Secuenciación y análisis del gen de la miostatina (gdf 8 ... · FRANK LEONARDO RAMOS BAQUERO Dr....

Universidad de La SalleCiencia Unisalle

Medicina Veterinaria Facultad de Ciencias Agropecuarias

1-1-2014

Secuenciación y análisis del gen de la miostatina(gdf 8) en búfalos de la raza murrah y sus crucespara determinar la existencia de posiblesmutaciones que se expresen en doble musculaturaen el departamento de AntioquiaMaría Angélica Reyes PáezUniversidad de La Salle

Natalia Johana Rojas TovarUniversidad de La Salle

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Citación recomendadaReyes Páez, M. A., & Rojas Tovar, N. J. (2014). Secuenciación y análisis del gen de la miostatina (gdf 8) en búfalos de la raza murrah ysus cruces para determinar la existencia de posibles mutaciones que se expresen en doble musculatura en el departamento deAntioquia. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/medicina_veterinaria/237

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UNIVERSIDAD DE LA SALLE

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Programa de Medicina Veterinaria

SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS DEL GEN DE LA MIOSTATINA (GDF 8) EN BÚFALOS DE LA RAZA MURRAH Y SUS CRUCES PARA DETERMINAR LA

EXISTENCIA DE POSIBLES MUTACIONES QUE SE EXPRESEN EN DOBLE MUSCULATURA EN EL DEPARTAMENTO DE ANTIOQUIA.

Trabajo de Grado

MARÍA ANGÉLICA REYES PÁEZ

NATALIA JOHANA ROJAS TOVAR

Bogotá, Colombia

2014

UNIVERSIDAD DE LA SALLE

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Programa de Medicina Veterinaria

SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS DEL GEN DE LA MIOSTATINA (GDF 8) EN BÚFALOS DE LA RAZA MURRAH Y SUS CRUCES PARA DETERMINAR LA

EXISTENCIA DE POSIBLES MUTACIONES QUE SE EXPRESEN EN DOBLE MUSCULATURA EN EL DEPARTAMENTO DE ANTIOQUIA.

Trabajo de Grado

MARÍA ANGÉLICA REYES PAEZ

CÓDIGO: 14082108

NATALIA JOHANA ROJAS TOVAR

CÓDIGO: 14051013

Director

Dr. GEOVANNY MENDOZA SÁNCHEZ

Coodirector

MARCELA FERNANDEZ

Bogotá, Colombia

2014

i

HOJA DE APROBACIÓN

DIRECTOR _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

Dr. Geovanny Mendoza Sánchez

JURADO _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

Dr. Ariosto Ardila Silva

JURADO _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

Dr. German Alonso Prada

ii

DIRECTIVOS

RECTOR

VICERRECTOR ACADÉMICO

VICERRECTOR DE PROMOCIÓN Y

DESARROLLO HUMANO

VICERRECTOR ADMINISTRATIVO

VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓN Y

TRANSFERENCIA

DECANA DE LA FACULTAD DE

CIENCIAS AGROPECUARIAS

DIRECTOR PROGRAMA DE MEDICINA

VETERINARIA

Hno. CARLOS GÓMEZ RESTREPO

Hno. CARLOS ENRIQUE CARVAJAL

COSTA

Hno. FRANK LEONARDO RAMOS

BAQUERO

Dr. EDUARDO ÁNGEL REYES

Dr. LUIS FERNADO RAMIREZ H.

Dra. CLAUDIA AIXA MUTIS BARRETO

Dr. JUAN FERNANDO VELA JIMÉNEZ

iii

COMPROMISO

El presente trabajo de grado no contiene ideas que sean contrarias a la doctrina católica

en asuntos de dogma y moral.

El presente documento es original y se realizó sin violar derechos de autor de terceros; las

ideas expuestas son propias de los autores y no son influenciadas por ninguna fuente.

iv

AGRADECIMIENTOS

Al Doctor Andrés Felipe Santander por su colaboración y enseñanzas que nos llevaron a

sacar adelante el proyecto.

A los Doctores del CES Jesús Alfredo Verdugo Gutiérrez y John Didier Ruiz Buitrago porque

sin su colaboración el estudio no habría sido posible.

A Boris Sepúlveda y Marcela Fernández coodirectora de nuestro proyecto de investigación,

quienes pertenecen al laboratorio Biotecgen que le dieron dirección con su experiencia y

conocimiento a nuestro trabajo.

Al Laboratorio Biotecgen por dejarnos usar sus instalaciones y equipos para poder realizar

los procedimientos ya que sin su ayuda no hubiéramos podido continuar con el proyecto.

A la Doctora Arlen Patricia Gómez por sus consejos y asesoría siempre que la necesitamos

y apoyo con el laboratorio.

Al Doctor Geovanny Mendoza director de la tesis que estuvo para apoyarnos y ayudarnos

a solucionar los inconvenientes que se presentaron en el camino.

A la Doctora Laura Victoria V. Castillo por sus consejos y actitud positiva que nos

motivaron a dar lo mejor de nosotras en el desarrollo del estudio.

v

DEDICATORIA

A mis padres María Cristina Páez Murillo y Jorge Andres Reyes Barajas,

quienes han estado presentes en cada etapa de mi vida y me han hecho la mujer

que soy hoy, agradezco cada uno de sus consejos y el apoyo brindado siempre en

las cosas que me apasionan de la vida. A mis hermanos Andres Felipe Reyes y

Juan Pablo Reyes quienes me han cuidado a lo largo del camino y siempre están

ahí para apoyarme y aconsejarme en todo. A mis amigas que considero como

parte de mi familia ya que me han acompañado en cada proceso y a quienes quiero

y admiro mucho.

María Angélica Reyes Páez

Con todo mi corazón a mis padres Dora Tovar y Jairo Rojas, por su apoyo

incondicional y darme fuerzas para continuar en esos momentos que sentía

rendirme, a mi hermano Andrés Rojas Tovar por sus ayudas fortuitas y

comprensión que fueron claves para continuar, a mi familia en general por todas

las palabras de ánimo en todo momento y finalmente a Giovanny Bohórquez que

siempre estuvo motivándome con todo su amor y paciencia; sin ellos no creo haber

logrado terminar todo este proceso arduo pero finalmente exitoso.

Natalia Rojas Tovar

vi

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN ..........................................................................................................................................x

ABSTRACT ....................................................................................................................................... xi

1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 1

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................................... 2

3. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 3

3.1 Objetivo General ............................................................................................................... 3

3.2 Objetivos Específicos ....................................................................................................... 3

4. HIPOTESIS ........................................................................................................................... 3

4.1 Hipótesis nula .................................................................................................................... 3

5. MARCO TEÓRICO ................................................................................................................... 4

5.1 EL BÚFALO (Bubalus bubalis) ....................................................................................... 4

5.1.1 Densidad poblacional en Colombia ....................................................................... 5

5.1.2 Importancia económica ............................................................................................ 6

5.2 MIOSTATINA .................................................................................................................... 6

5.2.1 Bioactividad de la Miostatina .................................................................................. 7

5.2.2 Miostatina y El Ciclo Celular ................................................................................... 8

5.2.3 Miostatina Bovina ..................................................................................................... 9

5.2.4 Miostatina en la especie Bubalus bubalis ............................................................. 9

5.2.5 Mutaciones y fenotipos asociados al gen de la Miostatina .............................. 11

5.2.4.1 Mutaciones que provocan la aparición de un codón Stop prematuro .................... 12

5.2.4.2 Mutaciones que afectan a la estructura secundaria de la proteína. ....................... 12

5.2.4.3 Mutaciones que no afectan a la función de la proteína. ......................................... 12

5.2.4.4 Mutaciones en otras especies Domesticas y el humano. ..................................... 13

5.3 DOBLE MUSCULATURA .............................................................................................. 13

5.3.1 Características de los individuos con doble musculatura. ............................... 14

5.3.2 Problemas asociados a la doble musculatura. .................................................. 15

6. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................ 16

6.1 Población ......................................................................................................................... 16

vii

6.2 Toma de muestras de sangre ....................................................................................... 19

6.3 Extracción de ADN ......................................................................................................... 19

6.4 PCR- convencional ......................................................................................................... 20

6.5 Electroforesis de productos amplificados ................................................................... 22

6.6 Secuenciación de nucleótidos ...................................................................................... 22

6.7 Manejo de variables y Análisis estadístico ................................................................. 22

7. RESULTADOS ........................................................................................................................ 23

7.1 Estandarización del proceso de amplificación. .......................................................... 23

7.2 Amplificación de ADN por PCR .................................................................................... 23

7.3 Análisis de la secuenciación ......................................................................................... 25

7.3.1 Comparación del Exón 2 entre la especie Bubalus bubalis............................ 25

7.3.2 Comparación del Exón 3 entre la especie Bubalus bubalis............................ 26

7.3.3 Comparación del Exón 2 entre la especie Bos taurus. ..................................... 27

7.3.4 Comparación del Exón 3 entre la especie Bos taurus. ..................................... 27

7.3.5 Comparación del Exón 2 entre las dos especies Bubalus bubalis y Bos

taurus…………………………………………………………………………………………………………………………………..28


taurus…………………………………………………………………………………………………………………………………..28

7.4 Variaciones encontradas entre Bubalus bubalis y Bos taurus. ............................... 29

8. DISCUSION ............................................................................................................................. 29

9. IMPACTO E INDICADORES ................................................................................................ 31

BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................... 32

viii

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Descripción de la población. ......................................................................................... 17

Tabla 2. Primers para la amplificación de ADN. ........................................................................ 20

Tabla 3. Identificación de las muestras para el proceso de PCR ........................................... 21

Tabla 4. Estandarización de temperatura de fusión. ............................................................... 23

Tabla 5. Las estimaciones de la divergencia evolutiva entre secuencias del Exón 2 entre

Bubalus bubalis. ............................................................................................................................. 26


Bubalus bubalis. ............................................................................................................................. 26


Bos taurus........................................................................................................................................ 27

Tabla 8. Las estimaciones de la divergencia evolutiva entre secuencias del Exón 2 entre la

especie Bos taurus. ........................................................................................................................ 27


ambas especies. ............................................................................................................................. 28


ambas especies. ............................................................................................................................. 28

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Censo Bufalino- Colombia 2013 por la Dirección y vigilancia epidemiológica. ... 5

Figura 2 Mecanismo de señalización de la Miostatina. ............................................................ 8

Figura 3. Características generales del gen de la Miostatina bovina. ................................... 9

Figura 4. Comparación del tamaño de los exones e intrones del gen de la Miostatina

GDF8 entre diferentes especies. ................................................................................................. 10

Figura 5. Estructura de la proteína y mutaciones naturales que se producen en el gen de

la Miostatina bovina. ...................................................................................................................... 11

Figura 6 . Animales compatibles con el fenotipo de doble musculatura............................... 17

Figura 7 . Animales con fenotipo de hipertrofia leve................................................................ 18

Figura 8. Animales de fenotipo normal. .................................................................................... 18

Figura 9. Animal control Bos taurus raza Holstein. ................................................................. 19

Figura 10. Kit de extracción DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN Corporation, USA). ... 19

Figura 11. Proceso de extracción de ADN. ............................................................................... 20

Figura 12. Termociclador C1000 Thermal Cycler (BIO-RAD, CA, USA) ............................. 21

Figura 13. Proceso de electroforesis. ........................................................................................ 22

Figura 15. Productos de la PCR-convencional Exón 1. .......................................................... 24

Figura 16. Producto de la PCR-convencional Exón 2 y Exón 3. ........................................... 24

Figura 17. Electroesferograma Exón 1 picos sobrepuestos muestra aE1. .......................... 25

x

RESUMEN

La Miostatina o GDF-8 (growth diferentiation factor-8) es un regulador extracelular negativo que se expresa a nivel de la masa muscular. Es miembro de la familia de los factores de crecimiento TGF-β, el cual es muy importante en el desarrollo y la fisiología del musculo. Desde el siglo XIX se han presentado bovinos con un desarrollo muscular desproporcionado, debido a mutaciones que inhibe la acción de la Miostatina, a esto se le denomina doble musculatura. Estos individuos se caracterizan por un aumento generalizado de la masa muscular de un 20%, debido a una hiperplasia muscular la cual es más evidente en el cuarto trasero, y así mismo a una reducción del contenido lipídico total. Esto es común en muchas razas europeas de la especie Bos taurus, pero no en individuos de la especie Bubalus bubalis.

