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AUTORESAUTHORS

PALAVRAS-CHAVEKEY WORDS

Braz. J. Food Technol., v.7, n.1, p.87-101, jan./jun., 2004 87 Recebido / Received: 20/08/2003. Aprovado / Approved: 11/02/2004.

Isolado protéico de soja; Tratamento térmico;Hidrólise enzimática; Propriedades funcionais / Soy

protein isolates; Hydrolysates; Heat treatment;Functional properties.

O objetivo deste trabalho foi estudar a influência do tratamento térmico sofridopelos isolados protéicos de soja nas suas propriedades funcionais e de seus hidrolisados. Oisolado protéico de soja (IPS) foi produzido a partir da farinha desengordurada de soja (FDS)e posteriormente submetido a diferentes tratamentos térmicos (70, 80 e 90°C/30’),apresentando diferentes graus de desnaturação, determinado por calorimetria diferencial devarredura. O comportamento eletroforético das proteínas dos IPSs foi analisado poreletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) enão apresentou diferenças quanto à composição relativa das frações 7S e 11S. O perfil dehidrofilicidade/hidrofobicidade dos IPSs foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiênciade fase reversa (CLAE-FR) apresentando caráter hidrofóbico. Os isolados nativo (IPSn) etratados termicamente (IPS70, IPS80 E IPS90) foram submetidos à hidrólise enzimática,monitorada por pH-stat e interrompida após atingir o grau de hidrólise (GH) desejado (2 e4%). Os hidrolisados obtidos (HIPSs) a partir dos IPSs com diferentes graus de desnaturação,embora com igual GH, apresentaram distribuição de peso molecular (SDS-PAGE) ecaracterísticas de hidrofobicidade diferenciados, que resultaram em produtos compropriedades funcionais distintas. Embora os HIPSs apresentassem caráter hidrofílico,determinado por CLAE-FR, a hidrólise resultou em aumento significativo da solubilidadeapenas em pH 5 (pI), de até 20 vezes. A presença de peptídeos de baixo peso molecularoriginados a partir da hidrólise, influenciou grandemente a capacidade de formação e deestabilização da emulsão, onde a capacidade emulsificante diminuiu com a hidrólise a 2% GH(107,8m2/g para HIPS70) quando comparado aos IPSs (256,3m2/g para IPS70), porémaumentou com a progressão da reação enzimática (280,3m2/g para HIPS70/4% GH). OsHIPSs obtidos a partir dos IPSs tratados termicamente apresentaram uma diminuição daestabilidade da emulsão em ambos os graus de hidrólise. Os resultados sugerem que mudançasprévias na conformação molecular da proteína podem originar produtos com característicase aplicações distintas.

The objective of this work was to study the influence of the heat treatment on thefunctional properties of soy protein isolates (SPI) and its α-chimotrypsin hydrolysates. Thesoy protein isolates (SPI) were produced from defatted soy flour (DSF) and submitted todifferent heat treatments (70, 80 and 90°C/30 minutes) to obtain isolates with differentdegrees of denaturation determined as Differential Scanning Calorimetriy (DSC). Theelectrophoretic profile (SDS-PAGE) showed no differences in the relative composition of the7 and 11S fractions of the SPIs. The hydrophilic/lypophilic characteristics as determined byReversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC), showed hydrophobiccharacteristics. The native soy isolate (SPIn) and the treated SPIs (IPS70, IPS80 and IPS90)were submitted to enzymatic hydrolysis with α-chimotrypsin, and monitored using the pH-stat. Hydrolysis was interrupted when the appropriate degree of hydrolysis (DH) was attained(2 and 4%). The hydrolysates (HSPIs) obtained from the SPIs with different denaturationdegrees, although showing the same DH, presented different molecular weight distributionsand hydrophobic characteristics, resulting in products with different functional properties.Although the hydrolysates presented hydrophilic characteristics, the hydrolysis only resultedin a significant increase in solubility only at pH5 (up to 20 times). The presence of smallpeptides, originating from the hydrolysis, influenced the emulsifying capacity and stability.The Emulsion Activity Index (EAI) decreased with hydrolysis up to 2% DH (107,8m2/g forHIPS70) as compared to that of the SPIs (256,3m2/g for IPS70), although it increased withthe progression of the enzymatic reaction up to 4% DH (280,3m2/g for HIPS70/4% GH).The hydrolysates originating from the heat-treated SPIs showed a reduction in the emulsionstability for both degrees of hydrolysis. These results suggest that previous changes in theprotein molecular structure can result in products with different characteristics andapplications.

Influência do Tratamento Térmico nasPropriedades de Solubilidade e deEmulsificação de Isolados Protéicos de Soja ede seus Hidrolisados Enzimáticos

Influence of Heat Treatment on the Solubilityand Emulsifying Properties of Soy ProteinIsolate and its Enzyme Hydrolysates

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SUMMARY

RESUMOCristina Yoshie TAKEITIDepartamento de Tecnologia de Alimentos

Faculdade de Engenharia de Alimentos-UNICAMPCaixa Postal 6121, 13083-970 Campinas-SP, Brasil

Fone: 0055-19-3788-3997, Fax: 0055-19-3289-3617e-mail: [email protected]

Aparecida Sônia SOUZAFlávia Maria NETTO

Departamento de Planejamento Alimentar e NutriçãoFaculdade de Engenharia de Alimentos-UNICAMP

Caixa Postal 6121, 13083-970 Campinas-SP, BrasilFone: 0055-19-3788-4059, Fax: 0055-19-3788-4060

e-mail: [email protected]; [email protected]

Braz. J. Food Technol., v.7, n.1, p.87-101, jan./jun., 2004 88

TAKEITI, C. Y.et al.

