Seminários em Fitopatologia II - Aluno Adriano Martins Barbosa
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
SECRETARIA DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL E TECNOLÓGICA
INSTITUTO FEDERAL GOIANO CAMPUS URUTAÍ
Curso Superior de Bacharelado em Agronomia
Acadêmico: Adriano Martins Barbosa
Professor: Milton Luíz da Paz Lima
Manejo de solos orgânicos visando redução da
colonização interna de plantas de tomate por
Salmonella enterica serovarTyphimurium
GU, G., CEVALLOS-CEVALLOS, J. M., VALLAD, G. E., AND VAN BRUGGEN, A. H.C. Organically managed soils reduceinternal colonization of tomato plants by Salmonella enterica serovar Typhimurium. Phytopathology 103:381-388.2013.
INTRODUÇÃO
• Frutas e legumes frescos cada vez mais reconhecidos como
veículos para a transmissão de patógenos entéricos humano
(salmonelose);
• Contaminação desde campos de produção até durante o
processamento;
• Salmonella enterica pode contaminar brotos, folhas, frutos
e sementes de uma gama de espécies de plantas;
• Produção vegetal orgânica tem sido sugerido com maior
risco de contaminação com patógenos entéricos do que em
produção convencional;
• Uso de esterco compostado ou resíduos de jardim para manter a
fertilidade do solo: possível via de contaminação.
• Mudanças na qualidade do solo afetam a fisiologia vegetal e,
possivelmente, a resistência à colonização por microrganismos;
• Plantas podem explorar consórcios microbianos do solo para se
protegerem contra infeccções;
• Indicações a respeito da correlação negativa entre populações de
enteropatogenos e diversidade microbiana em adubo, solo e
plantas.
INTRODUÇÃO
OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi investigar a colonizaçãointerna e transmissão por sementes de S. enterica ser.Typhimurium em plantas de tomate, e a avaliação do efeitodo tipo de manejo do solo em comunidades bacterianasendofíticas, persistência interna e translocação deSalmonella spp. nas plantas.
MATERIAL E MÉTODOS
Cepas bacterianas e preparação da planta
• Culturas bacterianas armazenadas em meio de Luria-Bertani (LB)
contendo 25% de glicerol a -80 °C;
• Sementes de tomate (Solanum lycopersicum 'Florida Lanai'),
desinfectadas, semeadas em mistura de envasamento;
• Mudas transplantadas em vasos, e água aplicada em um intervalo de 2
dias;
• Fertilização semanal com 8 g de Kow® para solo orgânico e 150 ml
de solução Hoagland® para o solo convencional;
• Temperatura oscilou entre 23 e 33 °C, com temperatura média de 28
°C.
Configuração experimental
• Experimento principal de duas fases, realizado duas vezes (1º em 2009
e experimento 2º em 2010);
• 126 plantas de tomate divididas em sete blocos e em cada bloco, nove
plantas cultivadas em solo e os outros nove em solo orgânico;
• Seis das nove plantas inoculadas aleatoriamente com S. enterica ser.
Typhimurium MAE110 ou MAE119, e as outras três plantas por bloco
mergulhadas em SDW;
• Cada ano, 84 plantas de tomate cultivadas em solo convencional ou
orgânicos (42 plantas cada), inoculados duas a quatro vezes, antes de
frutificação com cepas de S. entérica ser. Typhimurium, e 42 plantas
cultivadas no mesmos solos foram tratados com SDW como controle.
MATERIAL E MÉTODOS
• Segunda fase: extraiu-se sementes a partir de frutos contaminados e
não contaminados na primeira geração e semeadas em substrato
(experimento 1, com 135 sementes) ou convencional do solo
(Experimento 2, com 130 sementes);
• Detectar a possível contaminação da segunda geração plantas;
• Experimento adicional realizado para confirmar o efeito do manejo do
solo na sobrevivência interna de Salmonella spp. em folhas de tomate.
• 16 mudas de tomate plantadas aleatoriamente em quatro vasos com
solos convencional e orgânico, inoculados com Salmonella MAE110 (4
plantas por tratamento) e 4 vasos com SDW como controle.
