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  • UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM

    BIOTECNOLOGIA

    CATIANE DO SACRAMENTO SOUZA

    SINTASE DA QUITINA DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA (STAHEL) AIME & PHILLIPS-MORA: CARACTERIZAO GNICA E MODELAGEM DO

    PROVVEL STIO CATALTICO.

    Feira de Santana, BA Julho. 2007

  • CATIANE DO SACRAMENTO SOUZA

    SINTASE DA QUITINA DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA (STAHEL) AIME & PHILLIPS-MORA: CARACTERIZAO GNICA E MODELAGEM DO

    PROVVEL STIO CATALTICO.

    Dissertao apresentada ao Programa de Ps-graduao em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obteno do ttulo de Mestre em Biotecnologia.

    Orientador: Prof. Dr. Julio Cezar de Mattos Cascardo Co-Orientador: Prof. Dr. Aristteles Ges-Neto

    Feira de Santana, BA Julho. 2007

  • BANCA EXAMINADORA

    Feira de Santana BA 2007

  • Aos meus pais, que em todos os momentos foram

    os melhores pais de mundo. Um exemplo

    inesgotvel de amor, companheirismo, pacincia,

    carter e todas as coisas boas que eu posso

    imaginar. Vocs so meus moldes de seres

    humanos.

  • AGRADECIMENTOS

    Por chegar aqui agradeo primeiramente a A. Ges-Neto e J. C. M. Cascardo, pela

    confiana, orientao, presena e apoio em minhas dvidas e desesperos. Ao B. T. Hora-

    Junior, B. M. Oliveira e M.C. Santos-Junior, por me revelar os primeiros segredos da

    Biologia Molecular e Qumica Computacional. C. V. Dias, M. Lopes e C. P. Pirovani, pelo

    pronto apoio sempre que solicitados. Ao pessoal do LAMOL, em especial ao R. Vilas-Boas

    e A. K. Santos. R. Galante pelas leituras que me proporcionou e pelo presena, pelos

    puxes de orelha e por tentar polir umas arestas. Ao A. C. S. Rocha, I. K. C. Nobre, W. R.

    A. Soares, R. Q. Oliveira et al. pela troca de conhecimento e pelo apoio nas Atividades

    Complementares e afins. B. S. Andrade (uma tima pessoa para trabalhar junto) foram

    fantsticas e valiosas suas dicas em bioinformtica e os riso (todos eles!!!) G. J. Bulos e M.

    L. C. Pontes pelo modo novo de ver velhas fotografias e pelas intensivas experimentaes

    do resultado da fermentao de Vitis spp; a C. E. L. Fiuza, O. F. Paixo, J. Rodrigues, A.

    Estrela, G. M. A. Aires e H. R. Carneiro-Junior pelos cafs, vinhos, ombros, ouvidos e

    afins. No poderia esquecer de agradecer a Klb. Gomes e F. Jos pela simples

    objetividade, P. Drumond (tambm o poeta, mas aqui me refiro a pessoinha) pela

    delicadeza com todas as coisas e pela presena (ainda que via-Graham Bell). S. V.

    Oliveira, Sr. Falco e M. Camargos, por me devolver pesquisa. A D. Sampaio por sua

    insubstituvel e imaginativa contribuio. Aos Amigos do LAPEM, em especial queles da

    BioMol, pelos gis, pelos risos, por tudo... Aos meus pais por entenderem minha ausncia.

    Ao CNPq/FINEP e PPGBiotec, pela logstica, e em especial ao Mississipi Center for

    Supercomputing Research pelo acesso ao Amber, e principalmente a Sra. Snia, por ter

    facilitado muita coisa.

    E ao Deus, claro, por ter nos proporcionado um maravilhoso mundo codificado por genes

    (que ocupam nosso tempo e enchem de significado nossas vidas), mas principalmente,

    pela Cachoeira da Fumaa, pelas estrelas que reservou para o cu de l e por ter posto

    em meu caminho incrveis pessoas como, L. C. Pereira e D. M. Novaes, com quem eu

    pude caminhar naquelas trilhas: Amiguinhos, amo vocs de montanha!!!!!

    Agradecimento Especial

    Pelo modo empolgante com que orienta, pela ateno, incentivo e, principalmente, por seu

    envolvimento em cada passo que dei frente, agradeo a Aristteles Ges Neto, que foi

    mais que um orientador, foi um exemplo, o melhor.

  • ... um passo frente e voc no est mais no mesmo lugar.

    Chico Science

  • SUMRIO

    RESUMO 07 ABSTRACT 08 LISTA DE FIGURAS 09 LISTA DE TABELAS 13 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 14 1. INTRODUO 15 2. REVISO DA LITERATURA 18 2.1. O fungo Moniliophthora perniciosa 18 2.2. Parede Celular 22 2.3. A sintase da quitina 25 2.4. Determinao e caracterizao de gene por primer walking 28 2.5. A busca pelo controle da doena 29 3. MTODOS EM BIOLOGIA COMPUTACIONAL 31 3.1. Qumica computacional 34 3.2. Emprego da qumica computacional na modelagem