Influência do Tratamento Térmico nasPropriedades de Solubilidade e deEmulsificação de Isolados Protéicos deSoja e de seus Hidrolisados Enzimáticos

1. INTRODUÇÃO

2. METODOLOGIA

As proteínas de soja são utilizadas em alimentos comoingredientes funcional e nutricional, com aplicações emprodutos de panificação, fórmulas infantis, formulações paranutrição clínica, suplementos protéicos, produtos à base depeixe e como substituto em alimentos lácteos e cárneos (GEISE,1994; LUSAS; RIAZ, 1995). A soja contém fatoresantinutricionais que podem afetar a qualidade nutricional deseus produtos. Alguns destes fatores são parcial ou totalmenteinativados pelo calor durante o processamento. Geralmente,durante a obtenção comercial, os isolados sofrem diferentestratamentos, os quais causam alterações físico-químicas nasproteínas, conferindo-lhes propriedades funcionais distintas(KINSELLA , 1976; OHREN, 1981; GONZÁLES, 1995;MUTILANGI et al., 1995). A desnaturação é o efeito maissignificativo e, de acordo com a sua extensão, pode haver ofenômeno de agregação das cadeias polipeptídicasdesnaturadas, bem como a dissociação da proteína emsubunidades, desdobramento de sua estrutura e exposiçãode seus grupos hidrofóbicos (ARRESE et al., 1991; PETRUCELLI;AÑÓN, 1994a,b; PETRUCELLI; AÑÓN, 1995a,b).

Muitos estudos têm demonstrado que o uso dehidrólise enzimática controlada de isolados protéicos de soja(IPSs) aumenta as propriedades funcionais como solubilidade,capacidade de hidratação, emulsificação e capacidade deformação de espuma (KIM et al., 1990; HETTIARACHCHY;KALAPATHY, 1997; ACHOURI et al., 1998; BABIKER, 2000;ORTIZ; AÑÓN, 2000). Enzimas incluindo a pepsina, papaínae tripsina têm sido utilizadas para aumentar a solubilidade ea propriedade emulsificante de isolados protéicos de soja (KIMet al., 1990). Deste modo, considerações sobre a estrutura daproteína são importantes no processo de hidrólise, pois asmudanças na composição molecular de um hidrolisadoprotéico obtido a partir de um substrato parcialmente outotalmente desnaturado são importantes na sua utilizaçãopara diversos fins alimentícios (ADLER-NISSEN, 1993).

Modificação das propriedades funcionais das proteínasatravés da ação de enzimas requer que a hidrólise seja pequenae controlada, com somente 3 a 10% das ligações peptídicasclivadas (KINSELLA et al., 1985). Deve-se considerar, noentanto, que igual grau de hidrólise obtido pela utilização damesma enzima, porém para diferentes substratos, não garanteque os produtos apresentem as mesmas características(ADLER-NISSEN, 1986). O tipo de enzima escolhida e suaespecificidade pelo substrato, juntamente com as condiçõesdo meio e grau de hidrólise leva à formação de uma grandevariedade de peptídeos, que apresentam tanto baixo pesomolecular, como peptídeos de alto peso molecular e, ainda,cadeias que não sofreram hidrólise (PANYAM; KILARA, 1996).

Apesar disso, poucos estudos consideram aimportância das características do isolado quanto àsmodificações estruturais ocorridas durante sua obtençãocomercial e sua influência nas características dos hidrolisadosobtidos. HENN; NETTO (1998) observaram que o processode hidrólise e o perfil dos peptídeos obtidos com diferentesisolados de soja comerciais diferiram entre si ainda que oshidrolisados apresentassem o mesmo grau de hidrólise.

Segundo as autoras, as diferenças encontradas estavam maisrelacionadas à conformação das proteínas do que a outrosfatores, tais como, presença de fitato e inibidor de tripsina.SOUZA (2000) também observou que a partir de um isoladoprotéico de soja produzido laboratorialmente com diferentesgraus de desnaturação foram obtidos hidrolisados de mesmograu de hidrólise, mas com perfis diferenciados.

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influênciados tratamentos térmicos nas propriedades de solubilidadee emulsificação dos isolados protéicos de soja e de seushidrolisados enzimáticos obtidos a partir da utilização de α-quimotripsina.

2.1 Materiais

Farinha desengordurada de soja Prosan R (CevalAlimentos S.A.). Enzima α-quimotripsina produzida pelaSigma Chemical (nº C-1429). Os demais reagentes utilizadosapresentavam grau analítico.

2.2 Obtenção do isolado protéico de soja

O isolado protéico de soja (IPS) foi obtido a partir dafarinha desengordurada de soja, dissolvida em águadeionizada (farinha:água, 1:10, p/v) em pH 8 (NaOH 2N),por 2 horas em temperatura ambiente de acordo commetodologia descrita por PETRUCELLI; ÃNÓN (1995b), commodificações. A suspensão obtida foi centrifugada a 10000gpor 30 minutos a 4ºC. O pH do sobrenadante foi ajustadopara 4,5 (HCl 2N). O precipitado foi, então, lavado com águadeionizada em pH 4,5 e neutralizado em pH 7,0 (NaOH 2 N).O isolado protéico obtido foi dialisado por 48 horas a 8ºC eliofilizado. O conteúdo protéico do IPS foi de 96,9% em baseseca (N X 6,25), 4,1% de umidade, 3,2% de cinzas e 2,4% delipídios.

2.3 Tratamentos térmicos do isolado protéico de soja(IPS) e produção dos hidrolisados enzimáticos(HIPSs)

O isolado protéico de soja (IPS) foi disperso em água auma concentração de 8% (p/p) e transferido para frascos queforam vedados e colocados em banho-maria sob agitação.Para a obtenção dos IPSs parcial e totalmente desnaturadosforam empregados os seguintes tratamentos térmicos: 70,80 e 90°C por 30 minutos, obtendo-se o IPS70, IPS80 e IPS90.Após o tratamento térmico as amostras foram resfriadas àtemperatura ambiente em banho de gelo, imediatamentecongeladas e posteriormente liofilizadas. O isolado protéicode soja controle (denominado nativo - IPSn) foi produzido damesma maneira, entretanto, sem a utilização de tratamentotérmico. Os hidrolisados foram preparados a partir dosisolados protéicos na sua forma nativa e desnaturada, através




da ação da enzima α-quimotripsina. A concentração desubstrato utilizada foi de 8% em proteína (peso/volume),sendo a relação enzima-substrato de 1:30 (peso/peso).Quando a reação atingiu o grau de hidrólise preestabelecido(2 e 4% GH), as amostras foram transferidas para frascos, sendovedados e a temperatura foi elevada para 75ºC por 5 minutos,para inativar a enzima. Os hidrolisados obtidos foramimediatamente congelados e posteriormente liofilizados. Areação de hidrólise foi monitorada utilizando o método pH-stat, realizado em titulador automático METTLER TOLEDOGRAFIX 50.

