de gâmetas

Fr- medida de distância em mapas génicos. UNIDADE: cM (centimorgan) ou u.m. (unidade de mapa)

1 cM- distância entre dois genes cuja Fr é 1%

1 cM ≈ 1 Mb (1000 Kb, 1.000.000 pb)

A frequência de recombinação pode ser calculada quer para gâmetas quer para indivíduos e em qualquer dos casos, o que esta determina, é a probabilidade ou a proporção de crossing-overs entre os genes considerados. No caso anterior, em que os genes se encontravam muito próximos, não ocorrendo crossing-overs entre eles, Fr seria igual a zero. Se Fr for de 1% (em 100 meioses apenas numa delas ocorrer um crossing-over entre A e B), vamos ter 1% de gâmetas do tipo recombinante e 99% de gâmetas não recombinantes. A Fr pode ser dada em percentagem e como ela reflecte a distância entre genes pode ser aproveitada para o cálculo da distância entre genes num cromossoma. Se ao analisarmos o nº de recombinantes verificamos que ele está abaixo do nº que esperávamos obter se os genes fossem independentes, então podemos afirmar que quanto menor for Fr mais próximos os genes estão. Esta relação entre a distância dos genes e a frequência de recombinação originou uma unidade de distância em mapas génicos (u. m. –unidades de mapa).

Fr é igual a zero quando, teoricamente, nunca há crossing-over entre dois genes, embora na prática não seja possível pois pode sempre ocorrer crossing-over entre dois genes mesmo que eles estejam “colados” um ao outro.

Fr igual a 100 é um valor impossível pois significa que naquela fórmula todos os genes são recombinantes, seria verdade se em todos os quatro cromatídeos envolvidos na meiose tivesse ocorrido um crossing-over, gerando somente gâmetas recombinantes. Mas falando em milhares de gâmetas produzidos isso é impossível.

O valor máximo para a frequência de recombinação é de 50.

Quando a frequência de recombinação se aproxima do valor limite em que se consideram os genes independentes (50%), não é possível fazer uma extrapolação entre Fr e a distância génica. Somente quando o valor para Fr se apresenta entre 20%-30% é possível fazer uma equivalência directa para a distância génica, em cM. Acima de 30% já nos estamos a aproximar do valor limite de 50%.

Mapas de ligação

25 20

50 30

75 • 30

100 20

125 25

150

Mb cM / 125cM

Genoma haplóide

ANÁLISE DE LIGAÇÃO GENÉTICA

Ligação factorial = ligação genética

Frequência de recombinação – vai-nos dizer o que ocorreu na meiose (crossing-over). Serve para genes no mesmo cromossoma ou mesmo em cromossomas diferentes.

__nº de indivíduos recombinantes__ nº total de indivíduos

Ligação génica estreita – quando os dois genes estão muito próximos e raramente são separados pelo crossing-over. Freq de recombinação nunca acima de 10%.

Teoricamente não ocorre crossing-over entre dois genes “colados” um ao outro, embora na prática isto possa acontecer, mesmo estando os dois juntos. Na prática há sempre uma probabilidade de mesmo que a distância entre dois genes seja nula ocorrer “crossing-over”, apesar de neste caso a frequência de recombinação ser 0. Valor máximo para a frequência de recombinação é 100%.

Cis (coupling, acoplamento) – quando dois alelos de dois genes em ligação se encontram no mesmo cromossoma de um par de homólogos. A,B e a,b

Trans (repulsion) – quando dois alelos de dois genes se encontram em cromossomas homólogos opostos. A,b e a,B

Estes dois conceitos permitem-nos dizer que: quando há uma ligação estreita entre genes os alelos que se encontram em posição cis tendem a manter-se de geração em geração.

A a

B b

Cruzamento de prova (test - cross)– é o ideal para calcular a frequência de recombinação, consiste do cruzamento entre um indivíduo heterozigótico com um homozigótico recessivo. Método: são recolhidos progenitores homozigóticos (geração paterna) que geram um indivíduo (geração F1) que é heterozigótico para todos os genes considerados. Depois vem o cruzamento de prova em que se cruza este indivíduo duplamente heterozigótico com outro homozigótico recessivo para os genes considerados.

Se quando se faz o cruzamento de prova nunca aparecem indivíduos recombinantes, isto é, todos eles têm o genótipo correspondente aos progenitores F1. É mais fácil olhar para estes resultados uma vez que o resultados só vai depender dos gâmetas do F1 heterozigótico, pois a contribuição do outro é sempre a mesma. Numa família pequena pode-se esperar que não haja resultados recombinantes mas numa descendência de 1000 indivíduos (por exemplo) se não houver indivíduos recombinantes pode-se afirmar que existe uma ligação génica completa.

Também importante na elaboração de cruzamentos de prova é determinar se os indivíduos são ou não recombinantes, depende do haplótipo do indivíduo F1. Haplótipo – é a designação de todos os alelos ( que estamos a considerar) pertencentes a um determinado cromossoma de um par de homólogos. Constituição alélica dum cromossoma de um par de homólogos. Qualquer indivíduo tem sempre dois haplótipos, um para cada cromossoma homólogo.

Quando se olha para o fenótipo dos descendentes como intuito de descobrir quais os recombinantes, procura-se os que apresentam apenas a característica A ou a característica B, no primeiro caso e os que apresentam as duas ou nenhuma no segundo caso.

Estas são situações extremas em que a frequência de recombinação é de 50%. Encontram-se muito frequentemente valores intermédios entre estes 50% e os 0% no caso de ligação génica completa.

O grande problema para este tipo de estudo é o nº de descendentes que é necessário obter. Por isso usa-se a drosófila e os ratinhos, o que em homens e animais domésticos é difícil, apesar de com inseminação artificial se conseguir grande nº de descendentes em vacas leiteiras e touros, no geral não é fácil.

ANÁLISE DE LOD-SCORES

Método estatístico para averiguar da existência de ligação entre genes (ou entre um gene e um marcador), extraindo informação de pequenas famílias.

Baseia-se no cálculo da probabilidade relativa de determinada descendência resultar de um par de genes ligados, versus resultar da segregação ao acaso.

A a d D B B

ODDS RATIO – razão de probabilidades para uma determinada família.Ou seja, calcular a probabilidade de uma descendência ser resultante da ligação entre os genes ou, pelo contrário, ser resultante de uma segregação ao acaso desses genes.

A frequência de recombinação deriva de uma fracção recombinante ou do número total de descendentes não recombinantes e recombinantes e esta fracção de híbridos recombinantes é designada por θ ou fracção recombinante.

Se: Fr = 10%, então θ = 0,1 Se: Fr = 20%, então θ = 0,2

Ou seja, há uma equivalência entre os 2 conceitos.

Fr diz respeito à fracção de híbridos recombinantes numa determinada família.

rFr = ------ ( r = θ ) n + r

Este método tenta extrair informação de pequenas famílias mas há condicionantes: pelo menos um dos progenitores ter de ser heterozigótico para o marcador, porque essa é a única forma de, a nível da descendência, verificarmos se há ou não recombinação entre o híbrido e o marcador. Temos de encontrar uma co-relação positiva entre um dos alelos dos marcadores e a presença do alelo para a doença.Assim, nem todas as famílias servem para este tipo de análise.

Numa família com 4 descendentes:

� --------------------------------------------------------Ο A A a a B B b b

� ------------------------------Ο A a a a B b b b

� Ο � Οa a A a a a A a b b B b b b b b

sem recombinação recombinação

RAZÃO DE PROBABILIDADES DADA PELA FÓRMULA:

odds ratio = (1 - θ )n θ r

___________ ( ½ )n+r

n= nº de filhos não recombinantesr= nr de filhos recombinantesn+r= nr total de filhos do casal

A probabilidade de 2 acontecimentos independentes é igual ao produto das suas probabilidades.

Filho recombinante porque o pai era AB e ele é Ab.A fémea é homozigótica recessiva podemos esquecer ou negligenciar a sua contribuição.

3 Descendentes não recombinantes porque um é ab (igual ao α tipo paterno), outro AB e outro ab.

Se a segregação for ao acaso qual será a probabilidade de nascer 1 filho recombinante e um filho não recombinante?

A a B b

Casos: A A a a B b B b (1)

(1) os que resultam do crossing-over

não há ligação entre estes dois genes e a FR é 50% e a probabilidade de nascer um filho recombinante é 50%. r=0,5n=0,5

por exemplo, se o nr de filhos for T para calcular as probabilidades de nascimento para as diferentes combinações de filhos recombinantes e não recombinantes a partir da seguinte equação:

T (r+n)t

Para T=2 o binómio será:

r2 + 2rn + n2

cada um destes factores corresponde á probabilidade de um determinado conjunto de eventos ocorrentes simultaneamente:

P(r2)=probabilidade de nascimento de 2 filhos recombinates=0,52

P(n2)=probabilidade de nascerem dois filhos não recombinantes=0,52

P(rn)=probabilidade de nascer 1 recombinante e 1 não recombinante=2x0,5x0,5

Como a única coisa que difere é o facto de nascer 0, 1 ou 2 filhos recombinantes/não recombinantes, vamos utilizar estes 2 termos de binómio e chegar à conclusão que 0,5/n+r é o mesmo que calcular a probabilidade de:

(0,5)r x (0,5)n = (0,5)n+r = probabilidade de nascer n+r filhos (T) em que a probabilidade de nascer um recombinante é 0,5 e a P de nascer um não recombinante é também 0,5.

Exemplo:

Fr=10%

Para 4 descendentes – odds ratio = 0,93 x 0,11

___________ (0,5)4

A probabilidade de nascerem 4 filhos, sendo 3 não recombinantes e 1 recombinante vai ser igual a 0,54.

Esta é a prob. deste casal ter esta descendência admitindo que não há ligação entre os genes.

Se houver ligação entre os genes:

Como não sabemos qual é o valor da Fr o método de lod-scores baseia-se na atribuição sucessiva de diferentes valores para θ desde 0 até 0,5, isto é, o método assume que a Fr é, por exemplo, 0,1 e faz os cálculos e determina qual é o valor da Prob de 4 descendentes, sendo 1 recombinante e 3 não recombinantes se a Fr fosse 0,1.

Corre todos os valores de uma Fr de 0 até 50%.

Se a Fr=50% o θ = 0, 5 e o numerador vai ser igual a (0,5)4 porque assume que os genes vão ser independentes e assim o valor vai ser igual ao valor que aceitámos quando dissemos que os genes não estavam ligados.

Da relação entre as probabilidades de um acontecimento ligado a um determinado valor de θ e a prob. associada à independência entre 2 genes resulta o valor da razão de probabilidades e é este valor que nos diz se há uma tendência para a ligação (numerador > denominador) ou para a independência dos 2 genes uma vez que o valor do denominador vai ser maior que o do numerador.

A probabilidade de ligação é ligeiramente maior que a probabilidade de se tratar de genes com segregação independente.

Para θ = 0 Odds ratio = 0Para θ = 0,5 (é dizer que os genes são independentes) Odds ratio = 1Para 0<θ<0,5

O valor de odds ratio depende do tamanho da família e do nr de indivíduos recombinantes e não recombinantes.

Mesmo que os genes sejam independentes a família pode não ter filhos recombinantes.

O método determina a razão de P´s desde θ = 0 até 0,5 e determina vários valores para esta P.

Por outro lado, faz isto para todas as famílias que nós dispunhamos, isto é, se tivéssemos 5 ou 10 famílias íamos calcular a razão de P´s para cada família e dentro dessas famílias fazer o cálculo para todos os valores de θ .

No fim, combinando esses dados todos obtemos no fim o chamado lod – score (log das probs e que corresponde ao ∑ do log das razões das probs calculadas para cada valor de θ.)

(A soma de log ⇔ ao produto desses log)

é possível traçar um gráfico de valores de razões de probabilidades.

Logs das razões de probabilidades calculados para os diferentes valores de θ.

Somam-se todos estes logs e esse valor total ( ∑ dos logs da razão de probabilidades) é o lod-score ou seja, é a pontuação total que se obtém para cada um dos valores de θ.