El estudio propuesto se centró en la determinación de mutaciones en el gen de la Miostatina en individuos de la raza Murrah y sus cruces de la especie Bubalus Bubalis, cuya expresión pueda llevar al posible fenotipo de la doble musculatura. A partir de la clasificación y depuración de los datos preexistentes de la Asociación Colombiana de Criadores de Búfalos (ACB), se determinaron trece casos a evaluar de tres sistemas productivos de búfalos ubicadas el departamento de Antioquia. Adicionalmente se evaluó a un individuo de la especie Bos taurus (Raza Holstein) como control de la amplificación del gen. Se tomaron muestras de sangre directamente de la vena coccígea en tubos con EDTA por cada individuo, incluyendo el control. Siguiendo con los procesos de extracción de ADN, PCR y, finalmente, secuenciación de nucleótidos. Los resultados obtenidos fueron comparados y analizados con las secuencias reportadas para el gen de la Miostatina de las especies evaluadas. Evidenciando que los búfalos seleccionados con fenotipos compatibles con doble musculatura, hipertrofia leve y fenotipo normal no presentaron ningún tipo de alteración en los nucleótidos de las secuencias evaluadas. Se logró demostrar la variación interespecífica al comparar los exones dos y tres del gen, encontrando 12 variaciones entre dichas especies.

xi

ABSTRACT

Myostatin or GDF-8 (growth diferentiation factor-8) is an extracellular negative regulator of muscle growth. It is a member of the transforming growth factor-beta (TGF-β) superfamily of genes. This gen is very important in the physiology and development of the muscular tissue. Since de XIX century some cattle have exhibit an exceptional muscular development due to mutations that inhibit the action of Myostatin, these animals are referred to as double-muscled. These individuals are characterised by an increase in muscle mass of the order of 20%, due to a generalised skeletal muscle hyperplasia, which is more evident in the hindquarters, and a reduction in total lipid content. This phenotype is common in many European Bos taurus breeds but not in the Bubalus Bulalis.

The aim of this study was to determine mutations in the Myostatin gene of Murrah breed animals and their crosses of the Bubalus Bubalis specie, that are responsible for the expression of the possible double-muscled phenotype. Based on the classification and treatment of pre-existing data from the Colombian Buffalo Breeders Association (ACB) thirteen cases were evaluated from three breeding buffalo farms located in the department of Antioquia. Additionally was evaluated a Bos tauros (Holstein) animal that served as amplification control of the gene. The blood samples were collected in Vacutainer tubes with EDTA from all the animals including the control. Following a DNA extraction, PCR and nucleotide sequencing for their molecular analysis. The results were compared and analyzed with the sequences reported for the Myostatin gene of the species evaluated. Showing that buffaloes with selected phenotypes compatible with double muscled, mild hypertrophy and normal phenotype showed no alteration in the evaluated nucleotide sequences. In this study was demonstrated interspecific variations when exons 2 and 3 were compared among these species finding 12 variations.

1

1. INTRODUCCIÓN

El desarrollo muscular excesivo es un síndrome hereditario de diversas especies de mamíferos causado por un solo gen autosómico cuya expresión está influida por genes modificadores (Arthur et al., 1989), en bovinos se denomina doble musculatura (DM), descrito por primera vez en 1807 por Culley (Miranda et al., 2002) en vacas Shorthorn. Posterior a esto se han venido reportando varios casos en razas europeas a partir de la especie Bos taurus, tales como la Blanco Azul Belga, Asturiana de los Valles, Piamontesa, Marchigiana, Charoláis, Limousine, Maine Anjou, entre otras (Royo, 2002; Grisolia et al., 2009). Estos animales se caracterizan por presentar un 20% de aumento de la masa muscular, debido a la hiperplasia generalizada del músculo esquelético (Grobet et al.; 1997), cabe aclarar que otros autores lo describen como hipertrofia muscular como Moreno et al., 2008. Este fenotipo se atribuye a mutaciones naturales en el gen de la Miostatina, también denominado en inglés como “growth and differentiation factor-8” (GDF8), perteneciente a la superfamilia de los transforming growth factors (TFG-β), localizados en el cromosoma 2 bovino (BTA2) (Charlier et al., 1995). Se ha demostrado que las mutaciones que dan lugar a una Miostatina inactiva son responsables del crecimiento muscular exagerado que caracteriza este síndrome (Grobet et al., 1998). Funcionalmente la Miostatina actúa como un regulador extracelular negativo, y es esencial para la regulación adecuada de la masa del músculo esquelético (Mc Pherron y Lee, 1997; Moreno et al., 2008). Los animales que presentan esta afección se caracterizan por tener la musculatura corporal aumentada, el tejido adiposo subcutáneo e intramuscular disminuido, y menor tamaño en los órganos (Vermorel., et al, 1994). Así mismo, este fenotipo está asociado a una alta incidencia de problemas reproductivos, como la reducción de la fertilidad, distocia, baja viabilidad de las crías y aumento de la susceptibilidad al estrés (Menisser, 1982; Arthur, 1988). Por otro lado, en la industria de producción de carne, comparando la calidad de la carne proveniente de animales que carecen de éste síndrome con los que presentan la doble musculatura (DM) existen controversias. Ya que, los animales afectados presentan carnes más magras, reducción en el contenido lipídico, menos hueso y mayor retención de agua a nivel muscular, lo que da a lugar una carne más tierna (Menissier, 1982). Características deseables o no, dependiendo de los objetivos de cada producción ganadera, sopesando en algunos casos los problemas reproductivos. El estudio propuesto busca determinar posibles mutaciones en el gen de la Miostatina (GDF8) en animales de la especie Bubalus bubalis en el departamento de Antioquia, dónde se han presentado posibles casos de DM. Estos casos, han sido registrados tanto por parte de la Asociación Colombiana de Criadores de Búfalos (ACB) en sus visitas técnicas como por parte de los criadores de búfalos de la raza Murrah y sus cruces. Sin embargo, en esta especie en particular no es común encontrar esta mutación, como sí lo es en algunas razas europeas de Bos taurus, criadas para la producción de carne.

2

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La doble musculatura (DM), fue descubierta por primera vez en la raza Shorhorn a comienzos del siglo XIX. Después fue presentando en diversas razas europeas de la especie Bos taurus, lo cual llevó a una selección artificial a favor de estos animales en la producción de carne. Esto desató un movimiento entre los productores de carne haciendo que esta característica se conociera a nivel mundial (Ménissier, 1982) y fuera deseada por algunos productores de la época. Provocando años más tarde que creciera el interés sobre el estudio del gen de la Miostatina y sus mutaciones en diversas razas europeas las cuales son las responsables de esta característica.

Sin embargo, sólo hasta el año 2006 se iniciaron estudios para la caracterización del gen de la Miostatina, en individuos de la especie Bubalus bubalis en Brasil (Mota et al., 2006). En el estudio se compararon las regiones codificantes y la secuencia de aminoácidos con aquellas de la especie Bos taurus, arrojando un 98.94% de similitud en cuanto a las regiones codificantes y un 98.67% en la secuencia de aminoácidos comparada con la proteína bovina. Por otro lado, en Tantia et al. (2007), realizaron otro estudio en Haryana, India. En este estudio se secuenció el DNA genómico y el RNAm del gen de la Miostatina en búfalos de diferentes razas clasificadas por su tamaño. Este estudio comparó sus resultados con individuos de las especies Bos taurus , Bos Indicus, Ovis aries, y Homo sapiens, presentado varias similitudes entre especies.

Basados en la revisión bibliográfica se pudo establecer que sólo hay un reporte de la existencia de mutaciones en el gen de la Miostatina en individuos de la especie Bubalus bubalis, producto de un trabajo de investigación (Mota et al, 2003) en un resumen del Congreso Brasilero de genética número 49 que se realizó en Águas de Lindóia, São Paulo. El objetivo de este estudio fue determinar la presencia o ausencia de alteraciones en el exón III del gen GDF8, que pudieran dar lugar al desarrollo muscular diferenciado. El estudio arrojó dos alteraciones en los nucleótidos (A940G e A942G), las cuales provocan una sustitución de una histidina por una arginina en la secuencia de aminoácidos de la proteína, lo que llevó a sugerir una hipótesis de que esta mutación puede estar ocasionando una disminución en la actividad y control negativo de la Miostatina. Sin embargo, estos hallazgos no demuestran que la existencia de dichas mutaciones se exprese como fenotipo de la doble musculatura (Grobet et al., 1998) y que afecten de la misma forma que a la especie bovina.

En Colombia, en los últimos cinco años se han reportado casos de animales de la especie Bubalus bubalis por parte de algunos criadores, que posiblemente presentan el fenotipo de la doble musculatura como fue reportado por la ACB. Estos han sido basados en datos técnicos pero sin el respaldo de un estudio científico. Sin embargo no existen reportes de que este fenotipo sea comúnmente encontrado en esta especie, por tal razón en Colombia no se ha profundizado en el tema. Teniendo en cuenta estos registros, se busca identificar en estos animales posibles mutaciones en el gen de la Miostatina que se expresen en el fenotipo de doble musculatura, las cuales tienen directas implicaciones en la producción de carne. Un factor de gran importancia económica para muchos ganaderos en Colombia.

3

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo General

Secuenciar y analizar el gen de la Miostatina (GDF8) en búfalos de la raza Murrah y sus cruces identificando posibles mutaciones que expresen el fenotipo de la doble musculatura en individuos de la especie Bubalus bubalis en el departamento de Antioquia.

3.2 Objetivos Específicos

Secuenciar el Exón 1, Exón 2 y Exón 3 del gen de la Miostatina de los casos

existentes de individuos de la especie Bubalus bubalis.

Analizar las secuencias obtenidas mediante la comparación con las secuencias

reportadas para la especie Bubalus bubalis en el GenBank para identificar posibles

mutaciones.

