SUPEREXPRESSÃO INDUZIDA DE VEGF E HGF EM CÉLULAS...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA

SUPEREXPRESSÃO INDUZIDA DE VEGF E HGF EM

CÉLULAS MESENQUIMAIS ESTROMAIS DO

LÍQUIDO AMNIÓTICO NA INIBIÇÃO DA FIBROSE

INTERSTICIAL APÓS ISQUEMIA RENAL AGUDA EM

RATOS

TESE DE DOUTORADO

Marina Gabriela Monteiro Carvalho Mori da Cunha

Santa Maria, RS, Brasil

2012

SUPEREXPRESSÃO INDUXIDA DE VEGF E HGF EM

CÉLULAS MESENQUIMAIS ESTROMAIS DO LÍQUIDO

AMNIÓTICO NA INIBIÇÃO DA FIBROSE INTERSTICIAL

APÓS ISQUEMIA RENAL AGUDA EM RATOS


Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em

Medicina Veterinária, área de Concentração em Cirurgia Veterinária, da

Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para

obtenção do grau de

Doutor em Medicina Veterinária.

Orientador: Prof. Ney Luis Pippi

Santa Maria, RS, Brasil

2012

__________________________________________________ © 2012

Todos os direitos autorais reservados a Marina Gabriela Monteiro Carvalho Mori da Cunha. A

reprodução de partes ou do todo deste trabalho só poderá ser feita com autorização por escrito

do autor. Endereço: Av. Roraima, n. 1000, Universidade Federal de Santa Maria, Hospital

Veterinário, Bairro Camobi, Santa Maria - RS, 97110-000. Fone (0xx)55 3220-9400;

Endereço Eletrônico: [email protected]

__________________________________________________

Universidade Federal de Santa Maria

Centro de Ciências rurais

Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária

A Comissão Examinadora, abaixo assinada,

aprova a Tese de Doutorado

SUPEREXPRESSÃO INDUZIDA DE VEGF E HGF EM CÉLULAS

MESENQUIMAIS ESTROMAIS DERIVADAS LÍQUIDO AMNIÓTICO

NA INIBIÇÃO DA FIBROSE INTERSTICIAL APÓS ISQUEMIA AGUDA

EM RATOS

elaborada por


como requisito parcial para obtenção do grau de

Doutor em Medicina Veterinária

COMISSÃO EXAMINADORA

___________________________________________

Ney Luis Pippi, Prof. Dr.

(Presidente/Orientador)

___________________________________________

Dominguita Luhers Graça, Profa. Dr. (UFSM)

___________________________________________

Alexandre Krause, Prof. Dr. (UFSM)

___________________________________________

Priscylla Tatiana Chalfun Guimarães, Profa. Dr. (UNESP-Botucatu)

___________________________________________

Luciana Maria Fontanari Krause, Profa. Dr. (UNIFRA)

Santa Maria, 17 de Agosto de 2012.

Aos meus pais, Paulo Afonso e Maria Luiza. Todo o esforço para a realização desse trabalho

foi com o intuito de que vocês se orgulhassem de mim.

E ao meu filhote Fluke, nefropata há 5 anos. Amo muito vocês.

.

Ao meu orientador Ney Luis Pippi, por suas ideias sempre visionárias e pela sua dedicação à

cirurgia experimental.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais Paulo Afonso e Maria Luiza, por todos os ensinamentos e apoio em

todas as decisões importantes da minha vida. Vocês são um exemplo para mim. Aos meus

irmãos, João Paulo e Ana Catarina pelo carinho, ensinamentos e momentos de diversão. Vocês

serão sempre os meus melhores amigos!

Ao meu orientador Dr. Ney Luis Pippi, pela oportunidade que recebi para este

desafio, pelas críticas construtivas e pela confiança. Você me deu a oportunidade para que eu

me desenvolvesse por caminhos próprios, me motivando e guiando quando necessário. Muito

obrigada!

To my supervisors at Universiteit Katholiek Leuven, Jaan Toelen and Jan Deprest,

for your guidance and encouragement to keep pursuing the results. Thanks for the opportunity

and for sharing your knowledge.

Silvia Zia thanks for the great companion and friendship during all phases of this

study. Thanks to you we could finish this thesis on time. Everything would be harder and less

fun without you

Ao meu amigo e colega, Diego Vilibaldo Beckmann, pelo profissionalismo,

empenho e motivação para a realização desse trabalho. Tenho grande admiração pela pessoa e

pelo profissional que ele é. Obrigada por todas as idéias, para que tudo fosse o mais eficiente

possível.

Marianne Carlon thanks for all teaching about molecular medicine and

microsurgery, for supporting during the surgeries and for all your efforts to make the time I

spent in Leuven more pleasant, almost like at home, even I was 10.000 km from there.

Ao Professor. Alexandre Mazzanti, pela contribuição em minha formação e por

todas as ideias e sugestões cirúrgicas. Obrigada pelos ensinamentos e estímulo à pesquisa.

À professora Dominguita Graça, pela ajuda na análise histológica, pela companhia

agradabilíssima e por todos os seus ensinamentos. A docência está no seu sangue e o prazer

que você tem em compartilhar o seu conhecimento e ensinar, impressionam a todos. Com

certeza me espelharei em você sempre.

À amiga Rosmarini Santos pela ajuda na revisão dessa tese e por estar sempre lá

quando eu precisasse. Essa amizade vem de longa data, ainda quando éramos estagiárias.

Aos professores Cristiane Danesi e Marcos D’Ornellas, pela ajuda na análise

morfométrica.

Aos professores Ricardo Brainer e Júlio Zenkner pela ajuda nas decisões estatísticas.

Vocês são brilhantes!

Ao amigo Didier Quevedo pela ajuda na decisão das colorações e também pelo

carinho de sempre. Mesmo após anos distantes, sabemos que podemos contar um com o

outro.

Ao CNPq e ao Erasmus Mundus pelo fornecimento das bolsas de doutorado no

Brasil e na Bélgica.

À Universidade Federal de Santa Maria, minha escola, a qual tenho muito orgulho e

ao Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária pela oportunidade oferecida.

Ao Laboratório de Cirurgia Experimental – LACE e ao Laboratório de Ginecologia

Experimental da Katholiek Universiteit Leuven pelas instalações e equipamentos que

possibilitaram a realização deste experimento.

Aos colegas da pós-graduação Maurício da Rosa, Tiago Eilers, Bianca Bertoletti,

Fabíola Dalmolin, Saulo Pinto Filho, Gabrielle Freitas, Rogério Guedes, Graciane Aiello,

Laetícia Trindade e Arícia Sprada pelos momentos agradáveis e pelo compartilhamento de

conhecimento. Foi muito bom poder crescer e aprender com vocês.

Aos estagiários Marcella Teixeira e Diego Tolotti, pela ajuda sempre que precisei.

Às amigas, quase irmãs, Natália Pesset e Cristiani Bolzan por estarem sempre lá nos

momentos mais difíceis e também nos mais importantes!! Muito bom saber que posso sempre

contar com vocês.

Anke Van der Perren and Kim Nijs thanks for all support and friendship. You girls

became much more than friends during these two years. Our talks renew my energy to keep

going and to not give up of getting the results for this thesis. Thanks a lot for the true

friendship. And Anke, thanks for helping with the perfect surgical pictures!

Aos amigos Liliam Beckmann, Claudia Verffel, Cristiano Figueiredo dos Santos,

Raquel Mori, Kauê Danilo Reis, Franciele Walker, Carlos Eduardo Romanini, Juliana Cassoli,

Camila Takeno e Suzana Garcia por tantos momentos agradáveis. Vocês certamente foram

importantes para que eu não desistisse!

Lauran Reyniers, Dragana Vidovic, Amelie Fassbender and Diego Garcia thanks for

sharing your knowledge always I needed and for all pleasant moments we spent together.

A todos os funcionários do Hospital Veterinário, em especial à Nelci, à Liandra e, à

Isabel, que sempre foram amigas cordiais e solícitas.

Agradeço a todos os professores do curso pelos conhecimentos compartilhados.

“Around here, however, we

don’t look backwards for very long. We keep

moving forward, opening up new doors and

doing new things, because we're curious…

and curiosity keeps leading us down new

paths”.

(Walt Disney)

RESUMO

Tese de doutorado



SUPEREXPRESSÃO INDUZIDA DE VEGF E HGF EM CÉLULAS

MESENQUIMAIS ESTROMAIS DERIVADAS LÍQUIDO AMNIÓTICO

NA INIBIÇÃO DA FIBROSE INTERSTICIAL APÓS ISQUEMIA AGUDA

EM RATOS

AUTOR: MARINA GABRIELA MONTEIRO CARVALHO MORI DA CUNHA

ORIENTADOR: NEY LUIS PIPPI

Data e local da defesa: Santa Maria, 17 de Agosto de 2012.

O tratamento eficaz para a lesão renal aguda tem melhorado nos últimos anos, sendo objeto de inúmeras

pesquisas, no entanto a taxa de mortalidade desta patologia ainda permanece elevada. Além disso, pacientes que

sobrevivem após evento isquêmico possuem altos riscos de doença renal crônica progressiva. As células mesenquimais

estromais do líquido amniótico humano (hAFSC) são uma nova fonte alternativa de células-tronco que expressam

marcadores progenitores renais (CD24). A possibilidade da associação das terapias gênica e celular permite a

manipulação dessas para superexpressar o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator de crescimento de

hepatócitos (HGF), dois dos fatores de crescimento mais importantes para a regeneração renal. Diante disso, o objetivo

desse estudo foi avaliar se as hAFSCs transduzidas com VEGF e HGF possuem maior ação nefroprotetora, por meio

de efeito mitótico e anti-inflamatório a curto prazo, levando a uma inibição da fibrose a longo prazo em modelos de

isquemia e reperfusão renal. Na primeira fase do experimento, isolou-se, caracterizou-se as propriedades

imunofenotípicas e a capacidade de diferenciação das hAFSCs e após selecionou-se uma linhagem clonal que

expressasse os marcadores CD24 e CD117. Após essa linhagem foi transduzida com vetores lentivirais (VL)

codificando VEGF e HGF. Na segunda fase, induziu-se lesão de isquemia e reperfusão (I\R) renal pelo clampeamento

do pedículo renal por 50 minutos, em 50 ratos Wistar, machos. O grupos de tratamento foram divididos como (n=10

por grupo): grupo controle, tratado somente com o meio Chang; grupo tratado com hAFSC não transduzidas

(1x106/rato); grupo tratado com hAFSC transduzidas com LV-VEGF (1x10

6/rato); grupo tratado com hAFSC

transduzidas com LV-HGF (1x106/rato) e o grupo tratado tanto com hAFSC transduzidas com LV-VEGF

(0,5x106/rato) quanto LV-HGF (0,5x10

6/rato). A creatinina sérica foi mensurada em 24 horas, 48 horas e 2 meses após

a lesão I\R e as análises histológicas foram realizadas para avaliar os seguintes parâmetros: necrose tubular e formação

de cilíndros hialinos pelas colorações de PAS e H&E em 48 horas e fibrose intersticial pelas colorações Tricrômico de

Masson e Picrosirius Red em 2 meses Adicionalmente, a expressão de KI-67, -SMA e TGF- foram analisadas por

imunoistoquímica em 48 horas. Os resultados permitiram observar um efeito benéfico da terapia com hAFSCs em

lesões de I\R pela melhora mais rápida da função renal e menor índice fibrótico a longo prazo, no entanto obteve-se

um efeito ainda melhor quando associaram-se as hAFSCs. transduzidas com VEGF e HGF comparado com as hAFSC

não transduzidas. Já em 24 h observou-se o efeito renoprotetor nos grupos hAFSC e hAFSC VEGF + HGF pelo valor

significativamente menor da creatinina comparado com o controle. Em 48h todos os grupos ainda apresentavam

valores significativamente elevados de creatinina comparado com os ratos sham, exceto o grupo hAFSC HGF +

VEGF. Observou-se também que os grupos hAFSC VEGF +HGF e hAFSC VEGF tiveram um aumento significativo

na proliferação tubular renal, provavelmente pelo efeito da superexpressão de VEGF. Além disso, observou-se redução

da expressão de α-SMA e TGF-β em 48h nos grupos hAFSCs não-transduzidas, hAFSC VEGF+HGF e hAFSC HGF.

Como o TGF- β1 está envolvido na transdiferenciação de células epiteliais tubulares em miofibroblastos α-SMA-

positivos, o qual aumenta a deposição de matriz extracelular, a redução na expressão de α-SMA e TGF-β são

indicadoras de inibição da fibrose. Apesar de serem descritos diversos benefícios nefroprotetores do VEGF e do HGF

observou-se nesse estudo uma lesão renal mais pronunciada do que o controle nos grupos hAFSC VEGF e hAFSC

HGF, tanto em relação à função renal quanto à necrose tubular, o que sugere um efeito tóxico causado pela alta

concentração de secreção desses fatores de crescimento. A terapia celular utilizando a combinação de hAFSCs

transduzida com vetores lentivirais codificando VEGF e HGF resultou em efeito nefroprotetor ainda maior do que sua

forma não transduzida após evento isquêmico renal, o qual foi caracterizado pelo aumento do índice mitogênico,

melhor função renal e inibição de genes fibrogênicos, levando a um menor índice fibrótico em dois meses.

Palavras-chave: Regeneração renal. Terapia gênica. TGF-β.

ABSTRACT

Doctorate Thesis



AMNIOTIC FLUID-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS

OVEREXPRESSING VEGF OR HGF INHIBIT INTERSTITIAL

FIBROSIS AFTER ISCHEMIC ACUTE RENAL INJURY IN RATS

AUTHOR: MARINA GABRIELA MONTEIRO CARVALHO MORI DA CUNHA

ADVISOR: NEY LUIS PIPPI

Date and place of defense: Santa Maria, August 17th, 2012.

Despite extensive research on an effective treatment for acute renal injury (AKI), the mortality rate still remains

high. Moreover, patients who survive AKI are at high risk for chronic progressive kidney disease. Mesenchymal

stromal cells derived from human amniotic fluid (hAFSCs) are a new source of stem cells which express renal

progenitor markers (CD24). The possibility of combining gene and cell therapy allows stem cells to be manipulated to

overexpress vascular endothelial growth factor (VEGF) and hepatocyte growth factor (HGF), two of the most

important growth factors for kidney regeneration. Therefore, the aim of this study was to evaluate whether hAFSCs

overexpressing VEGF and HGF demonstrate a nephroprotective effect due to their mitogenic and anti-inflammatory

effect, leading to a long term inhibition of fibrosis. In the first phase of this study, we isolated hAFSCs from human

amniotic fluid samples, characterized their immunophenotypic properties and differentiation capacity and selected a

clonal lineage which expresses CD24 and CD117 markers. This lineage was subqequently transduced with lentiviral

vectors (LV) encoding VEGF and HGF. In a second phase, renal ischemia and reperfusion (I\R) injury was induced in

a rat model by clamping the renal pedicle for 50 minutes in 50 male Wistar rats. Treatment groups (n = 10 per group)

were assigned as follows: a control group treated with Chang Medium only; a group which received non-transduced

AFSC (1x106 cells/animal); a group which received AFSC transduced with LV-VEGF (1x10

6 cells/animal); a group

which received AFSC transduced with LV-HGF (1x106 cells/animal); and a group treated with AFSC transduced both

with LV-VEGF (0,5x106 cells/animal) and AFSC transduced with LV-HGF (0,5x10

6 cells/animal). Serum creatinine

was measured at 24 hours, 48 hours and 2 months after I\R injury and histological analysis was performed to analyze

following parameters: tubular necrosis and hyaline cast formation by PAS and H&E staining at 48 hours, and

interstitial fibrosis by Masson’s Trichrome and Picrosirius Red staining at 2 months. Additionally, the expression of

KI-67, α-SMA and TGF-β1 was assessed by immunohistochemistry. The results showed a beneficial effect of AFSCs

delivered to rats with I\R injury, which was characterized by a faster improvement in renal function and a lower

fibrotic index. However, administration of hAFSCs overexpressing VEGF and HGF resulted in an even better outcome

compared to non-transduced AFSCs. As early as 24 hours after AFSC delivery, a nephroprotective effect was observed

after both hAFSC and hAFSC VEGF + HGF treatment, which was characterized by significantly lower creatinine

values compared to those of the control group. At 48 hours, all treatment groups still demonstrated a significant

increase in creatinine values compared to sham animals, except in the hAFSC HGF + VEGF group. In hAFSC HGF +

VEGF and hAFSC VEGF treatment groups, a significant increase in renal tubules proliferation was observed,

measured by an increase in KI-67 expression, which is probably due to the effect of VEGF overexpression.

Furthermore, we observed a decrease in α-SMA and TGF-β expression at 48 hours in the non-transduced hAFSC,

hAFSC HGF and hAFSC VEGF + HGF groups. As TGF-β1 is involved in transdifferentiation of tubular epithelial

cells to α-SMA-positive myofibroblasts which increases extracellular matrix deposition, the reduction in the

expression of α-SMA and TGF-β indicates an inhibition of fibrosis. Although VEGF and HGF have both been

described to have nephroprotective properties, we interestingly observed that the hAFSC expressing both VEGF and

HGF resulted in more pronounced kidney damage compared to non-treated animals when treated with 1x106

cells/animal, which suggests that toxic side effects are possibly induced by high secretion levels of growth factors. In

conclusion, cellular therapy using the combination of hAFSCs transduced with lentiviral vectors encoding VEGF and

HGF, resulted in a stronger nephroprotective effect than non-transduced hAFSC delivered to rats with I/R injury,

which was characterized by an increased mitosis index, an improved renal function and an inhibition of genes involved

in fibrosis resulting in a lower fibrotic index at two months.

Key words: Renal regeneration.Gene therapy. TGF- β.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Figura representativa do isolamento mecânico das colônias de células

mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico

humano.........................................................................................................

35

Figura 2- Construções dos plasmídeos usados expressando eGFP, VEGF e HGF,

tendo como gene de seleção a forma truncada CD34 e tendo como

promotor o SFFV. Sendo LTR, long terminal repeat; RRE, rev response

element e IRES, internalribosome entry site................................................

40

Figura 3- As células estromais mesenquimais do líquido amniótico derivadas da

Imunoseleção para c-Kit: CD117 positivas (A) e (B) e CD 117 negativas

(C) e (D).......................................................................................................

44

Figura 4- Aparência das colônias formadas após plaqueamento do líquido

amniótico e em fase de realização da seleção mecânica: colônia em fase

inicial (A) e colônias em fase de transferência para a placa de 96 poços

(B, C, D).......................................................................................................

45

Figura 5- Exemplo de diferentes populações de hAFSC selecionadas

mecanicamente em passagem 4 de cultura. (100 e

200X)..........................................................................................................

46

Figura 6- Curva de sobrevivência dos clones das hAFSCs. A idade gestacional foi

descrita em semanas....................................................................................

46

Figura 7- Imunofenotipagem analisados por citometria de fluxo nos 79 clones de

células estromais mesenquimais do líquido amniótico isolados

mecanicamente de amostras de amniocentese.............................................

48

Figura 8- Análise de citometria de fluxo para avaliar o volume celular e a

complexidade interna das células das amostras isoladas por imunoseleção

(A) e mecanicamente (B).............................................................................

49

Figura 9- Coloração de Oil redO para detectar diferenciação adipogênica nas

células estromais mesenquimais do líquido amniótico derivadas de

diferentes semanas de gestação...................................................................

50

Figura 10- Coloração de Vermelho de Alizarina para detectar diferenciação

osteogênica nas células estromais mesenquimais do líquido amniótico

derivadas de diferentes semanas de gestação.............................................

50

Figura 11- Coloração de Azul Alciano para detectar diferenciação condrogênica nas

células estromais mesenquimais do líquido amniótico derivadas de

diferentes semanas de gestação...................................................................

50

Figura 12- Extração de corante Alizarina red nas amostras de células estromais

mesenquimais do líquido amniótico de diferentes semanas de gestação,

induzidas à diferenciação osteogênica.........................................................

51

Figura 13- Extração de corante Azul de Alcian nas amostras de células estromais

mesenquimais do líquido amniótico de diferentes semanas de gestação,

induzidas à diferenciação condrogênica......................................................

51

Figura 14- Expressão de Oct-4 nas células mesenquimais estromais do líquido

amniótico humano de diferentes semanas de gestação. Células endoteliais

da veia umbilical humana (HUVEC) e células troinco embrionárias

humanas (hESC) foram utilizados como controle negativo e positivo,

respectivamente............................................................................................

52

Figura 15- Força relativa dos promotores CMV, SFFV, CypA e CBA estão

representadas pela intensidade média de fluorescência de vetores

expressando eGFP…………………………………………………………

53

Figura 16- Coloração de X-Gal para detectar a atividade de β-Galactosidase em

células mesenquimais estromais do líquido amniótico humano

transduzidas com vetor lentiviral expressando o gene reporter Lac-Z…….

54

Figura 17- Expressão de GFP em células mesenquimais estromais do líquido

amniótico humano transduzidas com vetor lentiviral expressando o gene

reporter eGFP...............................................................................................

55

Figura 18- Confirmação da superexpressão dos genes VEGF (A) e HGF (B) pela

análise de PCR em tempo real das células mesenquimais estromais do

líquido amniótico humano transduzidas......................................................

56

Figura 19- Expressão protéica de VEGF nas células mesenquimais estromais do

líquido amniótico humano não transduzidas e transduzidas com VEGF….

56

Figura 20- Imunofluorescência para detectar a expressão de VEGF nas células

mesenquimais estromais do líquido amniótico humano não transduzidas

(hAFSC) (A) e transduzidas com VEGF-tCD34 (B) e de HGF nas hAFSC

não transduzidas (C) e transduzidas com HGF-tCD34 O núcleo foi

contracorado com Hoechst............................................................................

57

Figura 21- Citometria de fluxo para CD117, CD24, CD90, CD73, HLA-ABC, CD44,

CD29, CD105, HLA-DR, CD 34 e CD 45 das células mesenquimais

estromais do líquido amniótico humano transduzidas com

HGF..............................................................................................................

58

Figura 22- Citometria de fluxo para CD117, CD24, CD90, CD73, HLA-ABC,

CD44, CD29, CD105, HLA-DR, CD 34 e CD 45 das células

mesenquimais estromais do líquido amniótico humano transduzidas com

VEGF..........................................................................................................

59

Figura 23- Análise de citometria de fluxo para avaliar o volume celular e a

complexidade interna das células mesenquimais estromais do líquido

amniótico humano (A) e após transdução com VEGF (B) e HGF (C)……

60

Figura 24- Diferenciação das células mesenquimais estromais do líquido amniótico

humano transduzidas com VEGF e HGF em linhagens adipogênicas,

osteogênicas e condrogênicas.......................................................................

60

Figura 25- Extração de corante vermelho de alizarina nas amostras das células

mesenquimais estromais do líquido amniótico humano transduzidas com

VEGF e HGF, induzidas à diferenciação osteogênica.................................

61

Figura 26- Extração de corante azul alciano nas amostras das células mesenquimais

estromais do líquido amniótico humano transduzidas com VEGF e HGF e

nas células tronco embrionárias, induzidas à diferenciação condrogênica..