Olhando para todos os valores de θ, determinamos qual é o que tem o valor de lod-score mais elevado.

Existe ligação génica quando o valor de lod-score é ≥ a 3

O que equivale a uma razão de probabilidades (odds ratio) ≥ 1000/1 estamos a favorecer que quem prevalece nesta razão de probs é a explicação dos dados serem devidos à ligação.

Pelo contrário:

Independência génica para lod-scores ≤ -2Odds ratio ≤ 1/100

Favorece o denominador ou seja, a prob daquele caso resultar devido à independência dos 2 genes.

Se o lod-score é ≥3 então o valor + provável para a Fr, que é o que queríamos saber, 1º determinámos que há ligação entre os 2 genes e que a Fr é cerca de 0,1.. ou seja, estes genes estarão a cerca de 10centimorgans ou 10 milhões de pares de bases e existe ligação génica entre eles.

LIMITAÇÕES DO MÉTODO

1. Heterogeneidade genética

Termo que se aplica quando um determinado fenótipo para uma doença ou uma determinada característica, pode resultar de genes diferentes.

Ex. osteogenenis imperfecta pode resultar de mutações de 2 genes diferentes

Podem ser de tipo I (gene COL1A1) ou tipo II (gene COL2A2) e como não sabemos, imaginando que estamos no inicio da investigação , vamos encontrar marcadores que estejam associados por lig. Génica à doença, ao local do gene que ainda desconheço qual é.

Imaginando um grupo de famílias que resultam de um tipo de mutação do gene COL1A1 e outro do gene COL2A2. Faz-se uma analise lod-score entre diferentes marcadores que se localizam espalhados por todo o genoma. Extrai-se o DNA determinam-se os marcadores e todos eles espalham-se ao longo do genoma e é feita uma análise matemática tentando encontrar lod-scores positivos, ou seja, ligações entre a doença e os tais marcadores. Se tivermos famílias misturadas, a(s) família(s) em que acontece isto, quando fizermos uma análise lod-score com o marcador X (do gene COL1A1) vai dar-nos um valor menor que 2 pq não há relacão entre o gene e o marcador q estou a estudar. Quando chego ao fim os valores anulam-se e n se tiram conclusões.

FACTORES DE DESTABILIZAÇÃO NUMA ANÁLISE LOAD SCORE:

1. Heterogeneidade genética ex: osteogenesis imperfeita tipo I – gene COLIA I, osteogenesis imperfeita tipo II- gene COLIA II

2. Desconhecimento da fase cis ou trans entre o marcador e um alelo para uma doença recessiva

Numa análise load score em que não se conheça a posição correcta entre o marcador e o gene para a doença faz-se o estudo para as duas posições (a cis e a trans) e depois calcula-se a média do resultado e a partir daí vemos se há uma tendência para se considerar que há ligação entre o marcador e o gene ou não, se provavelmente eles são independentes.

SE o resultado obtido for ≤ 2 não há ligação entre o gene da doença e o marcador que estou a estudarSE o resultado obtido for > 3 então há ligação

3. Recombinação genética

O crossing-over (recombinação genética) é um factor de destabilização do método de load score

Neste caso o marcador e o gene para a doença estão em posição cis.

Note-se que a presença de “A” está associado à doença no entanto observa-se na geração F2 um indivíduo “aa” portador da doença, isto deve-se precisamente à recombinação genética, ou seja deu-se crossing-over

O rigor do diagnóstico é nos dado por 1-θ

No caso anterior o risco da doença para indivíduos que herdem o gene A é 1-0,03 = 0,97 = 97%, Já o risco da doença para indivíduos que não herdem o gene A é 0,03 = 3%

Limitações às técnicas de Lod-score

I Aa aa

II

Aa Aa aa

O alelo para a doença pode estar em posição cis (no mesmo cromossoma) para o alelo dominante, ou em posição trans.

b- alelo para a doença A a A a ou b B B b

Os recombinantes serão diferentes se se considerarem os cis ou trans. Podemos considerar a média dos dois.

- heterozigótico - normal - recessivo para o alelo da doença

I

aa AA

II Aa aa

III

Aa aa Aa aa Aa

Rigor de diagonóstico (a partir do valor de θ ) = 1 - θ

Análise de lod score – determina o valor mais provável de θ (a frequência de recombinação entre dois loci)

Se θ = 3% (3 cM), o risco de doença é 1 – 0.03= 0.97%A probabilidade de Ter a doença era de 3%.

Quanto mais próximos os marcadores estiverem do gene da doença, menor o risco de receber a doença.

Todas estas análises de ligação fazem-se quando ainda não se sabe qual o gene da doença. Se soubessemos usavam-se sondas para determinar.

B – doença A a A a

B b b B

Descendências futuras: Doença AB Doença aB o marcador A não serve para fazer o diagnóstico da doença.

Equilíbrio de ligação – associação aleatória em cis de alelos de loci em ligação

Desequilíbrios de ligação – quando frequência de haplotipos por associação em cis de alelos de loci em ligação é superior à esperada pelo acaso.

....fundador – ocorre em raças cridas pelo Homem; a frequência é muito alta ao longo da progressão de raça. (ex: Barrosã, Boxer)

Tempo necessário para se atingir o equilíbrio.Vantagem selectiva para um dado haplotipo – mesmo que a distância entre os loci fosse muito grande a frequência é enorme vantagem selectiva para o indivíduo que a possui.

Mapa físico – indica localização ou posição de características de enzimas de restrição no cromossoma.

Genómica

É uma parte da genética cujo o objecto é a análise do genoma das várias espécies. É um conceito relativamente recente, inicia-se com os programas de sequênciação dos genomas de algumas espécies, nomeadamente o Homem, bovinos, porco e cão.Pretende-se analisar o genoma à luz da genética molecular, isto é, fazer uma caracterização molecular do genoma essencialmente ao nível da sequência do DNA.

Estudo de ferramentas ligadas à manipulação e análise de grandes quantidades de DNA.

A finalidade destes estudos é obter uma sequênciação completa do genoma, isto é, determinar toda a sequência de nucleótidos do genoma da espécie. - função e interações génicas; - organização e evolução dos genomas.

Genoma – todo o material genético de uma espécie.

A análise do genoma pode ser feita a vários níveis, da mesma maneira que quando se faz um mapa de um país este pode ser mais grosseiro ou mais detalhados.

A primeira fase da análise é imputação genes e marcadores a um cromossoma específico, isto é, determinar qual o cromossoma onde se encontra um determinado gene.

Elaboração de mapas cromossómicos e físicos.- mapas cromossómicos (determinam a posição e distâncias de genes ou

marcadores no cromossoma)- mapa físico (localização de um fragmento clonado no cromossoma; são

determinações físicas para caraterísticas que não são genes)

Sequênciação de nucleótidos do genoma da espécie (nível mais baixo de resolução).

Análise de ligação para determinação de genes no cromossomaHibridação in sítu – utilizar sondas marcadas, típicas de uma determinada sequência de DNA e ver em que zona é que ela se liga.

PFGE (electroforese para grandes fragmentos de DNA)Hibridação de células somáticas

Mapeamento cromossómico pode ser feito com uma análise de recombinação ou com híbridos de células somáticas irradiados.

O mapa físico pode ser a posição num cromossoma de determinados locais de restrição.

...Contigues (fragmentos de DNA clonados) – bibliotecas genómicas em que os fragmentos clonados se sobrepõem; permite a determinação sequencial dos vários clones.

Como que se imputam determinados genes e marcadores a um deteminado cromossoma?- Ligação génica- Hibridação in sítu:

- hibridação de sonda a uma região específica de um cromossoma (já desnaturado), por complementariedade de bases - FISH (fluorescent in sítu hybridation)- os marcadores são fluorescentes- rearranjos cromossómicos

correlação entre a inactivação génica por quebras cromossómicas e o cromossoma afectado.

- PGFE (pulsed field gel electrophoresis) – electroforese em campo versátil. Separação electroforética de cromossomas inteiros (depende do tamanho do cromossoma)

Alternância de variações eléctricas no campo (campos eléctricos ortogonais). O DNA (com grande carga negativa) sofre alteração de carga eléctrica; quanto maior o tamanho da partícula mais dificuldade tem em recuperar das alterações. A separação também é feita tendo em conta o seu tamanho.Hibridação de sondas após de Southern plot

- híbridos de células somáticas (fusão de células na presença de vírus)células próximas, como o vírus é pequeno, quando actua liga-se a receptores de uma célula e células vizinhas; isto aproxima as paredes celulares, as membranas citoplasmáticas fundem-se, tal como os seus núcleos.

- perda progressiva de cromossomas- selecção de clones com representantes de todo o complemeto cromossómico- correlação entre o fenótipo de um marcador e a presença ou ausência de

determinados cromossomas

Análise genómica – níveis de resolução- imputar genes e marcadores a um cromossoma específico

- mapas cromossómicos

posição e distâncias de genes e marcadores no cromossoma

- mapa físico

determinar a posição no cromossoma de clones

- sequenciação do genoma

(nesta aula analisa-se o segundo ponto)

Os mapeamentos analisados são todos baseados na análise por ligação.Com a descoberta dos marcadores moleculares com polimorfismos elevados e facilidade de identificação do fenótipo os mapas de ligação evoluíram bastante em termos de precisão, o que possibilitou a elaboração de mapas com resolução até 1 CM. No entanto, isso não era suficiente, visto que, em algumas espécies, 1 CM equivale a 1 milhão de pares de bases.

Mapeamento por RFLPs – A primeira técnica baseada na ligação é o mapeamento por RFLPs (polimorfismo dos fragmentos de restrição), isto é, a existência ou não de um local de restrição de uma enzima leva a que o padrão de restrição seja alterado o que pode constituir um marcador.

Inconvenientes do mapeamento por RFLPs:- polimorfismo limitado (geralmente só existem dois alelos)

- baixa pecentagem de heterozigotia (relativamente a estes locus)

Mapeamento por SSLPs – marcadores por alteração do número de sequências em tandem repetidas (polimorfismo no comprimento das sequências). Quando se consideram DNAs repetitivos consideram-se os mini e microsatélites. Em ambos os tipos é possível que diferentes indivíduos possuam um número diferente de repetições em tandem, o que pode configurar a existência de um marcador polimórfico.

- DNA fingerprints

análise de DNA

minisatélite por Southern Blot

- VNTRs

análise de DNA

microsatélite por PCRs

O que se pretende em ambos os casos é, a partir de um marcador já conhecido, tentar fazer um mapeamento por ligação de características a genes cuja localização é desconhecida.

Mapeamento por SST: baseia-se na determinação de um genótipo de um espermatozóide por análise de PCR do seu DNA. Quando se calculam as frequências relativas de cada um dos tipos de espermatozóides é possível calcular a frequência de recombinação e determinar se essa frequência indica a existência de ligação génica. Permite calcular, sem ter de recorrer a cruzamentos, a frequência de recombinação e a determinação de mapas de ligação de diferentes marcadores ou genes.

Análise de Homozigotia: quando se fazem cruzamentos consanguíneos pode acontecer o seguinte caso. Uma progenitora heterozigótica (sem doença) acasala com um macho homozigótico dominante e nascem duas fêmeas ambas heterozigóticas. Pode acontecer que os seus filhos herdem o gene recessivo. Neste caso, estes alelos em que é possível traçar a sua origem a um progenitor comum dizem-se alelos idênticos por descendência. Se existir, a presença simultânea do alelo recessivo e do marcador, provavelmente estão em ligação factorial.

Uma ligação entre um alelo recessivo e um marcador molecular indica provavelmente uma ligação génica.

Análise de RAPDs: DNAs amplificados por PCRs baseado em primers sintetizados ao acaso. Amplifica-se o genoma de todo o indivíduo com base nesse primer.