2.4 Caracterização dos IPSs e HIPSs

2.4.1 Análise térmica por calorimetria diferencial devarredura (CDV)

Os IPSs foram suspensos em água destilada (20%) ecolocados em cápsulas de alumínio hermeticamente seladascontendo aproximadamente 10mg da amostra. As amostrasforam aquecidas de 20 a 120ºC na velocidade de 10ºC/minutoe uma cápsula vazia foi utilizada como referência. Após arealização das análises, as cápsulas foram perfuradas emantidas em estufa a 105°C até peso constante para adeterminação da massa de proteína para o cálculo da entalpiaem base seca. A entalpia (∆H) e a temperatura de desnaturação(Td) foram calculadas integrando-se a área sob o pico, atravésdo programa computacional do equipamento Universal V2.3CTA Instruments. O grau de desnaturação foi avaliado pelarelação entre a entalpia de desnaturação do IPS nativo etratamentos térmicos anteriormente citados.

2.4.2 Determinação do conteúdo de sulfidrila livre

Os teores de sulfidrila livre dos isolados protéicosnativo e tratados termicamente foram determinados segundoBEVERIDGE (1974), com modificações de HARDHAM (1981).Aproximadamente 10mg de amostra de cada isolado, foramdissolvidos em 10mL de tampão TRIS-Glicina (pH 8), contendo8M de uréia. À dispersão foram adicionados 100µl do Reagentede Ellman, o qual contém 4mg de ácido 2,2’ dinitro-5,5’ditiodibenzoico (DTNB) dissolvido em 1mL de tampão TRIS-Glicina. Após 30 minutos, as dispersões foram filtradas emmembrana Millipore 0,45µm e realizada a leitura daabsorbância a 412nm contra o branco, contendo 10mL dotampão Tris-Glicina (8M de uréia) e 100µl do Reagente deEllman. Para a determinação da quantidade de sulfidrila livrecontida nas amostras, utilizou-se a relação:

onde: Abs é a absorbância a 412nm e P corresponde ao pesoda amostra em proteína (mg).

2.4.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) das proteínas totais dos IPS e dos HIPSs

A determinação do perfil eletroforético das proteínastotais dos IPSs foi realizada de acordo com LAEMMLI (1970),utilizando gel de poliacrilamida com gradiente entre 8-25%(PhastGel, Amersham Pharmacia Biotech, cód. 17054201) e operfil do peso molecular dos hidrolisados foi determinado,utilizando um gradiente de gel de alta densidade (High DensityPhastGel, Amersham Pharmacia Biotech, cód. 57-6781-02).

A densitometria dos géis foi efetuada em densitômetroSharp JX 330, empregando o software Image Master(Pharmacia), que calculou os pesos moleculares aparentes decada banda comparando às proteínas-padrão (LMWCalibration Kit - Pharmacia). A composição relativa dassubunidades/polipeptídios foi calculada como a porcentagemda área das subunidades em relação à área total da globulina7S e a porcentagem da área dos polipeptídios em relação àárea da fração 11S.

2.4.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência deFase Reversa (CLAE-FR)

O perfil dos grupos hidrofílicos e hidrofóbicos dosisolados e hidrolisados protéicos foi determinado utilizando-se a técnica de CLAE-FR, de acordo com OOMAH et al. (1994).As condições de corrida obedeceram a um gradiente linearde 45 minutos do solvente A para o solvente B, para eluir asproteínas da coluna. A taxa de fluxo foi de 1 mL/min, comdetecção a 280nm. Após cada análise, a coluna foi retornadaàs condições iniciais através de um gradiente linear (0 a 100%solvente A) por 15 minutos para equilibrar a mesma. Foramfeitas duas dispersões de cada amostra que foram analisadasem triplicata.

2.5 Solubilidade dos IPSs e HIPSs

A porcentagem da solubil idade protéica foideterminada de acordo com o descrito por MORR et al. (1985)com modificações e o conteúdo protéico do filtrado foideterminado pelo método de KJELDAHL (AOAC, 1990). Forampesados aproximadamente 500mg de amostra em um béquerde 50mL e um pequeno volume da solução de NaCl 0,1Mgelado foi adicionado, obtendo-se uma pasta homogênea.Em seguida, foi adicionado NaCl 0,1M até o volume de 40mLdo béquer e colocado em banho de gelo, com ajuste de pH a3; 5 e 7,0 com NaOH ou HCl 0,1N. As dispersões forammantidas sob agitação constante durante 1 hora,monitorando-se o pH estabelecido. A dispersão foi transferidapara um balão volumétrico de 50mL, completando-se ovolume com NaCl 0,1M. Uma alíquota da solução foicentrifugada (20000g/30’) a 4°C. Após filtração em papelWhatman n°1, alíquotas foram tomadas para dosar oconteúdo de proteína solúvel pelo sistema micro-Kjeldahl. Aporcentagem de solubilidade protéica foi determinada por:

onde: Cs é a concentração de proteína no sobrenadante(mg/mL); P é o peso da amostra (mg) e Ca corresponde àconcentração de proteína na amostra (%).