61

Figura 27- Aspecto do rim após colocação do clampe vascular atraumático buldogue

no pedículo renal. Obervar a coloração vermelho-acastanhada antes da

colocação do clampe (A) e a evidência de isquemia o seu escurecimento

após a colocação do clampe (B)..................................................................

73

Figura 28- Passos para o acesso à arterial renal. Dissecação da aorta abdominal

caudalmente à artéria renal, indicada pela seta branca (A), colocação de

reparo ao redor da aorta abdominal (B), posicionamento do clample

vascular buldogue cerca de 1 cm caudal aos pedículos renais, logo acima

das artérias genitais (C) e colocação do clampe no pedículo renal direito,

etapa necessária apenas no grupo B............................................................

75

Figura 29- Esquema da cirurgia de acesso à artéria renal realizado no grupo B.

Colocação dos clampes na artéria aorta abdominal, caudalmente às

artérias renais e no pedículo renal esquerdo (A); localização da inserção

do cateter 26G. ligeiramente cranial ao clampe buldogue para

administração de metade da tinta naquim (B) e transferência do clampe do

pedículo esquerdo para o direito com o intuito de permitir a administração

da outra metade da tinta nanquim………………….....................................

75

Figura 30- Ângulo de inserção do cateter na aorta abdominal para acesso da artéria

renal..............................................................................................................

76

Figura 31- Aspecto dos rins direito (preto) e esquerdo vermelho-acastanhado),

imediatamente após a administração de nanquim em um tempo ................

81

Figura 32- Rim direito (A) e esquerdo (B) corados por Hematoxilina & Eosina no

grupo em que se administrou nanquim (A) em apenas um tempo e sem a

colocação de clampe na artéria renal

(Magnificação100x).....................................................................................

82

Figura 33- Amostras de criosecção coradas com solução X-gal. Baço (A) e pulmão

(B) de rato, 24h após a administração de hAFSC marcada com Lac-z

(magnificação 200x).....................................................................................

82

Figura 34- Curva de sobrevida dos animais dos diferentes grupos de ratos com lesão

de isquemia e reperfusão tratados com células mesenquimais estromais

derivadas do líquido amniótico humano transduzida ou não com VEGF e

HGF………………………………………………………………………...

83

Figura 35- Gráficos com valores de VEGF sérico de ratos com lesão de isquemia e

reperfusão após 24 h do tratamento com células mesenquimais estromais

derivadas do líquido amniótico humano transduzidos ou não com VEGF e

HGF.............................................................................................................

84

Figura 36- Fotos representativas da histologia renal 48 horas após indução de

isquemia e reperfusão por 50 minutos em ratos. Cortes histológicos

corados por H & E, objetiva de 10X: sham (ratos operados, sem indução

de lesão e sem tratamento; controle, ratos com I/R tratados com meio de

cultivo; hAFSC, ratos com I/R tratados com células mesenquimais

estromais derivadas do líquido amniótico humanas (hAFSC); hAFSC

VEGF + HGF, ratos com I/R tratados com hAFSC transduzidas com

VEGF e HGF; hAFSC VEGF, ratos com I/R tratados com hAFSC

transduzidas com VEGF e hAFSC HGF, ratos com I/R tratados com

hAFSC transduzidas com HGF (n=5 por grupo).........................................

86

Figura 37- Fotos representativas da histologia renal 48 horas após indução de


corados por ácido periódico de Schiff (PAS), objetiva de 10X: sham (ratos

operados, sem indução de lesão e sem tratamento; controle, ratos com I/R

tratados com meio de cultivo; hAFSC, ratos com I/R tratados com células

mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico humanas

(hAFSC); hAFSC VEGF + HGF, ratos com I/R tratados com hAFSC

transduzidas com VEGF e HGF; hAFSC VEGF, ratos com I/R tratados

com hAFSC transduzidas com VEGF e hAFSC HGF, ratos com I/R

tratados com hAFSC transduzidas com HGF(n=5 por grupo)..............

87

Figura 38- Fotos representativas de cortes histológicos de rins de ratos após indução

de lesão de isquemia e reperfusão por 50 mintuos corados pela técnica de

imuno-histoquímica para α-SMA sendo observada a positividade em

marrom e utilizando-se objetiva de 20X: sham (ratos operados, sem

indução de lesão e sem tratamento; controle, ratos com I/R tratados com

meio de cultivo; hAFSC, ratos com I/R tratados com células

mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico humanas

(hAFSC); hAFSC VEGF + HGF, ratos com I/R tratados com hAFSC

transduzidas com VEGF e HGF; hAFSC VEGF, ratos com I/R tratados

com hAFSC transduzidas com VEGF e hAFSC HGF, ratos com I/R

tratados com hAFSC transduzidas com HGF (n=5 por grupo)...................

89

Figura 39- Fotos representativas de cortes histológicos de rins de ratos após indução

de lesão de isquemia e reperfusão (I/R) por 50 minutos corados pela

técnica de imuno-histoquímica para TGF-β, sendo observada a

positividade em marrom eutilizando objetiva de 20X: sham (ratos

operados, sem indução de lesão); controle, ratos tratados com meio de

cultivo; hAFSC, ratos tratados com células mesenquimais estromais

derivadas do líquido amniótico humano (hAFSC); hAFSC VEGF + HGF,

ratos tratados com hAFSC transduzidas com VEGF e HGF; hAFSC

VEGF, ratos tratados com hAFSC transduzidas com VEGF e hAFSC

HGF, ratos tratados com hAFSC transduzidas com HGF (n=5 por grupo)..

90

Figura 40- Imuno-histoquímica para KI-67 de tecido renal, região cortical, de um

rato após 48 h de indução da lesão de isquemia e reperfusão, tratado com

células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico humano

(20X).............................................................................................................

91

Figura 41- Análise do indíce mitogênico avaliado por morfometria das lâminas

coradas por imuno-histoquímica para KI-67. Gráfico indica núcleos

positivos por campo de grande aumento nos diferentes grupos analisados.

*** indica diferença significativa p<0,0001.................................................

91

Figura 42- Fotos representativas da histologia renal 2 meses após indução de


corados por Tricrômico de Masson, evidenciando o colágeno tipo I em

azul utilizando objetiva de 20X: sham (ratos operados, sem indução de

lesão); controle, ratos tratados com meio de cultivo; hAFSC, ratos

tratados com células mesenquimais estromais derivadas do líquido

amniótico humano (hAFSC); hAFSC VEGF + HGF, ratos tratados com

hAFSC transduzidas com VEGF e HGF; hAFSC VEGF, ratos tratados

com hAFSC transduzidas com VEGF e hAFSC HGF, ratos tratados com

hAFSC transduzidas com HGF (n=5 por grupo)..........................................

93

Figura 43- Fotos representativas da histologia renal 2 meses após indução de


corados por Picrosirius red. Foto capturada com luz polarizada e objetiva

de 10X: sham (ratos operados, sem indução de lesão); controle, ratos

tratados com meio de cultivo; hAFSC, ratos tratados com células

mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico humano

(hAFSC); hAFSC VEGF + HGF, ratos tratados com hAFSC transduzidas

com VEGF e HGF; hAFSC VEGF, ratos tratados com hAFSC

transduzidas com VEGF e hAFSC HGF, ratos tratados com hAFSC

transduzidas com HGF (n=5 por grupo).......................................................

94

Figura 44- Análise da fibrose renal avaliada por morfometria das lâminas coradas

pelo tricrômico de Masson. Gráfico indica porcentagem da área positiva

por campo de grande aumento nos diferentes grupos analisados.* indica

diferença comparado ao grupo hAFSC VEGF. *** indica diferença

significativa p<0,0001 quando comparado com todos os outros grupos.

ANOVA , pos teste Tukey............................................................................

95

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Anticorpos monoclonais usados nas células cultivadas para realização

de imunofenotipagem.............................................................................

36

Tabela 2- Primers usados para o sequenciamento de HGF e VEGF..................... 40

Tabela 3 Imunofenotipagem das células mesenquimais estromais do líquido

amniótico humano transduzidas em diferentes tempos em cultura........

55

Tabela 4 Estudos já realizados relacionados a lesão renal e tratados com

terapia celular...........................................................................................................

68

Tabela 5- Valores séricos de creatinina em ratos com lesão de isquemia e

reperfusão, nos tempos 24 h, 48 h e dois meses, tratados com células

estromais mesenquimais do líquido amniótico transduzidos ou não

com VEGF e HGF.................................................................................

83

Tabela 6- Peso dos rins de ratos submetidos à lesão de isquemia e reperfusão e

tratados com células mesenquimais estromais derivadas do líquido

amniótico humano (hAFSC) transduzidas ou não com VEGF e HGF.

Valores expressos em gramas (g), com respectivas médias e desvio

padrão. Kruskal wallis seguido de pós teste de Dunn............................

84

Tabela 7- Média e desvio padrão dos escores de lesão tubular aguda em cortes

histológicos de ratos corados por Hematoxilina & Eosina nos

diferentes grupos após 48 horas de lesão renal isquêmica tratados

com células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico

humano (hAFSC) transduzidas ou não com VEGF e HGF. * AFSC

difere do controle (p< 0,05)…………………………………………..

85

Tabela 8- Média e desvio padrão dos escores de lesão tubular aguda em cortes

histológicos de ratos corados por H&E nos diferentes grupos após 48

horas de lesão renal isquêmica tratados com células mesenquimais

estromais derivadas do líquido amniótico humano (hAFSC)

transduzidas ou não com VEGF e HGF. *difere do sham(p< 0,05).

Kruskal Wallis pós teste Dunns………………………………………

92

LISTA DE REDUÇÕES

α-SMA- alfa smooth muscle actin ou actina de músculo liso alfa

AFSC- Amniotic Fluid derived mesenchymal stromal cells ou Células mesenquimais

estromais derivadas do líquido amniótico

CT – Células-tronco

CTA- Células-tronco do adulto

DRA- Doença renal crônica

ELISA- Enzyme-linked immunosorbent assay

eGFP- enhanced green fluorescent protein ou proteína verde fluorescente

ESC- Embryonic Stem Cell ou Células tronco embrionárias

HGF- Hepatocyte growth factor ou fator de crescimento de hepatócitos.

IA- Intrarterial

IP- intraperitoneal

IRES- Internal ribosome entry site

IV- intravenoso

IPSC- induced pluripotent stem cell ou Células tronco pluripotentes induzidas

LRA- Lesão renal aguda

LTR- Long terminal repeat

MSC- Mesenchymal stromal cells ou células mesenquimais estromais

RRE- Rev. Response element

TGF-β- Transforming growth factor- beta ou fator de crescimento transformador-beta

VEGF- Vascular endothelial growth factor ou fator de crescimento endotelial vascular

VL- Vetores lentivirais

LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1 Sequenciamento do plasmídeo codificandoVEGF ………. 125

ANEXO 2 Sequenciamento do plasmídeo codificando HGF .............. 126

ANEXO 3 Escores de lesão avaliados em cortes histológicos renais

corados por H&E após 48 horas de isquemia e reperfusão

renal………………………………………………………

127

ANEXO 4 Imagem da análise morfométrica para quantificação de

células positivas para KI-67. Observar que as células já

contadas ficam marcadas para que não seja duplamente

quantificada……………………………………………….

128

ANEXO 5 Escores de lesão avaliados em cortes histológicos renais

corados por H&E após dois meses de lesão por isquemia

e reperfusão renal…………………………………………

129

ANEXO 6 Imagem da análise morfométrica para Tricrômico de

Massom. Mensuração da área de fibrose…………………

130

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA............................................................................................... V

AGRADECIMENTOS..................................................................................... VI

EPÍGRAFE....................................................................................................... VIII

RESUMO......................................................................................................... IX

ABSTRACT..................................................................................................... X

LISTA DE FIGURAS...................................................................................... XI

LISTA DE TABELAS..................................................................................... XVI

LISTA DE REDUÇÕES.................................................................................. XVII

LISTA DE ANEXOS....................................................................................... XVIII

1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 21

2. CAPÍTULO 1............................................................................................... 25

Revisão Bibliográfica....................................................................................... 25

Material e Métodos.......................................................................................... 34

1. Isolamento das células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico ........ 34

2. Caracterização das células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico.... 36

3. Manipulação das células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico ..... 39

4. Caracterização e avaliação da eficiência da transdução das células manipuladas......... 40

5. Estatística......................................................................................................................... 43

Resultados........................................................................................................ 44

3. CAPÍTULO 2.............................................................................................. 62

Revisão Bibliográfica....................................................................................... 62

Material e Métodos.......................................................................................... 73

1. Modelo de isquemia e reperfusão renal.......................................................................... 73

2. Técnica cirúrgica de acesso renal.................................................................................... 74

3. Transplante de hAFSC transduzida com Lac-z................................................................ 76

4. Indução da lesão e transplante celular............................................................................. 76

5. Análises do efeito da terapia celular................................................................................ 77

6. Estatística......................................................................................................................... 80

Resultados........................................................................................................ 81

4. DISCUSSÃO................................................................................................ 96

5.CONCLUSÃO............................................................................................. 107

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................... 108

7. ANEXOS...................................................................................................... 125

21

1. INTRODUÇÃO

A lesão renal aguda (LRA) é a diminuição súbita da função renal caracterizada pela

inabilidade de regular os fluidos, eletrólitos e equilíbrio ácido-base. A IRA é causada devido a

um insulto isquêmico ou tóxico ao rim e é potencialmente reversível, no entanto,

frequentemente leva à falência múltipla dos órgãos (MORIGI et al., 2004; TÖGEL et al.,

2005). A taxa de mortalidade em humanos é de 50% (BRADY et al., 1991; LANE, et al.,

1994), apesar da realização de hemodiálise e em cães e gatos essa taxa é de 60% (VADE et

al., 1997) e de 47% (WORWAG & LANGSTON, 2008), respectivamente.

A incidência de insuficiência renal aguda e crônica está aumentando em todo o mundo

(PORT et al., 2000, XUE ET AL., 2006, HSU ET AL., 2007). Dessa forma, necessita-se de

uma nova estratégia terapêutica para um tratamento mais efetivo para evitar a fibrose e o

desenvolvimento de doença renal crônica.

A medicina regenerativa é um campo interdisciplinar amplo que tem como principal

objetivo a reconstrução, o reparo ou a reposição de tecido ausente ou lesionado com o intuito

de restaurar a função e arquitetura do órgão ou tecido alvo. O cirurgião possui um papel

fundamental na medicina regenerativa, já que a patologia cirúrgica está frequentemente

presente com uma necessidade urgente de regeneração de órgãos e tecidos.

A terapia celular é uma estratégia terapêutica médica que introduz novas células em

tecidos lesionados com o intuito de tratar uma doença ou lesão. Atualmente numerosos

centros de pesquisa investigam o potencial da terapia com células-tronco para mudar e

melhorar o tratamento clínico atual de diversas doenças em humanos e animais. A habilidade

das células-tronco de se autorrenovarem e possuirem graus variados de capacidade de

diferenciação levam a inúmeras possibilidades de exploração com o intuito terapêutico. Elas

podem ser usadas tanto para a geração de tecidos com a finalidade de repor tecidos doentes ou

lesionados como para modular a progressão de doenças, tais como as autoimunes ou

inflamatórias (NAUTA et al., 2007).

Avanços na terapia com células-tronco (CT) estão progredindo rapidamente e vêm

provendo a associação da terapia gênica, com alta tecnologia para a introdução de genes

recombinantes em diferentes tecidos. A terapia gênica oferece uma estratégia atraente para

entrega direta de genes de fatores de crescimento para as células com a intenção de alterar a

síntese de proteínas no aparelho celular, modificando a resposta de cura (TAUB et al., 1998).

Pelo fato de as células-tronco do adulto (CTA) ter um potencial de regeneração limitada a sua

22

utilização para a terapia gênica e celular torna-se restrita.

As células-tronco embrionárias (ESC) são a população de células-tronco mais plásticas

e possuem capacidade de autorrenovação indefinida e seriam interessantes para a manipulação

genética, no entanto três fatores importantes limitam sua aplicação clínica (JUNG, 2009): em

primeiro lugar, o debate ético visto que em alguns países não é permitido gerar ou até mesmo

trabalhar com linhagens de ESC humanas. Em segundo lugar, ESCs pluripotentes podem

induzir a formação de teratoma após o transplante. Em terceiro lugar, ESCs podem provocar

reações imunológicas após o transplante (BIEBACK & BRINKMAN, 2010). Da mesma

forma, as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ainda apresentam limitações em

relação à sua aplicabilidade clínica por causa de seu potencial teratogênico (TAKAHASHI

&YAMANAKA, 2006).

O tecido mais frequentemente analisado é o da medula óssea. No entanto, a aspiração

do sangue de medula óssea é um procedimento altamente invasivo e obtêm-se apenas um

número baixo de células por punção, cerca de 1-10 células mesenquimais estromais (MSC) a

cada 10.000 células monolucleares (GRONTHOS et al., 2003). Além disso, tem sido

obervado que a capacidade de diferenciação e a longevidade das MSCs declinam com a idade

(STENDERUP et al., 2003; BIEBACK et al., 2008). Portanto, tem sido considerada

necessária a pesquisa de fontes alternativas de MSCs, especialmente em alguns casos

refratários e complicados.

O líquido amniótico tem sido usado por décadas como uma fonte consistente de

diagnóstico pré-natal, no entanto, estudos recentes têm fornecido dicas importantes sobre o

potencial das células mesenquimais estromais do líquido amniótico (AFSC) para se tornar

uma importante fonte alternativa de células-tronco (MITKA, 2001; KAVIANI et al., 2001;

PRUSA et al., 2003; PRUSA et al., 2004). A combinação de ter uma idade cronológica jovem

que minimiza a viabilidade de mutações incorporadas (BIEBACK & BRINKMAN, 2010) e

ser extraembrionário, proporcionando um acesso relativamente fácil para colheita de células

faz do fluido amniótico uma importante fonte alternativa de células-tronco fetais (PRUSA et

al., 2003; FAUZA, 2004; DE COPPI et al., 2007). Uma vez que a maioria do líquido

amniótico é derivada da urina fetal, é razoável assumir que as células progenitoras renais são

um constituinte desse líquido (DA SACCO, 2010). As AFSCs isoladas são boas candidatas

para aplicações de terapia celular, superando assim os problemas éticos relacionados com

outras fontes de células-tronco fetais. Vários estudos pré-clínicos e clínicos demonstraram a

eficácia das células mesenquimais estromais modificadas geneticamente para expressar e

23

secretar fatores terapêuticos, confirmando a sua capacidade de servir como uma excelente

base para terapia gênica mediada por células (Yu et al., 2008; CHEN et al., 2011; YUAN, et

al., 2011).

Em ESCs derivadas de corpos embrióides, podem-se detectar células epiteliais

tubulares e podócitos por meio de marcadores específicos (KRAMER et al., 2006). As ESC

são incorporadas em células epiteliais tubulares com quase 100% de eficiência, quando

injetadas em um metanéfron em desenvolvimento (KIM & DRESSLER, 2005). Portanto, as

ESC seriam uma das melhores fontes de células para a reparação renal e representariam uma

ferramenta poderosa para tais abordagens. Por outro lado, o seu uso para terapias renais é

restringida devido ao risco de desenvolvimento de tumores malignos (THOMSON et al.,

1998) e pela rejeição imunológica após o transplante.

Vários tipos de células progenitoras têm sido isoladas a partir de rins de adultos. Essas

células apresentam a expressão de marcadores tais como CD133, CD24, Sca-1 ou Lin e são

localizadas nos túbulos renais, no interstício da papila renal ou no pólo urinário da cápsula de

Bowman (PERIN et al., 2007). Algumas linhagens clonais de AFSCs são CD 24 positivos,

dessa forma o líquido amniótico parece uma nova fonte promissora de células-tronco para o

tratamento de lesões renais.

É importante notar que, após o transplante, apenas uma pequena quantidade de

células-tronco integram no parênquima renal. Isso levou à suposição de que os efeitos

protetores das células-tronco na reparação renal são mediadas pela estimulação parácrina /

endócrina (TOGEL et al., 2005; BI et al., 2007; PERIN et al., 2007). BI et al. (2007),

IMBERTI et al. (2007) e TOGEL et al. (2007) sugeriram que a função protetora renal ocorre

devido à secreção dos fatores de crescimento de insulina-I (IGF-I), factor de crescimento de

hepatócitos (HGF), factor de crescimento vascular endotelial (VEGF), e fator de crescimento

epidérmico (EGF). Além disso, acreditando-se em uma ação parácrina, a liberação de

microvesículas e de transferência de informação genética pode ser responsável pelo efeito

benéfico das MSCs na recuperação da lesão renal aguda experimental (BRUNO et al., 2009).

Dessa forma, a manipulação genética das células tronco para superexpressar esses fatores de

crescimento seria interessante para que houvesse um efeito ainda melhor do que as células

tronco não modificada.

O objetivo desse estudo foi avaliar se o transplante celular com células mesenquimais

estromais derivadas do líquido amniótico transduzidas com VEGF e HGF possuem maior

efeito renoprotetor a curto prazo, por meio de efeito mitótico e antiapoptótico e efeito

24

antifibrótico a longo prazo.

Essa tese foi dividida em dois capítulos de acordo com as duas principais fases

experimentais para realizá-la. No primeiro capítulo está descrita a forma como foram isoladas,

caracterizadas e manipuladas geneticamente as células-tronco derivadas do líquido amniótico.

No capítulo dois discorre-se sobre as técnicas cirúrgicas utilizadas para esse estudo: o modelo

de isquemia e a técnica de acesso à artéria renal e sobre o transplante das células-tronco

derivadas do líquido amniótico transduzidas ou não com VEGF e\ou HGF em modelos de

isquemia e reperfusão renal em ratos.

25

2. CAPÍTULO 1

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Células-tronco

As células-tronco (CTs) têm o potencial de se desenvolverem em diferentes tipos

celulares do corpo durante o início da vida e o crescimento (WEISSMAN et al., 2001). Além

disso, elas servem como reparo do sistema interno de muitos tecidos, entrando em mitose

quando estimuladas para repor o tipo celular necessário durante toda a vida do indivíduo.

As CTs podem ser distinguidas de outros tipos celulares por duas características

importantes. Primeiro, elas são células indiferenciadas capazes de se autorrenovarem por meio

de divisão celular. Segundo, sob certas condições fisiológicas ou experimentais, elas podem

ser induzidas a se tornar células órgão- ou tecido-específicas com funções especiais. Em

alguns órgãos que apresentam uma elevada renovação celular, incluindo o sistema

hematopoiético, intestino e pele, as células-tronco se dividem quase que constantemente para

suprir progenitores para novas células somáticas. Outros órgãos tais como os rins e os

pulmões, possuem uma taxa de renovação celular bem menor, mas essas células são capazes

de proliferar e reparar sob estímulos, quando em lesão (BONVENTRE, 2003).