Outro tipo de elaboração de mapas cromossómicos é baseado nos híbridos de células somáticas. Nomeadamente:

- Chromossome mediated gene transfer: neste caso isolam-se cromossomas por citometria de fluxo – FACS - suspensão de cromossomas metafásicos de tal maneira que cada gota contém apenas um cromossoma. Antes os cromossomas foram marcados com um corante para AT e GC. Logo, o padrão de coloração depende da riqueza de bases. Esses cromossomas isolados podem ser fundidos – híbridos de células somáticas.Correlação entre o fenótipo de determinados marcadores e o cromossoma presente.

Quanto maior a proximidade de dois marcadores num cromossoma, maior é a frequência com que são transferidos juntos.

- Híbridos irradiados (raios x):quebra de cromossomas por irradiação

fusão de células irradiadas com células de ratinho

integração dos fragmentos

painel de híbridos

resolução dos mapas: 0,1 CM de densidade

mistura de cromossomas irradiados com os do rato

Análise:

- cálculo da frequência de retenção de marcadores nos híbridos

- cálculo da frequência de corretenção de pares de marcadores

- marcadores ligados – menor a probabilidade de quebras por irradiação entre eles. Frequência de corretenção é maior que a frequência de retenção individual (marcadores ligados no mesmo cromossoma).

Aumento da resolução dos mapas porque os fragmentos são muito pequenos.

ANÁLISE GENÓMICA

Mapas físicos – determinar a posição no cromossoma de clones

O conjunto de técnicas que vamos abordar vai procurar a correspondência entre um determinado clone, de uma biblioteca, e a sua posição no genoma da espécie.

- Mapeamento de contigs: Contig – biblioteca genómica em que os fragmentos clonados estão sobrepostos uns aos outros.

Todos estes clones representam o genoma de uma determinada espécie

O objectivo é alinhar os clones de tal maneira que seja possível obter uma sequência completa do genoma. Na biblioteca genómica os clones não estão ordenados.À medida que se vão fazendo estas bibliotecas de contigs vamos reduzindo o seu número até termos o número igual ao número de cromossomas da espécie.

Como se faz o alinhamento dos clones para uni-los formando os contigs1, 2, 3... ?

A partir do momento em que temos os clones alinhados podemos depois fazer análise de procura de genes ou, sabendo onde está um determinado marcador (ligado a um gene), fazer a sequência desse gene.

- CLONE FINGERPRINTSIdentificação de padrões de restrição múltipla específicos de cada clone.

Para cada um dos clones obter o padrão de restrição (elaborar o mapa de restrição – cortar cada clone com diferentes enzimas de restrição e elaborar o mapa). Se houver sobreposição entre os clones vão-se obter no mapa os mesmos padrões de restrição – alinhamento dos clones.

Se dois clones diferentes partilham, pelo menos parcialmente, o padrão de restrição é porque eles são contínuos uns aos outros.

- STS Sequence Tagged Sites (sequências únicas amplificadas por PCR)

São regiões dos clones, geralmente nas extremidades, que são identificadas pelo PCR e que só existem naquele local, em todo o genoma.

Existe um par de primers que amplifica uma determinada região do genoma, e apenas essa, e com base nisso é possível proceder à identificação do STS (marcador STS). Isto é, se um clone tem numa extremidade um marcador STS 1 e ao lado um STS 44, e um outro tenha o STS 1 e o STS 44 é provável que seja a mesma região que está clonada e que, portanto, haja continuidade entre os dois clones.

- Clonagem Shotgun Fragmentação mecânica do genoma Clonagem shotgun Sequenciação das extremidades Alinhamento dos clones

Tem esta designação porque é uma clonagem feita ao acaso, baseada na fragmentação mecânica do genoma (geralmente com banho de ultra-sons). Estes fragmentos são então clonados aleatoriamente em vectores apropriados, dependendo do tamanho. Uma das formas de os alinhar é fazendo a sequenciação das extremidades de cada um dos fragmentos. (100 ou 200pb). O processo é o mesmo, isto é, se tivermos sequências comuns em clones diferentes estes vão ser, provavelmente, contíguos.

Clonagem – inserção do fragmento num vector de sequência conhecida.

O sangue é uma das fontes mais utilizada para a extracção de DNA.

- Chips de DNA Matrizes alinhadas de clones Hibridação com clones específicos Mapeamento físico

Estes chips têm alguma analogia com os chips electrónicos de silício pelo facto de se basearem na produção de matrizes alinhadas de todos os clones que possuímos da espécie, isto é, numa membrana adequada coloca-se o DNA de cada clone, tipo DOT BLOT (é colocado num único ponto), fixa-se, ficando com um filtro que contém toda a representação dos clones dessa espécie.

Esta técnica também é utilizada para fazer uma análise funcional sobre quais os genes é que estão a ser expressos numa determinada célula, em cada momento.

A vantagem desta técnica é permitir uma análise simultânea de milhares de sequências de ácidos nucleicos, tornando-se muito mais rápida do que, por exemplo, uma análise de Southern.

- Clonagem posicional

- Clonagem génica baseada na determinação, o mais aproximada possível da sua posição

- Partindo de marcadores (já mapeados em ligação génica)- Pesquisa de sequências codificantes

Com estas técnicas vamos tentar descobrir a posição de determinados genes no

genoma da espécie. O termo clonagem posicional vem do facto de se pretender a clonagem de um

determinado gene (desconhecido) baseada na obtenção da posição desse gene. A análise parte da determinação do mapa de ligação de um determinado gene

com um conjunto de marcadores já identificados, isto é, a sua posição nos vários clones da espécie é conhecida.

2 técnicas:

- Chromossome Walking - Chromossome Jumping

A clonagem em si não nos diz qual é o gene, isto é, o que nós temos são só sequências de pares de letras. A maior parte do genoma é não codificante.

Chromossome Walking

Vamos determinar, progressivamente, a sequência nos vários clones.Conjunto de clones que correspondem a uma determinada zona do genoma. O que se faz é, partir de uma sequência conhecida, geralmente um marcador, uma hibridação procurando dentro de uma biblioteca genómica...

A partir de um clone isolar um pequeno fragmento, proceder à sua subclonagem para pesquisar no resto da biblioteca genómica.O ideal é ter dois marcadores ligados aos genes, um de cada lado.

Chromossome Jumping Áreas dificilmente clonáveis (DNA repetitivo) Digestão com enzimas de restrição Circularização dos fragmentos Corte e clonagem das extremidades Jumping library

A ideia é a mesma e surge pelo facto de determinadas zonas do genoma não serem facilmente clonáveis, ou mesmo impossível de o ser. Há regiões de DNA repetitivo que não se conseguem clonar, isto é, a partir de um fragmento, cortado de forma mecânica ou com enzimas de restrição, é impossível fazer a ligação a um vector já aberto, pois pode haver recombinações e perde-se o fragmento.

Não se faz clonagem de toda a sequência do genoma, mas corta-se, com enzimas de restrição, fragmentos de tamanho razoável (grandes) que contém as zonas que são dificilmente clonáveis e circularizar (promover o fecho da sequência de DNA).

Seguidamente, corta-se a sequência eliminando toda a região não clonada, e o pequeno fragmento resultante, por ter menor tamanho e não conter DNA repetitivo, vai ser clonado num vector apropriado.

O subclone vai ser utilizado como veículo de hibridação, isto é, o seu DNA vai ser utilizado para hibridar com uma segunda região dos tais fragmentos de restrição quando a sequência foi cortada, permitindo identificar um segundo ponto de salto para continuar a aproximar do tal gene que interessa estudar.O fragmento de restrição, que se inicia com este segundo ponto de salto, vai ser circularizada, e assim sucessivamente, até nos aproximarmos dos genes.

Sequênciação do genoma:- manual- automática

MUTAÇÃO

• MUTAÇÃO PONTUAL – alterações a nível da sequência do DNA que não são corrigidas, ao contrário do que já se disse em relação aos cromossomas que são as aberrações cromossómicas.São de 2 tipos:

1. transversão – não são as mais frequentes. Ocorre a substituição de uma base púrica por uma base pirimídica ou vice-versa.

Ex: GC → TA

O processo de mutação não afecta simultaneamente os 2 nucleótidos. O que pode ocorrer, neste exemplo, o G sofre uma transversão e é substituído por uma timina (pirimidina) e passa a não ocorrer emparelhamento entre o T e o C e, na replicação do DNA seguinte, quando há separação das cadeias o T que estava com a A vai ser complementado por uma A. A mutação também pode ocorrer com a citosina que tinha sido substituída originalmente por uma adenina e portanto ficava um par GA e na replicação seguinte é que o G era substituído pela T.

2. transição – mais frequentes. Substituição de uma base púrica por outra púrica ou substituição de uma pirimidina por outra pirimidina.

Ex.: GC → AT

Tanto poderia ter sido a guanina a sofrer a mutação e ter sido substituída por uma adenina ficando AC e depois na replicação seguinte a C substituída pela T ou também podia ter sido a citosina a ser substituída pela timina. Sempre dentro das purinas ou das pirimidinas.

3. Adições ou delecções nucleotídicas

Em vez da substituição de um nucleótido pode aparecer uma base extra ou várias; ou a delecção de uma ou várias bases.

Ex.: 211delG – delecção de uma guanina na posição 211 da sequência nucleotídica.

• MUTAÇÃO NONSENSE

Qualquer tipo das mutações referidas anteriormente pode originar este tipo de mutação.Alteração de um tripleto funcional para um codão stop. (tripleto = sequência de bases na cadeia do DNA e codão = sequência de tripletos de bases no RNA mensageiro. )

ex.: TAT - Tyr

TAA - stop

• MUTAÇÃO MISSENCE

Ocorre a substituição do aminoácido que está codificado.Ex.: y358C ou Tyr358Cys na posição 358 encontrava-se inicialmente uma tirosina que vai ser substituída por uma cisteína.As posições são já da proteína e não da sequência nucleotídica uma vez que estamos a falar de aminoácidos.

Muitas vezes os codões stop são abreviados por um * ex.: Tyr358* Quer isto dizer que o codão que codificava a tirosina deu origem a um codão stop (na posição 358).

• MUTAÇÕES SILENCIOSAS

São a designação dada a qualquer tipo de alteração da seq. Nucleotídica que não provoca a alteração do aminoácido codificado.São consequência da redundância do cód. Genético. A redundância manifesta-se no facto de vários codões poderem codificar o mesmo aminoácido. Geralmente esta redundância ocorre a nível da 3a posição do tripleto. Exemplo:

5´ GAT 3´ - Asp

5´ GAC 3´ - Asp

• MUTAÇÃO FRAMESHIFT

- Qualquer alteração que altera a grelha de leitura aberta (ORF)Geralmente provoca mutações missence e/ou nonsense. Quando se altera a grelha de leitura os tripletos a partir de determinado momento ficam alterados e por isso, ou se codificam aminoácidos diferentes ou aparece o codão stop prematuro.Uma mutação que dê origem a um codão stop mas que não origine uma alteração da grelha de leitura não pode ser considerada mutação frameshift.

• MUTAÇÃO SOMÁTICA

Que ocorre em células somáticas - são todas as células que não são células germinativas (células da linhagem dos gâmetas)Não é transmitida à descendência.

Dependendo do momento em que ocorre, pode afectar um n.º variável de células. Se a mutação for muito precoce no desenvolvimento embrionário pode afectar um orgão inteiro ou uma grande parte das células desse ser; se a mutação ocorrer depois do nascimento afecta um nr restrito de células.

São responsáveis por tumores ou pelo aparecimento de doenças de uma fase mais tardia da vida dos indivíduos.

• MUTAÇÃO GERMINAL

Que ocorre nas linhagens celulares gaméticasEventualmente transmitida à descendência

Relacionado com estes 2 tipos de mutação:Mutação – Perda da Heterozigotia (LOH)

Etiologia genética de doenças recessivas em que é herdado 1 alelo mutante germinal – a partir daqui é heterozigótico (1 alelo normal e 1 mutante) – não manifesta a doença

A doença ocorre (manifesta-se) por um evento de mutação somática no alelo normal, perdendo-se assim a heterozigotia protectora.

Ocorre qdo um dos pais é portador da doença ou quando tem mesmo a doença e o outro pai não é.