4. HIPOTESIS

Mediante el análisis molecular del gen de la Miostatina se determinará la existencia de

mutaciones en los animales estudiados, que se relacionen directamente con el fenotipo

de doble musculatura.

4.1 Hipótesis nula

Mediante el análisis molecular del gen de la Miostatina no se determinará la existencia

de mutaciones en los animales estudiados, que se relacionen directamente con el

fenotipo de doble musculatura.

4

5. MARCO TEÓRICO

5.1 EL BÚFALO (Bubalus bubalis)

El búfalo doméstico es originario del continente asiático, por ello también se le conoce como búfalo asiático. Se estima que fue domesticado 3.000 años antes de Cristo en el Valle de

Indus (en India), en la región del Ur (actual Irak) y en el valle de Yangtze de China, los anteriores dependen fuertemente del búfalo de agua por su carne, leche y su utilización para el trabajo. Recientemente se ha introducido en el Sur y Centro América (Morán, 2004).

En la clasificación taxonómica el búfalo doméstico es tradicionalmente agrupado dentro de la sub- familia Bovide, género Bubalus, especie Bubalus bubalis Esta especie se dividide en dos grupos principales el Bubalus bubalis sp. Comúnmente conocido como "Búfalo de río” o “Búfalo lechero" con 50 pares de cromosomas, y el Bubalus bubalis var. kerebau denominado "Búfalo de pantano o Carabao" con 48 pares de cromosomas (Patiño, 2011) El Bubalus bubalis es muy robusto, de color gris oscuro, semiacuático, con una pequeña giba dorsal y de gran cornamenta. Es un animal de fuerte contextura, ósea con un cuerpo abarrilado profundo y bajo, con extremidades cortas, los huesos de la cabeza son esponjosos y livianos lo que les permite flotar fácilmente en el agua. Sus pezuñas anchas le permiten pisar sin hundirse en terrenos pantanosos, está dotado de cuernos macizos curvados hacia atrás y dispuestos hacia fuera; gran parte del cuerpo está desprovisto de pelo y tiene un aspecto brillante y lustroso, además no tiene glándulas sudoríparas en la piel, factor que le hace buscar con más intensidad el agua para disipar el calor corporal (Derivaux, 1976). Debido a su entereza, los animales están muy adaptados a suelos de baja fertilidad, pantanos, siendo capaces de convertir sus alimentos en carne y leche ricos en proteínas y fibra de alto valor, con la longevidad y la capacidad de ocupar áreas geográficas inadecuadas para otras especies rumiantes. En los países latinoamericanos, especialmente Brasil, su contribución en estos aspectos ha crecido en los últimos años y se espera llegar a ser de gran importancia como para las propiedades rurales, así como para los productores y los procesadores de alimentos (Oliveira, 2005).

5

5.1.1 Densidad poblacional en Colombia

En Colombia se estima que la población bufalina tiene un crecimiento anual cercano al 10%, cifra superior al 3% del crecimiento de la ganadería bovina. (Sanint, 2006). Por esta razón cabe resaltar que la producción de carne de búfalo en el país está tomando fuerza y se está convirtiendo en una de las grandes industrias de los ganaderos. En la Figura 1 se observa el censo bufalino de Colombia en el año 2013 donde se muestra el crecimiento poblacional que tiene esta especie en el país. El Instituto Agropecuario Colombiano (ICA) indica una población aproximada de 188,079 animales concentrados principalmente en los departamentos de Córdoba, Antioquia y Santander que agrupan al 57% de la población. Por otro lado a nivel mundial la FAO reporta una población de 198’883,259 de la cual 262,702.00 pertenece al continente suramericano, mostrando el crecimiento que ha teniendo la especie en Latinoamérica.

Fuente: ICA, 2013

Figura 1. Censo Bufalino- Colombia 2013 por la Dirección y vigilancia epidemiológica.

El mapa indica por colores la densidad poblacional en los diferentes departamentos del territorio Colombiano. La población se centra en los departamentos de Antioquia, Santander, Norte de Santander, Córdoba, Sucre, Bolívar y el Magdalena.

6

5.1.2 Importancia económica

Los búfalos son animales cuya explotación agropecuaria se basa en dos grandes productos: carne y leche. En relación a la producción de carne se tienen reportes que los búfalos alcanzan el peso de sacrificio antes que el ganado vacuno, evidenciándose que es un animal precoz para producir carne. Por lo anterior, una explicación que se encuentra al respecto es la capacidad que tiene la especie de aprovechar con mayor eficiencia las pasturas, presentando mejores tasas de conversión alimenticia (Vale et al., 2002) Por otra parte, los resultados de investigaciones sobre la carne, emitidos por el Departamento de Agricultura en Estados Unidos, demuestran que la carne de búfalo tiene 40% menos colesterol, 12 veces menos grasa, 55% menos calorías, más minerales y más vitaminas, esto comparada con la carne de vacunos. Sumado a lo anterior, la carne se caracteriza físicamente por ser más suave, tener una apariencia similar a la carne vacuna y la grasa es totalmente blanca. El índice de grasa intra-muscular es menor que el de la carne bovina, lo que hace que al retirar esta grasa la carne sea extremadamente magra, así mismo el sabor es similar al de la carne de bovinos (Guarín et al., 2001). La leche del búfalo tiene valor nutritivo muy alto y es excelente para la preparación de productos derivados tales como quesos, mantequilla, yogurt, helado, entre otros. (Bustamante, 2011) La leche de búfala tiene una relación grasa/proteína de 2:1 aproximadamente. En comparación con la leche de vacuno, también tiene una mayor relación caseína/proteína. El alto contenido de calcio de la caseína facilita la fabricación de quesos (FAO, 2014). Posee al igual mayores porcentajes de sólidos totales 17.96 % comparado con un 12.83% del bovino (Bos taurus), grasa 7.64% vs 3.90%,proteína 4.36% vs 3.47% y lactosa 4.36% vs 3.47% respectivamente como lo reporta Sandu, 1985 quien fue citado por Bustamante en el 2011

5.2 MIOSTATINA

En el año 1997, McPherron identificó secuencias altamente conservadas entre los miembros de la familia TGF-β. Realizó los estudios con ADN Murino, mediante PCR usando oligonucleótidos degenerados. La familia de los TGF-β está constituida por un amplio grupo de factores de crecimiento y diferenciación, los cuales son de gran importancia en el desarrollo embrionario y en el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos de los animales adultos.

Después de su identificación se ha venido estudiando la Miostatina con el ánimo de caracterizar su función biológica (Thomas 2000, Joulia-Ekaza y Cabello, 2006). Examinando la acción molecular de esta, se reveló que inhibe la proliferación y diferenciación de células miogénicas a través del control de la progresión del ciclo celular. Durante la miogenesis la miostatina inhibe la diferenciación de los mioblastos en los miotubulos (Cassar-Malek et al., 2007; Grisolia et al., 2009), con lo que se determinó que inhibir la actividad de la Miostatina en Murinos tenía una gran influencia en la masa muscular, ya que inducia un incremento dramático en el peso corporal debido a un aumento en el crecimiento de la masa muscular.

El aumento de la masa muscular se identificó histológicamente como una hiperplasia más que una hipertrofia en las células musculares (Grobet et al., 1997). Autores como Lee y McPherron en el 2001 reportaron que no solo las fibras aumentaban en número (+40%, hiperplasia), sino también en diámetro (+21%, hipertrofia) en los Murinos transgénicos. En contraste autores como Zhu y colaboradores en el 2000, se refieren a hipertrofia sin presencia de hiperplasia, debido a esto como conclusión de los diferentes resultados se

7

sugiere que la baja o moderada inhibición de los niveles de Miostatina conduce a la hipertrofia muscular. Mientras que la supresión total de la Miostatina también induce hiperplasia como lo concluyó Joulia-Ekaza y Cabello en el 2006.

En el estudio de McPherron y colaboradores en 1997, también se demostró que la inhibición de la actividad de este gen no solo provoca aumento en la masa muscular si no también un efecto directo en el tejido adiposo. Lo anterior provoca que este se disminuya en un 70% comparado con animales que tenían una Miostatina normal (McPherron et al.,1997). Esta reducción se puede producir debido a que el aumento de la masa muscular durante mucho tiempo ha sido relacionado con el aumento del gasto de energía en reposo, lo que lleva a la disminución de la grasa libre. Cabe resaltar que los niveles de leptina y adipoquina circulantes y el factor de saciedad que controlan la grasa corporal están reducidos en estos animales (Rodgers y Garikipati, 2008).

Debido a estos estudios se consideró a la Miostatina o GDF-8 (growth/diferentiation factor-8) como un regulador extracelular negativo que se expresa a nivel de la masa muscular y regula su crecimiento, durante la embriogénesis este gen se expresa en los miotonos de los somitos en desarrollo y en los adultos se expresan en muchos músculos del cuerpo. El análisis molecular de este gen ha demostrado que está conformado por tres exones y dos intrones. Por otro lado la secuencia de aminoácidos del GDF-8 Murino consta de 376 aminoácidos, y se constituye de todas las características propias de la familia TGF-β. Dichas características incluyen una secuencia señal para la secreción, un lugar diana para el procesado proteolítico y una región carboxiterminal con un patrón conservado de nueve residuos de cisteína esencial para la actividad de los TGF-β. (McPherron et al., 1997). Al igual que muchos de los factores de crecimiento TGF-β la secuencia del GDF-8 se conserva entre diferentes especies como fue demostrado por McPherron y Lee (1997). Ellos detectaron secuencias homólogas en todas las especies de mamíferos y aves examinadas como en el Murino, rata, humano, babuino, bovino, porcino, pavo y también en pollos, ya que la proteína de la Miostatina es idéntica en la región carboxiterminal, biológicamente activa. Este mismo estudio sugiere que este gen está altamente conservado durante la evolución de los vertebrados, insinuando que la función de la Miostatina también ha sido conservada.

5.2.1 Bioactividad de la Miostatina

La Miostatina ejerce sus acciones mediante un mecanismo similar al del resto de los

miembros de la familia del TGF-ß. El gen depende de la formación de complejos

tetraméricos formados por 2 receptores tipo II (ActRIIB) y 2 tipo I (ALK4 o ALK5), el ligando

se une a los receptores tipo II y posteriormente se enganchan los receptores tipo I (Fiems

L., 2012). Este proceso provoca la formación de un complejo que inicia la cascada de

señalización intracelular que permite que el receptor tipo II fosforile al receptor tipo I en una

serie de residuos de serina y de treonina, activando su dominio cinasa. Por esta razón se

fosforilan las proteínas intracelulares denominadas smads (SMAD2 ySMAD3) reguladas

por receptores (R-smads), las cuales una vez fosforiladas forman un heterodímero con

SMAD4 y se trasladan al núcleo como se observa en la Figura 2. De esta forma se

regularán la transcripción de genes diana (Arce et al, 2004).

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Fuente: (Arce., et al 2004)

Figura 2 Mecanismo de señalización de la Miostatina.