Até recentemente, pesquisadores primariamente trabalhavam com dois tipos de CT:

células-tronco embrionárias (ESC) e CT do adulto (CTA). O trabalho pioneiro em CT foi

realizado em camundongo. O estudo de sua biologia na espécie murina conduziu a um método

para derivar as células-tronco a partir de embriões humanos, referido como células -tronco

embrionárias (hESC). Como os embriões usados nesses estudos foram embriões redundantes

oriundos de procedimentos de fertilização in vitro, a criação e utilização de hESC provocou

um grande debate ético. O segundo tipo de CT utilizado na pesquisa é a CTA. Acredita-se que

este tipo celular é indiferenciado e pode ser encontrado entre as células diferenciadas em um

tecido ou órgão.

Tipicamente, há um número muito pequeno de células-tronco em cada tecido e uma

vez removidas do corpo, sua capacidade de dividir é limitada, tornando a geração de grandes

quantidades de CT difícil. À procura de uma alternativa, pesquisas recentes elucidaram as

condições que permitem algumas células adultas especializadas a serem reprogramadas

geneticamente para assumir uma células com características tronco. Esse novo tipo de CT é

chamado de célula-tronco pluripotente induzida (iPSC).

26

Fontes de células-tronco

A plasticidade ou o potencial de diferenciação das células-tronco pode ser

classificados como totipotentes, pluripotentes, multipotentes e unipotentes.

A totipotência é a habilidade de uma única célula se dividir e produzir todos os tipos

de células diferenciadas do organismo, incluindo tecidos extra-embrionários. O

desenvolvimento dos mamíferos começam quando um espermatozóide fertiliza um óvulo e

cria uma única célula totipotente (zigoto). Nas primeiras horas após a fertilização, esta célula

se divide em células totipotentes idênticas, que mais tarde podem desenvolver-se em qualquer

uma das três camadas germinativas de um ser humano (endoderme, mesoderme ou

ectoderme) e em células da camada citotrofoblásticas ou da camada sinciciotrofoblástica da

placenta. Depois de atingir o estágio de 16-células, as células totipotentes da mórula

diferenciam em células que irão eventualmente tornar-se blastocisto de massa celular interna

ou o trofoblasto exterior. Aproximadamente quatro dias após a fertilização e após vários ciclos

de divisão celular, estas células totipotentes começam a se especializar.

As CT pluripotentes podem ser derivadas da massa interna celular antes da

implantação do embrião ou isoladas de um conjunto de células fetais primordiais, acima da

alantóide (THOMSON et al., 1998; ANDREWS et al., 2005). Apesar de um trabalho recente

ter mostrado que as ESC podem derivar de um único blastômero isolado usando

procedimento similar ao usado rotineiramente para o diganóstico genético de pre-implantação

(KLIMANSKAYA et al., 2007), a destruição de um blastocisto ou um embrião necessário para

o seu isolamento ainda levanta questões éticas (LO & PARHAM 2009). As células-tronco

multipotentes podem se diferenciar em diversos tipos celulares, no entanto essa diferenciação

é limitada a apenas uma camada germinativa.

As CTAs podem ser encontradas em quase todos os tecidos e têm sido extensivamente

caracterizadas pelo seu potencial terapêutico. Elas podem ser multipotentes (por exemplo, as

células-tronco hematopoiéticas e as células mesenquimais estromais) ou unipotentes (células

progenitoras, por exemplo).

As CT hematopoiéticas são capazes de dar origem a todos os tipos de células

sanguíneas: glóbulos vermelhos, linfócitos B e T, células NK, neutrófilos, eosinófilos,

basófilos, monócitos e mastócitos. As CTAs foram identificadas em vários órgãos e tecidos.

Acredita-se que elas residam em uma área específica de cada tecido (chamado de "nicho de

células-tronco"). As CTs podem permanecer quiescentes (sem divisão) durante longos

períodos até que são ativadas por uma necessidade fisiológica de manutenção tecidual, ou por

alguma alteração patológica, devido a alguma doença ou lesão tecidual.

27

FRIEDENSTEIN et al. (1976) inicialmente isolaram as CTsoriundas da medula óssea

pela sua capacidade de adesão ao plástico de placas de Petri e demonstraram que essas células

cresciam em colônias com morfologia fibroblástica, denominadas unidades formadoras de

colônia de fibroblasto ou células estromais medulares. Atualmente, elas são denominadas

como "células-tronco mesenquimais" ou "células mesenquimais estromais " (MSC) com base

na sua propriedade de se diferenciar em uma variedade de tecidos mesodérmicos, tais como o

osso, a cartilagem e o tecido adiposo. Além da medula óssea, as MSCs foram também

encontradas em quase todos os órgãos e tecidos pós-natais, incluindo o tecido adiposo (ZUK

et al., 2002), periósteo (DE BARI et al., 2001), membrana sinovial, líquido sinovial (DE

BARI et al., 2001a), músculo (ASAKURA et al, 2001), derme, dentes decíduos, pericitos,

osso trabecular, gordura infrapatelar, cartilagem articular, e sangue de cordão umbilical

(BIANCO et al, 2008; REBELATTO et al., 2008). As MSCs têm demonstrado grande

potencial para uso clínico, devido ao seu isolamento conveniente, a sua baixa

imunogenicidade, que permite o transplante alogênico sem drogas imunossupressoras; a falta

de controvérsia ética, e ao seu potencial de se diferenciar em tipos de células de tecidos

específicos (TOMA et al., 2002) ) com a atividade trófica (NAUTA & FIBBE, 2007; OH et

al., 2008; ANKRUM & KARP, 2010). Além disso, há evidências crescentes de que as MSCs

possuem potencial imunomodulador e propriedades anti-inflamatórias (DA SILVA

MEIRELLES et al., 2008).

Embora diversos marcadores fenotípicos têm sido mostrados para ser expressos em

MSCs, ainda não existem marcadores específicos únicos que possam ser utilizados para

assegurar a sua homogeneidade. Como parte dos critérios mínimos, as MSCs humanas devem

ter: (i) capacidade de adesão ao plástico, (ii) a expressão das moléculas de superfície CD73,

CD90, e CD105 e ausência de expressão de CD14, CD19, CD31, CD34, CD45, e HLA-DR ,

(iii) a capacidade de diferenciação mesodérmica em osteoblastos, condrócitos, e adipócitos,

sob condições de diferenciação padrão in vitro.

Células-tronco humanas derivadas do liquido amniótico

Em humanos, o líquido amniótico aparece no início da segunda semana de gestação

como uma película pequena de líquido entre as células do epiblasto. O fluido expande e

separa o epiblasto do amnioblasto, formando assim a cavidade amniótica (MIKI & STROM,

2006).

A origem das células do líquido amniótico ainda é muito discutível. A maioria das

células presentes são terminalmente diferenciadas e têm limitada capacidade proliferativa

28

(GOSDEN & BROCK, 1978; SIEGEL et al., 2007), no entanto alguns estudos demonstraram

a presença de um subconjunto de células com um potencial proliferativo e de diferenciação

(TORICELLI et al, 1993;. STREUBEL et al, 1996).

Durante a gravidez o líquido amniótico contém principalmente células fetais e

possivelmente células da placenta. Acredita-se que o mecanismo responsável pela produção e

renovação do líquido amniótico influencie o tipo celular presente na cavidade amniótica. Na

primeira metade da gestação, a maior parte do líquido amniótico é o resultado do transporte

ativo de sódio e cloreto oriundos da membrana amniótica e pele fetal, devido ao movimento

passivo concomitante de água (BRACE, 1999). Na segunda metade da gestação o fluido vem

da micção fetal. Uma fonte adicional importante de líquido amniótico é a secreção a partir do

trato respiratório (OLVER & STRANG, 1974; MESCHER et al., 1975). A deglutição fetal e

excreção do trato gastrointestinal, enquanto que não volumosa, também desempenham um

papel na composição do fluido amniótico (MULLER et al., 1994). Como resultado da

dinâmica de fluidos, as células presentes nas vias urinárias, respiratórias e gastrointestinal

podem ser expelidas para dentro da cavidade amniótica (BURGHARD et al., 1987; MULLER

et al., 1994). Todas estas variáveis que desempenham um papel na composição do fluido

amniótico parecem contribuir para o perfil variável do componente celular do fluido

amniótico.

Diferentes metodologias foram usadas para gerar linhagens de células clonais de

hAFSC de população celular heterogênea. O método de imunoseleção para c-kit (receptor

para o fator de células-tronco) foi demonstrado por DE COPPI et al., (2007). Essas células

representaram cerca de um por cento das células presentes no líquido amniótico do segundo

trimestre. Essas células foram denominadas células-tronco do líquido amniótico (AFSC). Eles

podem ser cultivadas sem a presença de feeders, duplicam em 36 horas e possum telômeros

longos, mantêm seu estado indiferenciado e de pluripotência, possuem clonogenicidade e

estabilidade genômica. Sendo esta última confirmada por cariótipo de série por mais de 250

ou 350 duplicações (DE COPPI et al., 2007; DA SACCO et al., 2010) ou mais de 20

passagens em cultura (ROUBELAKIS et al, 2011.). Além disso, foi possível gerar linhagens

clonais destas células, verificadas por marcação retroviral, as quais foram capazes de se

diferenciar em linhagens representativas de todas as três camadas germinativas (DE COPPI et

al., 2007).

Quase todas as linhagens clonais de AFSC expressam Oct-4 e Nanog, marcadores de

um estado pluripotente indiferenciado. As AFSC c-kit + Lin- de humano e camundongos

apresentaram um potencial de multi-linhagem hematopoiética in vitro e in vivo, apesar de ter

29

baixa ou ausência de expressão de CD34 (DITADI et al., 2009). As linhagens humanas de

AFSC c-kit-positivas podem formar corpos embrióides em 18-82% dos casos. A formação de

corpo embrióide foi acompanhada por uma diminuição na expressão de Oct-4 e nodal e a

indução de marcadores de diferenciação, tais como Pax 6, nestina (ectodérmica), GATA 4 e

HBE1 (mesodérmica) (VALLI et al., 2010).

Outra técnica descrita para o isolamento das AFSCs é o método de isolamento

mecânico descrito por, PHERMTHAI & ANAGOU (2010), o qual não utiliza nenhuma

substância xeno-imunológica, permitindo o desenvolvimento de técnicas futuras de um

sistema de produção de células livre de substâncias xenógenas. A técnica inicia pela seleção

de MSCs aderentes oriundas de uma cultura primária de células do líquido amniótico. Uma

célula individual selecionada é chamada de célula de partida ou precursora e é utilizada como

iniciante para a geração de uma linhagem celular clonal de AFSC.

Uma variedade de diferentes tipos de MSCs do líquido amniótico foram isolados e

caracterizados. Estas linhagens celulares são amplamente multipotentes com características

intermediárias entre as ESCs e CTAs. Assim, estas células-tronco exibem típicos marcadores

de células mesenquimais estromais, tais como CD 29, CD 90, CD 166, CD 73, CD 105, CD

44 (TSAI et al., 2006; DE COPPI et al., 2007; DA SACCO et al., 2010) e são negativos para

os marcadores de superfície hematopoiética CD 45, CD 34 e CD 14 ( PRUSA &

HENGSTSCHLAGER, 2002; PRUSA et al., 2003; TSAI et al., 2004; ROUBELAKIS et al.,

2007) e também têm características de células-tronco multipotenciais, como demonstrado pela

expressão de marcadores embrionários, incluindo Oct-4 e SSEA-4 (PRUSA et al., 2003; DE

COPPI et al., 2007). A caracterização de marcadores de superfície das AFSC revelou alta

expressão de histocompatibilidade principal (MHC) de Classe I e ausência de MHC de Classe

II ou moléculas co-estimulatórias (CD80, CD86, CD40) consistente com relatos anteriores

(DE COPPI et al., 2007). Isso indica que as AFSC, assim como as MSCs, provavelmente não

ativam respostas de rejeição em hospedeiros alogênicos. Os marcadores de superfície

observados para as AFSC não são consistentes entre os relatórios de diferentes grupos.

Enquanto alguns laboratórios descobriram que as AFSC são negativas para CD117 (TSAI et

al., 2004; CHIAVEGATO et al., 2007), outro grupo foi capaz de isolar as AFSC expressando

CD117 por imunoseleção utilizando microesferas magnéticas (DE COPPI et al., 2007). Uma

vez que existem diferentes relatos sobre o perfil de expressão das AFSCs, existe a necessidade

de uma investigação mais profunda para caracterizar melhor essa nova fonte de células-

tronco.

Apesar da sua alta taxa proliferativa, estas células apresentam um cariótipo normal

30

quando expandidas in vitro e não formam tumores in vivo (DE COPPI et al., 2007;

SESSAREGO et al., 2008), mesmo 7 meses após o transplante (CARRARO et al., 2008).

Diferenciação das AF-MSC

Uma grande subpopulação apresenta comprometimento para diferenciação em linhas

germinativas definidas, variando de progenitores inespecíficos a tipos celulares maduros

diferenciados. As AFSCs são caracterizadas pelo potencial de diferenciação ao longo de todas

as três camadas germinativas incluindo hepatócitos, osteócitos, condrócitos, adipócitos

(KOLAMBKAR et al., 2007, DE COPPI et al., 2007; NADRI & SOLEIMANI, 2007), da

linhagem neuronal (TSAI et al., 2004) e renal (PERIN et al., 2007).

PERIN et al. (2007) identificaram uma população CD24+OB-cadherin+ expressando

marcadores com características específicas renais (PAX-2, LIM-1, nephrin, PDGFRA, TRKA,

E-cadherin, CD24 e OB-cadherin), incluindo precursores de podócitos, de células epiteliais

tubulares e células mesangiais. A presença de células progenitoras específicas renais, em

especial os percursores de podócitos no líquido amniótico humano pode representar uma nova

fonte valiosa de células para terapias regenerativas que são potencialmente aplicáveis a uma

ampla gama de doenças renais.

Manipulação genética das células-tronco

Duas estratégias principais estão disponíveis para a transferência de genes para os

tecidos: transferência genética direta in vivo, a qual realiza a transferência de genes de fatores

de crescimento diretamente no DNA de células do meio ambiente lesionado por injeção direta

de DNA de plasmídeos ou usando técnicas inovadoras, tais como biolística, na qual o vetor

plasmidial é aderido a microesferas de ouro e expelido de um sistema de ar comprimido pelo

tecido por bombardeamento de micropartículas de gene por pistola de genes (DI PEPPE et al.,

2002) ou microsemeadura (AILAWADI et al., 2002); a outra abordagem é a transferência de

genes ex vivo pelo transplante de culturas de células transgênicas para o órgão-alvo. Após a

cultura destas células por várias passagens, elas podem ser 'transduzidas' utilizando-se vetores

virais contendo o alvo de DNA de plasmídeo, ou podem ser transfectadas utilizando-se

estratégias de vetores não virais tais como as técnicas de lipoplexão, recombinação homóloga

ou eletroporação (TAUB et al., 1998; SUPP et al., 2002). A vantagem das estratégias ex vivo é

o impacto sinérgico do substrato celular cultivado e os fatores de crescimento expressos sobre

o microambiente lesionado.

31

Tem sido sugerido que as MSCs podem ser utilizadas como veículos para terapia

gênica devido a sua alta quimiotaxia para as áreas de lesão (CHEN et al., 2001, 2003). Para

aplicações clínicas, as células transplantadas podem ser utilizadas tanto para reparar, substituir

ou regenerar o tecido danificado / órgãos; expressar enzimas ou genes para repor ou superar a

deficiência; ou como sistemas de distribuição de drogas ou genes. No entanto as CTAs têm

um potencial de regeneração limitada e, como consequência a sua utilização para a terapia

gênica e celular é limitada. A transdução e expressão de dois diferentes genes marcadores ou

repórteres, lacZ e eGFP, têm sido demonstrada sem que haja evidência de efeito sobre o

fenótipo das hAFSC e seu potencial de diferenciação (GRISAFI et al., 2008). Em particular,

num estado indiferenciado, as hAFSC continuaram a expressar ambos os transgenes, bem

como os marcadores multipotenciais típicos, tais como Oct4 e SSEA4. Quando cultivados em

regimes de diferenciação, as células transduzidas podem ainda diferenciar-se em osteócitos e

adipócitos que expressam os genes específicos de cada linhagem.

Vetores virais para transferência genética

Os vírus são veículos eficazes para infectar células, introduzir material genético dentro

do genoma do hospedeiro e forçar a célula a replicar o genoma viral a fim de produzir novas

partículas virais. Os vírus podem ser desenhados geneticamente em vetores virais que não

repliquem mais, mas que mantenham a capacidade de infectar e introduzir genes dentro da

célula. Por exclusão de partes do genoma viral e substituindo-os pelos genes de interesse, a

aplicação do vetor vai resultar em uma única infecção sem replicação na célula hospedeira. A

concepção geral de vetores virais baseia-se na separação física em diferentes plasmídeos dos

elementos cis envolvidos na transferência do genoma do vector a partir de elementos de ação

trans que codificam as proteínas virais (estrutural). Estes plasmídeos transportam os

componentes necessários para montar uma partícula de vetor durante a produção de vetor em

células produtoras. Os vetores virais podem ser utilizados tanto para a superexpressão quanto

para o silenciamento de determinados genes. O transgene codificado pelo vetor pode ser uma

proteína reporter para visualização das células marcadas por técnicas de imaginologia

imunohistoquímicos ou não-invasiva, tais como a bioluminescência, técnicas de medicina

nuclear ou ressonância magnética (DEROOSE et al., 2009). Para tratamentos com terapia

gênica, a proteína expressa pode ser uma proteína relacionada com a doença tratada, com o

objetivo de modular uma afecção patológica (KIRIK et al., 2003) ou uma proteína terapêutica.

Vários sistemas de vetores baseados em vários vírus têm sido desenvolvidos. A escolha do

sistema de vetor depende do tamanho do gene de interesse, a duração desejada da expressão

32

do gene, a célula-alvo e problemas de segurança biológica .

Para gerar a AFSC modificada é essencial utilizar uma plataforma de vetores com a

capacidade de transduzí-las com alta eficiência. Os adenovírus recombinantes são os vetores

mais interessantes: eles são relativamente fáceis de construir, podem ser produzidos em

elevada titulação e atingir elevada eficiência de transdução tanto em células proliferativas

como não-proliferativas. No entanto, os adenovírus não integram no DNA celular e a

aplicação de altos títulos usados muitas vezes provocou reações imunológicas em ensaios

clínicos (WONG & CHIU, 2011). A transdução com este vetor viral tem sido utilizada em

ESC e CTA de murinos e de humanos (MIZUGUCHI et al., 2005; KAWABATA et al., 2006;

ZACHOS et al., 2006; YUE et al., 2008).

Além dos vetores de adenovírus, os vetores lentivirais (VL) representam um sistema

altamente eficiente de transdução para as células-tronco. Os lentivírus podem transferir uma

quantidade significante de material genético dentro do DNA da célula hospedeira, por isso,

eles são um dos métodos mais eficientes de transferência genéticas por vetor. Os vírus da

imunodeficiência felina (FIV), o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o vírus da

imunodeficiência símia (SIV) são alguns exemplos de lentivírus. A transferência gênica

baseada em vetores lentivirais permite o carregamento e integração de um material genético

exógeno ao genoma de uma célula alvo, o que permite a expressão estável do transgene tanto

in vitro quanto in vivo (BOKER et al., 2008; MEYERROSE et al., 2008; WONG & CHIU,

2011).

Vetores lentivirais

Os VLs são derivados de lentivírus, uma família de retrovírus complexos que têm a

capacidade de se replicar em células que não se dividem, em oposição a retrovírus simples.

Vários estudos têm mostrado que os VLs derivados de HIV-1 são de fato capazes de uma

estável e eficiente expressão do transgene in vivo, sem indução de resposta imune

significativa (NALDINI et al., 1996; BAEKELANDT et al., 2002).

O prototípo do lentivírus é o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), que

tem um diâmetro de 110 nm. O genoma tem três grandes regiões codificantes em comum com

os retrovírus simples (gag, pol e env), ladeado por duas repetições terminais longas (LTR).

Gag codifica a proteína da matriz estrutural do núcleo, do capsídeo e núcleocapsideo, pol

codifica as enzimas virais (protease, transcriptase reversa (RT) e integrase) e env codifica os

componentes da glicoproteína do envelope viral. Além disso, retrovírus complexos contém

33

seis genes acessórios (tat, rev, vpr, vpu, vif e nef) que codificam proteínas reguladoras

adicionais. Estes genes acessórios não são essenciais para a replicação viral em cultura de

células, mas sim determinar a patogenicidade da infecção viral in vivo.

Desenho de vetores virais

A primeira geração de VLs derivados de HIV-1 foi desenvolvida em 1996 por

NALDINI et al. (1996) e produzidos por transfecção tripla de células 293T (linhagem de

células de rim embrionário humano) com três diferentes plasmídeos, proporcionando os

elementos cis e trans necessários para a produção de partículas de vetor. O primeiro

plasmídeo, o de empacotamento, codifica proteínas virais estruturais a partir de gag e pol de

enzimas sob o controle de um promotor constitutivo. Por razões de segurança biológica, o

sinal de empacotamento () e o gene env foram excluídos. O plasmídeo de envelope

codifica a glicoproteína do envelope do vírus da estomatite vesicular (VSV-G). O envelope de

VSV-G assegura uma melhor estabilidade da partícula em relação ao vetor de vírus com

envelope de HIV. O terceiro plasmídeo, o de transferência, codifica o transgene de interesse

sob o controle de um promotor heterólogo. Ele contém sequencias de ação cis necessárias

para a encapsidação, transcrição reversa e integração realizado por duas repetições terminais

longas (LTR). Os LTRs são necessários para a integração do DNA proviral mediada pela

integrase viral, além de possuir um promotor para a sua transcrição. Após a transfecção tripla,

as partículas de vetor produzidos pelas células 293T são liberados no meio, purificados e

concentrados.

Biosegurança dos vetores lentivirais

Os VLs derivados do HIV-1 podem levar a preocupações em relação à biossegurança

devido à patogenicidade bem conhecida desse vírus. Uma questão importante é a ocorrência

potencial de retrovírus de replicação competente, que pode, teoricamente, ser gerado durante a

produção de vetor por recombinação homóloga. Um grande esforço tem sido empreendido

para melhorar a biossegurança de VLs. Além da deleção do gene acessório no plasmídeo de

transferência, reduzindo ou eliminando a patogenicidade de HIV-1, VLs mais seguros têm

sido desenvolvidos através da divisão da sequência de ação cis e trans em dois plasmídeos e a

deleção do promotor e de elementos potenciadores no vetor de transferência propriamente

dito. Isso reduz a probabilidade de recombinação homóloga.

34

MATERIAL E MÉTODOS

1 isolamento das células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico

1.1 Isolamento inicial das hAFSc por seleção mecânica

Cinco a dez mililitros de 24 amostras independentes de líquido amniótico foram

obtidas a partir de mulheres grávidas com 15-22 semanas de gestação, submetidas à

amniocentese para detecção de alterações genéticas, tais como a síndrome de Down. O

Comitê de Ética da UZ Leuven aprovou este protocolo de estudo.

