Selecção de transconjugantes

Objectivos

Identificação das bactérias a utilizar

Selecção dos transconjugantes

Identificação das bactérias receptora e dadora a utilizar

avaliação da capacidade que um microrganismo tem de proliferar/crescer in vitro e na presença de vários fármacos.

Método de Difusão (de Kirby-Bauer [1] )

Epsilon Test

A partir dos testes de susceptibilidade foi possível concluir que as bactérias a utilizar na conjugação seriam a 999 e a K802N, respectivamente espécie dadora e espécie receptora.

Estirpe 999 – fermentadora da lactose

resistente à amoxicilina (não formou halo de inibição)

A estirpe K802 N – não fermentadora da lactose

resistente ao ácido nalidixico (não formou halo de

inibição).

Uma bactéria receptora é a que possui o DNA cromossómico que recebe o plasmídeo da dadora.

O conhecimento das características das estirpes é fundamental para que

estas possam ser correctamente escolhidas no laboratório para ensaios de

conjugação.

Encontro entre a espécie dadora e a receptora

Estirpe 999 (fermentadora da lactose e resistente à amoxicilina) (100µL)

K802N (não fermentadora da lactose e resistente ao ácido nalidíxico) (100µL)

Selecção de transconjugantes

Transconjugantes - transconjugação entre bactérias receptora

e dadora. Têm as características cromossómicas conferidas pela

bactéria receptora, mas com DNA plasmídico da dadora, que

confere resistência à amoxicilina. Os transconjugantes são,

assim:

Não fermentadores da lactose (Lac -)

Resistentes aos dois antibióticos (amoxicilina e ácido nalídixico)

A conjugação conduz ao aparecimento de uma mistura das 3 populações bacterianas: bactérias dadoras, receptoras e transconjugantes;

•Verifica-se a presença das bactérias transconjugantes, inoculando-as em meio sólido com os 2 antibióticos;

•Realiza-se o plaqueamento num meio selectivo, contendo os 2 antibióticos aos quais queremos testar a resistência;

O meio de MacConkey é um meio de selecção que promove o crescimento dos transconjugantes, pois neste caso apresenta amoxicilina e ácido nalidíxico.

Placa de controlo

O meio de seleção tem de ser controlado quanto à sua eficácia, por isso é utilizado um lote de placas em que uma delas é de controlo/testemunho, placa esta sem antibiótico.

O objectivo é verificar se o lote utilizado pode realmente ser usado para a selecção em causa.