5.2.2 Miostatina y El Ciclo Celular

La conexión entre el ciclo celular del mioblasto y la diferenciación se establece a través de

la regulación de las quinasas dependientes de ciclina (CDKs), una familia de enzimas que

catalizan eventos requeridos para las transiciones del ciclo celular. Los objetivos

principales de esta regulación son los complejos ciclina Cdk G1, la ciclina D-Cdk4 y ciclina

E-Cdk2, que cooperan para controlar la transición G1 a S a través de la fosforilación e

inactivación de la proteína del retinoblastoma (Rb). Los inhibidores de la quinasa dependen

de la ciclina (CKIs), de los cuales hay dos familias, la familia p16 y la familia p21, a su vez,

regulan las actividades quinasa de las CDK. La familia p16 inhibe específicamente Cdk4 y

Cdk6, mientras que la familia p21 inhibe todas las Cdk implicados en la transición de G1 /

S. La pérdida de la función de la miostatina conduce a la hiperplasia y la hipertrofia del

músculo esquelético. Debido a que el aumento de las fibras musculares puede resultar del

aumento de la proliferación de mioblastos y el retraso en la diferenciación. El uso de células

cultivadas de mioblastos C2C12 y la proteína recombinante de la miostatina, comprobó

que la miostatina de hecho regula la progresión del ciclo celular de mioblastos mediante el

control de la G1 a la fase S y G2 a la transición M-fase. También se demostró que la

miostatina logra esto mediante el aumento del nivel de p21 y la disminución de los niveles

y la actividad de la proteína CDK2, que hace de este modo que se inactive complejo ciclina-

E-Cdk2. Esto resulta en la supresión de la fosforilación de la proteína Rb vivo y concurrente

detención del ciclo celular de mioblastos en la fase G1. El aumento del número de miofibras

visto en el ganado y ratones con doble musculatura por lo tanto parece ser el resultado de

la proliferación de mioblastos causado por la ausencia de miostatina funcional. (Guo y

Walsh, 1997; Sherr y Roberts, 1999; Thomas et al., 2000)

9

5.2.3 Miostatina Bovina

La estructura del gen de la Miostatina bovina de la especie Bos taurus consta de tres

exones con 373, 374 y 381 nucleótidos, respectivamente, y dos intrones con 1838 y 2033

nucleótidos cada uno. Por otro lado, en la especie Bos Indicus la única diferencia es a nivel

del primer intrón 1864 nucleótidos, los cuales se observan en la Figura 3, (Tantia et al.,

2007). El ARNm producido estrictamente de las regiones codificante del gen da lugar a

una proteína de 375 aminoácidos. Smith et al., (1997), publicaron mediante el mapeo por

la clonación en YAC (Yeast Artificial Chromosome) que la “Miostatina bovina está cerca

al centrómero del cromosoma 2 bovino (Chr)2 (BTA2) a 2q11”, el cual está

indiscutiblemente en el intervalo donde se encuentra localizado citogenéticamente el locus

mh. Dicha posición es responsable de una hipertrofia muscular como es el caso de los

Murinos a los que se les inhibió la Miostatina, esta característica en bovinos recibe el

nombre de doble musculatura (Charlier et al., 1995, Grobet et al., 1998).

Fuente: Tantia et al., 2007

Figura 3. Características generales del gen de la Miostatina bovina.

5.2.4 Miostatina en la especie Bubalus bubalis

El gen de la Miostatina no había sido estudiado en búfalos hasta el año 2006, donde Mota

y sus colaboradores caracterizaron las regiones codificantes de la Miostatina de Bubalus

bubalis y las comparó con animales de la especie Bos taurus que no presentaran doble

musculatura, con el fin de localizar algún tipo de alteración a nivel de las secuencias de

nucleótidos y de la proteína.

En el estudio se secuenciaron 8 búfalos dentro de los cuales no se encontraron

polimorfismos entre ellos, pero si doce variaciones de nucleótidos y cinco alteraciones en

la secuencia proteica. Cuando el gen de la Miostatina fue comparado con el del bovino, los

resultados fueron los siguientes: Exon1 muestra tres alteraciones, la primera es una

transición de A-G localizada en la posición 301 desde el codón de inicio y es responsable

de la sustitución de una Serina por una Glicina en la posición 101 en la cadena proteica.

La segunda es una sustitución de A-C que es una trasnversion en la posición 348 donde

se remplaza un ácido glutamínico por un Ácido aspártico en la posición 116 en la secuencia

proteica. Finalmente la tercera es una sustitución de una A-G que es una transición en la

posición 349 la cual resulta en el reemplazo de una Treonina por una Alanina en la posición

117. En el Exón 2 se revela la presencia de 5 alteraciones de las cuales 4 son transiciones

silentes (T414C, G483A, G639A y C702T) y una transversión de A-C en la posición 421

responsable de la sustitución de una Lisina en la posición 141 por una Glutamina en la

secuencia del aminoácido (referencia). En el Exón 3 se observaron 4 cambios de los cuales

3 son transiciones silentes (A822G, T1020C y C1083T) y una sustitución (A824G) que lleva

a una remplazo de una Histidina en la posición 275 por una Arginina en la región C-terminal

de la proteína.

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La región codificante de 1128-pb que se secuenció en este estudio mostró un 98.94% de

similitud al igual que la secuencia de aminoácidos que evidenció un 98.67% de igualdad

comparado con la proteína bovina. El resultado de este estudio demuestra el alto grado de

conservación entre la Miostatina del búfalo comparado con la proteína bovina, y también la

completa transferencia de los pares de primers desarrollados para Bos taurus a Bubalus

bubalis. Esto era una expectativa de los investigadores debido a la cercanía entre especies

que pertenecen a la familia Bovidae (Mota et al., 2006).

Por otro lado, en la India se encuentran diez razas de búfalos definidas que se agrupan en razas de talla mediana y talla grande (Nivsarkar., et al 2000). En el 2007 Tantia y otros investigadores realizaron un estudio para caracterizar el gen de la Miostatina en búfalos de diferentes tamaños de las distintas razas, las cuales fueron: Bhadawari (400-475kg), Murrah (500-600kg), y Jaffabaradi (700-100kg). El gen de la Miostatina fue secuenciado en cuatro individuos de cada una de las tres razas nombradas anteriormente, utilizando la secuencia reportada en el GenBank (AH 013313) (Mota et al., 2006), disponible en el Centro Nacional de Biotecnología que es una base de datos que diseña primers para los exones. Se amplificaron los dos intrones del gen de la miostatina a partir de los primers diseñados entre los límites del intron-exon (Tantia et al., 2007). La secuencia del gen de la Miostatina de razas de búfalos de la India para los exones (AY854495 a 854.497), ADN genómico (DQ091762) y ARNm (DQ159987) se presentaron a la base de datos NCBI (Tantia et al., 2007). Se realizó una comparación del tamaño de los exones e intrones de los búfalos con Bos taurus , Bos Indicus, Ovis aries, y Homo sapiens, (Figura 4). El tamaño de los exones era igual en todas las especies, pero la secuencia de intrones reveló cercanía con Bos indicus. A pesar de las considerables variaciones en conformaciones corporales entre las tres razas de búfalos las secuencias de exones de la Miostatina fueron conservadas y eran similares (Tantia et al., 2007). Las razas de búfalos de la India no han sido sometidas a selección por masa muscular, pero con el reciente énfasis en la producción de carne de búfalo para la exportación, el gen de la Miostatina es de gran importancia. La secuencia sin embargo no reveló ningún cambio que pueda atribuirse a las diferencias de tamaño en las razas de búfalos (Tantia et al., 2007). En cuanto a la posición del gen en el cariotipo del búfalo no se han realizado estudios de la posición exacta del gen como si se ha hecho en bovinos en la raza Blanco Azul Belga como se identificó en el estudio de Charlier y colaboradores en el año 1995, quienes lograron obtener la posición del gen en el Cromosoma 2 bovino (BTA2). Figura 4. Comparación del tamaño de los exones e intrones del gen de la Miostatina GDF8 entre diferentes especies.

Fuente: Tantia et al., 2007

11

5.2.5 Mutaciones y fenotipos asociados al gen de la Miostatina

Una de las especies donde más se ha estudiado el gen de la Miostatina es en la bovina, debido a las mutaciones naturales encontradas en varias razas como la Blanco Azul Belga en Bélgica, Charolaise, Maine d’Anjou, Blonde d’Aquitaine, Parthenaise, Tarantaise, Bazadaise y Limousin en Francia; Piamontese en Italia; South-Devon en Gran Bretaña; Angus Americano, Galloway y Hereford en EE.UU.; Timina en Cuba; Sta. Gertrudis en Australia y finalmente en España en la Rubia Gallega, Asturiana de los Valles y Pirenaica (Royo Martín, 2002). Las razas descritas expresan un aumento del 20% en la masa muscular, fenotipo que recibe el nombre de doble musculatura (Grobet et al., 1998). Este fenotipo se ha relacionado con mutaciones identificadas en el locus mh (muscular hypertrophy siglas en ingles) el cual se encuentra localizado en el cromosoma 2 bovino (BTA2) a 3.1 cM (centimorgan) de la región del centrómero (Charlier et al, 1995). A continuación se describe gráficamente la estructura de la proteína y mutaciones naturales del gen de la Miostatina en la Figura 5. Figura 5. Estructura de la proteína y mutaciones naturales que se producen en el gen de la Miostatina bovina.

Fuente: Joulia-Ekaza et al., 2006.

Los tres dominios representados en este esquema son el péptido señal (SP), la región pro, el sitio RSRR, y el péptido activo en la parte C-terminal parte del precursor de la miostatina. Las flechas indican la posición de las mutaciones que inactivan la miostatina responsables del aumento en el crecimiento muscular observado en algunas razas bovinas (Joulia-Ekaza et al., 2006).

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Mediante la secuenciación de individuos de las diferentes razas europeas se identificaron 7 mutaciones como se describieron anteriormente en la Figura 4, dentro de las regiones codificantes fueron agrupadas por Royo (2002), dependiendo del efecto que tienen sobre la proteína resultante como se describe a continuación:

5.2.4.1 Mutaciones que provocan la aparición de un codón Stop prematuro

nt821 (del11): una delección de 11 pares de bases en la posición 21 después del codón de iniciación, y que provoca la aparición de un codón Stop prematuro. Esta mutación es característica de las razas Blanco-Azul belga y Asturiana de los Valles (Grobet et al., 1997)

nt419 (del7-ins10): una delección/inserción en la posición 419 a partir del codón de iniciación, donde se reemplazan 7 bases por un grupo de 10 bases. Provoca la aparición de un codón Stop prematuro en la región del péptido N-terminal latente, en la posición aminoacídica 140. Se encuentra en la raza Maine-Anjou.

Q204X: una transición C-T en el segundo exón en la posición 610, asociada a la aparición de un codón Stop prematuro en el péptido N-terminal latente en la posición aminoacídica 204. Esta mutación es típica de la raza Charoláis.

E226X: se trata una transversión G-T, en el segundo exón en la posición 676, que conlleva la aparición de un codón Stop prematuro en el péptido N-terminal latente, en la posición aminoacídica 226. Se encuentra en animales de la raza Maine-Anjou.