No prazo máximo de até 2 horas, sendo mantidas à 37° C, as células foram passadas

através de um filtro celular de 40μm (BD Falcon), para filtrar células epiteliais escamosas, e

subsequentemente as outras células e os detritos celulares foram isoladas do líquido amniótico

por meio de centrifugação a 200x g durante 5 min. O sobrenadante foi removido e o

sedimento celular foi ressuspenso em meio de crescimento consistindo em α-MEM1, 15% de

soro fetal bovino2, 1% de L-glutamina

3, 1% de penicilina / estreptomicina

4 e 18% Chang B e

2% Chang C5. As células foram expandidas em uma placa Petri por meio de incubação em

câmara com 5% de CO2, umidificada e à 37° C.

1.2 Seleção por C-Kit

O meio de crescimento foi substituído com novo meio depois de quatro dias, quando

as primeiras células aderidas puderam ser identificadas. O meio de cultivo era trocado a cada

quatro dias até que as células tornaram-se confluentes. Depois disso, a imunoseleção para c-

Kit foi realizada utilizando-se um kit de triagem magnética celular para CD117 de acordo com

as instruções do fabricante. Resumidamente as células recém tripsinizadas em suspensão

unicelular foram incubadas com um anticorpo monoclonal anti-CD117 rato anti-humano

diretamente conjugado com microesferas magnéticas6. As células CD117-positivas foram

purificadas por incubação num aparelho Mini-MACS7 seguido por um passo de lavagem e

procedimento de eluição. As células selecionadas foram subcultivadas rotineiramente a uma

1 GIBCO ® Invitrogen, Gent, Belgium.



4GIBCO ® Invitrogen, Gent, Belgium.

5 Irvine Scientific, Wicklow, Ireland

6 CD-117 MicroBead Kit humano, MACS, Miltenyi Biotec, Leiden, The Netherlands.

7 MACS. Miltenyi Biotec, Leiden, The Netherlands.

35

diluição de 1:4 a 1:8. Não permitiu-se que as células atingissem confluência superior a 70%,

sendo expandidas sempre que necessário para posterior análise.

1.3 Seleção mecânica

Para identificar as “células de partidas”, selecionaram-se sob a luz de um microscópio

invertido, as colônias primárias aderidas à placa com aspecto fibroblastóide. As células

individuais foram detectadas, identificadas e cultivadas, subsequentemente para formar as

colônias de hAFSC. Para evitar a confluência de colônias vizinhas, as células que crescessem

muito próximas umas das outras foram mecanicamente removidas, sendo o meio de cultivo

removido em seguida. A cultura foi mantida na placa de cultura primária durante 48 horas. Em

seguida, cada colônia celular foi separada mecanicamente por meio de aspiração utilizando-se

uma ponteira de 20 microlitros, sob visualização em microscópio invertido. As células

aspiradas foram ressemeadas em um poço individual de uma placa de 96 poços. A cultura foi

mantida em incubadora com 5% de CO2, sob umidifcação e à 37° C. Quando uma cultura de

células clonal atingiu a confluência de 70% na área de cultivo, foi realizada repicagem por

tripsinização e replaqueamento em uma placa de 24 poços e depois em uma placa de 6 poços

e, finalmente, mudou-se para uma placa de Petri de 10 centímetros (Figura 1). As células

foram expandidas até a confluência de 70% e, em seguida, rotineiramente subcultivadas com

uma diluição de 1:3

.

Figura 1. Figura representativa do isolamento mecânico das colônias de células mesenquimais estromais

derivadas do líquido amniótico humano.

36

2 Caracterização das células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico

2.1 Citometria de Fluxo (FACS)

As hAFSC foram caracterizadas por análise de citometria de fluxo na passagem 4.

Para isso, 100.000 células foram colhidas e ressuspensas em 1 mL de meio de coloração (PBS

+ BSA a 1%) em um tubo de FACS e centrifugadas a 300xg durante 5 min. As células foram

subsequentemente incubadas com anticorpos conjugados com FITC ou PE- contra os

diferentes marcadores CD8 (Tabela 1) durante 30 min a 4-6 ° C. Após a lavagem, as células

coradas foram analisadas utilizando um citômetro de fluxo9, utilizando o software da Quest

celular. Em seguida os dados foram calculados utilizando o software FlowJo10

.

Tabela 1: Anticorpos monoclonais usados nas células cultivadas para realização de imunofenotipagem

:

Marcadores positivos PE camundongo anti humano CD117

FITC camundongo anti humano CD24

FITC camundongo anti humano CD90

PE camundongo anti humano CD44



FITC camundongo anti humano CD29 (Acris)

FITC camundongo anti humano HLA-a/b/c

Marcadores Negativos PE camundongo anti humano HLA-DR



2.2 Ensaio de diferenciação

As células foram analisadas quanto à sua capacidade para se diferenciarem em

linhagem osteogênica, adipogênica e condrogênica nas diferentes semanas de gestação nas

quais foram isoladas. A diferenciação foi realizada em uma monocamada. As células foram

plaqueadas a uma densidade de 15.000 células / poço em uma câmara de LabTec11

, e

cultivadas a 37 ° C em uma atmosfera úmida (5% CO2) por diferentes períodos de tempo e

meios de diferenciação específicos.

8 BD Bioscience, Becton, Dickinson and Company, Belgium.

9 BD Bioscience, Becton, Dickinson and Company, Belgium.

10 Tree Star, Ashland, OR, USA

11 Nunc; Rochester, NY, USA

37

Diferenciação osteogênica

A diferenciação osteogênica foi induzida em cultura de AFSC passagem 5-8 em

confluência de 70%, durante 4 semanas em meio osteogênico (MO). O MO consistiu no meio

de diferenciação osteogênica disponível comercialmente12

e foi usado de acordo com as

instruções do fabricante. A diferenciação osteogênica das células foi avaliada por coloração de

vermelho de alizarina na deposição extracelular de matriz calcificada (ECM).

Diferenciação adipogênica

Para induzir a diferenciação adipogênica, as AFSC de passagem 5-8 em cultura foram

cultivados a 100% de confluência e, subsequentemente, diferenciados com meio de

diferenciação adipogênica durante 21 dias em câmara com 5% CO2 a 37 ° C. O meio foi

composto por 10% de FBS, 10-8

M de dexametasona, 0,2 mM de vitamina C e 10 mM β-

glicerofosfato em DMEM com alta glucose13

. A diferenciação na linhagem adipogênica foi

determinada por coloração Oil Red O.

Diferenciação condrogênica

Para induzir a diferenciação condrogênica, as células de passagem 5-8 foram

cultivadas em alta densidade em massa pellet. Semearam-se 20 µl de suspensão em pellet

(400.000 células ressuspensas em PBS) em poços individuais de uma placa de 24 poços. As

células foram deixadas sem meio durante três horas a 37 ° C em incubadora a 5% CO2 para

que aderissem ao plástico e então cultivadas durante 24 horas em meio de crescimento. No dia

seguinte, o meio foi substituído pelo meio de diferenciação condrogênica, o qual consistiu de

meio disponível comercialmente14

e foi usado de acordo com as instruções do fabricante. A

diferenciação condrogênica foi determinada por coloração com azul Alciano.

Extração de corantes das colorações de diferenciação osteogênica e condrogênica

Realizou-se a extração dos corantes apenas nas linhagens isoladas mecanicamente.

Azul alciano: Após finalizar o protocolo de diferenciação, as células foram lavadas duas vezes

com PBS e fixadas com metanol a -20°C por 1 minuto e lavadas com água destilada. Em

seguida, incubaram-se em solução de azul Alciano em 1N HCl pH 0,2 durante a noite. Após

12

GIBCO ® Invitrogen, Gent, Belgium 13

GIBCO ® Invitrogen, Gent, Belgium 14

GIBCO ® Invitrogen, Gent, Belgium

38

várias lavagens em água destilada, adicionaram-se 6M de guanidina HCL em água MilliQ,

pH5,8, por 5 horas em temperatura ambiente. A placa foi lida em densidade óptica de 620 nm.

Vermelho de alizarina : Após finalizar o protocolo de diferenciação em placas de 96 poços, as

células foram lavadas duas vezes com PBS. Após adicionaram-se 800 µl de ácido acético a

10% em cada poço e deixou-se em temperatura ambiente em agitador por 10 minutos. Após

raspou-se a monocamada com a ponteira de 200 microlitros e transferiu-se para um tubo de

polipropileno do tipo eppendorf com ácido acético a 10%. A solução foi ressuspensa em

vórtex por 30 segundos e adicionaram-se 500 µl de óleo mineral e aqueceu-se o tubo a 85°C

por 10 minutos. Em seguida o tubo foi transferido para o gelo, onde permaneceu por 5

minutos e centrifugado a 20.000 g por 15 minutos. Após removeram-se 500 µl de

sobrenadante e a solução foi transferida para um novo tubo e adicionaram-se 200 µl de

hidróxido de amônia e prepararam-se alíquotas de 150 µl para realizar a leitura em triplicada.

Mensurou-se em densidade óptica de 405 nm.

2.3 Isolamento de RNA para quantificação de OCT-4 usando PCR em tempo real

quantitativo

O RNA de cada clone foi extraído utilizando-se o reagente Tri Pure15

de acordo com

as instruções do fabricante. O DNA foi sintetizado a partir de 1 µg de RNA usando o reagente

para transcrição reversa Taq Man16

de acordo com as instruções do fabricante. O kit

SuperScript ™ III Platinum ® SYBR ® Green One-Step qRT-PCR com ROX17

foi utilizado

para detectar a expressão de Oct4 em amostras de AFSC (FW: 5'-

GATGGCGTACTGTGGGCCC-3 'RV: 5'-TGGGACTCCTCCGGGTTTTG-3') e o gene

GAPDH (FW: 5'-CAATGCCAGCCCCAGCGTCA-3' 'RV: 5'-

GCCTTCCGTGTCCCCACTGC-3) foi utilizado como gene de controle para normalizar os

níveis de mRNA. O RNA extraído de hESC linha H9 e CT endoteliais da veia umbilical

humana (HUVEC) foram obtidas a partir do Stem Cell Institute of Leuven (SCIL) e foram

utilizado como controle positivo e negativo, respectivamente.

15

Roche Diagnostic, Vilvoorde, Belgium. 16

Applied Biosytem, Belgium. 17

GIBCO ® Invitrogen, Gent, Belgium.

39

3 Manipulação das células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico

3.1 Transdução com vetores lentivirais (VL) expressando genes terapêuticos e repórteres

Para testar a funcionalidade de diferentes promotores nas hAFSC, utilizaram-se

vetores lentivirais codificando eGFP sob controle dos promotores citomegalovírus (CMV),

Chimeric Chicken-Beta-Actin (CBA), vírus formador de foco esplênico (SFFV) e CypA. A

fim de selecionar as AFSCs transduzidas, uma tecnologia baseada em imunoseleção de CD34

foi utilizada. Uma transferência bicistrônica lentiviral de plasmídeo foi construída pela equipe

de Vetores virais de Leuven, codificando eGFP e uma forma truncada da proteína

transmembrana CD34 (tCD34), separadas por uma sequência peptídica 2A e sob o controle do

promotor SFFV. Esse gene repórter foi convertido nos dois genes VEGF e HGF para o uso

terapêutico. A sequência cDNA de VEGF e HGF foram amplificados por PCR usando como

molde p-hVEGF e h HGF (HsCD00022276 e HsCD0005103, fornecido pelo banco de dados

de plasmídeo de Harvard, Mass, EUA). Para isso, utilizou-se primers VEGF sense (5'-

AAAATCTAGAATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGG-3’), VEGF anti-sense (5 '-

GCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGTGACTCGAGAAAA-3'), HGF sense (5'-

AAAATCTAGAATGTGGGTGACCAAACTCCTGCCA-3') e HGF anti-sense (5'-

TTTTGTCGACCTATGACTGTGGTACCTTATATGTTA-3'). Os produtos amplificados

foram digeridos com enzimas restritivas Xbal e Xhol para VEGF e Xbal e Sall para HGF, e

ainda subclonados direcionalmente Xbal-Xhol ou Xbal-Sall do plasmídeo de transferência

pSFFV-EGFP-T2A-tCD34, obtendo-se pSFFV-VEGF-T2A-tCD34 ou pSFFV-HGF-T2A-

tCD34 (Figura 2). A construção obtida foi sequenciada para assegurar uma correta sequência

de DNA (Tabela 2). O último plasmídeo de transferência genética utilizado nesse estudo

codifica a β-galactosidase localizada no núcleo, sob o controle de promotor CBA.

40

Figura 2: Construções dos plasmídeos usados expressando eGFP, VEGF e HGF, tendo como gene de seleção a

forma truncada CD34 e tendo como promotor o SFFV. Sendo LTR, long terminal repeat; RRE, rev response

element e IRES, internalribosome entry site.

Para as experiências de transdução, semeou-se 10000 células por poço em uma placa

de 96 poços de uma linhagem de hAFSC fortemente positivas para CD24 e CD117. No dia

seguinte, as células foram transduzidas com preparações de vetores lentivirais diluídas em

série, em meio Chang. Após 24 horas de incubação, os vetores foram removidos e o meio foi

substituído por novo meio Chang sem vetores. As células foram passadas (1 para 3) por pelo

menos 4 vezes para excluir pseudo-transdução.

Tabela 2: Primers usados para o sequenciamento de HGF e VEGF:

HGF sense:5’-CTCCTGCATCTCCTCCTGCTCC-3’

5’-GTCAGCCCTGGAGTTCCATGATA-3’

5’-GATATCCCGACAAGGGCTTTGAT-3’

VEGF

sense: 5’-TTGCTGCTCTACCTCCACCATG-3’

antisense: 5’-CTCGGCTTGTCACATCTGCAAGTA-3’

4 Caracterização e avaliação da eficiência da transdução das células manipuladas

4.1 Identificação e imunoseleção de células transduzidas

As células tranduzidas com eGFP-tCD34, VEGF-tCD34 e HGF-tCD34 foram

identificadas por análise de citometria de fluxo utilizando-se como marcador o anticorpo PE

41

rato anti-humano CD3418

. Para isolar as células CD34 positivas, a imunoseleção foi realizada

utilizando um kit magnético de triagem para CD3419

. A fração de células obtidas CD34

positiva foi semeada em placas de Petri e expandiu-se em diversas passagens para posterior

análise.

4.2 Deteção da expressão do transgene usando-se imunofluorescência ou coloração X-

gal

As hAFSCs (10.000 células por poço) foram plaqueadas em LabTek pelo período

mínimo de 16 horas. No início do procedimento foram fixadas e permeabilizadas em solução

de paraformaldeído a 2% com etanol a 50% durante 1 min à temperatura ambiente. Os sítios

de ligação inespecífica foram bloqueados com soro de burro20

a 10% em PBS durante 20 min.

Em seguida as células foram incubadas com anticorpo primário policlonal de coelho VEGF 21

ou com policlonal de cabra HGF22

na concentração de 1:500 em PBS, a 4 ° C, durante a noite.

Após três lavagens com PBS durante 5 min, as placas foram incubadas durante 1 h com

anticorpo secundário (rato anticoelho Alexa 488 ou de burro anticabra Alexa 488, a uma

concentração de 1:500 em PBS). Depois disso, as lâminas foram montadas com Hoechst

1:1000 em meio Mowiol. A expressão de VEGF e HGF foi analisada por microscopia

confocal23

.

As AFSC LacZ positivas foram identificadas através de coloração histoquímica por

X-gal24

. As células foram fixadas em formaldeído a 4% e glutaraldeído a 2% durante 2 min e

subsequentemente incubadas durante a noite a 37ºC com solução X-gal, o que resulta em um

precipitado insolúvel azul. As células foram contrastadas com paracarmina e montadas em

Mowiol.

4.3 Detecção da expressão do transgene usando ELISA

Para detectar a concentração extracelular de proteína VEGF no meio de cultura,

realizou-se o teste ELISA. As AFSC transduzidas com pSFFV-EGFP-T2A-tCD34 (controle)

ou pSFFV-VEGF-T2A-tCD34 foram semeadas a uma densidade de 104 células por cm

2 de

uma placa de 6 poços e cultivadas em DMEM com 5% de FBS a 37 ° C em incubadora com

18

BD Bioscience, Becton, Dickinson and Company, Belgium 19

CD34 Kit humano, MACS, Miltenyi Biotec, Leiden, The Netherlands 20

Dako, Heverlee, Belgium 21

VEGF A-20 SC-125, Santa Cruz Biotechnology, USA 22

AF-294-NA, R&D system, Belgium 23

LSM 510 um, Zeiss, Zaventen, Belgium. 24

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside #745-740– Boehringer Mannheim, Belgium

42

5% de CO2 até chegar a 70-80% de confluência. Após fixação durante a noite, o meio foi

substituído e as células foram cultivadas durante mais 24h antes de o meio ter sido recolhido

para análise. O sobrenadante foi diluído em 1:10 em tampão de revestimento (50 mM pH

Na2CO3 pH 9,6) e foi adicionado aos poços de uma placa de ELISA para incubação durante a

noite a 4 ° C. Após, o meio foi removido e lavado com solução PBS/Tween 0,1% e a placa foi

incubada durante 1 h à temperatura ambiente com solução de bloqueio (1% de BSA em PBS)

e mantida em agitador. Após lavagem em PBS + 0,1% de Tween, a placa foi incubada durante

1 h à temperatura ambiente com o anticorpo primário VEGF21

na concentração de 0,01 µg /

poço. Após, o anticorpo secundário biotinilado suíno anti IgG de coelho25

diluído na

concentração 1:1000 em PBS-1% BSA foi deixado reagir à temperatura ambiente durante 1

hora e incubado com streptavidina-HRP26

diluído na concentração de 1:1000 em PBS/ 0,1%

BSA por 30 min. A placa foi lavada usando PBS+Tween 0,1% (5 vezes) e incubada com

solução de TMB Ultra27

durante 20 min em câmara escura. A reação foi interrompida com

solução de 2M H2SO4 e em seguida mensurou-se a absorbância (450-540 nm) da placa em

leitor de ELISA28

.

4.4 Expressão de VEGF e HGF por PCR em tempo real

O RNA de células transduzidas foi extraído utilizando-se o reagente Tri Pure15

de

acordo com as instruções do fabricante. O cDNA foi sintetizado a partir de 1 µg de RNA

usando o reagente para transcrição reversa Taq Man16

de acordo com as instruções do

fabricante. O aparelho ABI Prism 700029

foi utilizado para avaliar a reação. O kit SuperScript

™ III Platinum ® SYBR ® Green One-Step qRT-PCR com ROX17

foi utilizado para detectar

a expressão de HGF (FW: 'RV: 5'-GCCTTGCAAGTGAATGGAAGTCCT-3' 5'-

TCCCCATCGCCATCCCCTAT-3) e expressão do VEGF nas amostras de AFSC (FW: 5'-

ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC-3 'RV: 5'-TGATTCTGCCCTCCTCCTTCTGC-3').

Utilizou-se como gene de manutenção para normalizar os níveis de mRNA o gene GAPDH

(FW: 5'-GCCTTCCGTGTCCCCACTGC-3 'RV: 5'-CAATGCCAGCCCCAGCGTCA-3'). As

condições utilizadas foram de 2 min a 50 ° C, 2 min a 95 ° C, seguido por 40 ciclos de 15

segundos a 95 ° C, 60 segundos a 60 ° C e 1 min a 40 ° C. Os produtos de PCR foram

25

E0353, DAKO, Heverlee, Belgium 26

DAKO, Heverlee, Belgium 27

eBioscence, Viena, Austria 28

Multiskan FC, Thermo Scientific 29

Applied Biosystem, Belgium

43

separados eletroforeticamente aplicados em um gel de agarose a 2% para confirmar a reação e

analisar o tamanho dos fragmentos amplificados.

4.5 Caracterização das AFSCs após manipulação genética

Após a transdução avaliaram-se eventuais alterações da morfologia, da

imunofenotipagem e do potencial de diferenciação nas células transduzidas com VEGF e

HGF, utilizando os mesmos protocolos descritos anteriormente.

5. Estatística

Os resultados foram expressos como média e desvio padrão. Os dados foram

analisados pelo método não paramétrico Kruskall-wallis, seguido de pós-teste de Dunn.

44

RESULTADOS

1 Isolamento e seleção das células mesenquimais estromais derivadas do líquido

amniótico

No dia 3 da cultura primária das amostras independentes do líquido amniótico,

observou-se um pequeno número (em media 4 a 8) de células isoladas aderidas em áreas

distintas da placa Petri. Houve contaminação do líquido amniótico em 3/24 amostras quando

colocadas em cultura.

Imunoseleção para c-Kit

As células de três amniocenteses foram submetidas ao protocolo de imunoseleção para

c-Kit (CD117) como descrito por DE COPPI et al. (2007). Não foi observada nenhuma

diferença morfológica entre as AFSCs c-Kit+ e as cKit

- . Em ambas havia uma mistura de

células com formato alongado e arredondado (Figura 3)

Figura 3. As células estromais mesenquimais do líquido amniótico derivadas da Imunoseleção para c-Kit:

CD117 positivas (A) e (B) e CD 117 negativas (C) e (D).

Seleção Mecânica ou por “célula de partida”

Realizou-se o isolamento mecânico de linhagens clonais de AFSC em 18 amostras de

líquido amniótico, sendo 2 a 3 amostras de cada semana gestacional (15 a 22 semanas). A

45

derivação de linhagem de células clonais usando o protocolo de seleção mecânica foi bem

sucedida em 79 dos 104 clones produzidos. Os outros 25 clones pararam de crescer após

poucas semanas em cultivo.

Após o plaqueamento do líquido amniótico, cada colônia derivou do drescimento de

uma única célula; estas células foram denominadas como "células de partida". Depois de

permitir o crescimento em meio Chang durante 48 h, cada célula de partida formou uma

colônia, a qual continha, em média, cerca de 100-300 células (Figura 4). As células foram

mecanicamente selecionadas a partir de uma colônia de células com morfologia idêntica.

Selecionaram-se apenas células de colônias que fossem oriundas de um único clone.

Figura 4. Aparência das colônias formadas após plaqueamento do líquido amniótico e em fase de realização da

seleção mecânica: colônia em fase inicial (A) e colônias em fase de transferência para a placa de 96 poços (B, C,

D).

As colônias foram removidas independentes e ressemeadas em uma placa de cultura

de 24 poços, sendo denominada de passagem 1. As AFSCs clonais atingiram a confluência de

70% (cerca de 30,000-35,000 células) em 3-4 dias após a primeira semeadura. As AFSCs

puderam ser expandidas até 100 células dentro de uma semana e, subsequentemente,

cultivadas à passagem 2 em um frasco de cultura de 25 cm2 e, em seguida, 75 cm

2 frascos de

cultura. Utilizando-se este método, um milhão de células a partir de uma população clonal de

AFSCs podem ser derivadas no prazo de duas semanas. Após a expansão, os clones

46

consistiram de uma população mista onde ambas morfologias alongadas e arredondadas

estavam presentes, mas depois de várias passagens em cultura, o formato alongado tornou-se

mais frequente (Figura 5). As AFSC foram expandidas de 4-40 passagens dependendo da

potencialidade de expansão e sobrevivência dos clones (Figura 6).

Figura 5. Exemplo de diferentes populações de hAFSC selecionadas mecanicamente em passagem 4 de cultura.

(100 e 200X).

Figura 6: Curva de sobrevivência dos clones das hAFSCs. A idade gestacional foi descrita em semanas.