MATERIAIS E MÉTODOS
Coleta do solo e análise
• Experimentos 1, 2 e 3: solos convencionais e orgânicos coletados a
partir de locais de manejo intensivo em diversas culturas;
• Vegetais cultivados organicamente por 5 anos e esterco de galinha
compostado foi aplicado 4 meses antes colheita;
• Nas fazendas convencionais, as culturas foram cultivadas com
fertilizantes, fungicidas, inseticidas e aplicação do herbicida;
• Duas sub-amostras (500 g) das amostras de solo coletadas foram
enviadas para análises laboratoriais.
MATERIAIS E MÉTODOS
Inoculação foliar das plantas de tomateiro com S. enterica
Typhimurium
• Imersão três folhas em cada um dos dois ramos, por planta, em 15 ml de
suspensão de Salmonella sp. (109 UFC/ml) com 0,025% de Silwet L-77
por 30 s.
• As plantas de controle inoculados com a mesma quantidade de SDW
com 0,025% de Silwet L-77;
• Plantas de tomate inoculadas nas semanas 5 e 10 no experimento 1 e nas
semanas 5, 8, 9 e 10 no experimento 2;
• Experimento 3: três folhas em cada um dos quatro ramos, por planta,
mergulhados em suspensão de Salmonella sp. (109 UFC/ml) com 0,025%
de Silwet L-77 durante 30 s, oito semanas após a semeadura da semente.
MATERIAIS E MÉTODOS
Amostragem de folhas e procedimento de teste
• Folhas inoculadas e não inoculadas amostradas 14 dias após a
inoculação no experimento 1;
• Experimento 2: 3 horas e 1, 3, 5, 7, 14, 21 e 30 dias após as
inoculações;
• Experimento 3: 1, 3, 5, 7, 14, 21 e 30 dias após a inoculação das quatro
plantas de cada tratamento. Mesmos número de folhas para as plantas do
controle;
• Retirados discos de 12 mm com um furador de cortiça estéril a partir
do meio de cada folha inoculada;
• Números de colônias de S. enterica ser. Typhimurium em cada placa de
Petri foi determinada pela contagem de UFC verde fluorescente usando
uma lâmpada UV.
MATERIAIS E MÉTODOS
Observações microscópicas
•Amostras observadas em microscópio de varredura a laser;
•Ao todo, 40 cortes de tecido foram examinados por amostra:
total 40 × 3 × 8 = 960 seções para folhas inoculadas e 960 seções
para folhas não inoculadas;
• Trinta seções por amostra de tronco foram examinados: total
30 × 8 = 240 seções;
• Cortes de tecido foram analisados com um comprimento de
onda de excitação de 488 nm e um filtro de emissão BA505-525
(GFP).
MATERIAIS E MÉTODOS
Extração de DNA, reação em cadeia da polimerase e
desnaturação eletroforese em gel gradiente
• DNA extraído a partir de 0,1 g de tecidos desinfectados das plantas,
usando um kit de isolamento de DNA PowerPlant®;
• Amostras submetidas a 16S rDNA polimerase reação em cadeia
(PCR) utilizando primers 799F e1492R;
• Produtos de PCR foram submetidos a eletroforese num gel de
agarose a 1%;
• Após a eletroforese, os géis foram corados durante 30 min com
SYBR GOLD® gel de ácido nucleico;
• As bandas foram visualizadas por Molecular Imager Gel Doc XR
System®.
MATERIAIS E MÉTODOS
Amostragem de frutas e procedimento de teste
• Frutos de tomate foram colhidos, desinfestados, cortado verticalmente
em metades e colocado por 1 min em LB agar contendo canamicina a
50 μg/ml.
• Quantidade de colônias foi determinada por contagem de UFC verde
fluorescente utilizando uma lâmpada de UV.
Extração das sementes e detecção
• Retirada da sementes por escavação da polpa do fruto de tomate.
• Sementes desinfestadas e secas, moídas e incubadas em caldo LB
(canamicina 50 μg/mL) a 37 °C durante 24 h.
• Salmonella sp. foi confirmada sob a luz UV.
MATERIAIS E MÉTODOS
Medição do peso seco das plantas
• Após a colheita, todos os frutos de tomate da primeira fase do
experimento 2, foram mensurados os pesos da parte aérea seca.