CITOGENÉTICA – a área da genética que estuda os cromossomas

1.Morfologia dos cromossomas 2.Cariótipo normal 3.Aberrações cromossómicas (qualquer alteração verificada a nível da estrutura ou da

morfologia dos cromossomas)

1. Morfologia dos cromossomas

Em Citogenética é normal trabalhar com cromossomas metafásicos (com 2 cromátides ou cromatídeos) onde cada cromossoma é constituído por 2 cópias exactamente iguais, em termos genéticos.

Num cromossoma metafásico, como em qualquer outro cromossoma, é possível definir 3 zonas: telómeros (extremidades dos cromossomas), centrómero e braços (longo e curto).

Telómero Braço curto (“p”) Centrómero

Braço longo (“q”) “p” - pettit

2 cromátides

telómeros – importantes para a manutenção da integridade dos cromossomas (envelhecimento); não contêm informação codificante.

centrómeros – região onde o cromossoma reduz o seu diâmetro (constrição primária, na medida em que, podem existir outras constrições secundárias que não são centrómeros) e região que se liga às fibras do fuso acromático, permitindo a migração dos cromossomas para os pólos da célula durante o ciclo celular.

Quando os telómeros dos cromossomas quebram, devido a doenças genéticas, estes têm tendência a juntarem-se topo a topo a outros que também não têm protecção a nível das extremidades – sticky chromossomes.

Um cromossoma sem centrómero (acêntrico) perde-se na mitose pois não tem capacidade de migrar para os pólos da célula, na medida em que não se liga às fibras do fuso acromático.

Parâmetro de distinção entre o braço longo e curto: tamanho.Nos cromossomas acrocêntricos (centrómero na extremidade) não faz sentido a distinção em braços “p” e “q”.

Regiões e Bandas

Bandas – técnicas de coloração diferentes que dão origem a padrões da bandas específicas. Cada cromossoma tem o seu padrão de bandas definido.

Regiões - são ordenadas a partir do centrómero em direcção ao telómero e, para cada, região está definida um padrão de bandas específico.

Xp 13 - cromossoma X, braço curto (“p”), região 1 e banda 3. (nomenclatura nos cromossomas sub-metacêntricos)

133 - cromossoma 1, região 3, banda 3 (nomenclatura nos cromossomas acrocêntricos)

O padrão de bandas é diferente consoante o tipo de coloração utilizado.

Tipos de cromossomas

- cromossomas sexuais (que definem o sexo dos indivíduos) - mamíferos X e Y ( - XX - XY) - aves Z e W ( - ZW - ZZ) - sexo homogamético - cromossomas sexuais iguais - sexo heterogamético – cromossomas sexuais diferentes- autossomas (não sexuais) - agrupados em pares homólogos (similares na morfologia e no padrão de

bandas)

A classificação homo/heterogamético faz-se quanto ao tipo de gâmetas formados no indivíduo. Por exemplo, a gata é homogamética na medida em que forma apenas gâmetas X, já a galinha é heterozigótica porque forma gâmetas Z e W.

O cromossoma Z é equivalente ao cromossoma X, quer em tamanho quer em composição genética. Já o cromossoma Y tem como equivalente nas aves o cromossoma W.

Morfologia dos cromossomas: baseia-se, fundamentalmente, na posição do centrómero nos cromossomas

- metacêntricos: centrómero a meio do cromossoma, sendo os braços de tamanho praticamente igual (ex.: cromossomas 7 e 12 dos equinos) - sub-metacêntricos: centrómero deslocado, dando origem a um braço curto e a um longo (ex.: cromossomas 3 e 4 dos equinos)

- acrocêntricos: centrómero está localizado praticamente numa das extremidades do cromossoma (ex.: cromossomas 15 e 21 dos equinos e a maioria dos cromossomas dos bovinos)

- telocêntricos: centrómero na extremidade do cromossoma

- microssomas (aves)

A diferença entre os cromossomas acrocêntricos e telocêntricos está na existência ou não de material genético para além do centrómero, respectivamente. No entanto, como a distinção entre eles é muito difícil, convencionou-se atribuir a terminologia acrocêntricos para classificá-los.

Os metacêntricos englobam os cromossomas com centrómeros centrais ou perto do centro, pois há ocasiões em que se torna difícil a classificação da posição do centrómero (central ou não).

Nos sub-metacêntricos o centrómero ocupa uma posição mais próxima de uma das extremidades.

Microssomas são autossomas de pequenas dimensões característicos das aves onde é impossível visualizar as bandas. Não se consegue fazer a distinção entre eles mas o seu número total é conhecido. Cariótipo – representação fotográfica dos cromossomas metafásicos de um indivíduo, ordenados e numerados de acordo com o seu tamanho e morfologicamente de acordo com base em convenções internacionais.

O número total de cromossomas é designado 2n, em que n é igual ao número de pares de cromossomas. Cada espécie tem um número característico de cromossomas 2n.

No gato os cromossomas estão ordenados em 6 grupos (de A a F); 2n = 38 Grupo A - 3 cromossomas sub-metacêntricos Grupo B - 4 cromossomas sub-metacêntricos Grupo C - 2 cromossomas metacêntricos Grupo D - 4 cromossomas metacêntricos Grupo E - 3 cromossomas metacêntricos Grupo F - 2 cromossomas acrocêntricos X – é sub-metacêntrico Y – é metacêntrico

Em todos os cariótipos os cromossomas X e Y, Z e W, estão colocados à parte. Em algumas espécies, como no caso do Homem e do gato, os cromossomas podem ser classificados ainda em grupos, noutras os cromossomas são apenas numerados sem mais algum tipo de agrupamento (ex.: bovinos, 2n=60; e porcos)

Ideograma – representação gráfica do padrão de bandas característico de cada par de cromossomas corados de acordo com técnicas específicas – técnica de coloração em bandas.

Técnica de coloração em bandas

As bandas resultam de várias técnicas de coloração. - Revelam um padrão de regiões coradas claras e escuras (negativas e positivas,

respectivamente).

- Bandas de baixa, média e alta resolução - cromossomas profásicos para a coloração (em vez de cromossomas

metafásicos) - agentes inibidores da condensação da cromatina (agentes intercalantes como o Brometo de Etídeo). Estes agentes intercalam-se na molécula de DNA, entre as bases, impedindo o seu enrolamento e, consequente, a sua condensação.

- baixa resolução: é difícil a identificação das bandas.

A razão do aparecimento destas bandas não está ainda muito bem esclarecida, mas parece resultar das interacções entre as proteínas e o DNA, nomeadamente o tipo de condensação que ocorre numa região específica do cromossoma. A ligação do DNA a proteínas histónicas e não histónicas vai resultar em padrões de condensação mais ou menos fortes e, por consequência, em padrões de coloração diferentes. Por outro lado, o próprio conteúdo nucleotídico da sequência de DNA também se ... de alguma importância para o padrão de bandas obtidos (bandas positivas ou negativas), isto é, uma zona mais rica em Adenina e Timina ou Guanina e Citosina parece refletir no padrão de bandas obtido.

São utilizados cromossomas profásicos porque estes se encontram menos condensados sendo assim mais fácil a visualização das bandas.

O brometo de etídeo é um dos agentes mais utilizados nos géis de agarose, pois permite a visualização dos fragmentos de DNA que, à medida que migram no gel, o captam. Esses fragmentos adquirem então a capacidade de fluorescência quando expostos à radiação UV.

Coloração em Bandas Q Quimacrina – corante fluorescente aos UV

Bandas de fluorescência intensa em regiões de AT e de fluorescência reduzida em regiões ricas em GC.

Bandas intensas correspondem às bandas G positivas.

Coloração em Bandas G (mais frequente) Giemsa – após tratamento proteolítico (tratamento onde se tenta remover a ligação do DNA às proteínas na cromatina

Bandas positivas – cromatina mais condensada ricas em AT, poucos genes expressos.

Bandas negativas – ricas em GC, muitos genes expressos

Bandas GTG (variação da técnica das bandas G) – tripsina (tratamento proteolítico), Giemsa (coloração).

O padrão obtido nas bandas Q é igual ao das bandas G, a diferença reside no tipo de método utilizado para a sua visualização, UV ou o corante Giemsa.

Técnicas de coloração de bandas (cont.)

As bandas podem ser positivas ou negativas, de baixa ou alta resolução.

Bandas Q – baseadas na emissão de uma fluorescência – quinacrina. Têm uma correspondência com as Bandas G que são mais frequentes no estudo dos cariótiposAcaba por haver um paralelismo entre bandas G e Q – geralmente são coincidentes.

Bandas G – relação entre as bandas positivas (escuras) e regiões onde geralmente os genes são pouco expressos (eventualmente porque há poucos genes nessas regiões) ao contrário das bandas claras (negativas) que são zonas de maior expressão génica (há relação com A-T e G-C).

Ex de bandas G em galinha: a determinação das bandas com base nos ideogramas é fácil mas quando se passa para a análise dos cromossomas é complicado. É necessária uma análise de cromossomas mais ou menos condensados , cromossomas pró-metafásicos ou metafásicos, nos quais o padrão de bandas é mais perceptível.

Bandas R- Padrão de bandas inverso comparado com as bandas G e Q- Bandas RBG: bromodeoxiuridina, Giemsa.Técnicas para obtenção de bandas R : uma delas dá origem às bandas RBG e

depois coloração também com o Giemsa.

Úteis para determinar as extremidades dos cromossomas porque se num cromossoma a última banda do telómero é uma banda negativa por vezes não é fácil determinar a terminação para saber por exemplo se se trata de um cromossoma acrocêntrico ou sub-metacêntrico.

Portanto, se fizermos uma técnica de coloração por bandas R, essa banda negativa tornar-se-à positiva e dá-nos uma melhor ideia da terminação do telómero do cromossoma.

Bandas TCoram essencialmente os telómeros. Útil também para a distinção entre cromossomas acrocêntricos e sub-metacêntricos.

Bandas C- Coram os centrómeros (heterocromatina).- Heterocromatina- designação dada às regiões de cromatina altamente condensada - Tratamento energético com extracção de DNA e proteínas

As regiões onde não há coloração ou a coloração é mais fraca são designadas de eucromatina (regiões onde a cromatina n é tão condensada). Regiões de eucromatina nas porções abertas do cromossoma e regiões de heterocromatina nas regiões fechadas do cromossoma.

Há dois tipos de heterocromatina - facultativa – aquela que em determinados momentos do ciclo da célula se

encontra sob a forma de heterocromatina mas em determinas alturas passa a eucromatina. Ou seja, são regiões dos cromossomas que podem estar activas ou inactivas e portanto a sua designação de heterocromatina facultativa vem desse motivo.

- Constitutiva – geralmente mantém-se assim por toda a vida da célula, são regiões que se encontram sempre condensadas e uma delas é a região dos centrómeros. Quando se faz uma coloração com bandas C cora-se a heterocromatina essencialmente a nível dos centrómeros.

Este tratamento de bandas C baseia-se essencialmente numa extracção muito forte de DNA e de proteínas e portanto ficamos apenas com a coloração dos centrómeros facilitando a distinção entre os vários tipos morfológicos de cromossomas.

Bandas N ou NOR ou AgNOR- Coram as regiões dos organizadores nucleolares; local de produção do nucléolo; onde são montados os ribossomas.- Ricos em genes por rRNA- Coloração com Giemsa e prata.

Têm inúmeras cópias de genes para RNA ribossomais.Constituem o local de produção do nucléolo – estrutura relativamente grande a nível do núcleo. Pode haver mais do que um por núcleo. São os organitos celulares onde se produzem os ribossomas que depois passam para o citoplasma. A produção do nucléolo está a cargo de regiões do cromossoma ricas em rRNA que se chamam NOR.

Há assim uma cadeia: os organizadores nucléolares (NORs) produzem nucléolos que por sua vez são o local de montagem dos ribossomas.Ao nucléolo chegam não só os RNA ribossomais (rRNA) produzidos a nível dos organizadores nucleolares (NORs) como também proteínas que são importantes para a montagem do ribossoma.