µmoles/g proteína =P

Abs×3,735(1)

100)100/(50

×××

a

s

CPC

% SP = (2)




2.6 Propriedades emulsificantes

O Índice de Atividade Emulsif icante (IAE) foideterminado segundo o método espectrofotométrico dePEARCE; KINSELLA (1978) e a estabilidade da emulsão formadafoi avaliada pelo método de WERE et al. (1997), commodificações. Dispersões da proteína (0,5% p/v) forampreparadas com NaCl 0,1M e mantidas sob agitação durante10 minutos, monitorando-se o pH em 7,0 com NaOH 0,1N.A emulsão foi preparada através da homogeneização dadispersão protéica, com o gotejamento de óleo de soja (3:1)em um agitador mecânico a 2.600rpm à temperaturaambiente. Alíquotas de 1,0mL da emulsão foram diluídas (1/500) em uma solução de SDS 0,1% e a absorbância foideterminada a 500nm. O índice de atividade emulsionantetem unidade de área da interface estabilizada por unidade depeso de proteína.

Para a determinação da estabilidade, uma novaemulsão foi preparada conforme citado anteriormente e umaalíquota de 1,0mL da emulsão foi retirada imediatamente apósa sua formação (A0), sendo diluída (1/100) em uma solução deSDS 0,1% e uma outra alíquota foi retirada após 20 minutos(A20) e também diluída com SDS 0,1% (1/100); as absorbânciasforam determinadas a 500nm. Para o cálculo do Índice deEstabilidade da Emulsão (IEE) foi utilizada a seguinte relação:

AtA

∆×0IEE = (3)

onde: A0 corresponde à absorbância no t0; t é o tempotranscorrido (20min) e ∆A corresponde à variação dasabsorbâncias (A0 - A20).

2.7 Análise estatística

Nos resultados experimentais, as médias foramcomparadas com o uso de análise de variância e quandodiferentes pelo Método de Tukey (COCKRAN; COX, 1957),utilizando-se o programa computacional Statistica 5.0.

3.1 Análise térmica por calorimetria diferencial devarredura (CDV)

A análise térmica por Calorimetria diferencial devarredura apresentou temperaturas de desnaturação (Td)correspondentes à fração 7S em 75,4°C e para a fração 11S em93,2°C. Ambos, IPS70 e IPS80 apresentaram somente uma Tdcorrespondente à fração 11S de 94,1 e 95,8°C,respectivamente. O IPS90 não apresentou Td, indicando atotal desnaturação da proteína. A maior estabilidade térmicada globulina 11S é devido à presença de 21 pontes dissulfeto,das quais, 15 são intramoleculares. A globulina 7S não possuiestas ligações e como conseqüência, sua temperatura dedesnaturação é menor (DAMODARAN, 1989; SCILINGO;AÑÓN, 1996). As temperaturas de desnaturação para asfrações 7S e 11S foram semelhantes aos resultadosencontrados por PUPPO; AÑÓN (1999) e SOUZA (2000).Quanto à entalpia (∆H) e grau de desnaturação (%D) (Tabela1), observa-se diminuição dos valores de entalpia com oaumento de temperatura do tratamento térmico, o que estáassociado às mudanças estruturais e conformacionais devidoao desdobramento das moléculas da proteína. As mudançasque ocorrem na molécula são uma combinação de reaçõesendotérmicas, onde ocorre o rompimento de pontes dehidrogênio e de reações exotérmicas, resultantes da agregaçãode cadeias polipeptídicas e do rompimento de interaçõeshidrofóbicas (PRIVALOV; KLECHINASHVILE, 1974). Valores maisaltos de entalpia estão associados com um maior conteúdode proteína nativa ou pouco desnaturada (WAGNER; AÑÓN,1990). Para este estudo, a entalpia observada para o IPSn foide 7,6 J/g, superior ao encontrado por SOUZA (2000), 3,7 J/g; entretanto, foi inferior ao relatado por PUPPO; AÑÓN (1999)e SORGENTINI et al. (1996) e que corresponderamrespectivamente a 18,3 J/g e 17,6 J/g para isolados nativosobtidos laboratorialmente em pH 8,0. Os tratamentostérmicos levaram à obtenção de isolados com diferentes grausde desnaturação: o IPS90 com 100% de desnaturação,enquanto o IPS80 e o IPS70 apresentaram 58 e 40%,respectivamente.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

TABELA 1. Temperatura (Td) e entalpia (H) de desnaturação das frações 7S e 11S e conteúdo de sulfidrila livre dos isolados protéicosde soja nativo e tratados termicamente.

Amostras Td (°C)/7S 1 Td (°C)/11S 1, 3 ∆H 1, 2, 3 (J/g) %D4 Sulfidrila Livre 1,3

IPSn 75,39 ± 0,64 93,17 ± 0,44 a 7,62 ± 0,07 a 0,0 3,82 ± 0,05 a

IPS 70 ND 94,10 ± 0,23 a, c 4,60 ± 0,10 b 39,63 3,79 ± 0,05 a

IPS 80 ND 95,77 ± 0,67 b, c 3,17 ± 0,09 c 58,40 3,35 ± 0,10 b

IPS 90 ND ND 0,0 100,00 1,09 ± 0,03 b

1 Valores determinados em 3 repetições.2 Valores expressos por grama de proteína em base seca.3 Valores com letras diferentes na mesma coluna diferem significativamente pelo teste de Tukey (p<0,05).4 %D Porcentagem de Desnaturação Protéica =100 – [(∆H IPS x 100) / ∆H IPSn]ND Não Detectado.