47

2. Caracterização das AFSCs

Citometria de fluxo (FACS)

Características antigênicas da hAFSCs isoladas a partir de todas as amostras de líquido

amniótico, selecionadas tanto imunologicamente como mecanicamente, foram analisadas por

citometria de fluxo. Quase todos os clones foram negativos para os marcadores

hematopoiéticos CD34, CD45 e HLA-DR com duas exceções (ambos os clones derivados

mecanicamente). As hAFSC foram positivas para os marcadores mesenquimais CD105, CD73

e CD90, para a molécula de adesão CD44, CD29 e de HLA-ABC. A expressão de CD117 foi

baixa em todas as amostras independente da idade gestacional, exceto por um pequeno

aumento na expressão, na semana 19. O CD 24 foi elevada em apenas algumas linhagens. A

imunofenotipagem dos clones celulares isolados mecanicamente está representada na Figura

7. A análise da relação de volume celular (Forward scatter plot, FSC) e complexidade interna

das células (Side scatter plot, SSC) demonstrou que amostras obtidas por seleção mecânica

consistiram numa população mais homogênea do que as das amostras selecionadas para c-Kit

(Figura 8).

48

Figura 7. Imunofenotipagem analisados por citometria de fluxo nos 79 clones de células mesenquimais

estromais do líquido amniótico humano isolados mecanicamente de amostras de amniocentese.

49

Figura 8. Análise de citometria de fluxo para avaliar o volume celular e a complexidade interna das células

mesenquimais estromais do líquido amniótico humano isoladas por imunoseleção (A) e mecanicamente (B).

Ensaio de diferenciação

As hAFSCs foram cultivadas com meio específico para diferenciação em linhagens

adipogênica e osteogênica usadas em hAFSC selecionadas pelos diferentes métodos, das

semanas 15-22 de gestação. Em ambos protocolos, as hAFSCs foram capazes de se

diferenciar nas linhagens adipogênica e osteogênica, determinada por Oil red O (Figura 10) e

vermelho de alizarina (Figura 11). A indução da diferenciação condrogênica foi realizada

apenas nas amostras selecionadas mecanicamente de 15-20 semanas de gestação e resultou

em colorações de azul alciano positivas (Figura 12).

50

Figura 9. Coloração de Oil redO para detectar diferenciação adipogênica nas células mesenquimais estromais do

líquido amniótico humano derivadas de diferentes semanas de gestação, objetiva 100X.

Figura 10. Coloração de vermelho de alizarina para detectar diferenciação osteogênica nas células

mesenquimais estromais do líquido amniótico humano derivadas de diferentes semanas de gestação, objetiva

100X.

Figura 11. Coloração de azul alciano para detectar diferenciação condrogênica nas células mesenquimais

estromais do líquido amniótico humano derivadas de diferentes semanas de gestação, objetiva 100X.

51

Extração de corantes das colorações vermelho de alizarina e azul alciano

Após diferenciação osteogênica, detectou-se um aumento significativo na quantidade

de corante nas amostras com hAFSCs derivadas das amostras de 16 a 22 semanas gestacionais

(Figura 12). E após diferenciação condrogênica pode-se detectar um aumento significativo em

amostras de todas as semanas gestacionais avaliadas (Figura 13).

Figura 12. Extração de corante vermelho de alizarina nas amostras de células mesenquimais estromais do

líquido amniótico humano de diferentes semanas de gestação, induzidas à diferenciação osteogênica.

Figura 13. Extração de corante azul alciano nas amostras de células mesenquimais estromais do líquido

amniótico humano de diferentes semanas de gestação, induzidas à diferenciação condrogênica, grupos separados

em semanas e hAFS sem indução de diferenciação e células tronco embrionárias (hESC) utilizadas como

controle negativo e positivo, respectivamente.

52

PCR em tempo Real quantitativo

Para avaliar a pluripotencialidade das hAFSC foi realizado PCR-RT quantitativo para

detectar a expressão de Oct4, um marcador de células estaminais embrionárias envolvido na

manutenção da pluripotência das células-tronco in vitro e in vivo.

As hAFSC mecanicamente selecionadas foram investigadas para a expressão de Oct-4.

Vinte e três dos 43 clones - derivados de diferentes idades gestacionais (15, 16, 17, 18 e 19) -

foram testados e 50% eram ligeiramente positivos em relação ao controle negativo, uma

linhagem de células de fibroblastos de tumor de ovário (Figura 14) .

Figura 14: Expressão de Oct-4 nas células mesenquimais estromais do líquido amniótico humano de diferentes

semanas de gestação. Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e células troinco embrionárias

humanas (hESC) foram utilizados como controle negativo e positivo, respectivamente.

3. Manipulação

Transferência genética mediada por lentivírus nas AFSCs

As hAFSC puderam ser convertidas em um sistema de transferência de genes

terapêuticos pela manipulação genética. Neste estudo utilizou-se uma plataforma de vetor

lentiviral para a introdução de genes repórteres e terapêuticos em diferentes linhagens de

células. Para investigar a eficiência de transdução de vetores lentivirais nas hAFSCs foram

53

utilizados os genes repórteres de proteína verde fluorescente (eGFP) e β-galactosidase (lacZ).

Foram investigadas as seguintes variáveis: adição de transdução de sulfato de protamina como

potencializador, eficiência do promotor, imunoseleção para tCD34 e o efeito da transdução na

expressão CD das hAFSCs.

Em uma experiência inicial a eficiência de transdução de vetores lentivirais das AFSC

foi investigada em condições normais e sob a adição de sulfato de protamina. Este último

resultou num ligeiro aumento da eficiência da transdução (em média 10%, dados não

mostrados). A análise de citometria de fluxo para a expressão de eGFP nas células foi

utilizada como uma medida do resultado.

Em seguida, transduziram-se as hAFSC usando vetores virais sob o controle de

diferentes promotores. Na análise de citometria de fluxo as unidades transdutoras e a

intensidade médias de fluorescência foram utilizadas como medidas de resultados. Todas as

preparações de vetores foram normalizadas em ELISA p24 (títulos não-funcionais). Como

demonstrado na figura 15, o promotor CMV resultou na expressão mais elevada de eGFP,

seguido pelos promotores SFFV, CypA e CBA.

Figura 15. Força relativa dos promotores CMV, SFFV, CypA e CBA estão representadas pela intensidade média

de fluorescência de vetores expressando eGFP.

Utilizou-se também um outro gene repórter nas hAFSCs. As células que expressaram

LacZ puderam ser facilmente identificadas em secções de tecido para detecção tecidual em

experiências com animais. O lac-Z possui a vantagem de ser mais confiável, no entanto as

células se tornam inviáveis após a coloração x-gal além de ser mais trabalhoso do que a

detecção eGFP, a qual é rapidamente detectada sob a luz de um microscópio de

54

imunofluorescência. A eficiência de transdução pôde ser realizada pela contagem de células

positivas após a coloração por X-gal (Figura 16). Observou-se cerca de 80% de positividade

para Lac-z após transdução (Figura 17).

.

Figura 16. Coloração de X-Gal para detectar a atividade de β-Galactosidase em células mesenquimais estromais

do líquido amniótico humano transduzidas com vetor lentiviral expressando o gene reporter Lac-Z.

Para analisar as AFSC transduzidas com eGFP-tCD34, VEGF-tCD34 e HGF-tCD34, a

expressão de eGFP, e de proteína CD34 foram detectadas por coloração de

imunofluorescência (Figura 21) e citometria de fluxo (Tabela 3), respectivamente. Para

aumentar o número de células tCD34+ em cultura, um protocolo de imunoseleção foi

realizado para esse marcador, resultando em um aumento da porcentagem de células

marcadas. O número de células eGFP-tCD34 aumentou de 46,6 para 93,7% após

imunoseleção. Após a transdução das hAFSC-HGF, obteve-se 19,2% de células positivas para

o marcador CD34, aumentando para 53% de células positivas após a imunoseleção, no

entanto após algumas semanas em cultivo (p28) houve uma queda novamente para 5,6% de

células CD34+. Já na linhagem transduzida com VEGF, os valores foram de 58,3%; 80,9% e

92,3%, logo após a transdução, pós imunoseleção e 28 passagens em cultivo, respectivamente.

55

Figura 17. Expressão de GFP em células mesenquimais estromais do líquido amniótico humano transduzidas

com vetor lentiviral expressando o gene reporter eGFP.

Tabela 3. Imunofenotipagem das células mesenquimais estromais do líquido amniótico humano transduzidas em

diferentes tempos em cultura

Marcador

CD

Clone

hAFSC

hAFSC HGF

pós-transdução(p.14)

hAFSC HGF

(p.29)

hAFSC VEGF

pós-transdução(p.14)

hAFSC

VEGF

(p.29)

CD117 37,2 18,4 1,18 5,05 4,87

CD24 82,4 46,3 9,9 16,3 45,9

CD90 1,54 53,2 11,8 28,8 7,33

CD73 86,9 83,1 95,7 98,3 97,9

HLA-ABC 51,9 80,4 78,4 86,5 90,2

CD44 89,3 86,4 94,7 88,4 97,8

CD29 85,6 90,6 89,1 91,3 47,1

CD105 57,3 70,3 60,7 71,2 96,8

HLA-DR 1,32 6,79 0,7 1,69 1,87

4. Caracterização das hAFSC modificadas geneticamente para VEGF e HGF

Para detectar a expressão de VEGF e HGF nas células transduzidas realizou-se PCR-

RT (expressão de mRNA), imunofluorescência e ELISA (expressão protéica).

A análise de PCR-RT mostrou que a expressão de mRNA para VEGF aumentou 121

vezes nas células AFSC-VEGF comparado às AFSCs não transduzidas. Já a expressão de

mRNA para HGF aumentou 4451 vezes nas hAFSC transduzidas com HGF comparadas às

56

não transduzidas (Figura 18). O nível de secreção de VEGF no meio de cultura foi mensurado

por ELISA, demonstrando um aumento de 50 vezes nos níveis de VEGF comparado às

hAFSC não transduzidas (Figura 19).

Para demonstrar a localização intracelular das proteínas VEGF e HGF, realizou-se

imunofluorescência, sendo visualizado o aumento da expressão por microscópio confocal

(Figura 20).

Figura 18. Confirmação da superexpressão dos genes VEGF (A) e HGF (B) pela análise de PCR em tempo real

das células mesenquimais estromais do líquido amniótico humano transduzidas.

Figura 19. Expressão protéica de VEGF nas células mesenquimais estromais do líquido amniótico humano não

transduzidas e transduzidas com VEGF.

57

Figura 20. Imunofluorescência para detectar a expressão de VEGF nas células mesenquimais estromais do

líquido amniótico humano não transduzidas (hAFSC) (A) e transduzidas com VEGF-tCD34 (B) e de HGF nas

hAFSC não transduzidas (C) e transduzidas com HGF-tCD34 O núcleo foi contracorado com Hoechst.

Uma vez que a manipulação genética de uma linhagem de células pode introduzir

alterações morfológicas ou funcionais, investigaram-se a morfologia, a expressão de

moléculas de superfície (CD) e capacidade de diferenciação das hAFSC transduzidas.

Morfologicamente as células transduzidas permaneceram uma população homogênea

semelhante a fibroblastos. À análise de citometria de fluxo, demonstrou-se que as células

permaneceram expressando os marcadores mesenquimais CD105 e CD73 e CD90, moléculas

de adesão CD44, CD29 e HLA-ABC e permaneceram negativas para os marcadores

hematopoiéticos CD34, CD45 e para HLA-DR (Figura 21 e 22), no entanto observou-se

ligeira redução no tamanho celular das hAFSCs transduzidas com VEGF e um aumento das

células transduzidas com HGF (Figura 23). Todas as células transduzidas mantiveram a sua

capacidade de se diferenciarem em adipócitos, condrócitos e osteócitos (Figura 24).

58

Figura 21. Citometria de fluxo para CD117, CD24, CD90, CD73, HLA-ABC, CD44, CD29, CD105, HLA-DR,

CD 34 e CD 45 das células mesenquimais estromais do líquido amniótico humano transduzidas com HGF.

59

Figura 22. Citometria de fluxo para CD117, CD24, CD90, CD73, HLA-ABC, CD44, CD29, CD105, HLA-

DR, CD 34 e CD 45 das células mesenquimais estromais do líquido amniótico humano transduzidas com

VEGF.

60

Figura 23. Análise de citometria de fluxo para avaliar o volume celular e a complexidade interna das células

mesenquimais estromais do líquido amniótico humano (A) e após transdução com VEGF (B) e HGF (C).

Figura 24. Diferenciação das células mesenquimais estromais do líquido amniótico humano transduzidas com

VEGF e HGF em linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas.

Houve um aumento na extração de corante vermelho de alizarina (Figura 25) nas

hAFSC transduzidas com VEGF após protocolo de diferenciação. Na análise de extração do

corante azul alciano observou-se um aumento na intensidade tanto das hAFSCs transduzidas

com VEGF quanto HGF, sendo as hAFSCs-VEGF tão intensas quanto as ESC (Figura 26).

61

Figura 25. Extração de corante vermelho de alizarina nas amostras das células mesenquimais estromais do

líquido amniótico humano transduzidas com VEGF e HGF, induzidas à diferenciação osteogênica.

Figura 26. Extração de corante azul alciano nas amostras das células mesenquimais estromais do líquido

amniótico humano transduzidas com VEGF e HGF e nas células tronco embrionárias, induzidas à diferenciação

condrogênica.

62

3. CAPÍTULO 2

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Lesão renal aguda

A lesão renal aguda (LRA) é uma sindrome em que ocorre o rápido declínio da

filtração glomerular caracterizada pelo aumento da creatinina sérica, inabilidade de

manutenção ou regulação de fluídos, eletrólitos e do equilíbrio ácido-base. A LRA pode ser

tanto causada ou induzida por uma toxinas, como por isquemia. Essa lesão pode ser

reversível, no entanto frequentemente leva à falência sistêmica de órgãos (MORIGI et al.,

2004; TÖGEL et al., 2005) e à fibrose intersticial (HUNPHREYS & BONVENTRE, 2008). A

incidência de insuficiência renal em estágio final está aumentando em todo o mundo (PORT

et al., 2000). Dessa forma, necessita-se de uma nova estratégia terapêutica para um tratamento

mais efetivo com o intuito de evitar a fibrose e o desenvolvimento de insuficiência renal

crônica.

O tratamento clínico da lesão renal aguda tem melhorado significantemente nos

últimos anos, mas não existe ainda uma terapia específica efetiva, a qual permaneça a função

das células epiteliais tubulares (BONVENTRE, 2003) e não forme fibrose túbulo intersticial,

evitando a doença renal crônica (BUSSOLATI et al., 2009). Apesar do entendimento

sofisticado da epidemiologia e patologia da LRA, estratégias preventivas atuais são

inadequadas e as opções de tratamento, além da terapia de reposição renal, são inexistentes

(WAIKAR ET AL., 2008).

O rim é um órgão altamente complexo, composto por cerca de 24 tipos celulares em

diferentes compartimentos (BUSSOLATI et al., 2009), sendo que o dano a qualquer um dos

componentes do néfron (glomérulo, túbulo, interstício e vasos sanguíneos) pode resultar em

uma perda irreversível de função, levando à fibrose (MORIGI et al., 2004; TÖGEL et al.,

2005).

Imediatamente após a lesão, os miofibroblastos e as células lesadas produzem

metaloproteinases de matriz, os quais rompem a membrana basal e secretam diferentes

fatores, os quais recrutam leucócitos que migram através da membrana basal rompida. Os

leucócitos secretam TGF-β, Il-4 e Il10. A inflamação possui um papel importante na

patofisiologia da lesão renal aguda e na progressão da fibrose intersticial e atrofia tubular

renal progressiva. Em casos de depleção de macrófagos há atenuação tanto da inflamação

63

quanto da fibrose e diminuição de TGF-β (KO et al., 2008).

Os linfócitos T são importantes tanto na doença imunomediada quanto na isquemia

renal, sendo relevante a inibição dessas células pela MSC para seu efeito terapêutico na IRA

(FRIEDEWALD & RABB, 2004). As MSC são imunológicamente privilegiadas e mesmo

quando alógenas não induzem resposta de proliferação de linfócitos T. O mecanismo dessa

tolerância inclui baixa expressão de moléculas de superfície de ambos complexos maior de

histocompatibilidade (MHC). A supressão da proliferação de linfócitos T pela MSC não causa

nenhuma restrição imunológica e o efeito supressor foi similar tanto em células autólogas

quanto alógenas (LE BLANC et al., 2003; KRAMPERA et al., 2003).

Atualmente, as MSCs têm demonstrado alguma propriedade imunomodulatória, sendo

capazes de suprimir a ativação e a proliferação de linfócitos T, assim como células

apresentadoras de antígeno, natural killers e linfócitos B. Provavelmente a administração de

MSC pode agir como moduladora da resposta inflamatória após um evento de isquemia e

reperfusão (I/R) renal (RASMUSSON, 2006; NAUTA, 2007; STAGG, 2007)

Isquemia e reperfusão

A LRA severa piora o prognóstico de pacientes hospitalizados, sendo a sua causa mais

freqüente a isquemia transitória ou hipoperfusão renal prolongada, a qual afeta principalmente

a função e estrutura de células epiteliais tubulares, que, em casos graves, é caracterizada por

necrose das células epiteliais. A lesão de isquemia e reperfusão renal resulta de um déficit na

oxigenação e distribuição de nutrientes e remoção de metabólitos das células renais, podendo

tanto ser local quanto generalizado (LE DORZE et al., 2009).

A isquemia não exclusivamente leva a alterações das células epiteliais, mas também

provoca inflamação intersticial e microvasculopatia intersticial. Tanto a inflamação e

microvasculopatia são particularmente importantes em termos de reparação renal pós-

isquêmica. A microvasculopatia pós-isquêmica é caracterizado por edema das células

endoteliais levando subsequentemente à oclusão microvascular, em um fenômeno de não-

refluxo, o qual inibe a reperfusão (PATSCHAN et al., 2012).

A I/R renal é caracterizada por alterações no metabolismo celular, inflamação,

geração de radicais livres e apoptose que resulta em desprendimento das células tubulares

renais originárias da membrana basal sendo liberado na urina (LIN et al., 2003). A lesão por

I/R ocorre não somente pela perda de regulação sanguínea, mas também pela produção e

64

regulação de eventos multifatoriais, tais como o rompimento do citoesqueleto de actina

devido às alterações de metabolismo do nucleotídeo adenina e no cálcio intracelular, perda de

adesão celular entre célula e matriz extracelular, geração de moléculas reativas de oxigênio e

resposta inflamatória determinada pela ativação do endotélio, o qual leva ao recrutamento e

infiltração de células efetoras (SÁENZ-MORALES et al., 2006; BOROS & BROMBERG,

2006; THURMAN, 2007; PATSCHAN et al., 2012). Diversas citocinas pró-inflamatórias e

imunomudulatórias são secretadas no tecido renal e na circulação, tais como Il- 1, -6 e -8,

TGF-β, TNF-α e MCP-1 (RAMESH & REEVES, 2004). A presença de infiltrado intersticial

inflamatório é uma característica marcante da fase pós-isquêmica. Esse infiltrado intersticial é

composto principalmente de macrófagos, neutrófilos, células NK e linfócitos T, os quais

fazem a modulação da resposta inflamatória (BONVENTRE & WEINBERG, 2003; ZHANG

et al., 2008).

Com a lesão severa, as células perdem sua superfície de polaridade de membrana

levando à morte por necrose ou apoptose e desprendem-se (BONVENTRE, 2003;

DEVARAJAN, 2006; SÁENZ-MORALES et al., 2006), sendo a membrana basal a única

barreira entre o filtrado glomerular e o interstício peritubular. O aumento da permeabilidade

resulta em extravasamento desse filtrado no interstício. As células e os seus fragmentos que se

destacaram da membrana basal combinam-se com outras proteínas presentes no lúmem para

formar cilindros que obstruem os túbulos e aumentam a pressão intratubular (BUSH et al.,

2000), impedindo a filtração glomerular.

Modelo de Isquemia e Reperfusão

O modelo I/R renal é um modelo já bem descrito, o qual é realizado pela colocação de

um clampe ao redor de ambas artérias renais ou ambos pedículos renais. Outro fator

importante é a grande variação de tempo de isquemia descrito na literatura, sendo relatado o

tempo de oclusão entre 25 a 90 minutos em ratos e de 15 a 45 minutos em camundongos.

PARK et al. (2008) relataram a ocorrência de lesão mediana quando a isquêmia foi realizada

por 25 minutos levando ao aumento da creatinina em até duas vezes o valor basal. Quando o

tempo de isquemia aumentou para 45 minutos, a lesão renal foi intensa, com necrose de mais

de 75% dos túbulos renais e elevação da creatinina em 7 vezes o valor basal.

Há evidências de que as fêmeas humanas e murinas apresentam nefroproteção após

insulto isquêmico renal (MÜLLER et al., 2002; HUTCHENS et al., 2008). Os ratos, quando

65

castrados, apresentaram mesmo efeito nefroprotetor do que as fêmeas (MÜLLER et al.,

2002), levando a acreditar que essa proteção esteja associada aos hormônios androgênicos, os

quais possivelmente mediam alterações endotélio vasculares.

Progressão da doença renal crônica

A patogênese da progressão da doença renal (PDR) é de grande complexidade, porém

é válido ressaltar que independentemente da etiologia da doença original, a PDR é resultado

de um processo patogenético que conduz a uma via final comum, na qual a glomerulosclerose

e a fibrose intersticial aparentemente têm papéis fundamentais. Além de um ponto não

totalmente definido, citado por alguns como perda de 75% da taxa de filtração glomerular,

não há retorno da função renal e a progressão para DRC terminal é inevitável, não podendo

ser interrompida por tratamento e nem mesmo pela remissão da doença original.

Acredita-se que a lesão primária glomerular leva a redução do fluxo pós-glomerular, o

que culmina com perda da capilaridade peritubular (FINE et al., 1998). Isso cria uma

ambiente de hipoxia que produz uma resposta de fibrose, a qual subsequentemente propaga a

lesão por afetar capilares adjacentes antes saudáveis. Uma outra perspectiva é de que a lesão

renal desencadeia uma resposta inflamatória, que recruta citocinas profibróticas, tais como o

TGF-β (YOSHIOKA et al., 1993), induzindo a transformação de células renais epiteliais e

endoteliais em miofibroblastos, em um processo denominado de trasndiferenciação epitélio-

mesenquimal (TEM), além de estimular a produção de proteínas da matriz extracelular e

inibir a sua degradação. (LIU, 2010; WANG et al., 2011) Actina de músculo liso-α (α –SMA)

é uma proteína característica de células musculares lisas, tais como o miofibroblasto, e sua

alta expressão no rim tem sugerido sinais de TEM (JIANG et al., 2009). Os fibroblastos e os

miofibroblastos levam ao aumento da matriz intersticial e subsequentemente à lesão

tubulointersticial e atrofia (ASKENAZI et al., 2006). A principal carcaterística da DRC é a

fibrose tubulointersticial, sendo então a fibrose um dos melhores preditores de progressão ao

estágio final da doença renal (SINHA, et al., 2009).