5.2.4.2 Mutaciones que afectan a la estructura secundaria de la proteína.

C313Y: una transición G-A en la posición 938 que supone la sustitución de una cisteína por una tirosina. Esta cisteína es la quinta de las nueve cisteínas altamente conservadas típicas de la familia TGF-β. Se piensa que está involucrada en la formación de un puente disulfuro intramolecular que estabiliza la conformación tridimensional de la proteína. Esta sustitución es bastante probable que afecte a la estructura y función de la proteína. Esta mutación también ha sido descrita por (Kambadur et al., 1997), McPherron y Lee (1997). Se encuentra en animales de las razas Piamontesa y Gascona.

5.2.4.3 Mutaciones que no afectan a la función de la proteína.

F94L: una transversión C-A en la posición 282, que conlleva a una sustitución conservativa de una fenilalanina a leucina en el primer exón en la posición aminoacídica 94. Esto ocurre en la parte menos conservada del péptido N-terminal latente. Además en esta misma posición en la Miostatina Murina aparece una tirosina. Es típica de la raza Limousine.

Nt414 (C-T): es una transición silenciosa C-T, que tiene lugar en la tercera posición del codón 138 (citosina) en el tercer exón. Esta mutación se encuentra en animales de raza Charoláis.

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En el 2003, se reportaron dos nuevas mutaciones conservadas que no afectan el péptido

bioactivo, ya que están localizadas en el Exón1 y Exón 2. No es posible determinar con

seguridad su efecto sobre la actividad de la Miostatina (Dunner et al., 2003).

S105C: es una transversion de C-G en el nucleótido 314 en el exón 1 y cambia una Serina por una Cisteína encontrada en la raza Parthenaise.

D182N: es una transición de G-A en el nucleótido 544 produciendo un cambio de amino acido desde un ácido Aspártico a una Asparagina.

5.2.4.4 Mutaciones en otras especies Domesticas y el humano.

Los Bovinos no son la única especie que ha mostrado un execivo desarrollo muscular

generalizada debido a mutaciones en el gen de la miostatina, como es el caso de la especie

canina en donde se encontró una deleccion de de dos nucleótidos en los Galgos de

carreras, los individuos heterocigotos para la mutación tienen una musculatura más

desarrollada y corren más rápido, lo que sugiere una relación directa mejorando el

desempeño (Shelton y Engvall,2007). Por otro lado los animales homocigotos presentan

una musculatura extrema los cuales son descartados por sus criadores. A sí mismo en las

especie ovina en la raza Texel se conocen casos de doble musculatura debido a la

transición de una G a una A en la región no traducida 3’.(Johnson et al.,2005).

También en humanos se reporto un caso en un niño el cual evidencio hipertrofia muscular

desde su nacimiento, debido una mutacion en el lugar de empalme del límite del primer

intron- exón debido a una transición de una G a una A en esta region (Schuelke et

al.,2004).

5.3 DOBLE MUSCULATURA

El origen de esta característica es discutido más a fondo al final de siglo XIX por Lauvergne et al., 1968;Kaiser, 1888; Plonnis, 1888; Zoeppritz, 1888, cómo fue citado por Ménissier en el año 1982, donde se cree que el origen del rasgo proviene de una mutación muy antigua que ha migrado en numerosas poblaciones sin que el rasgo aparezca, comportándose como un gen recesivo. Por lo tanto la selección y búsqueda de animales que tuvieran un valor más alto al sacrificio produjo una elección de aquellos que presentaran un alto desarrollo muscular (heterocigotos), lo que llevó a que el gen se dispersara y apareciera más ampliamente en las poblaciones.

Por otro lado este autor también reporta que se han identificado lazos familiares entre las principales razas donde el rasgo de doble musculatura se ha encontrado. Esto se debe a que la raza Shorthorn la cual exhibía el rasgo según autores como Culley, (1807); Kaiser, (1888); Wriedt, (1929), citado por Ménissier, (1982) fue usada ampliamente para el mejoramiento de muchas razas de Europa occidental en el siglo XIX, en particular Maine Anjou, Charolais y Blanco Azul Belga. Al igual como se hizo la introducción a un rebaño de Piemontese de la raza Charolais, convirtiéndose tal vez en otro punto de migración del gen de la hipertrofia muscular. Después del análisis de los diferentes estudios que se realizaron a finales del siglo XIX e inicios del XX Ménissier concluyó “que el rasgo es debido a una acción pleotrópica de un gen mayor, pero cuya expresión fenotípica puede ser

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modificada por el efecto de epistasia de genes modificantes de los cuales no se tiene claro el número y tipo de herencia”. Por otro lado a nivel de la penetrancia genética se observó que es casi completa o totalmente completa en homocigotos y pobre o no existente en heterocigotos. Actualmente se clasificó el rasgo de doble musculatura como parcialmente recesivo debido a que los estudios realizados demuestran que el fenotipo no presenta un único origen debido a la gran variedad de mutaciones encontradas que en algunos casos son raza especifica.

5.3.1 Características de los individuos con doble musculatura.

Esta característica se asocia al incremento de la masa del músculo esquelético en un 20%, al igual que una reducción del 70% del tejido adiposo (McPherron et al., 1997, Grobet et al., 1997y Potts et al., 2003). También es conocida como hipertrofia muscular, pero histológicamente se demostró que era una hiperplasia o incremento en el número de las fibras musculares y no el aumento en el diámetro de las fibras individuales (Grobet et al., 1997). Lo anteriormente descrito conlleva a que la densidad del músculo se compense con un descenso del tejido conjuntivo y adiposo. En comparación con los animales normales, el ganado con doble musculatura tiene proporcionalmente menos hueso, menos grasa y alta proporción de cortes de carne (Menissier, 1982, Shahin y Berg, 1985).

Las características de la doble musculatura son evidentes durante los dos primeros tercios de la gestación de un feto, puesto que el número de fibras es mayor que en un feto estándar. Al poco tiempo de nacer los terneros presentan una lengua aumentada de tamaño o macroglosia, que en ocasiones afecta toda la región bucal, por lo que dificulta y en algunos casos imposibilita al animal alimentarse (Arthur et al., 1988). Algunos autores referencian que después de varias semanas de vida, esta característica desaparece (Teixeira et al., 2006).

Los animales que presentan el fenotipo tienen todos los músculos del cuerpo aumentados, siendo el área trasera del cuerpo la más prominente, por tanto, la cadera está inclinada en comparación a animales normales. El aumento de la masa muscular del área trasera del cuerpo, genera un surco que se evidencia a cada lado de las vértebras sacras haciendo que los músculos de esta zona se observen bien definidos, especialmente entre los músculos bíceps femoral y vasto externo (Oliver y Cartwright, 1968). Así mismo, visualmente se percibe que el individuo con doble musculatura presenta los miembros más separados de lo habitual, dado al aumento de la masa muscular en el área en mención. Tal como lo referencia Teixeira et al., (2006) “cuando se observa detalladamente un animal con doble musculatura, se nota claramente una diferencia en la región media del cuerpo”.

En ese orden de ideas, los animales que presentan esta condición parecen ser más largos de la cadera al hombro, el abdomen se retrae, y el cuello parece ser más pequeño y más grueso arqueándose sobre la clavícula (Oliver y Cartwright, 1968). En los machos otra característica predominante que se presenta, es a nivel de los testículos, los cuales se encuentran disminuidos en tamaño y aparentan estar más cerca a la pared abdominal, lo cual ha sido reconocido como infantilismo genital (Oliver y Cartwright, 1968).

Sumado a lo anterior, la expresión del gen de la doble musculatura es generalmente más marcada en los animales de las razas con musculatura pobre (lecheros, doble propósito) o con gordura marcada (razas de carne británicas) (Menissier, 1982).

El grado de hiperplasia no es el mismo para todos los músculos y no es igual en todas las

áreas del cuerpo, es decir, es general pero no uniforme, es mayor en algunas partes del

hombro y del brazo, pero sobre todo es mayor en la parte proximal de las extremidades

posteriores. Los animales con hiperplasia tienen músculos más pesados de lo normal por

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la tanto el incremento muscular se generaliza. Las partes distales de las extremidades son

menos afectadas que las proximales, por lo que se puede observar que las partes medias

de los miembros delanteras y traseras tienen menos hueso en animales con doble

musculatura (Dumont, 1982).

Como se ve, el músculo se compone de un gran número de fibras musculares de diferentes

tipos metabólicos y de diferente velocidad contráctil, por lo tanto se debe considerar revisar

tres aspectos; el número y tamaño de las fibras musculares, los tipos de fibras musculares

y la textura del músculo, al comparar animales con hiperplasia con animales normales

(Dumont, 1982).

5.3.2 Problemas asociados a la doble musculatura.

El fenotipo de doble musculatura también causa problemas en los animales que la presentan, ya que se asocia a la disminución del tamaño de otros órganos, reducida fertilidad de la hembra, susceptibilidad a enfermedades respiratorias y existe alta incidencia de distocia (Bellinge et al, 2005). Otros problemas que describe la literatura son la baja viabilidad de las crías que se deben a factores como terneros con musculatura extrema, macroglosia, vacas con pezones alargados, poca producción de calostro, y aumento de la susceptibilidad al estrés (Menissier de 1982, Arthur et al., 1989).

Los factores que afectan la reproducción en animales con doble musculatura se atribuyen al retraso de la pubertad e infantilismo genital (Oliver y Cartwrigth, 1968). Igualmente la dificultad al momento del parto se debe a la unión de diferentes factores, como por ejemplo el alto peso del ternero al nacer, junto a las anormalidades anatómicas de este. Estos terneros presentan hipertrofia de los cuartos traseros aumentando su ancho corporal y a esto se le puede sumar el problema esquelético que presenta la madre que resulta en un estrechamiento de la abertura pélvica (Arthur et al., 1988). Como se indicó, es notable que la doble musculatura afecta la curva de crecimiento de los terneros, esto se da desde el momento en que nace, ya que el peso de este es mayor que el de los terneros normales entre un 10% y 30% aproximadamente (Hanset, 1967; Kieffer et a., 1971; Vissac et al., 1973; Nott, 1074). La tasa de crecimiento de estos permanece mientras son jóvenes, especialmente durante la época de amamantamiento (Dechambre, 1911; Vissac et al., 1973).

De igual manera en las hembras que presentan doble musculatura, existen ciertos trastornos de comportamiento sexual y maternal que sugieren una reducción en la producción de estrógeno (Vissac et al., 1974). Las tasas de concepción en el momento de la ovulación e inseminación artificial son bajas comparadas con hembras normales. Sumado a lo anterior, durante la ovulación inducida las hembras jóvenes con la característica de doble musculatura presentan un ovario más débil (Ménissier, 1974, 1977).También, a nivel productivo la literatura reporta que las hembras pueden llegar a producir entre un 15 y un 30% menos de leche y calostro que las vacas normales (Arthur et al., 1989, Teixeira et a., 2006). Por otro lado, en cuanto a la fertilidad del macho en la colecta normal de esperma, el volumen de semen es menor en machos con doble musculatura; sin embargo, la cantidad de espermatozoides no varía mucho (Bizzard, 1964; Menissier, 1974; Sanchez, 1976).