3.2 Conteúdo de sulfidrila livre

O conteúdo de sulfidrila livre encontrado neste estudo(Tabela 1) para o IPSn, foi de 3,8µmoles/g de proteína, sendomuito inferior ao relatado por LIU et al. (2000), que foi 10µmoles/g de proteína. Porém, foi superior ao citado por PETRUCELLI;AÑÓN (1994a; 1995a,b) correspondendo a 1,7; 1,3 e1,6µmoles/g de proteína, estando somente similar ao relatadopor VOUTSINAS et al. (1983). O conteúdo de sulfidrila livrediminuiu com o aumento da severidade do tratamentotérmico, apresentando diferença significativa (p≤ 0,05) a partirdo tratamento a 80°C, onde a fração 11S está parcialmente ea 7S totalmente desnaturada, como determinado pela análisede DSC. A redução mais marcante ocorreu aos 90°C, onde aquantidade encontrada representa apenas a um terço do valorinicial. Este comportamento também foi relatado porPETRUCELLI; AÑÓN (1994a) em seu estudo sobre a relaçãoentre o método de obtenção e propriedades funcionais deisolados protéicos de soja. Parâmetros cinéticoscorrespondentes à desnaturação térmica de IPS obtidos porDSC, demonstram que um tratamento a 85°C por 5 minutos écapaz de desnaturar 69% da glicinina, a fração que contém amaior quantidade de grupos sulfidrílicos (ARRESE, 1991). Afração 7S possui um conteúdo baixo de grupos sulfidrílicos(SH) e dissulfídicos (SS) (THANH; SHIBASAKI, 1978; COATES etal., 1985), enquanto a fração 11S apresenta 48 mols deresíduos de cisteína por mol de proteína (CATSIMPOOLAS etal., 1969), contribuindo pela maioria das transformaçõesdestes grupos. Diversos autores relatam a importância dosgrupamentos SH e SS para as propriedades funcionais dasproteínas, identificando as ligações importantes para oprocesso de geleificação e de coagulação protéica (CIRCLE etal., 1964; FURUKAWA et al., 1979; VOUTSINAS et al., 1983).

3.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)das proteínas totais e solúveis em água destiladados IPSs e de seus hidrolisados enzimáticos

A composição relativa das subunidades/polipeptídeosdas frações 7S e 11S presentes nas proteínas dos IPSs e dosHIPSs estão representadas na Figura 1. Não foi possívelproduzir o HIPSn com 4% de GH, pois o máximo grau dehidrólise da proteína na sua forma nativa foi de 2,83%. Quantoàs proteínas totais dos IPSs, a composição relativa de suassubunidades/polipeptídios manteve-se praticamenteinalterada em função do tratamento térmico empregado,sugerindo que o aquecimento não foi capaz de provocar umaagregação que acarretasse em alteração de peso molecular ede composição relativa de suas frações, estando emconcordância com o observado por outros autores comoYAMAGISHI et al. (1980) e SOUZA (2000).

Entretanto, o perfil eletroforético dos hidrolisados comgrau de hidrólise (GH) igual a 2 e 4 %, obtidos a partir dos IPSsnativos e tratados termicamente apresentaram diferenças naproporção das frações 7S e 11S remanescentes. Na hidrólisedo IPS nativo a 2%GH, as subunidades α e α’ foram maisfortemente hidrolisadas que a β-7S, enquanto a fração 11Spermaneceu praticamente intacta. O aumento da severidadedo tratamento térmico resultou no desaparecimento da fração7S, enquanto a globulina 11S permaneceu presente após ahidrólise. Possivelmente, a fração 7S foi mais susceptível àhidrólise, por estar desnaturada pelo aquecimento, conformedemonstrado por análise térmica de CDV, sendo tambémobservado por SOUZA (2000). A maior estabilidade térmicada fração 11S, pode ter contribuído para uma maior resistênciaao desdobramento das cadeias polipeptídicas e,conseqüentemente, ao ataque enzimático o que poderia

Os valores representam a porcentagem da área das subunidades em relação à área total da globulina 7S e a porcentagem dos polipeptídios em relaçãoà área total da globulina 11S, calculadas a partir da densitometria dos géis.

FIGURA 1. Composição relativa das subunidades/polipeptídeos das subunidades das frações 7S e 11S presentes nas proteínas dosIPSs e HIPSs.




explicar a permanência desta fração em todos os HIPSs.Resultados semelhantes também foram relatados porCAMPBELL et al. (1996), que investigaram a extensão dodesaparecimento das subunidades da fração 7S e dospolipeptídios ácidos e básicos da fração 11S quandosubmetidas à hidrólise na presença da α-quimotripsina. Estesautores relataram que houve o desaparecimento da fração 7Se dos polipeptídios ácidos da fração 11S em GH maior que0,3%, enquanto os polipeptídios básicos-11S foram maisresistentes a esta enzima por apresentarem menoresquantidades de aminoácidos aromáticos. Outro fator relevanteestá relacionado às diferenças estruturais entre os doispolipeptídios, onde os básicos que são mais hidrofóbicos,conseqüentemente, são mais compactos e, assim, dificultama acessibilidade da enzima (LEE et al., 1990).

Quanto aos hidrolisados com 4% de GH, notou-se ototal desaparecimento da fração 7S e o gradualdesaparecimento da subunidade ácida (poli A) da fração 11Scom o aumento do tratamento térmico. A subunidade básica(poli B) permaneceu em todos os hidrolisados e notou-se oaparecimento de peptídeos de PM inferior a 14 kDa maisintensamente que o observado quando os IPSs foramhidrolisados até 2% de GH.

Estes resultados sugerem que o mecanismo de reaçãode hidrólise do IPS nativo seguiu o modelo one-by-one, ondefoi observada tanto a presença de proteínas intactas como depeptídeos de baixo peso molecular; entretanto, a proteólisedos isolados tratados termicamente seguiu o modelo zipperdevido à presença de peptídeos de baixo peso molecular. Estecomportamento também foi relatado por SOUZA (2000), queutilizou condições de hidrólise semelhantes.