Além do processo pró-fibrótico, a hipóxia também inibe a degradação da matriz

extracelular por meio de redução da expressão e atividade de metaloproteinases de matriz, tais

como metaloproteinase-I de colágeno (FINE et al., 2008). A fibrose em si não é suficiente

para impedir a função do rim. A perda eventual da microvasculatura cria um ambiente

hipóxico levando à progressão da fibrose. A rarefação de capilares peritubulares foi observada

em exame de biópsias de pacientes com DRC (BOHLE et al., 1996) e em modelos animais

(KANG et al., 2002).

66

Regeneração renal

Evidências sugerem que o rim contém um sistema renopoético e que o polo urinário da

cápsula de Bowman pode representar um nicho de células tronco, o qual é um local específico

no tecido adulto, onde as células-tronco residem (RIZVI & WONG, 2005; BLANPAIN et al.,

2007).

O rim é um órgão terminalmente diferenciado com um potencial significativamente

menor de proliferação em comparação com outros órgãos do corpo, tais como o fígado. Além

disso, seu o potencial de regeneração celular não é suficiente para a regeneração de todo o

órgão, pois o rim possui diferentes tipos celulares funcionais ao invés de apenas um tipo

celular. De fato, a regeneração renal requer a reposição de tipos celulares específicos,

adjacentes uns aos outros de uma adequada forma espacial (IWATANI & IMAI, 2010). Sendo

assim, a ocorrência de regeneração natural do rim continua a ser um processo intrigante. Tem

sido demonstrado que a regeneração renal durante a renovação do tecido normal e,

especialmente após lesão renal, pode ser mediada por meio de substituição por células

maduras não proliferativas, que reentram no ciclo celular, ao invés das células-tronco

(PLENICEAU et al., 2010). Uma população auto-renovadora de células progenitoras do rim

embrionário foi isolada e comprovou-se o seu amplo potencial de diferenciação mesodérmica.

Esta população possivelmente representa o mesênquima metanéfrico (MM) não

comprometido, o qual apresenta potencial mesenquimal e estromal, no entanto não parece

persistir ao fim da nefrogênese. Esta população de células embrionárias renais nunca foi

isolada a partir de rim adulto, confirmando que enquanto o MM embrionário representa uma

população de células-tronco multipotentes, este não persiste após o nascimento (LUSIS et al.,

2010).

Estudos histológicos revelam que a perda de células durante a lesão renal aguda é

seguida pela desdiferenciação fenotípica de células tubulares sobreviventes na região da lesão

(BONVENTRE, 2003). Estas células rapidamente reexpressam marcadores típicos de néfron

em desenvolvimento, tais como a molécula de adesão celular neural (NCAM) e Pax-2

(ABBATE et al., 1999; VILLANUEVA et al., 2006). Estudos de vários grupos de pesquisa

demonstram que estas células tubulares parcialmente dediferenciadas proliferam após uma

lesão e, assim, repovoam o túbulo renal (WITZGALL et al., 1994; LIN et al., 2005).

MAESHIMA et al. (2003) injetaram BrdU em ratos durante 7 dias para marcar as células em

divisão durante esse tempo e, em seguida, submeteram ratos a lesão de isquemia e reperfusão

renal, sendo então observado que as células tubulares que haviam retido o BrdU eram as

67

células do túbulo proximal e ducto coletor e eram estas células as mais prováveis de se

desdiferenciar (expressam vimentina) e proliferar em resposta à lesão.

Lesão renal e tratamento com células-tronco

Vários grupos demonstraram a utilização de diferentes tipos de CTAs no tratamento de

LRA em diferentes modelos animais experimentais (Tabela 4), obtendo resultados benéficos.

Tem sido demonstrado que as MSCs podem melhorar a recuperação tanto da LRA citotóxica

(HERRERA et al., 2004; MORIGI et al., 2008) quanto isquêmica (DUFFIELD et al., 2005;

TOGEL et al., 2005). Em um estudo realizado por KUNTER e colaboradores (2007) 2X106

MSC foram injetados na artéria renal e obtiveram benefício, no entanto aos 60 dias, 20% do

glomérulo continham grandes adipócitos provenientes de uma má diferenciação das MSCs.

Uma explicação para essas alterações é o número de células injetadas, uma vez que em outros

estudos foram injetados 2-10 X105, o que poderá ter resultado em uma alta concentração local

celular, predispondo a algumas vias de diferenciação das MSCs.

Em um modelo de necrose tubular por glicerol, as AFSC foram capazes de sobreviver,

reproduzir-se e integrar-se no rim in vivo, demonstrando que essas células sobreviveram por

até um mês após o transplante (PERIN et al., 2007). Além disso, hAFSCs GFP positivas

incorporam em estruturas renais primordiais e expressaram os marcadores precoces renais

ZO-1, fator neurotrófico derivado de linhagem de célula glial (GDNF) e claudina

contribuindo assim para o desenvolvimento de vesículas renais, em forma de corpos C- e S

(PERIN et al., 2007). Da SACCO (2010) identificou as AFSCs expressando marcadores de

células progenitoras renais, incluindo precursores dos podócitos e epiteliais tubulares e células

mesangiais.

Nefroproteção mediada por fatores de crescimento

Em um estudo recente observou-se que o meio de cultivo das MSC foi suficiente para

se conseguir o mesmo benefício com o transplante das MSCs (BI et al., 2007), provavelmente

devido à presença dos fatores solúveis e microvesículas secretados pelas MSCs, tendo um

efeito parácrino nas células renais residentes.

As MSCs secretam inúmeras citocinas e fatores de crescimento, incluindo fator

estimulador de colônia granulocítica, fator de células tronco, IL-6, IL-11 (HAYNESWORTH

et al., 1996), VEFG, HGF, IGF. Alguns desses fatores solúveis aumentam a proliferação

68

epitelial, modulam a inflamação e promovem a angiogênese, sendo, portanto bons candidatos

para eficácia terapêutica em lesões renais. O IGF-1 e o HGF, por exemplo, são morfogênicos

e mitogênicos epiteliais que também promovem o aumento do fluxo sanguíneo renal e são

conhecidos por proteção da lesão isquêmica (HIRSCHBERG & ADLER, 1998; LIU, 2002).

Uma das citocinas mais importantes para a regeneração renal é a VEGF (MA et al.,

2011). Devido à sua ação angiogênica e nefroprotetora, que funciona em conjunto com outros

fatores de cresimento para promover a divisão celular, a migração, a sobrevivência da célula

endoteliais, e a neovascularização. O transplante de hMSC transduzida com VEGF levou a

benefícios ainda maiores de proteção contra o lesão renal aguda, aumentando os efeitos

antiapoptóticos e melhorando a microcirculação e proliferação celulares (YUAN et al., 2011).

Estudos recentes sugerem que o HGF é uma potente proteína nefrotrópica que

desempenha um papel crítico na promoção da reparação tubular e regeneração renal após

estímulos nocivos (KAWAIDA et al., 1994; MILLER et al., 1994; NIGAM & LIEBERTHAL,

2000; VARGAS et al, 2000), além de ser um potente fator protetor das células epiteliais

tubulares renais, evitando a apoptose (KUAN, 2008; VIJAYAN et al., 2001). Além do efeito

protetor ou regenerativo do HGF em células epiteliais tubulares, esta proteína tem sido

relatada por possuir adicionalmente um efeito antifibrótico (YANG et al, 2001;. MIZUI et al,

2004), pela diminuição da expressão de colágeno IV, um dos maiores componentes da matriz

extracelular no glomérulo e TGF-β1, e aumento da expressão de MMP-2, a qual degrada o

colágeno (ESPOSITO et al., 2005). A administração de HGF recombinante em ratos com

lesão renal aguda isquêmica aumenta a recuperação funcional e morfológica do epitélio

tubular lesionado (MILLER et al., 1994). Foi comprovado que o bloqueio da HGF endógena

aumenta a progressão da lesão crônica, bem como a sua suplementação exógena diminui a

progressão (GONG et al., 2006). A administração de HGF em ratos imediatamente após a

lesão renal resultou em aumento da proliferação tubular e recuperação da função (MILLER et

al., 1994).

A introdução desses fatores nefroprotetores nas CTs por meio de manipulação

genética, poderia proporcionar novos caminhos para uma nova terapia farmacológica para a

lesão renal aguda, visto que a regulação e manipulação da função parácrina apresentam um

novo método para melhorar a eficácia das MSCs (YUAN et al., 2011).

69

Tabela 4. Estudos já realizados relacionados a lesão renal e tratados com terapia celular.

Artigo Modelo Espécie Via Fonte Janela terapêutica Resultado

LIN et al., 2003 I/R 15 min Camundongo IV –V.cauda 2,0x105 BMSC 2 e 4h Nefroproteção

LANGE et al., 2005 I/R 40 min Rato IA-A.Aorta 1,5x106 BMSC Após refluxo Nefroproteção

LIN ET AL., 2005 I/R 45 min Camundongo IV –V.cauda 1,0x106 BMSC 2h

TOGEL et al., 2005. I/R 40 min Rato IA-A.Carótida 1,0x106 BMSC Após refluxo e 24h

Nefroproteção

↓ Apoptose e

↑mitose

BEHR et al., 2006 I/R unilateral 60 min Ovelha IA -A. renal 8x107BMSC autólogo 1h e 2s Admisnitração após 1h > índice de enxerto

DA SILVA et al., 2007 I/R 30 e 45 min Camundongo IV –V.cauda 1,0x107 BMSC Sem efeito

LI et al., 2007

I/R 45 min Camundongo IV –V.cauda 1,0x106 BMSC 2h Nefroproteção

SEMEDO et al., 2007 I/R 60 min Rato IV BMSC 6h ↓ Inflamação

Nefroproteção

TOGEL et al., 2007 I/R 30 min Camundongo IA 1,0x105 BMSC ou EC-MSC Após refluxo ↓ Apoptose

TOGEL et al., 2008. I/R 30 min Camundongo IA-A. Aorta

IV Jugular 1,0x105 BMSC Após refluxo

IA melhor resultado

Nefroproteção

CHEN et al., 2008 I/R 30 min Camundongo IV –V.cauda 1,0x106 MSC renal 24h ↑ Angiogênese

Nefroproteção

BEHR et al., 2009. I/R 60 min Ovelha IA -A. renal 5x107 BMSC Após refluxo Sem efeito

KUDRYAVTSEV et al., 2009 Uninefrectomia + I/R 90min Rato Córtex renal hBMSC fetal Após refluxo Nefroproteção

TOGEL et al., 2009. IR 58 min Rato IA -A.aorta 1,5x106 BMSC Após refluxo ↓TGF e fibrose

WANG et al., 2009. I/R 60 min Rato

IV

IP

IC

4,0x106 NSC 4h

Nefroproteção

IV melhor resultado

↓inflamação

CAO et al., 2010 I/R 60 min Rato IA-A. carótida 1,0x106 UC-MSC 16h Nefroproteção

FENG et al., 2010. I/R 38 min Rato IA 5x106ADSC Após refluxo ↑ Mitose e sobrevida

↓inflamação

GATTI et al., 2011 Uninefrectomia + I/R 45 min Rato IV –V.cauda 30µg Microvesiculas de

hBMSC Após refluxo Nefroproteção

ZHUO et al., 2011 I/R 60 min Rato IV 1,0x106 BMSC alógeno Após refluxo Nefroproteção

ASANUMA et al., 2010 Obstrução ureteral Rato 1,0x106 hBMSC 1 e 4 sem Nefroproteção

PERIN et al., 2010 Glicerol Camundongo Córtex renal 1,0x106 hAFSC e AFSC

alógeno 2h

↓ Apoptose

↑ Mitose

BI et al., 2007 Cisplatina Camundongo IV –V.cauda

IP

1,0x105 ADSC ou 2,0x105

BMSC 72h ↓ Apoptose

MORIGI et al., 2008 Cisplatina Camundongo IV –V.cauda 5,0x105 hBMSC 24h Nefroproteção

YUAN et al., 2011 Cisplatina Camundongo IV ESC-VEGF ou ESC 5x105 24h ↓ Apoptose e

↑ Mitose grupo ESC VEGF

KUNTER et al., 2007 Uninefrectomia + Anti-Thy Rato IA 2,0x106 BMSC 48h Nefroproteção a curto prazo, após mal

diferenciação em adipócitos

SEMEDO et al., 2009 Nefrecotomia5/6 Rato IV 2,0x105 BMSC q14d/8sem ↓ Fibrose

LEE et al., 2010 Nefrecotomia5/6 Rato IV –V.cauda BMSC q 7d Tratamento semanal, melhor efeito

70

Vias de administração

O cirurgião tem como principal objetivo facilitar o tráfego, a adesão e a infiltração das

MSCs, mas também proporcionar às MSCs o microambiente especializado ou nicho para auxiliar a

sua auto-renovação e manter sua multipotencialidade (CAPELA et al., 2003). Atualmente, tem sido

discutido que apesar do potencial das células-tronco, a via de administração apropriada para o

transplante celular em um órgão lesionado é um pré-requisito essencial para o sucesso do seu

enxerto com intuito de reparação de órgãos.

As principais vias de administração das CT tendo o rim como órgão alvo são: via

intraperitonial (IP), intravenosa (IV), intra-arterial (IA) e a injeção local no rim ou sob a capsula

renal (Tabela 4). Quando a via de administração utilizada é a IV, geralmente as células são injetadas

na veia da cauda ou na veia jugular; quando usada a via de administração IA, injeta-se nas artérias

carótida, renal e aorta torácica e abdominal na região suprarrenal.

A infusão sistêmica das MSCs, tanto pela via IV como pela IA, distribui as células

homogêneamente no rim (LEE et al., 2008; SACKSTEIN et al, 2008). Apesar da infusão por via IV

ser a menos invasiva, o transplante das células-tronco por via IA tem maiores índices de enxertia

(BARBASH et al, 2003;. FREYMAN et al., 2006; ZONTA et al., 2010). Isso provavelmente se

deve pelo fato de que o seu trajeto inicial evita passar pelos órgãos de filtragem, tais como os

pulmões e o baço, as MSCs chegam mais facilmente ao órgão alvo. Além disso, a administração

pela via IA tem apresentado nefroproteção mais significativa (TOGEL et al., 2008). Por estes

motivos, o transplante de MSC por via IA é mais comumente utilizado em diversos estudos pré-

clínicos (BEHR et al, 2007;. WALCZAK et al, 2008).

Homing e tráfico das células estromais mesenquimais

O homing das MSCs é definido como a chegada e permanência dessas células dentro da

vasculatura de um tecido ou órgão alvo, seguida por transmigração através do endotélio. Após a

infusão, as MSCs permanecem na circulação por não mais do que uma hora (GAO et al., 2001).

Posteriormente, as MSCs são detectáveis principalmente nos pulmões, baço, e em terceiro lugar nos

órgãos lesados, embora neste último em baixa frequência. É importante determinar a posição exata

das MSCs dentro dos tecidos em relação aos vasos sanguíneos, principalmente depois de 24h de seu

transplante, pois as células podem estar temporariamente dentro dos vasos no tecido, passivamente

aprisionadas na vasculatura ou extravasaram através da parede vascular, enxertando no tecido

(SACKSTEIN et al., 2008; WALCZAK et al., 2008).

71

Enxertia das MSCs

Ainda é altamente controverso que as MSC realizam enxertamento no néfron, e mesmo os

pesquisadores que aceitam essa hipótese, acreditam que essa taxa de integração das MSC é muito

baixa, sendo observado apenas em 8% das células regeneradas (LIN et al., 2003). Se as MSC não

repovoam diretamente nos locais lesados no rim, reparando os túbulos renais, então mecanismos

parácrinos e endócrinos, com influencia mitogênica, antiapoptótica, antinflamatória e angiogênica,

poderiam explicar seu efeito terapêutico em casos de lesão renal.

Tanto o transplante de um maior número de CT quanto o seu transplante antecipado após

evento isquêmico tem demonstrado uma melhora na taxa de enxertia (CHEN et al., 2001). Porém,

as poucas MSCs que enxertam podem contribuir para a reparação dos tecidos pela secreção de

moléculas tróficas que incluem matriz extracelular solúvel, citocinas e fatores de crescimento

(ANKRUM & KARP, 2010) e pela conexão direta entre célula-célula (MSCs e células teciduais

adjacentes (PLOTNIKOV et al., 2008).

Em ratos recém-nascidos as AFSC alógenas foram capazes de enxertar em diferentes

tecidos, mesmo na ausência de lesão em qualquer órgão (GHIONZOLI et al., 2010). O intestino foi

o órgão em que se observou maior positividade (67%), seguido pelo fígado (25%), baço (16%),

coração (16%), pulmões (16%), fêmur (8%) e cérebro (0%), sendo que a presença das células foi

compravada tanto por análise de imunohistoquímica como por PCR (GHIONZOLI et al., 2010).

Anatomia cirúrgica renal

Os rins são órgãos pares que lembram a forma de um grão de feijão e localizam-se no

espaço retroperitoneal, lateral à aorta e à veia cava caudal. Eles têm uma cápsula fibrosa e são

mantidos em sua posição pelo tecido conjuntivo subperitoneal. Na parte medial côncava de cada

rim, localiza-se o hilo renal, local onde se encontram a artéria e a veia renal, vasos linfáticos, plexos

nervosos e o ureter, que se expande dentro do seio renal, formando a pelve. O rim é irrigado pela

artéria renal, a qual se origina da artéria aorta. A veia renal drena o rim e desemboca na veia cava

inferior.

O rim é envolvido em toda sua superfície por membrana fibroelástica muito fina e brilhante,

denominada cápsula renal. Esta adere à pelve e aos vasos sanguíneos na região do hilo. O rim

direito é envolvido pela gordura perirrenal e relaciona-se ventralmente com parte do intestino

delgado e o esquerdo, com o estômago, parte do omento, baço e pâncreas. Em relação à topografia

dos rins no rato, o direito é mais cranial do que o esquerdo, assim como os seus vasos do pedículo

(TAGUCHI et al., 2001).

72

Devido à sua localização, o rim está situado dorsalmente às estruturas e órgãos abdominais,

sendo necessárias algumas manobras atraumáticas para a sua exposição, por exemplo: o duodeno

descendente e cólon descendente podem ser tracionados inferior e medialmente para melhor

visualização do rim direito e esquerdo, respectivamente.Os rins são órgãos pares que lembram a

forma de um grão de feijão e localizam-se no espaço retroperitoneal, lateral à aorta e à veia cava

caudal. Eles têm uma cápsula fibrosa e são mantidos em sua posição pelo tecido conjuntivo

subperitoneal. Na parte medial côncava de cada rim, localiza-se o hilo renal, local onde se

encontram a artéria e a veia renal, vasos linfáticos, plexos nervosos e o ureter, que se expande

dentro do seio renal, formando a pelve. O rim é irrigado pela artéria renal, a qual se origina da

artéria aorta. A veia renal drena o rim e desemboca na veia cava inferior.

73

MATERIAL E MÉTODOS

1. Modelo de isquemia e reperfusão renal

Essa fase experimental foi importante para a otimização e estabelecimento de modelo

cirúrgico de isquemia e reperfusão. Nessa fase testaram-se dois tempos de isquemia: 45 e 50

minutos e duas marcas de clampes atraumáticos vasculares buldogue, os quais foram denominados

clampe 130

e 231

. Foram utilizados 12 ratos, três em cada protocolo cirúrgico: 45 minutos com o

clampe 1, 50 min com o clampe 1, 45 min com o clampe 2 e 50 min com o clampe 2.

A indução e a manutenção anestésica foi realizada em câmara de isoflurano vaporizado a

100% de O2. Realizou-se a antissepsia em solução alcoólica de clorexidine 0,2%, seguida de

paramentação do campo cirúrgico.

Para o acesso da cavidade abdominal realizou-se uma celiotomia mediana pré-retro-

umbilical e em seguida os órgãos abdominais foram envolvidos em gaze umedecida com solução

salina morna. Para acesso ao rim direito, tracionava-se o cólon ascendente para o esquerdo e com o

auxílio de uma pinça, na parede abdominal do lado oposto, o rim era exposto para a sua

manipulação. Para acesso ao rim esquerdo, tracionava-se o cólon descendente para o lado direito.

Dissecava-se o hilo renal para a colocação do clampe atraumático vascular buldogue, seguido do

seu posicionamento ao redor do pedículo renal por 45 ou 50 minutos, dependendo do grupo. Após a

colocação do clampe, observou-se alteração da coloração renal (Figura 27). A reperfusão renal foi

confirmada visualmente após a remoção dos clampes.

Os animais foram mantidos aquecidos em colchão térmico até a completa recuperação

anestésica e receberam como analgesia pós-operatória buprenorfrina na dose de 0,1mg/kg a cada 12

horas por dois dias.

Figura 27. Aspecto do rim após colocação do clampe vascular atraumático buldogue no pedículo renal.

Obervar a coloração vermelho-acastanhada antes da colocação do clampe (A) e a evidência de isquemia o seu

escurecimento após a colocação do clampe (B).

30

Fine science tools 31

Edlo

74

Todos os procedimentos envolvendo animais seguiram as normas do comitê de ética e

experimentação animal da Universidade Federal de Santa Maria. Os animais foram mantidos em

gaiolas forradas com maravalha, em ambiente com temperatura controlada (24ºC ± 2ºC) e umidade

controlada, com ciclo claro/escuro de 12 x 12 horas e alimentados com ração comercial e água ad

libitum.

2. Técnica cirúrgica de acesso ao rim para transplante celular

Para a otimização da técnica cirúrgica, injetou-se tinta nanquim na aorta abdominal com o

intuito de observar o trajeto do líquido injetado, testando-se duas diferentes técnicas.

Os ratos foram induzidos e paramentados da mesma forma como anteriormente. Para o

acesso da cavidade abdominal realizou-se celiotomia mediana pré-retro-umbilical e em seguida os

órgãos abdominais forma envolvido em gaze umedecida com solução salina morna. A aorta

abdominal foi dissecada caudalmente à artéria renal (Figura 28A). Após um fio mononálion4-032

foi

utilizado para realizar o reparo da aorta (Figura 28B). A fim de direcionar o fluxo das células

injetadas para a artéria renal, ocluiu-se a aorta com um clampe buldogue aproximadamente 1 cm

caudal aos pedículos renais, logo acima das artérias genitais (Figura 28C). No grupo A (n = 2),

0,8ml de nanquim foi injetado, sem a oclusão de qualquer pedículo renal e no grupo B (n = 2), o

pedículo renal direito foi ocluído (Figura 28D) antes da administração de 0,4 ml de tinta nanquim,

em seguida, o mesmo clampe foi reposicionado no pedículo renal esquerdo e administrado mais

0,4ml de tinta nanquim. A manobra para o acesso aos pedículos renais foi a mesma utilizada

anteriormente. Uma cateterização retrógrada foi realizada utilizando-se cateter 26G33

diretamente

na aorta abdominal em ângulo de 45°, logo acima do clampe posicionado na aorta anteriormente

(Figuras 29 e 30). Após a administração, o cateter for removido e a hemostasia foi realizada por

compressão manual do local de punção com uma membrana absorvível de colágeno34

previamente

umedecida com solução salina, por cerca de 5 minutos.