Así mismo, se ha demostrado que el apetito de los animales que presentan la doble musculatura, es menor que el de los animales que no presentan esta característica, esto puede ser debido a la reducción del tamaño y pobre desarrollo en el tracto digestivo (Vissac, 1968; Hanset y Asay, 1971) por lo que también se ve afectada la movilización de reserva de lípidos, lo que hace que sea más complicado adaptarse a los cambios de dietas

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(Holmes et al., 1970).También se observa una menor disipación de calor, provocando un aumento de la temperatura rectal más rápido que en animales de fenotipos normales, debido a la capacidad respiratoria tan reducida, por lo que al ejercicio forzado los animales se fatigan con mayor rapidez (Boccard et al., 1974).

6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1 Población

Para el presente estudio se manejaron animales de la especie Bubalus bubalis de la raza Murrah y sus cruces, los cuales fueron seleccionados según las características fenotípicas; como animales compatibles con doble musculatura, hipertrofia leve y animales quienes presentaban también tremores musculares asociados a la hipermuscularidad y normales como control, como se observa en la Tabla 1 y en las Figuras 6,7 y 8. También se seleccionó a un animal raza Holstein de la especie Bos taurus como control de la amplificación del gen de la Miostatina (Tabla 1 y Figura 9).

Los casos fueron reportados y registrados por parte de los propietarios en la Asociación Colombiana de Criadores de Búfalos (ACB). Los cuales fueron identificados entre el periodo de Enero de 2010 y Marzo de 2013, en el momento en que el técnico de la asociación realizó la evaluación correspondiente para su registro.

La información de los casos y las bases de datos fueron depuradas directamente de la Asociación Colombiana de criadores de Búfalos (ACB), el criterio de selección se basó en la selección de todos los animales vivos en los que se habían reportado fenotipos compatibles o probables. Posteriormente se llevo a cabo la visita a las producciones de búfalos para realizar la respectiva toma de muestras de sangre. Esta parte del trabajo fue apoyado por el Comité Operativo de Investigación de la Universidad del CES (Corporación para Estudios de Salud) en Antioquia. Los casos se obtuvieron de tres explotaciones de búfalos ubicadas en el departamento de Antioquia.

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Tabla 1. Descripción de la población.

ID.

Clasificación

Fenotipo

Característica observada

M1 Caso compatible con doble musculatura

Tremores musculares

M2 Caso compatible con doble musculatura

Tremores musculares

M3 Caso hipertrofia leve Tremores musculares







C1 Control Fenotipo normal Tremores musculares




C+ Control Bos taurus

Fenotipo normal _____

ID: Identificación de los búfalos seleccionados; Clasificación: animales seleccionados como casos o controles; Fenotipo: descripción de las características físicas de los animales seleccionados; Características observadas sintomatología clínica observada.

Fuente: Berdugo, 2014

Figura 6 . Animales compatibles con el fenotipo de doble musculatura.

18


Figura 7 . Animales con fenotipo de hipertrofia leve.


Figura 8. Animales de fenotipo normal.

Fuente: María Angélica Reyes, 2014

19

Figura 9. Animal control Bos taurus raza Holstein.

6.2 Toma de muestras de sangre

Se recolectaron muestras de sangre procedentes de los casos reportados y registrados por parte de los propietarios en la ACB. Los cuales se muestrearon, luego de su contención física en brete. No fueron utilizados fármacos ni procedimientos altamente invasivos, diferentes a una venopunción. Para el proyecto se tomó una muestra de 4 mL de sangre directamente de la vena coccígea. Esta zona se desinfectó adecuadamente con alcohol para evitar la contaminación de la muestra e infección de los animales. La muestra de los trece búfalos de raza Murrah y sus cruces y del bovino raza Holstein (Bos taurus) se tomó con agujas y camisas del sistema vacutainer. Se depositaron en tubos vacutainer con 7.5 mg de EDTA. La muestra se homogenizó y se mantuvo refrigerada (Mota et al. 2006) hasta el momento en el que se envió a las instalaciones de La Universidad de la Salle, para su procesamiento.

6.3 Extracción de ADN

La extracción de ADN se realizó en las instalaciones de la Universidad de La Salle sede norte por parte de las personas responsables del proyecto. Se utilizó el Kit de extracción DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN Corporation, USA) (Figura 9). El procedimiento se realizó según las indicaciones del fabricante para las catorce muestras tomadas incluyendo el Bos taurus. Los ácidos nucleicos obtenidos de las muestras durante el proceso, se almacenaron a una temperatura de -20ºC para posteriormente realizar la PCR convencional y de esta forma amplificar los tres exones del gen de la Miostatina el cual es la porción del genoma de interés para el trabajo de investigación.

Fuente: Autores, 2014

Figura 10. Kit de extracción DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN Corporation, USA).

Reactivos : Buffer AL, Buffer AW1, Buffer AW2, Buffer ATL, Buffer AL y Proteinasa K.

20


Figura 11. Proceso de extracción de ADN.

6.4 PCR- convencional

El proceso se basó en la amplificación del primer, segundo y tercer exón del gen de la Miostatina. Se usaron los primers específicos reportados en el artículo de Mota et al., (2006), quienes diseñaron los primers a partir de DNA de la especie Bos taurus, demostrando una completa transferencia a la especie Bubalus Bubalis. Utilizando el programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) se verificó el alineamiento de los primers con los tres exones del gen de la Miostatina de la especie Bubalus bubalis. La PCR se realizó utilizando el kit GoTaq® Green Taq DNA Polymerase Master Mix (Promega, Corporation; USA), en las instalaciones del laboratorio de la Universidad de La Salle y fue finalizado en el laboratorio privado de Biotecnología y Genética S.A (Biotecgen S.A). Se utilizó un equipo termociclador C1000 Thermal Cycler (BIO-RAD, CA, USA)( Figura 11), el cual fue programado con el siguiente protocolo: desnaturalización a 94ºC por cuatro minutos, 35 ciclos por un minuto a 94°C , 54°C por un minuto y una extensión por un minuto a 72°C y una extensión final a 72°C por cuatro minutos (Mota et al., 2006). Se incluyó para cada exón una muestra de control negativo de amplificación que correspondía a agua ultrapura. Tabla 2. Primers para la amplificación de ADN.

Exón Primer (5´ a 3´) Fragmentos esperados

1 F - ATTCACTGGTGTGGCAAGTTGTCTCTCAGA

620 pb R - CCCTCCTCCTTACATACAAGCCAGCAG

2 F - GTTCATAGATTGATATGGAGGTGTTCG

550 pb R - ATAAGCACAGGAAACTGGTAGTTATT

3 F - TGAGGTAGGAGAGTGTTTTGGG

500 pb R - TCGAAATTGAGGGGAAGACC

Fuente: Mota et al., 2006.

21

Fuente: Autores, 2014) Figura 12. Termociclador C1000 Thermal Cycler (BIO-RAD, CA, USA)

Este proceso de amplificación se realizó con todas las muestras de ADN extraídas a partir de los individuos seleccionados (Tabla 1), con las cuales se verifico la amplificación del gen con los pesos molecuales esperados como se observa en la Tabla 2. Sin embargo, para el proceso de secuenciación final se escogieron seis animales (a, b, e, f, k, o) de los trece animales participantes en el estudio inicialmente seleccionados, los cuales demostraron una mayor probabilidad de revelar alguna mutación debido al fenotipo que presentaban (Tabla 3). Al igual que la muestra del animal de raza Holstein de la especie Bos taurus como control de la correcta amplificación del gen de la Miostatina. Tabla 3. Identificación de las muestras para el proceso de PCR

ID.

MARCAJE PCR Clasificación

Fenotipo

Exón 1 Exón 2 Exón 3

M1 a E1 a E2 a E3 Caso Fenotipo compatible con

doble musculatura

M2 b E1 b E2 b E3 Caso Fenotipo compatible con

doble musculatura

M5 e E1 e E2 e E3 Caso hipertrofia leve

M6 f E1 f E2 f E3 Caso hipertrofia leve

C3 k E1 k E2 k E3 Control Fenotipo normal

C4 o E1 o E2 o E3 Control Fenotipo normal

C+ m E1 m E2 m E3 Control Bos taurus

Fenotipo normal

ID Identificación de las muestras; Marcaje PCR: se decide marcar las muestras de los animales seleccionados para identificarlas por Exon1, Exón 2 y Exón 3; clasificación: animales seleccionados como casos o controles; Fenotipo: descripción de las características físicas de los animales seleccionados.

22

6.5 Electroforesis de productos amplificados

Para el proceso de electroforesis los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 1.5 % de concentración, con un buffer TBE (40mM Tris, 2 mM EDTA, pH 8.0). A este se le adicionó como floroforo EZ-Vision® (AMRESCO, USA) (Figura 13).Los productos fueron comparados con una escalera de 100 pares de bases (GeneRuler 100 bp DNA Ladder, Thermo Scientific, USA). El proceso se desarrolló con un voltaje de 87V durante 60 minutos. Los resultados se observaron en un Transiluminador (DyNA Light™ UV Transilluminator, Labnet International, Inc, USA) verificando los fragmentos correspondientes a los Exones 1, Exón 2 y Exón 3 evaluando los pesos esperados con el marcador de peso molecular descrito previamente (Tabla2).

(Fuente: Autores, 2014)

Figura 13. Proceso de electroforesis.

6.6 Secuenciación de nucleótidos

Los productos de la PCR de los seis búbalos seleccionados (a, b, e, f, k, o del Exón 2 y 3) fueron enviados para la purificación de ácidos nucleicos y secuenciación de nucleótidos a la empresa Macrogen Corporation, Seoul, Korea, en donde se procesaron las muestras con el secuenciador ABI3730Xl (Applied Biosystem). Una vez obtenidas la secuencias estas fueron analizadas y comparadas entre los mismos casos y las secuencia del gen completo reportado en el GenBank de Bubalus bubalis (DQ091762.1), tanto de sus exones 1(AY854495.1) ,2(AY854496.1) ,3(AY854497.1) y la secuencia completa de la especie Bos Taurus (AF320998). Las secuencias de los seis búfalos seleccionados se analizaron con los programas BioEdit Sequence Aligment Editor, Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 6), Chromas LITE versión 2.1.1y Clustal W2.

6.7 Manejo de variables y Análisis estadístico

Se manejó una base de datos en el programa Excel® y se había planteado por medio del paquete estadístico Statgraphics Centurion XVI®; realizar un análisis descriptivo de la población. En atención a que la determinación de las variantes alélicas permitiría conocer el genotipo de cada animal muestreado, las frecuencias genotípicas y alélicas se determinarían por el método del recuento simple. Además se analizaría la población respecto a la condición de equilibrio génico según Hardy-Weinberg (Hoenigsberg, 1992).