Segunda geração de amostras de tecido de plantas e a
detecção
• Experimento 1: 61 sementes de frutos contaminados e 74 sementes de
sem inoculação foram plantadas em substrato; Experimento 2: 100
sementes contaminadas e 30 sementes sem inoculação foram plantadas m
solo convencional;
• Mudas foram transplantadas novamente em substrato e cresceu para a
maturidade;
• Fruitos foram verificados se havia presença de Salmonella spp. como
descrito nos testes anteriores.
MATERIAIS E MÉTODOS
Análises estatísticas
• Taxa estimada dos parâmetros foram submetidos à análise de variância
(ANOVA) incluindo o termo de interação;
• Como não houve interação significativa, o efeitos do tipo de manejo
do solo na sobrevivência de Salmonella spp. nas folhas inoculadas
foram avaliados por meio de análise multivariada de variância
(MANOVA);
• ANOVA, MANOVA e testes t foram realizados utilizando programa
de comparação de médias SAS;
• Os testes χ2 e Q' foram realizados em Microsoft Excel.
MATERIAIS E MÉTODOS
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Testes de interação
• Não houve efeito significativo de interação entre morfotipo
Salmonella e manejo do solo na diminuição das taxas de Salmonella
Typhimurium em folhas inoculadas;
• Não houve efeito significativo da interação entre morfotipo
Salmonella e tipo de manejo do solo sobre o número de plantas com
e sem inoculação das folhas, número de frutos e de plantas com
frutas com presença da bacteria;
• Os valores de P para os testes do Q‘ que determinam essas
interações foram de 0,72, 0,67, e 0,64, respectivamente.
Tabela 1. Salmonella enterica ser. Typhimurium (dados da combinação de cepas
MAE110 e MAE119) em contaminação em plantas de tomate nos dois experimentos
principais.
w - Plantas com folhas adjacentes não inoculadas contaminadas internamente para folíolos inoculados, conforme determinado após
enriquecimento de Salmonella spp. em suspensão de folhas. Contaminação dos frutos foi alta o suficiente para que o enriquecimento
não fosse necessário.
x - Nove de nove frutas em uma planta.
y - Número igual de solos orgânicos e convencionais.
z - Cinco de seis frutas em uma planta e duas de sete frutas na outra planta.
Experimento, tratamento
Número de plantas
internamente contaminadas/
total de plantas (w)
Número de plantas com fruta
contaminada/ total de plantas
Número de frutas
contaminadas/ total de plantas
1
Plantas inoculadas em solo
convencional... 1/42 9/270(x)
Plantas inoculadas em solo
orgânico... 0/42 0/270
Controle - Plantas controle em
solo orgânico ou convencional
(y)
... 0/42 0/270
2
Plantas inoculadas em solo
convencional5/42 2/42 7/250(z)
Plantas inoculadas em solo
orgânico3/42 0/42 0/250
Controle - Plantas controle em
solo orgânico ou convencional0/42 0/42 0/250
Fig. 1. Tendências de sobrevivência de Salmonella enterica Typhimurium em folhas de tomate inoculadas. Silwet L-77 foi usado
0,025% de suspensão de inoculo, um tanto mais baixa que a concentração utilizada pelos agricultores em aplicações de pesticidas
(≈0.10%). A. Diminuição da S. enterica Typhimurium na primeira fase do experimento 2 (dados de cepas MAE MAE 110 e 119 foram
aglomeradas); B. Diminuição da S. enterica Typhimurium tensão MAE 110 no experimento 3. Porg e Pcon - curva de regressão prevista
com base no modelo de decaimento exponencial com assíntota para a sobrevivência de Salmonella spp. em plantas de tomate cultivadas
em solos orgânicos e convencionais, respectivamente.
Sobrevivência de S. enterica ser. Typhimurium em plantas de
tomate
Tabela 2 - Estimativas dos parâmetros para o declínio exponencial da concentração de
Salmonella enterica ser. Typhimurium em folhas de tomate depois de um período de 30
dias(y).
y - A = assíntota e R = taxa de declínio. Letras indicam diferenças significativas (P = 0,05) entre tratamentos dentro de cada uma dos
experimentos.
Z - número do experimento e tipo de manejo do solo.