Os animais foram submetidos à eutanasia por exanguinação imediatamente após a

administração de nanquim pela aorta e os rins foram colhidos e armazenados em solução de formol

a 4%. Após 24h nessa solução, os rins foram processados para parafinização, seccionados em 4µm e

corados em Hematoxilina & Eosina.

32

Ethicon 33

Neoflon 26 g 0,6 X 19 mm -BD 34

Lyostypt® - B. Braum

75

Figura 28. Passos para o acesso à arterial renal. Dissecação da aorta abdominal caudalmente à artéria renal, indicada

pela seta branca (A), colocação de reparo ao redor da aorta abdominal (B), posicionamento do clample vascular

buldogue cerca de 1 cm caudal aos pedículos renais, logo acima das artérias genitais (C) e colocação do clampe no

pedículo renal direito, etapa necessária apenas no grupo B.

Figura 29. Esquema da cirurgia de acesso à artéria renal realizado no grupo B. Colocação dos clampes na artéria aorta

abdominal, caudalmente às artérias renais e no pedículo renal direito (A); localização da inserção do cateter 26G.

ligeiramente cranial ao clampe buldogue para administração de metade da tinta naquim (B) e transferência do clampe

do pedículo direito para o esquerdo com o intuito de permitir a administração da outra metade da tinta nanquim.

A B C

76

Figura 30. Ângulo de inserção do cateter na aorta abdominal para acesso da artéria renal.

3. Transplante de hAFSC transduzida com Lac-Z

Com o intuito de localizar o posicionamento das AFSCs e sua distribuição após 24h de sua

administração, injetou-se AFSCs marcadas com LAC-z, um gene repórter, na aorta abdominal após

6 horas da indução da isquemia e reperfusão renal. A técnica do grupo B, descrita anteriormente, foi

utilizada nesse caso. A eutanásia foi realizada 24 horas após o transplante celular com inalação de

isoflurano, no interior de um recipiente, seguindo a legislação em vigor e os preceitos do Colégio

Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Os rins, pulmões, coração, baço e fígado foram

colhidos e colocados em um molde com meio OCT, próprio para congelamento, para posterior

análise. Realizaram-se criosecções de 5 µm de espessura, posteriormente incubadas em solução X-

gal pH 8,0, durante a noite, em câmara escura. As lâminas foram contracoradas com paracarmina e

montadas em meio Mowiol.

4. Indução da lesão e transplante celular

Grupos animais

Foram usados 50 ratos machos da raça Wistar, 3 meses de idade, pesando entre 250-300 g,

distribuídos nos seguintes grupos após lesão de isquemia e reperfusão (n=10): Controle, tratado

apenas com o meio Chang; grupo AFSC, tratado com AFSCs (1x106); grupo AFSC-VEGF, tratado

com AFSCs transduzida com VEGF (1x106); grupo AFSC-HGF, tratado com AFSCs transduzida

com HGF (1x106); grupo AFSC-VEGF+HGF, tratado com AFSCs transduzida com VEGF

(0,5x106) e transduzida com HGF (0,5x10

6). No grupo sham (n = 4) os animais foram operados,

77

sem lesão de isquemia/reperfusão e sem tratamento.

Os ratos foram induzidos em câmara de isoflurano vaporizados com 100% de O2 e mantidos

com esse mesmo gás anestésico em máscara durante todo o procedimento cirúrgico. Realizou-se a

antissepsia em solução alcoólica de clorexidine 0,2%, seguido de paramentação do campo cirúrgico.

A lesão por isquemia e reperfusão foi induzida da mesma forma como descrita anteriormente, ou

seja, pelo clampeamento do pedículo renal por 50 minutos. A reperfusão do rim foi confirmada

visualmente após os clampes serem removidos. Seis horas após a lesão isquêmica, realizou-se o

transplante celular na aorta abdominal em dois tempos, como descrito anteriormente.

Administraram-se 800 μl da suspensão celular (1,0x106 celular) em meio Chang nos grupos

tratados, ou seja, 400 µl em cada rim e nos animais do grupo controle administrou-se o mesmo meio

Chang, pela mesma via e mesma forma.

Colheita de material

Após 24 horas de tratamento 0,5 ml de sangue foi colhido da veia da cauda. Os ratos foram

submetidos à eutanásia por meio de exsanguinação em ratos anestesiados em câmara de isoflurano

após 48 horas (n = 5 ratos para cada grupo) e após 2 meses do tratamento (n = 5 ratos para cada

grupo). Em ratos anestesiados com isoflurano, colheram-se de 10-15 ml de sangue da aorta

abdominal para a quantificação de VEGF sérica e creatinina. Cada rim foi pesado e depois

seccionado longitudinalmente, sendo metade fixada em 10% de formol tamponado neutro para

exame histológico e imuno-histoquímica, e a outra metade foi congelada e armazenada em

nitrogênio líquido para análise de RT-PCR.

5.Análises do efeito da terapia celular

Função Renal

A creatinina sérica foi mensurada para avaliar a função renal nos tempos 24 horas, 48 horas

e dois meses após a reperfusão. A mensuração foi realizada em um leitor de ELISA, usando-se a

técnica de Jaffé, como descrita anteriormente.

Quantificação de VEGF sérico

Quantificou-se VEGF sérico em todos os ratos 24h após o transplante celular. Para isso, 10

µl de soro de cada animal foram diluídos em 90 µl de tampão carbonato e adicionados a um poço de

uma placa de 96 poços e realizou-se a técnica de ELISA, como descrito no capítulo 1.

78

Análise histologica da lesão de isquemia e reperfusão em 48 horas

Morfologia renal: Amostras fixadas em formol forma parafinizadas e depois seccionadas

com espessura de 4 µm. Após serem desparafinizadas, foram coradas com os reagentes

Hematoxilina & Eosina e ácido periódico de Schiff (PAS). As laminas foram avaliadas e

classificadas quanto a: formação de cilíndros hialinos, necrose tubular, mitose, dilatação tubular e

presença de infiltrado intersticial mononuclear. Observaram-se campos não-sobrepostos em alta

magnificação utilizando uma objetiva de 40X. A classificação variou de 0 a 5, sendo 0 quando não

havia lesão; +1 quando observava-se lesão em padrão isolado; +2 quando observava-se menos de

25% de lesão por campo; +3 quando observava-se lesão entre 25 e 50% do campo; +4 quando

observava-se lesão entre 50 e 75% do campo e +5 quando mais de 75% do campo. As laminas

foram avaliadas por um observador independente, de maneira cega.

Imuno-histoquímica: Com o intuito de analisar o índice de mitose, a presença de

miofibroblastos e a expressão de TGF-β, realizou-se a análise de imuno-histoquímica para KI-67, α-

SMA e TGF- β, respectivamente. A imunocoloração foi realizada em secções parafinizadas de 4

µm. Em resumo, realizou-se a desparafinização, seguido de bloqueio da peroxidase endógena com

0,5% H2O2 diluída em metanol durante 30 min à temperatura ambiente. A recuperação do antígeno

foi realizada em tampão citrato (10 mmol / L, pH 6,0) por duas horas a 95°C. Em seguida o

bloqueio antigênico foi realizado por meio da incubação das secções com 1% BSA e 2% leite em

PBS + 1% Tween 80 durante 60 min. As lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os

seguintes anticorpos policlonais diluídos em PBS: actina de músculo liso-α (α-SMA35

) em diluição

1/200, Ki-6736

em diluição 1/50 e Fator de crescimento transformador-β (TGF-β37

) em diluição

1/150. Utilizaram-se como controle negativo amostras sem a incubação com anticorpo primário. A

marcação específica foi detectada com o anticorpo secundário conjugado ao HRP38

, de acordo com

o anticorpo primário A reação de cor foi revelada com 3,3 '-diaminobenzidina39

(DAB) e

contracorada com Hematoxilina de Mayer. Os cortes foram gradualmente desidratados em etanol e

xilol e as lâminas montadas em DEPEX. Realizaram-se três lavagens das lâminas com PBS por 5

min entre todos os passos do procedimento, exceto após o bloqueio antigênico. Todas as lâminas

foram avaliadas por um patologista experiente de maneira cega para identificação da amostra. As

células Ki-67-positivas eram detectadas pela marcação intranuclear das células dentro da túbulos

em magnificação de 400x e o TGF-β e α-SMA foram observados em magnificação de 200X (n = 5

35

α-SMA, clone 1A4, Dako, Belgium. 36

Ki-67 clone MIB -5, Dako, Belgium. 37

ab66043 TGF-β, Abcam, Belgium. 38

Envision ™ WAS / HRP Detection Kit, Dako, Belgium. 39

3,3 '-diaminobenzidina –Sigma, Barnem, Belgium.

79

ratos para cada grupo).

Análise morfométrica para índice mitogênico: Foram analisadas 29 lâminas obtidas através

da técnica imuno-histoquimica. Em cada lâmina foram capturados doze (12) campos, não

coincidentes com um aumento aproximado de 400X. Em cada campo microscópico foi efetuada a

quantificação de células Ki-67 positivas, determinada pela coloração acastanhada, sem levar em

consideração a intensidade da coloração.

Para a análise morfométrica, utilizou-se a ferramenta de medição do Sistema de

Processamento e Análise de Imagens IMAGE TOOL® - versão 3.0.

Análise histologica da lesão de isquemia e reperfusão dois meses após a cirurgia

Morfologia Renal: Amostras fixadas em formol foram parafinizadas e depois seccionadas

com espessura de 4 µm. Após serem desparafinizadas, foram coradas com os reagentes

Hematoxilina & Eosina, Tricômico de Masson e Picrosirius Red, sendo que os dois últimos coram

colágeno de azul e de vermelho, respectivamente. A análise das lâminas coradas com Hematoxilina

& Eosina, quantificou dilatação tubular; presença de cilindros hialinos, infiltrado mononuclear

intersticial, proliferação fibrosa interna e subcapsular; espessamento da cápsula glomerular e atrofia

glomerular. Observaram-se campos não-sobrepostos em alta magnificação utilizando uma objetiva

de 40X. A classificação variou de 0 a 5, sendo 0 quando não havia lesão; +1 quando observava-se

lesão em padrão isolado; +2 quando observava-se menos de 25% de lesão por campo; +3 quando

observava-se lesão entre 25 e 50% do campo; +4 quando observava-se lesão entre 50 e 75% do

campo e +5 quando mais de 75% do campo. Nas lâminas coradas pelo Tricrômico de Masson,

observou-se principalmente a presença de fibrose e os resultados foram avaliados por morfometria.

Para a análise das secções coradas por Tricrômico de Masson, utilizou-se uma objetiva de 20X e

para a análise das secções coradas pó Picrosirius Red, utilizou-se uma objetiva de 10X, sob luz

polarizada.

Morfometria para a fibrose renal: Foram analisadas 29 lâminas obtidas através da

coloração Tricrômico de Masson. Em cada lâmina foram capturados vinte (20) campos, não

coincidentes com um aumento aproximado de 200X. Em cada campo microscópico foi mensurada a

área de fibrose, determinada pela coloração azul, sem levar em consideração a intensidade da

coloração.

Para a análise morfométrica, utilizou-se a ferramenta Colour Deconvolution do Sistema de

80

Processamento e Análise de Imagens FIJI para IMAGE J ®.

Formação de tumor

Visto que o VEGF é conhecido por ser um potente indutor da angiogênese, especialmente

relacionado com a angiogênese tumoral, avaliou-se a formação de tumor durante a colheita de

amostras dois meses após o transplante celular. A mensuração de VEGF sérico foi também realizada

pelo método ELISA, uma vez que níveis elevados de VEGF sérico podem indicar a presença de um

tumor secretor de VEGF.

6. Análise estatística

Os resultados foram expressos como média e desvio padrão. Os dados foram analisados pelo

método não paramétrico Kruskall-wallis, seguido do teste de Dunn ou Anova, seguido de Tukey.

Considerou-se o nível de significância estatística de p< 0,05. Para a sobrevida, realizou-se o teste

Kaplan Meir.

81

RESULTADOS

1. Modelo de isquemia e reperfusão renal

O modelo de lesão foi mais eficiente utilizando o clampe 2, por 50 minutos. Utilizando o

clampe 1 observou-se ligeiro aumento da creatinina, no entanto, houve aumento mediano da

creatinina (cerca de duas vezes o valor basal). Em relação ao tempo de isquemia, com a

permanência do clampe por 45 minutos houve aumento da creatinina, mas por 50 minutos esse

aumento era mais significativo, permanecendo a sobrevida dos animais inalterada.

2. Técnica cirúrgica de acesso ao rim

Inicialmente realizou-se a inserção do cateter por via normógrada, no entanto, pelo fato da

vasculatura da região a ser dissecada ser mais envolta de tecido conjuntivo e de acesso mais difícil e

pelo fato de a ponta do cateter ficar além do ramo das artérias renais, optou-se por modificar a

inserção para o modo retrógrado. Outra intercorrência cirúrgica observada foi a hemorragia da aorta

no ponto puncionado, sendo possível após a hemostasia por compressão com uma membrana

absorvível de colágeno.

Quando a administração do nanquim foi realizada em um só tempo, sem a colocação do

clampe nas artérias renais, observou-se a coloração preta da tinta nanquim apenas no rim direito

(Figuras 31 e 32). Dessa forma, conclui-se que a administração da tinta nanquim em duas etapas e a

colocação do clampe na artéria renal eram fundamentais para a administração homogênea em

ambos rins.

Figura 31. Aspecto dos rins direito (preto) e esquerdo vermelho-acastanhado), imediatamente após a administração de

nanquim em um tempo.

82

Figura 32. Rim direito (A) e esquerdo (B) corados por Hematoxilina & Eosina no grupo em que se administrou

nanquim (A) em apenas um tempo e sem a colocação de clampe na artéria renal (Magnificação100x).

3.Transplante de AFSC transduzida com Lac-Z

Com o intuito de avaliar onde as AFSC injetadas realizariam enxertia, amostras de rim,

coração, pulmão, fígado e baço foram coradas com solução X-gal para a detecção de células

marcadas com β-galactosidade. Observou-se a presença de células marcadas apenas em amostras do

pulmão e do baço (Figura 33), sendo que algumas vezes elas eram presentes em grandes

concentrações.

Figura 33. Amostras de criosecção coradas com solução X-gal. Baço (A) e pulmão (B) de rato, 24h após a

administração de hAFSC marcada com Lac-z (magnificação 200x).

4. Efeito do terapia com células transduzidas ou não com VEGF e HGF em lesão de isquemia

e reperfusão renal

Risco de embolismo

Três animais do grupo hAFSC HGF morreram imediatamente após o transplante celular.

Não foi observado esse efeito de morte súbita em nenhum outro animal de outros grupos. Não foi

83

realizada a necropsia desses animais.

Sobrevida

Avaliou-se a sobrevida dos diferentes grupos avaliados por dois meses, sendo observada alta

mortalidade no grupo hAFSC-HGF (3/8 ratos), sendo que dois deles morreram 5 dias e um aos 6

dias após a indução da I/R (Figura 34) Apenas um rato do grupo controle morreu aos 7 dias após a

indução da I/R.

Figura 34. Curva de sobrevida dos animais dos diferentes grupos de ratos com lesão de isquemia e reperfusão tratados

com células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico humano transduzida ou não com VEGF e HGF.

Função Renal

A função renal foi avaliada por meio da quantificação da creatinina nos diferentes grupos.

Quanto se comparou a creatinina sérica de um animal sham (saudável), observou-se aumento muito

significativo da creatinina no grupo controle, no entanto essa diferença foi mais significativa ainda

nos grupos AFSC VEGF e AFSC HGF, tanto em 24h quanto em 48h. Já o grupo AFSC apresentou

aumento significativo somente em 48h (Tabela 5).

Tabela 5. Valores séricos de creatinina em ratos com lesão de isquemia e reperfusão, nos tempos 24 h, 48 h e dois

meses, tratados com células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico humano transduzidos ou não com

VEGF e HGF.

Grupo Creatinina 24h (n=10) Creatinina 48h (n=10) Creatinina 2m (n=5)

Sham ou saudáveis 0,58±0,07 0,6±0,03 0,61±0,04

Controle 3,05±1,28** 2,45±1,93** 0,74±0,15

hAFSC 1,98±1,08 2,06±1,29* 0,75±0,18

hAFSC VEGF+HGF 1,96±0,55 1,28±0,35 0,8±0,21

hAFSC VEGF 3,9±2,03*** 4,29±3,32*** 0,62±0,05

hAFSC HGF 4,0±1,85*** 4,1±3,0*** 0,63±0,13

* p entre 0,05 e 0,01 ** p entre 0,01 e 0,001 ***p<0,001

84

VEGF sérico em 24 horas

Quantificou-se o VEGF sérico em 24 horas em todos os grupos (n=10), sendo observada

uma elevação em todos os grupos tratados com terapia celular em elação ao grupo controle, no

entanto essa diferença não foi significativa entre os grupos (Figura 35).

Figura 35. Gráficos com valores de VEGF sérico de ratos com lesão de isquemia e reperfusão após 24 h do tratamento

com células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico humano transduzidos ou não com VEGF e HGF.

Peso renal

Houve uma fraca tendência de redução do peso renal em todos os grupos aos dois meses, no

entanto essa diferença não foi significativa (Tabela 6).

Tabela 6: Peso dos rins de ratos submetidos à lesão de isquemia e reperfusão e tratados com células mesenquimais

estromais derivadas do líquido amniótico humano (hAFSC) transduzidas ou não com VEGF e HGF. Valores expressos

em gramas (g), com respectivas médias e desvio padrão. Kruskal wallis seguido de pós teste de Dunn.

Grupos Peso em 48h após I/R (g) Peso 2 meses após I/R (g)

Controle

Rim direito

Rim esquerdo

1,86±0,1

2,00±0,2

1,83±0,06

1,77±0,13

hAFSC

Rim direito

Rim esquerdo

1,93±0,01

1,86±0,08

1,79±0,21

1,72±0,22

hAFSC VEGF +HGF

Rim direito

Rim esquerdo

1,99±0,26

1,95±0,23

1,85±0,17

1,8±0,16

hAFSC VEGF

Rim direito

Rim esquerdo

1,72±0,23

1,65±0,18

1,8±0,16

1,86±0,24

hAFSC HGF

Rim direito

Rim esquerdo

1,89±0,17

1,92±0,22

1,84±0,21

1,88±0,27

Morfologia renal 48 horas

85

Observou-se necrose e formação de cilíndros hialinos em graus variados nos diferentes

grupos, sendo estes observados tanto na coloração de H&E quanto na coloração PAS. A

quantificação desses dados por um patologista em ensaio cego nos permitiu comparar os

tratamentos quanto à lesão tubular aguda (Tabela 7), sendo observadas lesões mais intensas nos

grupos controles, hAFSC VEGF e hAFSC HGF (Figuras 36 e 37). Além disso, observou-se intensa

atividade mitótica e a presença de infiltrado mononuclear intersticial nos diferentes grupos. Houve

correlação do grau de lesão tubular aguda com o aumento da creatinina (ANEXO 1).

Tabela 7. Média e desvio padrão dos escores de lesão tubular aguda em cortes histológicos de ratos corados por

Hematoxilina & Eosina nos diferentes grupos após 48 horas de lesão renal isquêmica tratados com células

mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico humano (hAFSC) transduzidas ou não com VEGF e HGF. *

AFSC difere do controle (p< 0,05).

Grupo Necrose tubular Cilíndros hialinos

Controle 2,7±0,97 4,4±0,65

hAFSC 1,8±0,76 1,9±0,96*

hAFSC VEGF +HGF 1,8±1,09 2,8±1,09

hAFSC VEGF 2,9±1,08 3,6±1,08

hAFSC HGF 2,7±1,2 3,9±0,96

86

Figura 36. Fotos representativas da histologia renal 48 horas após indução de isquemia e reperfusão por 50 minutos em

ratos. Cortes histológicos corados por H & E, objetiva de 10X: sham (ratos operados, sem indução de lesão e sem

tratamento; controle, ratos com I/R tratados com meio de cultivo; hAFSC, ratos com I/R tratados com células

mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico humanas (hAFSC); hAFSC VEGF + HGF, ratos com I/R

tratados com hAFSC transduzidas com VEGF e HGF; hAFSC VEGF, ratos com I/R tratados com hAFSC transduzidas

com VEGF e hAFSC HGF, ratos com I/R tratados com hAFSC transduzidas com HGF (n=5 por grupo).

87

Figura 37. Fotos representativas da histologia renal 48 horas após indução de isquemia e reperfusão por 50 minutos em

ratos. Cortes histológicos corados por ácido periódico de Schiff (PAS), objetiva de 10X: sham (ratos operados, sem

indução de lesão e sem tratamento; controle, ratos com I/R tratados com meio de cultivo; hAFSC, ratos com I/R

tratados com células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico humanas (hAFSC); hAFSC VEGF +

HGF, ratos com I/R tratados com hAFSC transduzidas com VEGF e HGF; hAFSC VEGF, ratos com I/R tratados com

hAFSC transduzidas com VEGF e hAFSC HGF, ratos com I/R tratados com hAFSC transduzidas com HGF(n=5 por

grupo).

88

Imuno-histoquímica para α-SMA e TGF-β

Quanto à análise imuno-histoquímica para α-SMA , que cora vasos sanguíneos e

miofibroblastos, classificou-se como marcação fraca e forte, desconsiderando-se os vasos

sanguíneos. Observou-se intensa positividade em 4/5 ratos do grupo hAFSC VEGF, 2/5 ratos do

grupo controle e apenas 1/5 do grupo hAFSC VEGF + HGF(Figura 38). Para as lâminas coradas

contra o TGF-β, foi observada intensa positividade em todos os ratos do grupo controle, em 4/5 do

grupo hAFSC VEGF e fracamente positivos em 2/5 do restante do grupo (Figura 39).

89

Figura 38. Fotos representativas de cortes histológicos de rins de ratos após indução de lesão de isquemia e reperfusão

por 50 mintuos corados pela técnica de imuno-histoquímica para α-SMA sendo observada a positividade em marrom e

utilizando-se objetiva de 20X: sham (ratos operados, sem indução de lesão e sem tratamento; controle, ratos com I/R

tratados com meio de cultivo; hAFSC, ratos com I/R tratados com células mesenquimais estromais derivadas do

líquido amniótico humanas (hAFSC); hAFSC VEGF + HGF, ratos com I/R tratados com hAFSC transduzidas com

VEGF e HGF; hAFSC VEGF, ratos com I/R tratados com hAFSC transduzidas com VEGF e hAFSC HGF, ratos com

I/R tratados com hAFSC transduzidas com HGF (n=5 por grupo).

90

Figura 39. Fotos representativas de cortes histológicos de rins de ratos após indução de lesão de isquemia e reperfusão

por 50 minutos corados pela técnica de imuno-histoquímica para TGF-β, sendo observada a positividade em marrom

eutilizando objetiva de 20X: sham (ratos operados, sem indução de lesão e sem tratamento; controle, ratos com I/R

tratados com meio de cultivo; hAFSC, ratos com I/R tratados com células mesenquimais estromais derivadas do líquido

amniótico humano (hAFSC); hAFSC VEGF + HGF, ratos com I/R tratados com hAFSC transduzidas com VEGF e

HGF; hAFSC VEGF, ratos com I/R tratados com hAFSC transduzidas com VEGF e hAFSC HGF, ratos com I/R

tratados com hAFSC transduzidas com HGF (n=5 por grupo).