23

Se había propuesto estimar con el programa Tools For Population Genetics Analisys, TFPGA (Miller, 1997), las frecuencias alélicas de las variantes del gen, las heterocigosidades observadas y esperadas y las pruebas del equilibrio H-W para la población total. Sin embargo debido a que la hipótesis de que las alteraciones musculares fueron debidas a la mutación en gen de la Miostatina, no se pudo realizar ninguno de los análisis propuestos.

7. RESULTADOS

7.1 Estandarización del proceso de amplificación.

A pesar de que se uso el protocolo de amplificación del estudio de Mota et al., 2006, la

temperatura de fusión usada en este solo permitió la amplificación correcta del exón 3,

debido a esto se modifico esta temperatura para los exones 1 y 2 para lograr la correcta

amplificación como se observa en la Tabla 4.

Tabla 4. Estandarización de temperatura de fusión.

Mediante el programa MBCF Oligo Calculator, se calcularon las temperaturas de fusión

para los tres exones.

7.2 Amplificación de ADN por PCR

Los productos de la PCR se evidenciaron correctamente en el proceso de electroforesis

como se describen y observan en las Figura 15 y 16. Las muestras del Exón 1 mostraron

un peso esperado de 620pb, el Exón 2 un peso de 550pb al igual que las del Exón 3 con

un peso de 500pb, tanto para los individuos de la especie Bubalus bubalis como para el

individuo raza Holstein de la especie Bos taurus. Por otro lado la muestra negativa de agua

Exón Primer Temperatura

de fusión - Tm Promedio

Temperatura de

alineamiento (Ta) = promedio primers + 5

Tm Final

1

ATTCACTGGTGTGGCAAGTTGTCTCTCAGA

61,6

62,2 67,2

67 CCCTCCTCCTTACATACAAGCCAGCAG 62,8

2

GTTCATAGATTGATATGGAGGTGTTCG 56,7

54,95 59,95

62 ATAAGCACAGGAAACTGGTAGTTATT 53,2

3

TGAGGTAGGAGAGTGTTTTGGG 54,8

53,3 58,3

54 TCGAAATTGAGGGGAAGACC 51,8

24

ultrapura no evidencio ningún tipo de contaminación comprobando que el proceso se

realizó correctamente.


Figura 145 Productos de la PCR-convencional Exón 1.

Siete muestras del exón 1. Carriles: 1. Escalera de 100 – 1000 pb; 2. Control negativo exón 1 (NE1); 3. Animal compatible con el fenotipo de doble musculatura exón 1 (aE1); 4. Animal fenotipo de hipertrofia leve exón 1 (bE1); 5. Animal fenotipo de hipertrofia leve exón 1 (eE1); 6. Animal sospechoso de hipermuscularidad exón 1 (fE1); 7. Animal fenotipo normal exón 1 (kE1); 8. Animal fenotipo normal exón 1 (oE1); 9. Animal control Bos taurus raza Holstein exón 1 (mE1).


Figura 15 Producto de la PCR-convencional Exón 2 y Exón 3.

Siete muestras del exón 2. Carriles: 1. Escalera de 100 – 1000 pb; 2. Control negativo exón 2 (NE2); 3. Animal compatible con el fenotipo de doble musculatura exón 2 (aE2); 4. Animal compatible con el fenotipo de doble musculatura exón 2 (bE2); 5. Animal con fenotipo de hipertrofia leve exón 2 (eE2); 6. Animal con fenotipo de hipertrofia leve exón 2 (fE2); 7. Animal fenotipo normal exón 2

25

(kE2); 8. Animal fenotipo normal exón 2 (oE2); 9. Animal control Bos taurus raza Holstein exón 2 (mE2); 10. Control negativo exón 3 (NE3); 3. Animal compatible con el fenotipo de doble musculatura exón 3 (aE3); 4. Animal compatible con el fenotipo de doble musculatura exón 3 (bE3); 5. Animal sospechoso de hipermuscularidad exón 3 (eE3); 6. Animal con fenotipo de hipertrofia leve exón 3 (fE3); 7. Animal con fenotipo de hipertrofia leve 3 (kE3); 8. Animal fenotipo normal exón 3 (oE3); 9. Animal control Bos taurus raza Holstein exón 3 (mE3).

7.3 Análisis de la secuenciación

Al análisis de la secuencia del Exón 1 se observan picos sobrepuestos en el electroesferograma de todas las muestras por lo que no fue posible realizar la lectura y obtener resultados certeros (Figura 17). Esto fue debido a una amplificación excesiva como fue reportado en el análisis de la empresa Macrogen Corporation. A pesar de que en el proceso de la electroforesis se observó una sola banda con el peso esperado de 620pb (Figura 15) en cada muestra. Basados en Grobet y colaboradores en el año 1998, que indica que las mutaciones que afectan directamente el gen no se encuentran en esta región se decide no incluir este exón en los análisis posteriores. Sin embargo las secuencia del exón 2 y exón 3 presentaron un electroesferograma apto para la comparación y análisis, por lo cual los resultados se basaron en estos dos exones.

Fuente:( BioEdit SequenseAligment Editor)

Figura 167. Electroesferograma Exón 1 picos sobrepuestos muestra aE1.

A continuación se observan los resultados de las diferentes comparaciones entre los

individuos de la especie Bubalus bubalus, al igual que la comparación con el individuo

control de la especie Bos taurus para determinar las variaciones entre especies. Para

presentar la información de manera correcta y entendible se muestra el análisis por exón.

7.3.1 Comparación del Exón 2 entre la especie Bubalus bubalis

Se analizaron los resultados de las secuencia de los seis búfalos seleccionados (aE2, bE2,

eE2, fE2, kE2, oE2). En la Tabla 5 se muestra la comparación del exón 2 de todos los

búfalos del estudio, añadiendo la secuencia del gen completo (DQ091762.1) al igual que

la del Exón 2 (AY8544961) reportados en el GenBank. Las secuencias se analizaron por

el programa Mega 6 (Tamura., 2013), en el cual se puede determinar qué posición hay

sustitución de bases entre las secuencias. Se encontró que no existe ninguna variación

entre los nucleótidos por lo que se deduce que no hay mutación alguna en este fragmento.

Se incluyeron un total de 8 secuencias de nucleótidos con un total de 476 posiciones,

donde se encontró un 100% de igualdad entre todos los individuos analizados.

26

Tabla 5. Las estimaciones de la divergencia evolutiva entre secuencias del Exón 2 entre Bubalus bubalis.

Exón 2 1 2 3 4 5 6 7

1.aE2_Exn2F

2.bE2_Exn2F 0,000

3.eE2_Exn2F 0,000 0,000

4.fE2_Exn2F 0,000 0,000 0,000

5.kE2_Exn2F 0,000 0,000 0,000 0,000

6.oE2_Exn2F 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

7.AY8544961 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

8.DQ091762.1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

Comparación del exón 2 entre búfalos. Se compara el exón 2 de los seis búfalos de los que se envió la muestra a secuenciar, junto con el exón 2 de Bubalus bubalis reportado en el GenBank (AY8544961) y el gen completo del búfalo (DQ091762.1) también reportado.

7.3.2 Comparación del Exón 3 entre la especie Bubalus bubalis

Las secuencias del exón 3 fueron igualmente analizadas con el programa Mega 6

(Tamura., 2013). Se realizó la misma metodología utilizada para el exón 2 comparando el

exón 3 de los seis búfalos (aE3, bE3, eE3, fE3, kE3, oE3) entre ellos y el exón 3

(AY8544971) y el gen completo (DQ091762.1) reportados en el GenBank para la especie

Bubalus bubalis . No se encontró variación de nucleótidos en el exón 3, lo que indica que

tampoco hay mutación en esta parte del gen para estos animales. Se incluyó dentro del

análisis un total de 400 posiciones. Entre las secuencias existe un 100% de igualdad por

lo tanto no hay diferencia en esta parte del gen (Tabla 6).

Tabla 6. Las estimaciones de la divergencia evolutiva entre secuencias del Exón 3 entre Bubalus bubalis.

Comparación del exón 3 entre búfalos. Se compara el exón 3 de los seis búfalos de los que se tomó la muestra, junto con el exón 3 de Bubalus bubalis reportado en el GenBank (AY8544971) y el gen completo del búfalo (DQ091762.1) también reportado.

Exón 3 1 2 3 4 5 6 7

1.aE3_Exn3F

2.bE3_Exn3F 0,000

3.eE3_Exn3F 0,000 0,000

4.fE3_Exn3F 0,000 0,000 0,000

5.kE3_Exn3F 0,000 0,000 0,000 0,000

6.oE3_Exn3F 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

7.AY8544971 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

8.DQ091762.1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

27

7.3.3 Comparación del Exón 2 entre la especie Bos taurus.

Se comparó la secuencia obtenida del bovino raza Holstein (mE2) al que se le tomo la

muestra como animal control y se comparó con el gen de la Miostatina de la especie Bos

taurus (AF320998).Al análisis se encuentra una igualdad del 100% entre las dos

secuencias, ya que no hay variación entre los nucleótidos (Tabla 7). El análisis se realizó

en el programa Mega 6 (Tamura., 2013) y se estudiaron 478 posiciones en el conjunto de

datos finales, soportando en cierta medida la idoneidad del proceso realizado.

Tabla 7. Las estimaciones de la divergencia evolutiva entre secuencias del Exón 2 entre Bos taurus.

Exón 2 1

1.mE2_Exn2F

2.AF320998 0,000

Se compara el exón 2 del bovino raza Holstein (Bos taurus) al que se le tomo la muestra

como control (mE2) y se compara con el gen de Bos Taurus reportado en el GenBank

(AF320998).

7.3.4 Comparación del Exón 3 entre la especie Bos taurus.

Se realizó una comparación al igual que con el exón 2 con la secuencia del bovino raza

Holstein (mE3) y la secuencia completa del Bos taurus GenBank (AF320998) para el exón

3, esta comparación mostro un 100% de identidad entre las secuencias analizadas

demostrando que no hay diferencia en el gen de la Miostatina cuando se comparara con

la misma especie (Tabla 8).

Tabla 8. Las estimaciones de la divergencia evolutiva entre secuencias del Exón 2 entre la especie Bos taurus.

Exón 3 1

1.mE3_ Exn3F

2.AF320998 0,000

En la tabla se muestra el número de sustituciones por sitio entre las secuencias mostradas, el análisis incluye 2 secuencias, de las cuales fueron eliminados los gaps y datos faltantes dando como resultado un total de 404 posiciones en el conjunto de datos finales. El análisis fue realizado en programa MEGA6 (Tamura., 2013).

28


taurus

Se realizó una comparación de las seis secuencias del exón 2 de los búfalos (aE2, bE2,

eE2, fE2, kE2, oE2) , junto con la secuencia reportada del exón 2 (AY854496.1) y la

secuencia completa (DQ091762.1) anteriormente mencionadas junto con la secuencia del

bovino raza Holstein (mE2) y la secuencia completa de la especie Bos taurus (AF320998),

esta comparación mostró que la secuencia del bovino raza Holstein y la secuencia

completa Bos taurus tienen un 99.99% y un 99.98% de similitud respectivamente

comparando con todas las secuencias de los búfalos tanto las resultantes de este estudio

como las reportadas (Tabla 9).Lo que demuestra la proximidad entre especies.