3.4 Cromatografia líquida de alta eficiência de fasereversa dos IPSs e dos HIPSs (CLAE-FR)

A cromatograf ia CLAE-FR fo i ut i l i zada paracaracterizar e comparar os IPSs e seus hidrolisados. Acomparação foi baseada nos perfis cromatográficos,considerando os tempos de eluição e as áreas sob os picosdetectados. A Figura 2 representa o perfil cromatográficodos IPSs nativos (a) e tratados termicamente (b, c, d).Observou-se uma similaridade entre eles, com a presençade cinco picos bem definidos com tempos de eluiçãoaproximadamente iguais a 6; 16; 24; 28 e 31 minutos.Entretanto, com o aumento da temperatura do tratamentotérmico, nota-se que ocorreu uma diminuição da definiçãodos picos compreendidos entre 23 e 36 minutos,principalmente a partir de 80°C. Quanto à altura dos picos,observa-se uma similaridade entre o IPS nativo e o IPS 70°C/30’; porém, com o aumento do tratamento térmico ocorreuuma diminuição da altura dos mesmos (IPS 80 e 90°C/30’).Perda de definição e aumento de área sob os picos situadosa partir da metade do cromatograma também foi citado porOOMAH et al. (1994) e GARCÍA et al. (2000b). GARCÍA et al.(2000b), assim como, outros autores (PETERSON; WOLF,1988; YASUMOTO et al., 1990) obtiveram separadamenteos perfis cromatográficos das frações 7S, 11S e do IPS totale por comparação observaram que os picos que apareceram

no início do cromatograma correspondem à fração 7S,enquanto os picos presentes no final apresentavam ummaior conteúdo da globulina 11S, parecendo estarassociada à subunidade β da fração 7S.

As Figuras 3 e 4 apresentam os cromatogramas dosHIPSs com 2 e 4% GH. Diferentemente dos cromatogramasdos IPSs, os hidrol isados apresentaram grandeconcentração de pequenos picos na zona I (0 – 24mintempo retenção) e diminuição da concentração e daamplitude dos picos da zona II (a partir 24min de eluição).O aumento da concentração de picos dos HIPSs na zona Isugere seu caráter hidrofílico. Comportamento semelhantefoi relatado por ORTIZ; AÑÓN (2000), que sugeriram suapossível contribuição para o aumento da solubilidade e namesma extensão, para outras propriedades de superfíciecomo a emulsificação e formação de espuma. Os picos dazona II, com tempos de eluição de 28; 32 e 34 minutos,correspondem aos picos existentes no IPS representando,possivelmente, a fração não-hidrolisada; além disto,ocorreu uma diminuição acentuada da quantidade donúmero de picos. Poucas mudanças foram observadas noperfil cromatográfico dos HIPSs com 4% GH, quandocomparados aos HIPSs com 2% GH, notando-se o gradualdesaparecimento do pico detectado aos 24min de eluiçãocom o aumento do tratamento térmico.

3.5 Solubilidade protéica

Observa-se na Figura 5 (a, b, c) que os IPSsapresentaram um comportamento típico, com baixasolubilidade em pH 5, região do pI, aumentando nos pHsacima e abaixo deste valor. Este comportamento também foicitado por diversos autores (BERNARDI et al., 1991; ELIZALDEet al., 1996; WERE et al., 1997; CHIANG et al., 1999; BABIKER,2000). O pH afeta a densidade de cargas e o balançoeletrostático intra e intermolecular, modificando a habilidadeda proteína em participar das interações hidro e lipofílicas. Oaumento da densidade de cargas da proteína em pHsafastados da região do ponto isoelétrico favorece asinterações proteína-água, resultando num aumento daspropriedades de hidratação (ELIZALDE et al., 1996). Aocorrência de baixa solubilidade próxima à região do pI édevido principalmente à falta de repulsão eletrostática, quepromoveu agregação e precipitação via interaçõeshidrofóbicas (DAMODARAN, 1996).

Os tratamentos térmicos com temperaturas de 80 e90°C resultaram na diminuição significativa da solubilidade(p<0,05). O IPSn e o IPS70 apresentaram a maiorsolubilidade em todos os pHs estudados variando de 0,7%(pH 5) a 15,6% (pH 3), enquanto o IPS 80 e IPS 90apresentaram solubilidade entre 0,5% (pH 5) e 10,3% (pH7). O decréscimo da solubilidade apresentado pelos IPSs,tratados com temperaturas acima de 80°C, pode ser devidoà formação de agregados insolúveis, com a participaçãode ligações dissulfídricas, fato constatado pelo decréscimodos grupos de sul f idr i las l ivres observado após otratamento térmico (Tabela 3).




(a) IPS nativo; (b) IPS 70°C/30´; (c) IPS 80°C/30´; (d) IPS 90°C/30´

FIGURA 2. Cromatogramas de CLAE-FR dos IPSs nativos e tratados termicamente.




(a) HIPS nativo; (b) HIPS 70°C/30´; (c) HIPS 80°C/30´; (d) HIPS 90°C/30´

FIGURA 3. Cromatogramas de CLAE-FR dos HIPSs com 2% GH.




(a) HIPS 70°C/30´; (b) HIPS 80°C/30´; (c) HIPS 90°C/30´

FIGURA 4. Cromatogramas de CLAE-FR dos HIPSs com 4% GH.




Valores médios de 2 dispersões em NaCl 0,1M analisadas em triplicata.Barras com letras diferentes no mesmo pH diferem significativamente pelo teste de Tukey (p<0,05).

FIGURA 5. Percentual das solubilidades protéicas dos isolados protéicos de soja (IPSs) e de seus hidrolisados enzimáticos (HIPSs).




O mecanismo de desnaturação térmica é altamentecomplexo e envolve, principalmente, desestabilização de umgrande número de interações não-covalentes. Pontes dehidrogênio, interações eletrostáticas e forças de van der Waalssão exotérmicas, sendo desestabil izadas por altastemperaturas. Porém, como as pontes de hidrogênio estãolocalizadas no interior da molécula, elas permanecem estáveisnuma ampla faixa de temperatura. Por outro lado, interaçõeshidrofóbicas são endotérmicas, sendo estabilizadas em altastemperaturas e desestabilizadas em baixas temperaturas. Asmoléculas de água ligam-se a diversos grupos, incluindoresíduos não polares, via hidratação hidrofóbica(DAMODARAN, 1996).