Designação de AgNORs vem da técnica de coloração que se baseia essencialmente da coloração com prata e depois utilizando também o Giemsa. (AgNORs nos cromossomas no cavalos encontram-se no cromossoma 1, 25 e 30, por exemplo.)

A técnica de coloração de AgNORs é útil também em patologia nomeadamente porque revela no caso dos tumores malignos um “erro” derivado ao tumor, muitas vezes pela acumulação em excesso de AgNORs, isto é, estas bandas que têm um nr determinado e fixo podem parecer mais se a célula é um célula tumoral essencialmente devido a erros e portanto à acumulação de pares extra de cromossomas etc.O mesmo se passa em nucléolos onde células tumorais têm uma maior carga de nucléolos do que uma célula normal.

Cariótipos normais

Espécie Cromossomas Meta e sub-metacêntricos

Cromossomas acrocêntricos

Cão 78 0 38

Gato 38 6 2

Porco 38 12 6Cabra 60 0 29

Ovinos 54 3 23

Bovino 60 0 29

Cavalo 64 13 18

Burro 62 24 6

Coelho 44 19 2Galinha 78

(30 microcromossomas)7 1

Cão – exemplo – tem 38 pares de cromossomas acrocêntricos e estes são só os autossomas. Tem mais um par de cromossomas sexuais. Tem no total 39 pares.

Os microcromossomas das aves não são distinguíveis entre si.

Mula = (cavalo x burra) ou (égua x burro)

A mula tem 63 cromossomas (burro/a n=31 e cavalo/égua n=32, logo 31+32= 63 – híbridos viáveis.)

Os cromossomas são ordenados de forma sequencial não há grupos, por tamanho decrescente e depois colocar à parte os sexuais.Os cromossomas sexuais são geralmente metacêntricos ou sub-metacêntricos. No caso do cão o cromossoma X é sub metacentrico e o Y também mas os braços são praticamente iguais, aparentando assim ser um cromossoma metacentrico.

Cariótipo do gatoEm termos de regras de elaboração de cariótipos das nossas espécies é aquela que tem as regras mais complexas, isto é, são definidos conjuntos de grupos que no essencial dividem cromossomas morfologicamente similares.Grupo F, por exemplo, engloba os 2 pares de acrossomas .Grupo E são metacentricos pequenos Grupo D são sub metacentricos que relativamente ao grupo B que tb é composto por sub metacentricos mas são de menor tamanhoGrupo A são sub metacentricos mas o braço p é ligeiramente maiorGrupo C são cromossomas metacentricos.Cromossoma x é um cromossoma sub metacentrico e o Y metacêntrico.

Porco12 Sub metac ou metac e 6 cromossomas acrocentricosOs cromossomas sexuais são ambos sub metacentricos

BovinoTodos acrossomas, são também numerados sem interrupção de 1 a 29 e por tamanhos. Do par 1 acrocentrico maior ao par 29 que é o mais pequeno.Cromossomas sexuais são sub metacentricos para o X e metacentricos para o cromossoma Y.Aberração frequente: fusão de um cromossoma 29 com um cromossoma 1 e portanto dá origem a um cromossoma sub metacentrico.

CaprinosIdêntico ao do bovinoTodos ordenados

Ovinos

3 Pares metacentricos ou sub metacRestantes todos acrocentricos

Cavalo2 Grandes grupos, os primeiros 13 pares são submetac ou metac e os restantes pares são acrocentricosCromossomas sexuais são sub metacentricos

BurroNumeração sequencialPares metacentricos e acrocentricos

No caso da Mula não existe emparelhamento entre muitos dos cromossomas, nomeadamente, porque lhes falta um cromossoma homólogo, ocorrendo assim problemas na meiose o que leva à infertilidade dos indivíduos.Coelho e galinha?

ABERRAÇÕES CROMOSSÓMICAS NUMERICAS

Aberrações cromossómicas numéricas (alterações do cariótipo)

• Euploidia – variação por múltiplos de número haplóide (n) de cromossomas.

Aqui todo o cariótipo sofre aumento ou diminuição por conjunto completo de cromossomas.Isto é causa de morte embrionária, visto não ser compatível com a vida.

1. Haploidia – alteração do nº de cromossomas: redução do n normal.As haploidias apenas são normais no caso dos gâmetas.

2. Poliploidia alteração do nº de cromossomas: aumento de n.

- Triploidia- Tetraploidia- Pentaploidia

No caso da Galinha temos a situação normal de diploidia com 78,ZWEm haploidia temos 39,ZO em que cada um dos pares de homólogos tem

apenas um representante (afecta os cromossomas sexuais).Em triploidia temos 117,ZZW ou117,ZWW (afecta também os cromossomas

sexuais)Em tetraploidia temos 156,ZZWW (afecta tb os cromossomas sexuias)

As situações de poliploidia são incompatíveis com vida nos mamíferos.Fórmula cariotípica – descrição simbólica do cariótipo das espécies (indica-nos o que se passa a nível desse cariótipo)

A fórmula cariotípica normal tem sempre o nº total de cromossomas do indivíduo e, separados por uma vírgula, os cromossomas sexuais.(NOTA: o nº total de cromossomas inclui os cromossomas sexuais)

Por exemplo o Gato tem a fórmula cariotípica 38,XY e o Bovino 60,XX (vaca, neste caso).

As euploidias referem sempre o nº alterado de cromossomas. Os cromossomas sexuais quando estão a mais ou a menos são representados por extenso.

As euploidias geralmente são incompatíveis com a vida, mas há 2 excepções:- A Galinha que pode ter indivíduos triploides viáveis (que atingem a idade adulta); a mortalidade é elevada nestas linhas triploides- não é vantajoso para os animais.- Peixes em que temos poliploidia induzida por choque térmico (calor ou frio): não ocorre disjunção na meiose. Os indivíduos resultantes são triploides, são estéreis (não conjugação dos pares cromossómicos) mas viáveis e com boa produção ao nível do desenvolvimento corporal. Não gastam energia com a reprodução sendo utilizada exclusivamente no crescimento.

Podemos tb obter indivíduos tetraploides, estes são férteis, com gâmetas diploides, O cruzamento destes com animais diploides origina indivíduos triploides que são os mais produtivos, e que nos interessam.

Em mamíferos isto não acontece em todas as células mas pode ocorrer em células tumorais.

• Aneuploidias – variação no número de cromossomas mas não por múltiplos do nº haploide (n). É por nº inferior a n.

Aumento ou diminuição do nº de cromossomas restrito a um pequeno nº de pares de cromossomas.Estas alterações não são completas do conjunto de cromossomas.São importantes causas de morte embrionária visto serem incompatíveis com a vida. Após reabsorção do feto a fêmea volta a entrar no cio, sendo a produtividade destas fêmeas geralmente mais baixa.

Tipos de aneuploidias:

1. Nulissomia – ausência completa de ambos os membros do par de cromossomas.

2. Monossomia – no par só está presente um cromossoma (ausente um dos membros do par)

3. Polissomia – aumento do nº de cromossomas do par. Morfologicamente são iguais (geneticamente talvez não) mas podem emparelhar entre si na meiose.

- Trissomia (3 cromossomas num par)- Tetrassomia (4 cromossomas num par)

Por exemplo no Gato, podemos ter a situação de nulissomia no par 3 (este não apresenta cromossomas). Podemos tb ter nulissomias nos cromossomas sexuais. Naturalmente que não há nulissomias compatíveis com a vida.

As monossomia dos cromossomas sexuais são representadas por um “O”.No caso do Gato teríamos 37,XO

Na espécie humana esta situação de ausência de um cromossoma X é chamada de “Síndroma de Turner” tendo consequências graves como atraso mental. Nos animais habitualmente apenas temos problemas de infertilidade. Isto ocorre apenas nas fêmeas.

As monossomias, são letais excepto se for no cromossoma X.

As polissomias mais frequentes são as trissomias.Por exemplo, na égua, uma situação de trissomia no cromossoma X seria:

65,XXXAs trissomias dos cromossomas sexuais são compatíveis com a vida, não

tendo estes animais graves problemas fenotípicos, sendo inclusivamente férteis.Para além da elaboração do cariótipo podemos detectar as trissomias se

olharmos para os corpúsculos de Barr – condensações da cromatina encostada à parede nuclear, corresponde ao cromossoma X inactivo.

Trissomia do cromossoma X são habitualmente férteis, animais com trissomia nos X e Y não são.

Como já se disse em aulas anteriores apenas um dos cromossomas X das fêmeas permaneça activo, o que é inactivado aparece sob a forma de cromatina sexual ou corpúsculos de Barr.

Na trissomia encontramos 2 corpúsculos de Barr, em vez de um, que seria normal.

Na tretassomia encontramos 3 corpúsculos de Barr, e assim sucessivamente.Cada célula só pode ter um cromossoma X activo aparecendo o outro sob a forma de corpúsculo de Barr (ou vários corpúsculos no caso de polissomia)

A trissomia nos cromossomas sexuais no homem tem a designação de “Síndroma de Klinefelter” sendo os indivíduos altos e com atraso mental. Fenotipicamente são machos.

Nos animais leva à infertilidade mas sem outros problemas.No caso dos Gatos ( 39,XXY ) podem apresentar pelagem “tartaruga”

(características das fêmeas) devido à existência do alelo para a cor laranja num cromossoma X e para a cor preta no outro X. Qualquer macho que ostente esta pelagem apresenta certamente trissomia nos cromossomas sexuais.

Estas situações podem apresentar-se sob a forma de 2 populações celulares com cariótipos diferentes- com origem no mesmo zigoto que sofreu erros na mitose (a disjunção é mal feita) – mosaicismo.

Trissomia nos autossomas são menos frequentes que as sexuais. No caso da espécie humana a mais famosa é a do “Síndroma de Down” ou trissomia 21, que provoca um fenótipo característico.

Sempre que há trissomia nos autossomas ela ocorre sempre em cromossomas de pequeno tamanho (caso do 21 do homem). Em cromossomas grandes tornam-se letais.

Por exemplo temos nos Bovinos temos +18,+23,etc; nos Equinos temos +23,+28,+30,etc.Provocam alterações graves ao nível do fenótipo.…. Trissomias

- aneuplóidias dos cromossomas sexuais : relacionadas com o facto da inactivação do cromossoma X (existência de mais ou menos cromossomas X, como no caso do síndrome de Turner); são compatíveis com a vida, ao contrário das aneuplóidias dos autossomas (não são viáveis e os indivíduos não nascem). A maioria das alterações fenotípicas ligadas às transformações dos cromossomas sexuais estão relacionadas com perturbações a nível da evolução sexual ou do fenótipo sexual dos indivíduos. Nomeadamente com situações de hipoplasia testicular ou ovárica, isto é, ovários ou testiculos mais pequenos que o normal; geralmente com situações de infertilidade e,

nalguns casos, situações de intersexualidade, isto é, indivíduos que, em termos fenotípicos, não pertencem ao padrão de um determinado sexo, apresentando características de um e de outro sexo com maior ou menor grau de incidência. O criptorquidismo em si não seria muito grave pois um testículo é suficiente para que o animal tenha uma fertilidade praticamente normal mas a temperatura mais elevada a que está sujeito o testículo que fica interabdominal geralmente leva ao aparecimento de tumores nesse testículo e portanto implica uma cirurgia. Também se podem ver no quadro muitas situações de mosaicismo, ou seja, uma série de indivíduos que apresentam várias povoações com cariótipos diferentes.

-Aberrações cromossómicas numéricas Causas: • não-disjunção meiótica (muitas destas aberrações cromossómicas numéricas

devem-se a problemas de separação dos cromossomas homólogos durante a meiose, resultando quase sempre na formação de gâmetas desequilibrados; se os dois cromossomas, que deviam segregar para gâmetas diferentes, vão para o mesmo lado, ficam um dos gâmetas com um cromossoma a mais e o outro sem nenhum dos cromossomas daquele par. A maioria das vezes a infertilidade resulta destas aberrações cromossómicas por parte de alguns dos gâmetas dos indivíduos não serem completos em termos dos cromossomas.)