    comparativa 38

    4. MATERIAL E MTODOS 41 4.1. Busca e anotao das provveis seqncias do gene da

    sintase da quitina do Banco de Dados do Projeto Genoma do M. perniciosa

    42

    4.2. Desenho de oligonucleotdeos iniciadores 43 4.3. Extrao e purificao do DNA total de M. perniciosa 43 4.4. Amplificao de fragmentos de DNA genmico 44 4.5. Seqenciamento 46 4.6. Anlise das seqncias 47 4.7. Anlise filogentica 48 4.8. Determinao da estrutura 3D: Modelagem da regio

    conservada contendo o stio ativo 49

    4.9.1. Identificao e alinhamento seqencial da protena molde 49 4.9.2. Construo e refinamento do modelo 50 4.9.3. Validao 53 5. RESULTADOS E DISCUSSO 54 5.1. Seqenciamento do gene da sintase da quitina 54 5.2. Resultados em Qumica Computacional 74 6. CONCLUSO 98 7. REFERNCIAS 100 APNDICES 112

  • RESUMO

    A sintase da quitina (CHS) converte UDP-N-acetilglicosamina em quitina, o principal componente da parede celular de fungos. Esta glicosiltransferase tem cinco diferentes nveis de expresso, dependendo do estdio do ciclo da vida do fungo. A sintase da quitina classe III age diretamente na formao da parede celular, so responsveis por muitas das quitinas na clula e , por isso, um alvo molecular altamente especifico para frmacos que podem inibir o crescimento e desenvolvimento do fungo patognico, pois a CHS um precursor imediato da quitina e cataliza uma reao irreversvel. Este trabalho objetivou a caracterizao molecular experimental e in silico do gene da sintase da quitina de Moniliophthora perniciosa, (MopCHS), um provvel homlogo do gene chs1 do Agaricus bisporus. Os contigs de M. perniciosa foram mapeados com, uma cobertura de aproximadamente 80% no produto gnico de A. bisporus com alta significncia estatstica, e pares de oligonucleotideos iniciadores foram produzidos para garantir a amplificao para o seqenciamento de dois intervalos do provvel gene MopCHS por primer walking. Aps o sequenciamento completo do gene, que compreende 3443 pb (14 xons e 13 ntrons), constituindo um cDNA com uma fase de leitura aberta com 2739 pb e codificando uma protena com 913 aa, um modelo do provvel sitio ativo foi construdo pelo mtodo de modelagem por homologia. Um dos homlogos utilizado, o 1Z3X, apresentou 61% de identidade. O modelo foi construdo pelo Swiss Model e refinado por clculos de Mecnica e Dinmica Molecular executados pelos campos de fora presentes no BioMediCache 6.1 (MM3) e Amber 8.0 (ff99). A qualidade do modelo resultante foi testada pelo programa Procheck 3.0 e ANOLEA. O grfico de Ramachandran produzido mostrou que o modelo proposto tem cerca de 94,5% de seus resduos nas regies favorveis. O completo conhecimento da geometria do stio ativo de MopCHS ser til para desenvolver inibidores contra a doena vassoura-de-bruxa.

    Palavras-chave: Moniliophthora perniciosa, sintase da quitina, seqenciamento, estrutura 3D, homologia.

  • ABSTRACT

    Chitin synthases (CHS) converts UDP-N-acetylglycosamine into chitin, the main component of the fungal cell wall. These glycosyltransferases have five different expression levels depending on the fungal life cycle stage. Class III chitin synthases act directly in the formation of the cellular wall, are responsible for most of the chitin synthesis in the cell, and are, therefore, a highly specific molecular target for drugs that could inhibit the growth and development of pathogenic fungi, since CHS is the immediate precursor of chitin and catalyzes an irreversible reaction. This work aims to an in silico and experimental molecular characterization of Moniliophthora perniciosa chitin synthase gene (MopCHS), a putative homologous of Agaricus bisporus chs1 gene. M. perniciosa contigs were successfully mapped onto A. bisporus CHS gene product, with a coverage of approximately 80% with high statistical significance, and pairs of primers were produced to generate amplicons for sequencing two gaps inside the putative M. perniciosa gene by primer walking. After the complete sequencing of the gene, which has 3443 pb (14 exons and 13 introns), a cDNA ORF with 2739 pb and codes for a protein with 913 aa, a model of active site was constructed using Homology Modeling approach. The homologous 1Z3X, with 61% identity, was used as one of the templates. The model was constructed using Swiss Model and refined by a set of Molecular Mechanics and Molecular Dynamics calculation, both using MM3 force field in BioMedCache 6.1. and ff99 from Amber 8.0. The quality of resultant model was evaluated by Procheck 3.0 and ANOLEA. Ramachandran plot indicated that the model has 94,5% of residues in the most favored regions. The complete knowledge about the geometry of active site of MopCHS will be useful to develop new inhibitors against witches broom disease. Keywords: Moniliophthora perniciosa, sequencing, chitin synthase, 3D structure, homology.

  • LISTA DE FIGURAS Figura 01: Aspecto da doena vassoura-debruxa nos botes florais e nos frutos de cacau causados pelo M. perniciosa (Fonte: AIME, PHILLIPS-MORA, 2005).

    19

    Figura 02: Ciclo de vida do M. perniciosa. As partes em azul e laranja do ciclo correspondem s fases biotrfica e saproftica, respectivamente. Em verde, est delimitada parte do ciclo do fungo na sua interao com a pla