Experimento, solo (z) A (log [CFU/g]) R (dia–1)
2
Solo convencional 3.826 +- 0.129 a 0.039 +- 0.023 a
Solo orgânico 2.071 +- 1.715 b 0.168 +- 0.059 b
3
Solo convencional 3.877 +- 0.229 a 0.044 +- 0.043 a
Solo orgânico 0.027 +- 1.012 b 0.219 +- 0.059 b
Tabela 3 - Impacto do manejo convencional e orgânico de fazenda na taxa de declínio de Salmonella
enterica Typhimurium em folhas de tomate, as propriedades do solo e diversidade e riqueza de
comunidades bacterianas endofíticas em experimentos 2 e 3, e os coeficientes de correlação entre as
taxas de declínio de Salmonella spp. e as propriedades solo e comunidade bacteriana (v).
v - Propriedades do solo: NH3, nitrogênio; NOx, os óxidos de nitrogênio; P, fósforo; K, potássio; Ca, cálcio; Mg, magnésio; e OM, a
matéria orgânica do solo (%). Coeficiente significativo de correlação (α <0,05) entre os níveis de nutrientes, teor de matéria orgânica ou
diversidade bacteriana ea taxa de declínio de Salmonella spp. são mostradas em negrito.
w - C1 a C3, solos provenientes de diferentes fazendas convencionais; O1 a O3, solos coletados em diferentes fazendas orgânicas.
x - Taxa de declínio de Salmonella spp. (log [UFC / g] / dia) foi medida através do ajuste dos dados observados (como na Figura 1) a um
modelo de decaimento exponencial com assíntota. y - Diversidade da comunidade bacteriana endofítica antes da inoculação.
z - Riqueza da comunidade bacteriana endofítica antes da inoculação.
Propriedades da amostra de solo e correlação com
persistência interna de S. enterica ser. Typhimurium em folhas
de tomate
Tabela 3 - Impacto do manejo convencional e orgânico de fazenda na taxa de declínio de Salmonella
enterica ser. Typhimurium em folhas de tomate, as propriedades do solo e diversidade e riqueza de
comunidades bacterianas endofíticas em experimentos 2 e 3, e os coeficientes de correlação entre as
taxas de declínio de Salmonella spp. e as propriedades solo e comunidade bacteriana (v).
v - Propriedades do solo: NH3, nitrogênio; NOx, os óxidos de nitrogênio; P, fósforo; K, potássio; Ca, cálcio; Mg, magnésio; e OM, a
matéria orgânica do solo (%). Coeficiente significativo de correlação (α <0,05) entre os níveis de nutrientes, teor de matéria orgânica ou
diversidade bacteriana ea taxa de declínio de Salmonella spp. são mostradas em negrito.
w - C1 a C3, solos provenientes de diferentes fazendas convencionais; O1 a O3, solos coletados em diferentes fazendas orgânicas.
x - Taxa de declínio de Salmonella spp. (log [UFC / g] / dia) foi medida através do ajuste dos dados observados (como na Figura 1) a um
modelo de decaimento exponencial com assíntota. y - Diversidade da comunidade bacteriana endofítica antes da inoculação.
z - Riqueza da comunidade bacteriana endofítica antes da inoculação.
Comunidades bacterianas endofíticas em plantas de tomate
cultivadas em solos convencionais e orgânicas
Figura 2. Fruto de tomate e sementes contaminadas com Salmonella enterica Typhimurium. A, Fruto contaminado cortado; B,
Colónias de Salmonella recuperado a partit do fruto mostrado em A em placas de Luria-Bertani com canamicina; C e D,
Contaminação internadas sementes de tomate quando germinadas em ágar rico em carbono com ≈1,000 ppm C (55).
Contaminação do fruto e da semente de plantas de tomate
cultivadas em solo convencional
CONCLUSÕES
• S. enterica Typhimurium pode atingir não apenas frutos de
tomate, mas também sementes via inoculação da folha, embora
a possibilidade seja baixa;
•A colonização interna de Salmonella spp. em folhas de
tomate foi afetada pelo tipo de manejo do solo;
• Células de Salmonella foram encontradas nas células do
floema no caule de plantas cultivadas convencionalmente mas
não naquelas cultivadas organicamente;
• Ca é conhecido por resultar em paredes celulares mais
resistentes e melhor função da membrana;
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