-meiose I -meiose II

- Fêmeas: resultado XX/O (Se a não-disjunção ocorre ou na meiose I ou na meiose II formam-se sempre dois tipos de gâmetas – óvulos que não recebem nenhum dos cromossomas X e óvulos que recebem os dois cromossomas X)

- Machos: a situação pode ser mais complicada e existem várias possibilidades dependendo da fase em que ocorre a não-disjunção.

Meiose I

Meiose II

• Polispermia (fecundação de um óvulo por dois ou mais cromossomas, originando situações de poliploidia)

• Fusão de zigotos (origina situações de quimerismo com euploidia)• Não-disjunção mitótica (o indivíduo pode não ser viável, se ocorrer quando o

embrião é pequeno, ou sofrer de um problema localizado que é detectado posteriormente quando se faz uma análise de cariótipo por mosaicismo, isto é, encontram-se linhas de células com cariótopos diferentes provenientes dos erros que ocorreram nalgumas células durante a mitose, se a não disjunção mitótica ocorrer depois do embrião estar formado). Os tumores geralmente são situações de mosaicismo, ou seja, o resto do corpo tem cariótipo normal e a nível do tumor encontramos umas linhas regulares com alterações mais ou menos graves geralmente resultado de alterações a nível da mitose não só na disjunção.

2 espermatozóides sem nenhum cromossoma sexual

2 espermatozóides com trissomia nos cromossomas sexuais

Espermatozóides XX (pode gerar Trissomia do cromossoma X)

Ou

Espermatozóides YY (geralmente não compatíveis com a vida)

Espermatozóides normais

ABERRAÇÕES CROMOSSÓMICAS ESTRUTURAISCausas:• Translocação recíproca (trcp) - troca de segmentos entre cromossomas não-homólogos (geralmente os indivíduos têm um fenótipo normal porque não ocorre perda de material genético) Nem sempre estas translocações recíprocas são pacíficas pois existem a nível do controle da transcrição génica mecanismos de posição e que levam a que, quando um gene sai do seu ambiente (da sua posição normal) e se integra noutro local do cromossoma, haja desregulação da transcrição desse gene. Em todas as sequências reguladoras existem promotores fortes e fracos e isso pode levar a que um gene, que geralmente está ligado a uma região de regulação com uma determinada característica, passe para outra posição passando a estar sob a influência de sequências reguladoras por exemplo mais fortes, o que leva a que esse gene se expresse mais do que devia e ocorram problemas apesar de não haver perdas de material genético e, portanto, nem sempre o fenótipo é normal. A este propósito a Trissomia 21, no caso da espécie humana, pensa-se que quase não há perda do material genético, antes pelo contrário, é um cromossoma 21 que está a mais, e uma das teorias para explicar o fenótipo desses indivíduos é o facto de existir um excesso de determinados genes que deveriam expressar-se de uma forma limitada e, pelo facto de existirem mais cópias que o normal, vão expressar-se mais e os efeitos da expressão de alguns desses genes é que serão responsáveis pelo fenótipo dos indivíduos com Síndrome de Down.

- Um outro conceito ainda na translocação recíproca e que se aplica a muitas destas aberrações cromossómicas é o de translocação heterozigótica ou homozigótica e que refere o facto destas aberrações cromossómicas poderem afectar ambos os membros dos pares de homólogos –translocação homozigótica- ou afectarem apenas um dos membros dos pares de homólogos – translocação heterozigótica -.

Nas translocações recíprocas homozigóticas não existem problemas na fertilidade pois ambos os cromossomas passam a formar dois cromossomas novos, com bocados de um e de outro e, portanto, a nível da meiose, a segregação desses cromossomas não tem problemas. Nas heterozigóticas há uma redução significativa da fertilidade dos indivíduos resultante da tentativa dos cromossomas emparelharem entre si na meiose e geralmente o que acontece é a formação do cromossoma chamado quadrivalente (resulta do emparelhamento entre os cromossomas translocados com os cromossomas normais que não sofreram translocação, por homologia de regiões). Os problemas surgem na altura da segregação, existindo três alternativas com designações diferentes:

- Segregação alternada – entre centrómeros homólogos e não homólogos, dando origem à produção de gâmetas equilibrados porque um dos gâmetas recebe dois cromossoma e o outro gâmeta recebe dois cromossoma aberrantes mas que contêm todos os genes que estão envolvidos nesta translocação.

- Segregação adjacente 1 – afecta centrómeros homólogos e o resultado é a formação de gâmetas desequilibrados. Os gâmetas não

possuem todos os genes que deveriam e o indivíduo não será viável pois faltar-lhe-ão uma quantidade de genes importantes.

- Segregação adjacente 2 – afecta cetrómeros não-homólogos e o resultado é também a formação de gâmetas desequilibrados.

1 – translocações robertsoniana ou fusão cêntrica (trob)

. Fusão centrométrica de 2 cromossomas acrocêntricas produzindo 1 metacêntrico.

. Translocação heterozigótica ou homozigótica. Redução do nr total de cromossomas (-1 trob heterozigótica, -2 trob homozigótica).. Fenótipo normal.

Exemplo: dois cromossomas acrocêntricos, a fusão dos centrómeros origina um cromossoma submetacêntrico. Geralmente não há perda de material genético mas pode ocorrer com perda da parte do centrómero (como no exemplo). Também pode ocorrer perda de um dos centrómeros.

Da mesma maneira que a translocação cíclica utiliza os termos translocação heterozigótica e homozigótica, indicando no primeiro caso, quando só um dos membros dos dois pares de cromossomas é que está afectado e que sofreu a translocação, e a translocação diz-se homozigótica quando ambos os membros dos pares de homólogos sofreram essa aberração cromossómica. O resultado é que quer num caso quer noutro há sempre uma redução do nr total de cromossomas – se a translocação é heterozigótica há menos um cromossoma, se é homozigótica há menos 2 cromossomas. O fenótipo dos indivíduos é normal. Há uma redução da fertilidade.

Um tipo de translocação mto frequente em bovinos é a 1-29 e que corresponde à fusão de um cromossoma do par 29 com um cromossoma do par 1. o resultado é um cromossoma sub metacêntrico.

Há redução da fertilidade – tudo acontece a nível do emparelhamento meiótico entre o cromossoma translocado e os cromossomas normais 1 e 29, isto no caso da translocação heterozigótica, e quando há um emparelhamento destes cromossomas translocados com os normais forma-se um trivalente.

Exemplo: Caprino com translocação nos cromossomas 9 e 12

Podem ocorrer 2 situações : ou a segregação se faz de tal maneira que para um gâmeta vai o translocado

e para o gâmeta os cromossomas normais – formação de gâmetas equilibrados – possuem uma cópia de cada um, sem consequências para a fertilidade. No entanto, mtas vezes ocorrem segregações aberrantes de tal maneira que o cromossoma translocado não se separa do que está emparelhado com ele – formam-se 2 gâmetas desequilibrados. Quando houver fecundação com um gâmeta normal dá-se origem a uma trissomia ou, no outro gâmeta, dá origem a uma monossomia. Com raras excepções as trissomias e as monossomias são incompatíveis com a vida e o resultado é que estes embriões morrem, são inviáveis.

Translocação robertsoniana

. Redução da fertilidade

. Gâmetas desiquilibrados por segregação meiótica aberrantes de trivalente ⇒ trissomia/monossomais

2 – Fissão Cêntrica

. Separação pelo centrómero de um cromossoma metacêntrico, produzindo 2 acrocêntricos . Não se trata de trissomia

Corresponde à separação transversal do centrómero de um cromossoma geralmente metacêntrico produzindo 2 acrocêntricos. É a situação inversa à translocação robertsoniana. O indivíduo tem um fenótipo normal, não há perda de material genético.

Tem uma outra designação:

Isocromossomas (i)

Quebra transversal do centrómero de um metacêntrico ;Produção de 2 isocromossomas. Geralmente 1 perde-se por divisão desigual

do centrómero.

3 – Inversão (inv)

Quebra do cromossoma em 2 locais e rotação 180º do fragmento (volta a integrar-se no cromossoma)

- inversão pericêntrica – o fragmento inclui o centrómero- inversão paracêntrica – o fragmento não inclui o centrómero, por exemplo,

abrange apenas uma parte do braço longo do cromossoma.

A detecção de inversões só é possível com base na coloração de cromossomas em bandas.

Consequências das inversões:. gâmetas desequilibrados . emparelhamento meiótico com formação de ansa – para haver emparelhamento de regiões homólogas nos cromossomas em questão.

Problema do emparelhamento: se houver crossing over, um segundo emparelhamento, na região da ansa, os resultados são a formação de 2 gâmetas normais(que contêm todas as regiões do cromossoma, não há perdas de material) mas existem outros 2 tipos de gâmetas com duplicações e por outro lado delecções.

Resultado: gâmetas desequilibrados, problemas na meiose. Na inversão paracêntrica – o fragmento n abrange o centrómero. O resultado, qdo ocorre o crossing over dentro da ansa temos os cromossomas emparelhados com a ansa – o resultado é um cromossoma com 2 centrómeros (dicêntrico) e um outro cromossoma que não tem centrómero (acêntrico).

Nas inversões pericêntricas – duplicação e delecções parciais, por sobrecruzamento na região do loop.Nas inversões paracêntricas – produção de cromossomas acêntricos (ace) e dicêntricos com delecções, por sobrecruzamentos na região do “loop”.

Os cromossomas acêntricos não se ligam às fibras do fuso acromático e portanto n sofrem a migração para os pólos das células filhas e por outro lado quer num caso quer noutro há grandes regiões do cromossoma que são delectadas e os indivíduos não viáveis os que resultarem da reprodução com estes gâmetas desequilibrados. 4 – Delecção (del)

Quebra de cromossomas e perda do fragmento . Delecção intersticial – quebra em 2 locais do cromossoma e perda do fragmento . Delecção terminal – apenas 1 local de quebraDiagnóstico – coloração em bandas e muitas xs bandas de alta resolução para os cromossomas que estão pouco condensados

5 – Duplicação (dup)

Duplicação de uma região do cromossoma –uma a seguir à outraPossível origem: sobrecruzamento em ansa de cromossomas com inversão pericêntrica.

6 - Cromossoma em anel (ring)

Quebra do cromossoma, perda das extremidades (neste caso os telómeros e os centrómeros) e o fragmento resultante tem tendência a voltar a unir-se – anel – Os telómeros são partes mto importantes nos cromossomas uma x que cuidam da manutenção da integridade do cromossoma. Sempre que há quebra dos telómeros o cromossoma passa a ser “pegajoso” e tem tendência a unir-se a outro cromossoma que tenha sofrido o mesmo - cromossoma em anel .

SITIOS FRÁGEIS

Consistem em constrições secundárias (a primária geralmente é o centróero, daí ser secundária) de um cromossoma com separação parcial desta região e que ocorrem em locais específicos de cromossomas específicos.

Separações parciais em locais específicos de alguns cromossomas.Geralmente não há separação total. Só são visíveis se se fizer uma cultura das

células antes de se elaborar o cariótipo em meios que provocam a deplecção de alguns tipos de nucleótidos como é o caso da timina.

Tornadas visíveis pela deplecção ou inibição de percurssores de nucleótidos (fluorodioxiuridina). No meio de cultura das células utilizadas para elaborar o cariótipo. O cromossoma X é mto susceptível ao aparecimento destes sítios frágeis.

Os sítios frágeis:

- Herdados de forma mendeliana; um indivíduo que tenha um sítio frágil transmite-o à descendência - Locais com maior frequência de quebras e uniões entre cromossomas (?); - Cão Xp22; Xq21; Xq 21.2; homologo no homem - X-frágil: expansão de repetições trinucleotídicas instáveis intragénicas.

Herdados de forma mendeliana porque estes locais frágeis são locais de expansão de regiões trinucleotídicas a nível de um determinado gene.

Estado de “pré-mutação” – instabilidade da região na meiose, eventualemnte afectando a descendência.

Estado de “mutação” – provoca uma metilação, consequente inactivação génica e 1 fenótipo patológico.