Tabla 9. Las estimaciones de la divergencia evolutiva entre secuencias del Exón 2 entre ambas especies.

En la tabla se muestra el número de sustituciones por sitio entre las secuencias mostradas, el análisis incluye 10 secuencias, de las cuales fueron eliminados los gaps y datos faltantes dando como resultado un total de 434 posiciones en el conjunto de datos finales. El análisis fue realizado el programa MEGA6 (Tamura., 2013).


taurus

Para el exón 3 también se realizó la misma comparación que en el análisis anterior de las

seis secuencias del exón 3 de los búfalos (aE3, bE3, eE3, fE3, kE3, oE3) , junto con la

secuencia reportada del exón 3 del gen de la miostatina (AY854497.1), las dos secuencia

completas del gen de Bubalus bubalis (DQ091762.1) y Bos taurus (AF320998) y la

secuencia del bovino raza Holstein (mE3) esta comparación mostro que la secuencia del

bovino raza Holstein tiene un 99.98% de similitud y la secuencia completa del Bos Taurus

reportada un 99.98% comparándolo con todas las secuencias de los búfalos (Tabla 10) Lo

que sigue demostrando la proximidad entre estas especies.

Tabla 10. Las estimaciones de la divergencia evolutiva entre secuencias del Exón 2 entre ambas especies.

Exón 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Exón 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1.aE2_Exn2F

2.bE2_Exn2F 0,000

3.eE2_Exn2F 0,000 0,000

4.fE2_Exn2F 0,000 0,000 0,000

5.kE2_Exn2F 0,000 0,000 0,000 0,000

6.oE2_Exn2F 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

7.AY8544961 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

8.DQ091762.1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

9.mE2_Exn2F 0,009 0,009 0,009 0,009 0,009 0,009 0,009 0,009

10.AF320998 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,000

29

1.aE3_Exn3F

2.bE3_Exn3F 0,000

3.eE3_Exn3F 0,000 0,000

4.fE3_Exn3F 0,000 0,000 0,000

5.kE3_Exn3F 0,000 0,000 0,000 0,000

6.oE3_Exn3F 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

7.AY854497.1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

8.DQ091762.1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

9.mE3_ExnF 0,018 0,018 0,018 0,018 0,018 0,018 0,018 0,018

10.AF320998 0,018 0,018 0,018 0,018 0,018 0,018 0,018 0,018 0,000

En la tabla se muestra el número de sustituciones por sitio entre las secuencias mostradas, el análisis incluye 10 secuencias de las cuales fueron eliminados los gaps y datos faltantes dando como resultado un total de 400 posiciones en el conjunto de datos finales. El análisis fue realizado usando el Maximum Composite Likelihood model, y el análisis de evolución se realizó en MEGA6 (Tamura., 2013).

7.4 Variaciones encontradas entre Bubalus bubalis y Bos taurus.

Al momento de comparar todas las secuencias tanto de Exón 2 y Exón 3 de las muestras del estudio y las reportadas de Bubalus bubalis (Exón 2 (AY854496.1),Exón3 (AY854497.1) con las reportadas del Bos taurus ( GeneBank AF320998) y el animal control raza Holstein (mE2 ymE3) (Bos taurus) se encontraron cinco variaciones de nucleótidos a nivel del exón 2 (C2306T, C2313A, G2375G, A2531G y T2594C) y siete en el exón 3 (G4748A, G4750A, C4946T, T5009C, A5056G , T5058C y A5081C), las pociones encontradas se basan en la secuencia completa de la especie Bubalus bubalis GenBank (DQ091762.1).

8. DISCUSION

En este estudio se realizó una comparación del gen de la Miostatina de individuos de la especie Bubalus bubalis, con fenotipo compatible con doble musculatura, animales con hipertrofia leve y animales normales, esto con el fin de encontrar alguna mutación en el gen que explique la razón de la hipertrofia muscular. Se estandarizaron las temperaturas de fusión para los exones 1 y 2 logrando una correcta amplificación de estos. A nivel de la secuenciación no se logro analizar las secuencias del exón 1 debido a que se presentaron picos sobrepuestos lo que puede indicar que se amplificaron diferentes fragmentos de ADN del mismo peso molecular (620pb) imposibilitando el análisis de este.

En el análisis molecular sobre los exones 2 y 3 correctamente secuenciados del gen de la Miostatina permitió establecer que ninguno de los individuos del estudio presenta mutación. Ya que en el alineamiento de las secuencias comparadas con el gen completo de la Miostatina de los búfalos reportado en el GenBank; no se observaron sustituciones de bases, descartando la hipótesis que inicialmente se habría

propuesto.

Los resultados anteriormente descritos revelan que las secuencias analizadas del exón 2 y exón 3 durante el estudio tienen un 100% de igualdad, lo que se evidenció desde el proceso de electroforesis, donde se obtuvieron de los productos de PCR los fragmentaos

30

esperados de 550pb para el exón 2 y 500pb para el exón 3, resultados compatibles con los del estudio de Mota et al., (2006) quienes obtuvieron los mismos fragmentos en su estudio. Estos resultados se contemplan, debido a que se evaluaron animales de la misma especie, como también fue evidenciado en dicho estudio donde caracterizaron las regiones codificantes, basándose en la secuencia de ocho búfalos, dentro de los cuales no se encontraron polimorfismos entre ellos. Igualmente Tantia y colaboradores en el año 2007 basados en los estudios de Mota compararon las secuencias de cuatro animales de tres razas y tamaños diferentes (Bhadawuari, Murrah y Jaffabaradi) en los cuales no encontraron variaciones entre ellos, confirmando que no hay variaciones de nucleótidos entre razas ni tamaños.

Sin embargo en el año 2003, Mota y sus colaboradores en El Congreso Brasilero de Genética en Sao Pablo, presentaron dos variaciones en el exón 3 (A940G y A942G), las cuales acarrean una sustitución de una histidina por una arginina en la secuencia de aminoácidos de la proteína a nivel de la región C-terminal, proponiendo así la hipótesis de que la mutación en la región bioactiva del gen podría estar causando una disminución del control negativo de la Miostatina provocando un desarrollo muscular diferenciado, asegurando la mutación como se evidenció en el exón 3 de varias razas bovinas como el Blanco Azul Belga y Piamontesa (Grobet et al; 1997; Kambadur et al., 1997; McPherron y Lee, 1997). Teoría que no se pudo comprobar en este estudio ya que no se encontraron variaciones.

Por esta razón se contemplan explicación a la hipertrofia que presentan los animales

estudiados. Una de estas puede ser la miotonía congénita del búfalo, conocida

anteriormente como Hiperplasia congénita del Búfalo (Barbosa et al. 1999, Borges et al.

2013) , la cual es una enfermedad autosómica recesiva y de amplia distribución en los

animales de raza Murrah (Borges 2008, Borges et al. 2013). Los signos clínicos que

caracterizan a la miotonia hereditaria son contracciones musculares en el cuerpo en

general, que se producen cuando los animales son estimulados a salir del estado de

reposo. Los búfalos afectados presentan rigidez, movimiento lento y con esfuerzo, sin

embargo la rigidez es menos visible después del ejercicio lo que indica un fenómeno de

calentamiento. Las lesiones se caracterizan por el aumento del músculo semitendinoso,

semimembranoso y área de la piel haciendo que el tejido adiposo sea menor y más delgado

(Barbosa et al. 1999), estas características junto con los tremores musculares se

relacionan directamente con los animales seleccionados para el estudio.

También con las miotonías se ha observado la aparición de ataques similares a las convulsiones sin pérdida de consciencia cuando los animales se mueven, que se intensifican si se acelera este movimiento. La intensidad de los ataques es también variable y los músculos superficiales de gran parte del cuerpo o sólo los músculos de las extremidades pueden verse afectados. Se observa que los búfalos con contracciones musculares son más anchos, y la superficie de la musculatura del tronco aumentada. Esta afección es atribuida a una mutación en el gen del canal del cloro (CLCN1) lo que provoca una disminución en la conductancia del cloro a nivel del sarcolema produciéndole una hiperexcitabilidad de la membrana muscular retrasando la relajación del musculo después de la contracción (Borges et al. 2013). Esta condición podría ser evaluada en estudios posteriores sobre las mismas muestras del presente estudio. El gen de la Miostatina se conserva entre las especies ya que es 100% idéntico en la región C-terminal entre mamíferos. Como lo demostró McPherron y Lee en 1997, comparando las secuencias del gen entre Murinos, ratas, humanos, porcinos y bovinos sugiriendo que el alto grado de conservación de las secuencias de estos animales conlleva a conservar la función del gen. Hasta el día de hoy en todos los vertebrados la organización genómica de

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la Miostatina describe tres exones de tamaño similar separados por dos intrones y cuyo tamaño se conserva en aves y mamíferos. Como lo confirmo Tantia y colaboradores en 2007, haciendo la comparación del tamaño de los exones al igual que los intrones de las especies Bos Indicus, Bos taurus, Bubalus bubalis, Ovis aries y Homo sapiens. El tamaño de los exones fue igual en todas las especies, pero en cuanto a la secuencia de los intrones de la especie Bubalus bubalis son más próximos a la del Bos taurus. Por lo anterior se puede confirmar la similitud entre las secuencias de las especies, Bos taurus y Bubalus bubalis debido a que pertenecen a la misma familia (Bovidae). Sin embargo se encontraron doce variaciones cuando se compararon el exón 2 y exón 3 de las mismas. Los resultados descritos son compatibles con los obtenidos por Mota y colaboradores en el 2006 donde encontraron 12 variaciones de nucleótidos en el Exón 1, 2 y 3, sin embargo en el presente estudio las doce variaciones se centran en el exón 2 y exón 3.

9. IMPACTO E INDICADORES

Se espera que con los resultados del proyecto, la Universidad de la Salle y la Universidad CES en conjunto con la Asociación Colombiana de Criadores de Búfalos, puedan instruir y capacitar un mayor número de productores, funcionarios y estudiantes a nivel tecnológico y profesional por medio de pasantías, trabajos de grado y de iniciación científica, en relación a todos los aspectos de selección y genética de las características de importancia zootécnica en los búfalos.

La realización del proyecto permitió la consolidación investigativa de los Grupos participantes por la Universidad de La Salle y la Universidad CES, buscando generar un posicionamiento nacional e internacional en la evaluación e identificación molecular de las características de importancia económica. Además, con la ejecución del proyecto se fortalecerá al personal técnico e investigativo de la Asociación Colombiana de Criadores de Búfalo, igualmente se formará recurso humano en investigación perteneciente a las dos universidades participantes.

Con la ejecución del proyecto se busca generar nuevo conocimiento y fortalecer la capacidad científica a nivel institucional, nacional e internacional, mediante la publicación de 2 artículos en revistas indexadas. Paralelamente se realizará la apropiación social del conocimiento a través del establecimiento de programas de control y adecuada clasificación de animales con dicha característica que pueden tener un impacto en la calidad de la canal y salud animal. Se generará con el desarrollo del proyecto proyección social al capacitar a productores, estudiantes y técnicos.

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