A efetividade da hidrólise enzimática no aumento dasolubilidade foi dependente do tratamento térmico sofridopelo IPS e do pH da solução. Para todos os IPSs, a hidróliseresultou em aumento significativo da solubilidade apenas empH 5, onde houve um aumento de até 20 vezes em relaçãoaos valores obtidos para a proteína intacta. SegundoDAMODARAN (1996), proteínas solúveis no pI apresentamuma alta relação entre os resíduos hidrofílicos e os não-polarespresentes na superfície. Se as forças de repulsão devido aosgrupos carregados dos resíduos de aminoácidos forem maioresque as interações hidrofóbicas proteína-proteína, a proteínapermanecerá solúvel no pI.

A solubilidade em pH 3 (Figura 5a) dos hidrolisadoscom 2% de GH obtidos a partir de proteínas com baixo graude desnaturação, IPSn e IPS70, não atingiu os valores obtidospela proteína intacta (14%), enquanto para os hidrolisadosobtidos a partir dos isolados com maior grau de desnaturação,IPS80 e IPS90, os valores foram próximos aos obtidos pelosubstrato inicial (8% para IPS80 e 9% para IPS90). Apenas osHIPS com 4% de GH, em pH 7, apresentaram solubilidadesuperior aos isolados de origem. Diversos trabalhos relataramo aumento da solubilidade de hidrolisados protéicos em largafaixa de pH (BERNARDI et al., 1991; ELIZALDE et al., 1996;WERE et al., 1997; CHIANG et al., 1999; BABIKER, 2000).Interessante notar que a solubilidade dos hidrolisados com2% de GH, obtidos a partir do IPS 90, foi o único a nãoapresentar diminuição da solubilidade em pH 5, apresentandosolubilidade de 8% em todos os pHs estudados. Este aumentoda solubilidade em pH 5,0 das amostras que sofreramtratamento térmico prévio e posterior hidrólise (Figura 5b),confere um potencial de aplicação no enriquecimento debebidas lácteas ou à base de frutas.

3.6 Propriedades emulsificantes

O Índice de Atividade Emulsificante (IAE) e do Índicede Estabilidade da Emulsão (IEE) dos IPSs e de seus HIPSsestão apresentados na Figura 6. Quanto ao IAE do IPS nativoe dos IPSs tratados termicamente, observou-se que o aumentodo tratamento térmico resultou num aumento daspropriedades emulsificantes até a temperatura de 80°C(290m2/g). A 90°C observou-se uma redução do IAE,praticamente igualando-se ao valor encontrado para o IPSn(200 m2/g). Comportamento semelhante foi relatado no estudosobre a relação entre o método de obtenção, a estrutura e a

funcionalidade de IPSs, realizado por PETRUCCELLI; AÑÓN(1994b), onde os autores relataram que o isolado dialisado etratado termicamente a 80°C (pH 7,0) apresentou maiorcapacidade de emulsificação que o IPS nativo e o IPS90, o quefoi atribuído à desnaturação da fração 7S e à elevação da taxade adsorção na interface como resultado do aumento dahidrofobicidade superficial. Ainda no mesmo estudo,PETRUCCELLI; AÑÓN (1994b) através de análise eletroforéticadas proteínas remanescentes na fase aquosa, após acoalescência, observaram um alto conteúdo do polipeptídioA em relação aos outros componentes (α, α’, β-7S e B-11S),indicando que este polipeptídio não migra para a interface.Em elevada força iônica, o polipeptídio A encontra-separcialmente associado em agregados de alto peso moleculare este estado de associação somado à sua baixahidrofobicidade superficial retardam a sua adsorção nainterface (WAGNER; GUÉGUEN; 1995, 1999 a,b).

Os tratamentos térmicos prévios sofridos pelos IPSsresultaram em HIPSs com propriedades emulsificantesdiferentes. Quanto ao IAE dos HIPSs (Figura 6), observou-seque as propriedades emulsificantes diminuíram com ahidrólise a 2%GH (107,8m2/g para HIPS70) quandocomparado aos IPSs (256,3m2/g para o IPS 70), aumentandocom a progressão da reação enzimática (280,3m2/g para HIPS70/4%GH), mas não diferindo significativamente (p<0,05) dosIPSs. Os HIPSs com 2%GH apresentaram uma maiorheterogeneidade de peso molecular, com a presença tanto deproteína intacta como de pequenos peptídeos, que podemter deslocado as cadeias intactas da interface, diminuindo acapacidade emulsificante. Todavia, com a progressão dahidrólise diminuiu-se a proporção de proteína intacta,obtendo-se um maior número de pequenos peptídeos, osquais puderam migrar e se orientar mais facilmente na interfaceóleo/água (HALLING 1981; WAGNER; GUÉGUEN; 1995,1999b).

A grande variedade de condições experimentais,enzimas utilizadas, tipo de matéria-prima e tratamentosquímicos e físicos empregados, dificultam a comparação daliteratura com os resultados obtidos no presente trabalho.Vários autores relataram não ter observado mudanças nacapacidade de emulsificação dos hidrolisados quandocomparados ao IPS intacto (BERNARDI et al., 1991; WERE etal., 1997). No entanto, outros pesquisadores observaram umadiminuição das propriedades emulsificantes de hidrolisadoscom α-quimotripsina (SÜLE et al., 1997; BABIKER, 2000) eaumento do IAE de IPS tratado termicamente (NIR et al., 1994)quando comparado ao IPS não-tratado. ACHOURI et al. (1998)relataram aumento da capacidade de emulsificação do IPS até5% GH, com diminuição das propriedades emulsificantes aelevados GH (8 e 10%).