Cromossoma X inactivo das fêmeas é um cromossoma praticamente todo metilado. No homem nem todos os sítios frágeis provocam um fenótipo anormal.

CROMOSSOMA Y E X. DETERMINAÇÃO DO SEXO. TEORIA DE COMPENSAÇÃO DE DOSAGEM DO SEX0Cromossoma Y

O cromossoma Y é constituído por:- duas regiões pseudo-autossómicas (PAR), localizadas nas extremidades, e que são designadas por PAR 1 e PAR 2 (ficam próximas das regiões teloméricas, promovendo o emparelhamento homólogo com o cromossoma X);- e uma região não-recombinante (NRY), que corresponde à região intermédia.

Cromossoma Y – Genes – O cromossoma Y é um cromossoma com poucos genes.

O que alguns autores admitem é que terá existido um cromossoma antepassado comum ao X e ao Y; com o decorrer da evolução, o cromossoma Y terá perdido alguns genes, ao contrário do cromossoma X, que os manteve.

Dentro dos genes que constituem o cromossoma Y, podemos falar de dois grandes grupos:- os genes homólogos de X, que, como o nome indica, são genes que possuem um alelo homólogo;- e os genes não homólogos de X.

Genes Homólogos de X

Os genes homólogos estão localizados nas duas regiões pseudo-autossómicas. No entanto, existem muitos outros genes na região NRY.

O macho, sendo portador de um cromossoma X e de um cromossoma Y, possui genes que ora estão localizados num, ora estão presentes no outro; se esta situação não fosse controlada, iria originar um desequilíbrio em termos de carga genética, ou seja, no macho existiriam genes com duas cópias, uma no X e outra no Y, e na fêmea, caso o fenómeno de inactivação fosse completo, só haveria um dos alelos a funcionar.

Admite-se que todos estes genes que são homólogos de X, no caso da fêmea, vão escapar à inactivação génica que ocorre no cromossoma X.

E é desta forma que se estabelece a igualdade entre sexos: estes genes estão presentes em cópia dupla, ou mais precisamente, com dois alelos funcionais, quer na fêmea (um no cromossoma X activo e outro, apesar de ser no cromossoma X inactivo, a funcionar), quer no macho (um alelo a funcionar no cromossoma Y e o outro a funcionar no cromossoma X).

Estes genes homólogos de X estão presentes em cópia única, isto é, em todo o cromossoma Y só existe uma cópia para estes genes homólogos; a sua expressão é universal (ubíqua), querendo isto dizer que estes genes se expressam em todos os tecidos e em todos os órgãos, não havendo, portanto, uma expressão restrita a um tecido ou a um órgão. Esta expressão é ubíqua porque a maioria deles, ou, pelo menos, a maioria daqueles que são conhecidos, têm funções ditas de “house-keeping”, e que estão relacionadas com o facto destes genes se encarregarem de manter o metabolismo normal das células. Não têm funções específicas relativamente a um determinado tecido, mas têm que estar presentes em todas as células porque são indispensáveis ao seu metabolismo normal. Assim se explica, com estas funções, que eles se expressem em todos os tecidos sem especificidade.

Genes Não Homólogos de X

Estes genes existem apenas no cromossoma Y, sob a forma de cópias múltiplas.

Existe uma excepção que é o gene SRY, que se apresenta como cópia única apesar de ser não homólogo de X; todos os outros não homólogos de X, geralmente, têm várias cópias no mesmo gene, localizadas no cromossoma Y.

A sua expressão não é universal, pois está restrita ao tecido testicular. Estes genes só se expressam a nível do testículo e a maioria deles, mais uma vez, a maioria daqueles que se conhecem, têm funções especializadas, ligadas à determinação do sexo (um exemplo é o SRY), à espermatogénese e também à fertilidade masculina.

A título de curiosidade, no caso da espécie humana, a presença de pêlos no bordo superior da orelha, é uma característica ligada a um gene localizado no cromossoma Y, ao contrário do que acontece se os pêlos se encontrarem no interior do canal auditivo (esta característica não está ligada ao cromossoma Y). Há ainda uma outra característica que também ocorre devido ao gene situado neste cromossoma; trata-se da presença de membranas entre os dedos - membranas interdigitais.

Estes genes localizados no cromossoma Y e que apresentam uma expressão exclusiva do macho são designados genes holândricos (expressão restrita ao sexo masculino).

Gene SRY (Sex Determining Region)

Está ligado à determinação do sexo.A sua localização na maioria das espécies em que é conhecida é no braço

curto (p) do cromossoma Y.Apesar de existirem algumas dúvidas relativamente aos mecanismos

moleculares de determinação do sexo, admite-se que o gene SRY é, talvez, o principal

responsável pelo desenvolvimento e diferenciação das gónadas indiferenciadas; ele contribui para que estas sigam um rumo que levará, posteriormente, à formação das características sexuais secundárias e sexuais primárias masculinas.

A gónada indiferenciada, com todas as potencialidades, que irá dar origem às gónadas e determinará o sexo, pode seguir duas vias:

1- Se não houver nada em contrário, a evolução é para o sexo feminino (por omissão, ou em inglês, default). Desenvolvem-se os chamados ductos de Müller; a partir destas estruturas anatómicas embriológicas descritas por Müller, surgem depois todas as estruturas ligadas ao sexo feminino, nomeadamente, as trompas de Falópio, o útero, a vagina, etc.

2- A evolução no sentido do sexo masculino necessita de uma intervenção activa e que está a cargo do gene SRY. Originam-se os canais de Wolff, estruturas embriológicas, ainda muito primitivas, que vão dar origem aos testículos, ao epidídimo, às vesículas seminais, etc.

♀ ♂ducto ductode Müller de Wolff

O gene SRY não funciona sozinho, uma vez que existe um conjunto de outros tipos de genes envolvidos neste fenómeno de diferenciação sexual, no sentido da formação dos testículos; alguns exemplos são: WT-1, SOX-9, SF-1, etc.

Existem muitos genes porque se trata de um processo bastante complexo, o que aliás se percebe uma vez que durante o desenvolvimento embrionário, a espermatogénese é sempre um fenómeno algo complexo, envolvendo muitos genes, uns activos num determinado momento, outros activos noutro.

Actualmente, admite-se que é o próprio gene WT-1, e não o gene SRY, que controla todo o processo depois da diferenciação, concluída a formação do testículo.

Mas como isso ainda não está bem definido, continua-se a acreditar que o gene SRY é um dos principais, senão o principal, apesar de também estarem envolvidos outros genes neste processo de diferenciação.

Quando se fez uma análise a nível molecular à proteína produzida ou codificada pelo gene SRY, encontrou-se um domínio conservado de ligação ao DNA, o que pressupõe que este gene não actuará directamente sobre as estruturas. Ele faz, antes, o controle da regulação génica de outros genes, estes sim directamente ligados com o fenómeno da manipulação destas estruturas embriológicas.

Este domínio conservado pertence a uma família de factores de transcrição, pertencente ao grupo HMG (High Mobility Group).

O facto de ele ter um domínio ligado ou presente num conjunto de famílias de factores de transcrição (factores de transcrição são genes ou proteínas codificadas por genes que controlam uma transcrição génica) e o facto deste gene ser um domínio importante na ligação ao DNA atribui ao gene SRY e à sua proteína uma função de regulação da expressão génica de outros genes.

De uma forma directa ou indirecta, um dos acontecimentos importantes do que ocorre a seguir é a expressão do factor MIS (Müllerian Inhibiting Substance) pelas células de Sertoli. Quando se fala em directa ou indirectamente é porque ainda não se conhece muito bem, e poderá ser a própria proteína e a regulação génica de outros

Gónada indiferenciada

genes feita de uma forma directa com o gene SRY, ou serão eventualmente outros genes que regulados por esse SRY irão fazer o controlo do que se passa posteriormente.

Como descrito anteriormente, os primórdios embriológicos que dão origem às estruturas sexuais femininas partem dos ductos de Müller; o que o factor MIS vai fazer é inibir a diferenciação deste ducto, impedindo que as células da gónada indiferenciada sigam o seu caminho para originar células de estruturas sexuais femininas. Dá-se uma atrofia do ducto de Müller e todas as estruturas que ele ia desenvolver (trompas de Falópio, útero e parte da vagina) vão ser impedidas de progredir.

Um segundo factor que é determinado, mais uma vez, directa ou indirectamente, pelo gene SRY é a produção de testosterona pelas células de Leydig (quer as células de Sertoli quer as células de Leydig são células do testículo); esta produção de testosterona vai provocar uma diferenciação positiva estimulando a diferenciação do ducto de Wolff.

Por um lado existe a inibição da diferenciação do ducto de Müller e, por outro, há um estímulo para a diferenciação dos canais de Wolff, que vão dar origem às vesículas seminais, ao ducto deferente e ao epidídimo, portanto estruturas do testículo.

Estes dois factos vão originar a produção de características sexuais primárias.A testosterona (hormona sexual masculina), para além de provocar esta

diferenciação dos canais de Wolff, é também responsável pela masculinização da genitália externa, ou seja, as características sexuais secundárias são determinadas pela sua formação. Só que para a testosterona poder actuar necessita de, antes de poder influenciar as células, se ligar a receptores de androgénios, receptores esses que são codificados por um gene que está localizado no cromossoma X.

Nota: qualquer mutação a nível deste gene, nos receptores de androgénios, provoca o Síndrome de Masculinização Testicular. Apesar de o indivíduo ter genótipo XY, ter o gene SRY, impedir a produção das estruturas sexuais femininas e produzir testosterona, normalmente não consegue fazer a masculinização da genitália externa. O resultado é que este indivíduo sofre uma diferenciação dos ductos de Müller, produzindo estruturas sexuais femininas, sendo, fenotipicamente, do sexo feminino. Inactivação do Cromossoma X

Mary Lyon colocou, em 1961, a hipótese de inactivação do cromossoma X com base em vários aspectos. Basicamente, o que a teoria diz é que dos dois cromossomas X da fêmea, um deles sofre o processo de inactivação.

Com algumas excepções, esta teoria mantém-se válida; no fundo ela explica porque é que machos e fêmeas mantêm diferenças fenotípicas tão grandes, tendo em conta que a carga genética difere muito, devido à existência de dois cromossomas X na fêmea e só um no macho.

Esta teoria é também chamada Teoria da Condensação de Dosagem do Sexo, uma vez que procura evidenciar porque é que a nível dos dois sexos existe uma compensação, acabando por existir a mesma carga genética em termos de expressão dos genes.

Os principais aspectos da teoria fundamentam que:

1- A inactivação do cromossoma X ocorre numa altura muito precoce do desenvolvimento embrionário. Geralmente, o período em que ocorre a sua inactivação é um pouco antes das células se converterem no sentido da diferenciação para um determinado tecido ou órgão. Enquanto elas mantêm toda a sua potencialidade

genética de evoluir num sentido ou noutro não há inactivação; um pouco antes desse conjunto de células se iniciar em diferenciação para um determinado tecido ou órgão é que ocorre a inactivação do cromossoma X.

2- O processo de inactivação é aleatório, isto é, tanto pode ser um cromossoma X de origem materna como um cromossoma X de origem paterna a sofrer a inactivação. Há excepções: no caso do canguru e de alguns marsupiais é sempre o cromossoma X paterno que é inactivado, mas esta excepção só serve para confirmar a regra de que o processo de inactivação é aleatório.

3- O cromossoma X inactivo vai aparecer como uma estrutura a nível do núcleo das células chamada corpúsculo de Barr. Murray Barr encontrou-o pela primeira vez em neurónios de gatas, surgindo como uma estrutura plano-convexa de cromatina mais condensada junto à parede nuclear. Os neurónios de gatos não possem esta estrutura nuclear. Se por acaso existir uma situação de aberração cromossómica com mais de um cromossoma X, são inactivados todos os cromossomas X (assim, encontram-se vários corpúsculos de Barr, cada um correspondendo a um dos cromossomas X inactivados).