A hipótese mais aceita é que a hidrofobicidadesuperficial é a característica da proteína mais importante quedefine o seu comportamento na superfície econseqüentemente determina as propriedades emulsificantes(GRAHAM; PHILLIPS, 1979; NAKAI, 1983; NAKAI et al., 1980;1986). Estes autores correlacionam hidrofobicidade, tensãosuperficial e IAE, enquanto outros autores concluem quepara prevenir a floculação e aumentar a resistência àcoalescência, a camada interfacial deve ser a mais densa




possível, altamente hidratada e carregada para promoverelevada repulsão eletrostática (GRAHAM; PHILLIPS, 1979;DAGORN-SCAVINER et al., 1987; GUÉGUEN et al., 1990;PETRUCCELLI; AÑÓN, 1994b).

Quantos aos resultados da estabilidade da emulsãopara os IPSs e HIPSs, observou-se que a estabilidade diminuiusignificativamente (p<0,05) com o aumento do tratamentotérmico dos IPSs: 43,7 min para IPSn e 28,1min para IPS90.PETRUCCELLI; AÑÓN (1994b) também relataram que IPSstratados a 98°C por 5 e 30 minutos apresentaram baixaestabilidade com mais de 60% de coalescência, o que foiatribuído à diminuição da solubilidade. No mesmo estudo,as autoras observaram que o IPS dialisado e tratado a 80°C(pH 7,0) apresentou baixa liberação de óleo (% oiling off) emenor volume de fase aquosa, sendo atribuído à rigidez dofilme formado. A mesma tendência de comportamento foiobservada em nosso estudo, onde o IPS80 foi dentre todosos isolados, aquele que demonstrou conjuntamente osmelhores valores do IEE (38,1min) e IAE (291,2m2/g prot).

A hidrólise promoveu maior estabilidade da emulsãoapenas do HIPS 70°C/30’ (2 e 4%GH). O aumento detemperatura do tratamento térmico e a hidrólise enzimáticaresultaram na diminuição do IEE dos HIPS80 e HIPS90 em ambosos graus de hidrólise (Figura 6). Entretanto, o valor do IEEencontrado para o IPSn (43,7min) foi o maior dentre todas asamostras e diferiu significativamente (p<0,05) dos demais. Estes

resultados sugerem que com o processo de hidrólise, houve aformação de peptídeos de baixo peso molecular, que foramrapidamente adsorvidos na interface, mas foram incapazes deestabilizar-se devido a não-formação de um filme rígido nemde uma rede estrutural capaz de resistir às forças de deformação.De acordo com HALLING (1981), a presença de pequenasmoléculas surfactantes, como os peptídeos de baixo pesomolecular, pode modificar a reologia superficial do filmeprotéico formado. Estes agentes tendem a penetrar ou mesmoa deslocar a proteína da interface, reduzindo a rigidez dasuperfície do filme protéico.

Os valores do IEE dos hidrolisados com 4% GH foramligeiramente superiores (41,4min para HIPS70) àqueles doshidrolisados com 2% GH (34,9min para HIPS70) e diferiramsignificativamente (p<0,05), exceto o HIPS90 (Figura 6). Istopode estar relacionado a uma maior homogeneidade de pesomolecular dos hidrolisados com 4% GH que com 2% GHdetectada na análise do perfil eletroforético. Peptídeos de baixopeso possivelmente deslocaram as proteínas intactas dainterface, diminuindo a estabilidade da emulsão dos HIPSscom 2% GH. Entretanto, o HIPS70/4% apresentou IEEsemelhante ao da proteína intacta IPS70 (41min), não havendodiferença significativa entre eles (p<0,05). Os hidrolisados com2% e 4% de GH (HIPS70, HIPS80 e HIPS90) apresentaram valoresde IEE decrescentes em função da severidade do tratamentoprévio, demonstrando o impacto do tratamento térmico sobreas propriedades de emulsificação dos hidrolisados.

Barras com letras maiúsculas diferentes diferem significativamente pelo teste de Tukey (p<0,05).Pontos com letras minúsculas diferentes diferem significativamente pelo teste de Tukey (p<0,05).

FIGURA 6. Índice Atividade Emulsificante (IAE) e Índice de Estabilidade de Emulsão (IEE) dos IPSs e de seus hidrolisados a 2e 4% GH.




4. CONCLUSÕES

O isolado protéico de soja nativo e os isoladostratados termicamente apresentaram propriedades funcionaisdiferentes: ( i ) o tratamento térmico diminuiusignificativamente (p<0,05) a solubilidade dos IPSs àtemperatura acima de 80°C, devido possivelmente à formaçãode agregados insolúveis, com a participação de ligaçõesdissulfeto; (ii) a atividade emulsionante aumentou nos IPSstratados termicamente, com exceção do IPS90, que apresentouresultados iguais ao IPSn, enquanto a estabilidade da emulsãodecresceu com o aumento da temperatura do tratamentotérmico. Quanto aos hidrolisados obtidos com mesmo GH,propriedades funcionais distintas foram observadasdependendo do tratamento térmico prévio sofrido pelos IPSs:(i) hidrolisados oriundos de IPSs com maior grau dedesnaturação apresentaram maior solubilidade. Nenhumhidrolisado, no entanto, apresentou solubilidade superiorao IPSn ou IPS70. A hidrólise a 2 e 4% GH resultou em aumentosignificativo da solubilidade apenas em pH 5 (pI) e aefetividade da proteólise no aumento da solubilidade foidependente do tratamento térmico sofrido pelo IPS e do pHda solução; (ii) a atividade emulsionante dos hidrolisadoscom 4% GH foi maior que a atividade apresentada peloshidrolisados com 2% GH e os HIPSs com 4% GH nãoapresentaram diferenças entre si. A estabilidade da emulsãodos HIPSs com 4% GH foi, em geral, superior ao dos HIPSscom 2% GH. O aumento da temperatura do tratamentotérmico previamente empregado nos IPSs resultou emdiminuição da estabilidade da emulsão dos HIPSs.

AGRADECIMENTOS

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Agradecemos à Capes pela concessão de bolsa deestudo e à Fapesp pelo financiamento do projeto (proc.n° 00/04842-6).

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