4- O padrão de inactivação é estável e irreversível; isto é, depois de ocorrer a inactivação no cromossoma X todas as células descendentes daquelas vão manter o mesmo padrão de inactivação. Por esse motivo, formam-se clones, ou seja, a partir do momento em ocorre inactivação numa célula, todas as células filhas descendentes dessa mantêm o mesmo padrão de inactivação, originando um clone. Por outro lado, pode-se dizer que as fêmeas constituem um mosaico relativamente à inactivação dos cromossomas X; numas temos inactivação do X materno, noutras do X paterno, o que provoca algo deste género:

A partir da célula totipotente, antes de existir a diferenciação celular, ocorre a inactivação do X paterno, dando origem a um clone de células em que é o X paterno que fica inactivo; noutro caso, é o X materno a ser inactivado, dando origem a um clone de células com X materno inactivo, e assim sucessivamente. Sendo o processo aleatório admite-se que, em média, 50% das células têm o X materno activo e os outros 50% o X paterno activo (as percentagens podem variar).

Um dos efeitos visíveis desta inactivação é representado pelas gatas com pelagem tartaruga. Esta pelagem caracteriza-se pela existência de manchas laranja e manchas pretas simultâneas, que não podem ser encontradas num macho. O macho ou expressa o laranja (amarelo) ou o preto, mas nunca as duas cores simultaneamente.

O tipo de manchas varia com as gatas. A predominância de uma cor relativamente à outra depende de como se deu a inactivação. As células que migram para a hipoderme e depois dão origem aos melanócitos, dependendo de qual foi o cromossoma X que sofreu inactivação e da percentagem de cada uma delas, é que vão originar maiores extensões de manchas pretas ou maiores extensões de manchas laranja.

5- A inactivação é determinada pelo gene XIST, e portanto este gene é q é responsável pela inactivação do cromossoma X de tal maneira q só se expressa no cromossoma X inactivo, e portanto acaba por constituir uma excepção à inactivação do cromossoma X, isto é, o cromossoma X está inactivo ; existem genes q se expressam à mesma, um deles é este X q é responsável pela manutenção deste estado de inactivação, mas existem outros, vimos há pouco qd falámos das regiões pseudo-autossómicas e de alguns outros genes tb situados na região não recombinante do cromossoma Y, são homólogos entre o cromossoma Y e o cromossoma X, e dissémos q por uma questão de compensação de dosagem, fazia sentido pensar q na fêmea alguns destes genes escaparão à inactivação, e portanto mantêm-se activos mesmo estando presentes no corpúsculo de Barr do cromossoma inactivo.

A expressão do gene XIST não é uma proteína mas sim um tipo especial de RNA, chamado RNA XIST. Quando se faz uma análise deste RNA XIST só se verifica a sua existência dentro ou em cima do cromossoma X inactivo; assim sendo, o produto do gene XIST (este RNA), vai-se acumular no cromossoma X inactivo, constituindo no fundo a razão da sua inactivação. É a presença deste RNA que determina ou mantém o estado de inactivação do cromossoma X.

6- As sequências reguladoras do gene XIST no cromossoma X activo estão metiladas e por isso a sua transcrição é descontínua. Como a manutenção da inactivação do cromossoma X depende da expressão do gene XIST, então é lógico pensar que ele não se pode expressar no cromossoma X activo, porque caso isso acontecesse provocava a sua inactivação. Dessa forma, as sequências reguladoras estão metiladas no cromossoma X activo, permitindo que ele permaneça nesse estado (a metilação de sequências é uma das maneiras q as células têm de inactivar um gene, neste caso o gene XIST).

7- A inactivação resulta da metilação que ocorre, principalmente, nos resíduos de citosina, presentes em alguns dinucleótidos muito frequentes nas regiões 5’ de muitos genes e que são designados por ilhas CpG (ilhas citosina – guanina). É esta citosina destes dinucleótidos que faz, geralmente, a ligação do grupo metilo; consequentemente, a metilação afecta, principalmente, estas ilhas CpG. Como são frequentes nas regiões 5’ de alguns genes promovem a sua inactivação, fazendo com que o gene seja incapaz de se transcrever.

8- Porque é que, uma vez inactivo o cromossoma X, todas as células filhas vão manifestar o mesmo padrão de inactivação? Isto está relacionado com a enzima responsável pela metilação da citosina.

O que acontece é que durante a replicação do DNA, como se trata de um processo semi-conservativo, passam a existir duas cadeias “velhas”, contendo o padrão de inactivação dado, ou seja, as suas ilhas CpG encontram-se metiladas. As cadeias recém sintetizadas não vão estar metiladas; a DNA polimerase quando acrescenta nucleótidos não metila as citosinas. Tem de haver, pois, um processo que faça com que o DNA das cadeias recém sintetizadas seja também metilado nestas posições.

A enzima responsável pela metilação, quando reconhece uma das cadeias “velhas”, vai metilar os nucleótidos da respectiva cadeia complementar.

Replicação do DNA

Metilação

A- Cadeia de DNA com as ilhas CpG metiladas na citosina.B- Quando ocorre a replicação do DNA num processo semi-conservativo, uma das cadeias permanece metilada mas a cadeia recém sintetizada não herda ou não recebe essa metilação.C- Quando a enzima responsável pela metilação encontra um grupo metilo na cadeia “velha” acrescenta uma metilação no nucleótido da cadeia complementar.

As duas células filhas vão apresentar o mesmo padrão de inactivação em termos de metilação das citosinas, mantendo, dessa forma, os genes inactivos.

Os genes tanto podem estar numa cadeia como na outra (numa direcção ou na outra). Se a metilação só preenchesse uma das cadeias, os genes que estivessem na cadeia não metilada poderiam dispersar-se. O que se pretende é que todo o cromossoma X fique inactivo, portanto, o organismo encarrega-se de proceder à metilação de ambas as cadeias por detecção da metilação na cadeia “velha”.

CITOGENÉTICA; TELÓMEROS, IMPRINTING GENÓMICO, FREEMARTINISMO

Telómeros- a sua quebra leva à formação de terminações “sticky” instáveis (é essencial a conservação destas porções dos cromossomas)

Os telómeros são constituídos por sequências repetidas ao longo de extensões relativamente grandes (sequências de oligonucleótidos repetidas em tandem. exº GGGTTA)

A

B

C

Manutenção do telómero ao longo da divisão das células

A DNA polimerase tem dificuldade em fazer a replicação até ao fim da cadeia. Se este mecanismo não existisse, em cada ciclo os telómeros iam encurtando.

Na replicação de DNA a extremidade 3’ é estendida por uma DNA polimerase, dependente de RNA, tendo como molde uma sequência complementar de RNA (CCCAAU) presente numa enzima telomerase. Essa enzima possui uma sequência complementar e funciona como molde. A DNA polimerase que faz a síntese dá origem à sequência do telómero.

O telómero 5’ é depois sintetizado por uma DNA polimerase standard baseada na cadeia 3’ recém sintetizada.

Uma diminuição da actividade da telomerase estará relacionada com a acumulação de aberrações cromossómicas que acompanham a senescência celular (morte por envelhecimento) e tumorigénese (quando um telómero desaparece verificam-se translocações, etc o que leva ao aparecimento de tumores nesses tecidos).

(Ainda não se conseguiu controlar o envelhecimento com este mecanismo, i.e., evitando o encurtamento dos telómeros. Exº - Doly)

Imprinting genómico

Para determinados genes ocorre uma expressão preferencial dos alelos de origem materna ou paterna (exº - quando se verifica imprinting materno expressa-se sempre o gene proveniente da mãe).

(O mecanismo não está ainda bem conhecido. A existência de imprinting dificulta a análise genealógica)

Na gametogénese o imprinting é “reset” (posto a zeros) para que na geração seguinte a cópia activa do gene seja dependente do progenitor de origem e não do seu estado de inactivação prévio num dos pais.

A metilação está ligada ao processo de inactivação estando os alelos inactivos por vezes metilados nas ilhas CpG (p – ligação fosfato entre a citosina e a guanina; dinucleótidos CG).

Como aqui se verifica no imprinting materno é o gene proveniente da mãe que se mostra activo independentemente de o ser anteriormente ou não

(Cadeia 3’ é geralmente mais extensa)

Exº de imprinting materno (atenção à F2)

Freemartinismo- ocorre em 90% dos partos gemelares em bovinos.

- raro noutras espécies: caprinos, suínos, ovinos (1%).

- nos equinos não tem consequências (as anastomoses acontecem mas os indivíduos não são afectados)

Fêmeas estéreis freemartins resultantes de um parto gemelar (gémeos) em que o irmão é do sexo masculino.

Resulta da formação de anastomoses vasculares ao nível da placenta de ambos os fetos e consequente troca de células hematopoiéticas (eritrócitos e leucócitos).

Os freemartins (tanto o gémeo masculino como o feminino) são quimeras porque possuem populações celulares com origem em dois zigotos diferentes. O quimerismo é visível ao nível dos grupos sanguíneos, manifestando-se também nos leucócitos que são quimeras (XX/XY). Não há quimerismo ao nível das restantes células do macho e da fêmea.

Consequências na fêmea: (perturbação tanto maior quanto mais precoce é a anastomose)

- existência de vários estados de intersexualidade (mistura de características masculinas e femininas em graus variáveis)

- gónadas com tecido ovárico e testicular (ovatestes)

- ovários normais → testículos intra-abdominais (este extremo verifica-se caso a anastomose seja muito precoce)

- genitália externa essencialmente normal e clitóris hipertrofiado

- tendência para a regressão dos derivados do ducto de Muller (estruturas sexuais femininas) e sobredesenvolvimento dos derivados do ducto de Wolf

- útero, cérvix, vagina normais → vesículas seminais, ducto deferente e vagina em fundo de saco.

Consequências no macho: (pouco significativas)

- ligeira redução da fertilidade em consequência da diminuição da motilidade dos espermatozóides e da concentração destes no esperma

- características sexuais normais

Para verificar se determinado indivíduo é freemartin efectua-se um enxerto de pele do seu gémeo. Caso tenha havido anastomose, o sistema imunitário reconhece as células.

MODELO MULTIFACTORIALEste modelo é aplicado a características determinadas pelo efeito combinado

de muitos factores, quer genéticos, quer ambientais.

Em genética, tudo o que não é genético designa-se ambiental.

2 Parâmetros:

- Susceptibilidade (liability) – variável contínua que quantifica o efeito combinado dos factores genéticos e ambientais, que conferem a um indivíduos uma maior ou menor propensão para o desenvolvimento de uma característica.

- Limiar (threshold) – nível de susceptibilidade acima do qual todos os animais desenvolvem uma dada doença e abaixo do qual são todos normais.

As características podem ser geneticamente explicadas pelos conceito de:

Penetrância genética incompleta – proporção de indivíduos com um dado genótipo que mostram o fenótipo esperado (exº apenas 90% demostram o fenótipo próprio)

Expressividade variável – variação no grau de expressão fenotípico

exº - displasia, monogénica recessiva – os monozigóticos recessivos apresentariam a doença, mas isso não acontece em todos (penetrância incompleta). Ainda assim, os que possuem podem ter displasia mais ou menos severa (expressividade variável).

Estas doenças são melhor enquadradas num modelo multifactorial.

Uma estimativa da importância relativa dos factores genéticos e ambientais num modelo multifactorial é dado pela heritabilidade (h2 ) e não hereditabilidade.

Heritabilidade – neste contexto, é a proporção da variação total da característica atribuída à variação dos factores genéticos.

Se conseguirmos quantificar o que é genético e o que é ambiental estamos a analisar heritabilidade.

Heritabilidade de susceptibilidade – proporção das diferenças de susceptibilidade atribuível às diferenças genéticas entre os animais.

Animais geneticamente iguais - h2 = 0 (clones). Se os indíviduos são geneticamente iguais e têm susceptibilidades diferentes, a componente genética é nula (devido a factores ambientais).

Ambiente igual - h2 =1. Geneticamente diferentes mas todos sujeitos ao mesmo ambiente. Aí toda a variação se deve a factores ambientais.