91

Morfometria para Ki-67

Observou-se a intensa presença de células mitóticas nos túbulos renais, indicada pela

marcação intranuclear (Figura 40). Esses núcleos foram quantificados em doze campos de grande

aumento, sendo observada a presença mais significativa (p<0,001) nos grupos AFSC CEGF+ HGF

e AFSC VEGF (Figura 41). Quantificou-se apenas as células epiteliais tubulares positivas (ANEXO

2)

Figura 40. Imuno-histoquímica para KI-67 de tecido renal, região cortical, de um rato após 48 h de indução da lesão de

isquemia e reperfusão, tratado com células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico humano (20X).

Figura 41. Análise do indíce mitogênico avaliado por morfometria das lâminas coradas por imuno-histoquímica para

KI-67. Gráfico indica núcleos positivos por campo de grande aumento nos diferentes grupos analisados. *** indica

diferença significativa p<0,0001.

92

Morfologia renal aos dois meses

A avaliação da fibrose intersticial foi estudada pela coloração Tricrômico de Masson,

Hematoxilina & Eosina e Picrosirius Red. No momento da colheita dos rins, observou-se que

alguns apresentavam irregularidades na superfície, parecendo pequenas granulações ou depressões

na região cortical. Aos dois meses após a indução de isquemia e reperfusão renal já se pôde

observar áreas de fibrose de graus variados nos cortes histológicos de rim corados por H&E,

Tricrômico de Masson e Picrosirius Red. A fibrose pôde ser observada em todas as colorações

estudadas, no entanto utilizou-se o tricrômico de Masson posteriormente para análise morfométrica,

pelo maior contraste de cor entre o tecido saudável e o fibroso. A classificação feita pelo patologista

encontra-se no ANEXO 3, desses dados analisou-se a fibrose subcapsular e a fibrose intersticial

interna quanto à diferença estatística (Tabela 8). Nessa análise, observou-se um maior grau de

fibrose renal subcapsular nos grupos controle, hAFSC VEGF e hAFSC HGF e maior grau de

fibrose intersticial interna nos grupos controle e hAFSC HGF. Esses dados estão representados nas

figuras 42 e 43.

Tabela 8. Média e desvio padrão dos escores de lesão tubular aguda em cortes histológicos de ratos corados por H&E

nos diferentes grupos após 48 horas de lesão renal isquêmica tratados com células mesenquimais estromais derivadas do

líquido amniótico humano (hAFSC) transduzidas ou não com VEGF e HGF. *difere do sham(p< 0,05). Kruskal Wallis

pós teste Dunns.

Grupo Fibrose subcapsular Fibrose intersticial interna

Sham ou saudáveis 0,0±0,0 0,06±0,08

Controle 2,8±1,5* 3,24±1,15*

hAFSC 1,5±1,5 2,08±1,39

hAFSC VEGF +HGF 1,033±0,79 1,66±1,08

hAFSC VEGF 2,7±1,3* 2,2±1,2

hAFSC HGF 2,8±2,02* 3,3±1,7*

93

Figura 42. Fotos representativas da histologia renal 2 meses após indução de isquemia e reperfusão por 50 minutos em

ratos. Cortes histológicos corados por Tricrômico de Masson, evidenciando o colágeno tipo I em azul utilizando

objetiva de 20X: sham (ratos operados, sem indução de lesão e sem tratamento; controle, ratos com I/R tratados com

meio de cultivo; hAFSC, ratos com I/R tratados com células estromais mesenquimais derivadas do líquido amniótico

humanas (hAFSC); hAFSC VEGF + HGF, ratos com I/R tratados com hAFSC transduzidas com VEGF e HGF; hAFSC

VEGF, ratos com I/R tratados com hAFSC transduzidas com VEGF e hAFSC HGF, ratos com I/R tratados com hAFSC

transduzidas com HGF (n=5 por grupo).

94

Figura 43. Fotos representativas da histologia renal 2 meses após indução de isquemia e reperfusão por 50 minutos em

ratos. Cortes histológicos corados por Picrosirius red. Foto capturada com luz polarizada e objetiva de 10X: sham

(ratos operados, sem indução de lesão e sem tratamento; controle, ratos com I/R tratados com meio de cultivo; hAFSC,

ratos com I/R tratados com células estromais mesenquimais derivadas do líquido amniótico humanas (hAFSC); hAFSC

VEGF + HGF, ratos com I/R tratados com hAFSC transduzidas com VEGF e HGF; hAFSC VEGF, ratos com I/R

tratados com hAFSC transduzidas com VEGF e hAFSC HGF, ratos com I/R tratados com hAFSC transduzidas com

HGF (n=5 por grupo).

95

Análise morfométrica para fibrose renal

A avaliação da área de fibrose intersticial foi estudada pela coloração Tricrômico de Masson.

Quando se comparou a área de fibrose nos diferentes grupos com grupo controle, observou-se uma

área significativamente menor (P<0,0001) no grupo hAFSC VEGF + HGF, sendo interessante

ressaltar que nos grupos AFSC VEGF e AFSC HGF observou-se uma área ainda maior de fibrose,

embora não significativa estastisticamente (Figura 44). A forma como foi realizada a mensuração

da área de fibrose está reperesentada pela figura no ANEXO 4.

Figura 44. Análise da fibrose renal avaliada por morfometria das lâminas coradas pelo tricrômico de Masson. Gráfico

indica porcentagem da área positiva por campo de grande aumento nos diferentes grupos analisados.* indica diferença

comparado ao grupo hAFSC VEGF. *** indica diferença significativa p<0,0001 quando comparado com todos os

outros grupos. ANOVA , pos teste Tukey.

Formação de tumor

No momento de colheita dos materiais para análise, observou-se um tumor cutâneo,

levemente aderido à musculatura de tamanho 2 cm X 0,9 cm em apenas um dos ratos do grupo

AFSC VEGF, nesse mesmo animal observou-se que o valor do VEGF sérico triplicou em relação a

um animal saudável. Esse mesmo aumento significativo foi observado em outro animal do mesmo

grupo. O tumor foi classificado por um patologista como hemangioma.

96

4. DISCUSSÃO

Nos últimos anos, as CTs surgiram como uma ferramenta promissora na medicina

regenerativa. Suas características de auto-renovação e pluripotência sugerem que elas podem ser

úteis para reparar o tecido lesionado e reconstruir órgãos danificados (STOCUM, 2001). O líquido

amniótico despertou recentemente o interesse de cientistas como uma fonte alternativa de células

pluripotentes. Sabe-se há muito tempo da presença de células maduras, já diferenciadas, tais como

células musculares lisas, osteoblastos e células epiteliais do pulmão (TSANGARIS et al., 2005) e

recentemente identificou-se a presença de células progenitoras (DE COPPI et al., 2007). Estas

hAFSCs foram facilmente obtidas por meio de amniocentese, e teve a grande vantagem de evitar as

preocupações éticas associadas com o uso de ESCs, além de ser facilmente propagadas em cultivo,

mantendo a capacidade pluripotencial.

A aplicação de terapia celular requer importantes escolhas, entre elas a fonte, a qual deverá

ser fácil e rapidamente expandida em grandes quantidades, mantendo as suas características

homogêneamente e livre de patógenos ou xenógenos. De acordo com a literatura (DE COPPI et al.,

2007; PHERMTHAI, et al., 2010; ROUBELAKIS et al., 2011), focou-se esse estudo em dois

métodos diferentes de isolamento de hAFSCs para tratamento médico: a seleção c-Kit (DE COPPI

et al., 2007) e a seleção mecânica, por meio de uma “célula de partida” para produção clonal

(PHERMTHAI, et al., 2010;. ROUBELAKIS et al., 2011). Seguindo o protocolo de Imunoseleção

para c-kit, não foi possível isolar uma população homogênea de hAFSC como mostrado por uma

morfologia heterogênea das células em cultura e pela obtenção de populações com diferentes graus

de positividade para o marcador CD117, sendo então obtido apenas um enriquecimento de células

que expressassem este marcador. Além disso, esse método é apropriado apenas para pesquisa, uma

vez que é necessária a utilização de anticorpos criados a partir de animais. A fim de tornar as células

seguras para uso humano, preferiu-se o foco desse estudo na técnica de seleção mecânica, método

no qual não se utilizam substâncias xeno-imunológicas, permitindo o desenvolvimento e o

aprimoramento de um sistema de produção xeno-livre.

O estudo realizado por DE COPPI et al. (2007) estabeleceu uma linhagem celular utilizando

cultura celular primária do líquido amniótico, isolamento das AFSC c-kits+ e a derivação de uma

linhagem clonal oriunda de uma única célula. Utilizando o método de isolamento mecânico de uma

célula de partida, essas três etapas podem ser combinadas em apenas um passo. Isso faz com que

esse protocolo seja simples e rápido de ser realizado. Além disso, a linhagem de células clonais

obtida do líquido amniótico tem uma alta homogeneidade, como observado pela citometria de

fluxo. Dessa forma, esse método possibilita a seleção específica de uma linhagem que se aplique em

diferentes terapias médicas, de acordo com a necessidade de expressão de diferentes marcadores de

97

superfície e do tipo de lesão. No caso desse estudo, selecionou-se uma linhagem que expressasse

CD117 e CD24, visto que o CD117 é um marcador de pluripotência e o CD24 de células

precursoras renais (PERIN et al., 2007).

Para a seleção das células de partida em uma cultura primária, utilizaram-se células que

estavam ativamente em proliferação, tendo a mesma morfologia e sendo equidistantes umas das

outras. A análise da expressão de clones derivados de células individuais de partida, determinada

pela análise FACS, documentou a presença de marcadores mesenquimais como CD44, CD90,

CD73, CD29, HLA-ABC, CD105 e uma expressão de c-kit (CD117) e CD24 variáveis e ausência

de marcadores CD hematopoiéticos (CD34 e CD45), assemelhando-se ao fenótipo das MSCs

descritas como critérios padrão (DOMINICI al. de 2006). Para demonstrar ainda mais o potencial

de pluripotencialidade foi possível diferenciar as hAFSCs em múltiplas linhagens mesodérmicas

(adipogênica, osteogênica e condrogênica) em amostras originadas de todas as semanas

gestacionais.

O Oct-4 desempenha um papel crítico na manutenção da pluripotência e auto-renovação das

ESCs (NIWA et al., 2000; PESCE & SCHOLER, 2001) e é especificamente expresso em células

tronco embrionárias (ESCs), mas também pode ser detectada em CTA tais como derivadas da

medula óssea de células mesenquimais estromais (POCHAMPALLY et al., 2004). Esperava-se que

todas as linhagens expressassem Oct-4, no entanto detectou-se esse a expressão desse gene somente

nas linhagens derivadas da 19º e da 22º semana, indicando que existe uma variação grande entre as

amostras.

A fim de ser capaz de selecionar as células transduzidas, investigou-se um processo de

seleção baseado na imunoseleção por CD34. As experiências anteriores mostraram que a seleção

baseada em genes de resistência quimioterapêuticos (Blasticidine, puromicina e higromicina)

resultou na morte de todas as células (transduzidas e não transduzidas, dados não mostrados). A

seleção baseada em FACSorting usando eGFP é viável, mas requer manipulação semi-estéril de

células e depende da disponibilidade desse equipamento de classificação celular. Como uma

alternativa explorou-se a seleção MACS usando anticorpos magneticamente marcados. Como as

hAFSC não expressam o marcador hematopoiético CD34, optou-se por utilizar uma versão truncada

da proteína CD como alvo para o anticorpo.

Um dos objetivos da terapia celular é utilizar as células-tronco como vetor para introduzir

genes terapêuticos em um órgão deficiente. Nesse estudo demonstrou-se que as hAFSCs

mecanicamente selecionadas são eficientemente transduzidas com o vetor lentiviral expressando

genes repórteres LacZ e GFP, e com genes terapêuticos HGF e VEGF, com nenhum efeito de

silenciamento após múltiplas passagens em cultura, além de ter conservado a expressão de

98

marcadores mesenquimais e do potencial de diferenciação. Observou-se inclusive que após

transdução com VEGF, aumentou o potencial de diferenciação em linhagens osteogênicas e

condrogênicas das AFSCs, o que as torna interessantes para a terapia de afecções ortopédicas.

Comprovou-se a eficácia da transdução das hAFSCs com VEGF e HGF por meio de PCR

em tempo real e imunofluorescência, obtendo-se uma superexpressão de 121 vezes e 4451 vezes,

respectivamente. A elevada eficiência de infecção das AFSCs e sua capacidade de manter o

potencial mesenquimal após a infecção faz dessas células candidatas ideais para aplicações de

terapia celular e gênica.

O mecanismo de ação da melhora da função renal após a terapia com células-tronco ainda

não foi totalmente elucidado. Alguns estudos sugerem que ocorra fusão das MSCs com as células

tubulares residentes; outros estudos sugerem que as MSCs são capazes de se diferenciar em células

residentes renais, no entanto a ação parácrina é a que tem sido mais aceita ultimamente, pela

secreção de fatores de crescimento, tais como VEGF, HGF e IGF-1, mediando uma ação

antiapoptótica e mitogênica (TÖGEL et al., 2005; BI et al. 2007). Assim como as MSCs, tem sido

documentada a secreção de níveis elevados de fatores de crescimento pelas AFSC, tais como o

VEGF, no entanto as MSCs têm uma secreção muito mais elevada do HGF.

A existência de um sistema progenitor renal em rins de mamíferos adultos leva os

pesquisadores a questionarem por que a capacidade regenerativa do rim manifesta somente em

alguns casos e por que a lesão não leva à geração de novos néfrons, apesar da alta similaridade

estrutural e molecular, assim como ocorre em fetos de humanos e em peixes. ROMAGNANI (2009)

acredita que, provavelmente, isso ocorra devido à rápida interposição de tecido fibroso, o qual

confere uma vantagem de sobrevivência pela prevenção de infecção e a desvantagem de prejudicar

a regeneração tecidual. O desvio entre a cicatrização por regeneração e a por formação de tecido

fibroso é principalmente controlada pela resposta imune, explicando porque fetos humanos, assim

como os peixes, os quais possuem o sistema imune imaturo, cicatriza sem a formação de cicatriz e

pode gerar novos néfrons (MESCHER & NEFF, 2005; SAGRINATI et al., 2006). Dessa forma, a

inibição da inflamação e o retardamento do processo fibroso, permite que as células tubulares

proliferem e regenerem o rim, antes que ocorra deposição de colágeno e matriz extracelular. Além

disso, após evento isquêmico renal ocorre microvasculopatia pós-isquêmica, que é caracterizada por

edema das células endoteliais levando subsequentemente à oclusão microvascular, em um

fenômeno de não-refluxo, o qual inibe a reperfusão (PATSCHAN et al., 2012), dessa forma a

utilização de uma terapia que module a inflamação, irá consequentemente ter um efeito

nefroprotetor, evitando a perpetuação da isquemia renal. Dada a importância da inflamação na

patofisiologia da LRA (HUMPHREYS &, BONVENTRE, 2008), foi importante considerar

mecanismos imunomodulatórios, que ocasionaria uma renoproteção.

99

A administração de proteínas recombinantes é limitada na prática clínica devido ao seu alto

custo. Em comparação com a administração de proteínas recombinantes, a terapia genética tem a

vantagem de poder sustentar a expressão do gene (SUZUMURA et al., 2008). Estudos recentes têm

estabelecido sistemas de distribuição de vários genes de fibrose tecidual por meio de manipulação

genética (YANG et al., 2001; SUZUMURA et al., 2008). No entanto, devido às limitações próprias

dos sistemas virais e não-virais, a sua utilização clínica é também limitada. Portanto, a partir de um

ponto de vista clínico, necessita-se de um método de transferência genética segura que alcance uma

expressão em longo prazo. Esta entrega de gene utilizando o sistema ex vivo tem várias vantagens.

Primeiro, a eficiência de transdução; a duração da expressão tanto de HGF quanto de VEGF in vivo

é controlável, visto que as MSCs administradas não sobrevivem por muito tempo após transplante.

Em segundo lugar, o transplante das células alvo após a transdução de genes in vitro evita o contato

direto com o vírus no corpo, diminuindo uma potencial toxicidade.

A diminuição de células transduzidas com HGF tCD34+ após imunoseleção e algumas

semanas em cultura indica que as células positivas foram afetadas de alguma forma, ou pela

diminuição da sua taxa proliferativa ou devido à indução de apoptose. Ocorreu aumento em 4451

vezes o valor de expressão de HGF nas hAFSC após transdução com vetores lentivirais codificando

HGF tCD34. Possivelmente o valor absoluto de secreção de HGF não é tão elevado, visto que, ao

contrário das MSCs da medula óssea, as AFSCs quase não secretam HGF (HAUSER et al., 2010) e

o PCR em tempo real foi realizado tendo as AFSCs como controle. Possivelmente ocorreu um

aumento na porcentagem de células positivas visto que as hAFSC VEGF apresentaram uma taxa de

crescimento maior do que a sua forma in natura.

Foi possível aumentar o nível de expressão de VEGF e HGF mantendo-se as características

tronco da linhagem celular utilizada, incluindo a mesma imunofenotipagem e mesmo potencial de

diferenciação. Utilizar células tronco transgênicas teve a vantagem de ter um efeito sinérgico pelo

tratamento celular e gênico, provendo uma maior secreção de dois dos mais importantes fatores de

crescimento para a regeneração renal. Dessa forma, o VEGF atuou na angiogênese, mitogênese e no

efeito antiapoptótico e o HGF atuou principalmente no retardo da ativação de miofibroblastos e

consequentemente da fibrose renal.

O processo de reparo da lesão requer a capacidade de diminuir a velocidade de resposta

fibrótica (ROMAGNANI et al., 2009), pela diminuição da inflamação e imunomodulação, dando

tempo para que as células progenitoras proliferem e possam regenerar o tecido e ao mesmo tempo

prevenir o acúmulo de matriz extracelular por meio de secreção de fatores de crescimento. Dessa

forma, a terapia celular nesse estudo teve como objetivo modular a inflamação e prover uma

concentração ainda maior dos principais fatores de crescimento para a regeneração renal.

A lesão por isquemia e reperfusão é uma das causas da LRA e ela ocorre em diversas

100

situações clínicas, incluindo o transplante renal, cirurgia da artéria renal, cirurgia da aorta

suprarrenal e certos estados hipotensivos. O efeito a longo prazo na lesão de I/R tem sido de

especial interesse no transplante renal (VANES et al., 1983; GJERTSONDW, 1991), visto que o

órgão após a remoção do doador rapidamente desenvolve sinais de isquemia, apesar do adequado

resfriamento e uso de fluidos preservativos (GUELER et al., 2004). O tempo de isquemia renal de

50 minutos utilizado nesse estudo foi efetiva para causar a lesão, caracterizado pelo aumento

significativo da creatinina, um dos exames mais utilizados para determinação da função glomerular

(FINCO, 1971; DIBARTOLA, 1997), sendo que seu aumento ocorre quando pelo menos 75% dos

néfrons estão afuncionais, ou seja, houve lesão generalizada dos rins nesse estudo.

Inicialmente considerou-se o transplante celular por via intrarrenal, pelo fato de ser próxima

ao órgão alvo (BANTUBUNGI et al., 2008), no entanto tem sido observado que as células

transplantadas por essa via frequentemente morrem antes de uma contribuição significante na

resposta de cura devido à limitada difusão de nutrientes e oxigênio (MUSCHLER et al., 2004).

Dessa forma, optou-se pela administração da terapia celular o mais próximo possível da artéria

renal, por possuir maior chance de enxertia de uma alta concentração de células dentro da área de

interesse, além de prevenir o homing de células transplantadas para outros tecidos são desejáveis.

Considerou-se a inserção do cateter de forma normógrada (crânio-caudal), pelo fato de as

células serem administradas na mesma direção do fluxo sanguíneo, no entanto observou-se que a

extremidade do cateter ficava além das artérias renais, além de ser necessária uma maior dissecação

da aorta, visto que na região suprarrenal o acesso é mais difícil. Dessa forma, optou-se pela inserção

retrógrada do cateter, de forma que a extremidade do cateter ficasse imediatamente cranial às

artérias renais. A colocação dos clampes tanto na aorta, caudal aos rins e na artéria renal

contralateral ao rim alvo, permitiu que o único direcionamento possível fosse a artéria renal do lado

em questão, distribuindo de forma homogênea a tinta nanquim.

Ocorreu a morte de três ratos alguns minutos após a administração das hAFSCs HGF em

três ratos. Acredita-se que a causa seja a obstrução vascular de um vaso importante, possivelmente

pela diminuição significativa da velocidade sanguínea nos vasos após a administração das MSCs já

documentada (FURLANI et al., 2009), além de ter sido observado que as hAFSCs transduzidas com

HGF apresentaram um aumento de volume celular, o que pode ter favorecido o embolismo nesses

animais. Por meio de angiografia observou-se redução do fluxo sanguíneo após transplante celular,

bem como evidências de obstrução microvascular, alertando os médicos para uma possível

limitação de administração sistêmica ou intra-arterial de MSCs (WALCZAK et al., 2008;

FURLANI et al., 2009).

Para determinar se as hAFSCs transplantadas iriam migrar e enxertar no rim lesionado,

injetaram-se AFSC marcadas com Lac-z; alguns pesquisadores têm comprovado que as MSCs

101

enxertam no rim após evento isquêmico, sendo que essas taxas são muito baixas (LIN et al., 2003) e

maiores em transplante autólogo e alógeno (TOGEL et al., 2009). Decidiu-se realizar o transplante

celular 6 horas após a indução da lesão para que houvesse a secreção dos fatores quimiotáticos no

rim lesionado, os quais estimulam a migração das MSCs. Ainda assim, não foi possível identificar

nenhuma célula marcada nos cortes histológicos analisados no tecido renal, sendo observado

somente no pulmão e baço. Acredita-se que o efeito observado após a terapia celular foi devido à

secreção de fatores solúveis das células presentes em outros órgãos, no entanto acredita-se que as

hAFSC que eventualmente tenham enxertado no rim tenham entrado em apoptose, pois apesar de as

MSC apresentarem quimiotaxia pelos locais de inflamação, este microambiente hostil do tecido

lesado, incluindo a isquemia e a fibrose, pode diminuir a sobrevida das MSCs exógenas (SY et al.,

2011). TOGEL et al., (2008) também observaram redução contínua das MSCs marcadas com

luciferina detectadas por bioluminescência. Os autores justificaram essa redução pela contínua

apoptose, visto que não se observou o deslocamento dessas células para outras regiões.

A renovação das células tubulares basais renais é excessivamente baixo e parece ocorrer

pelas células epiteliais tubulares terminalmente diferenciadas (VOGETSEDER et al., 2005). Ainda

que em taxas menores do que os grupos hAFSC e hAFSC VEGF+HGF, observou-se proliferação

das células tubulares mesmo nos animais controles, da mesma forma como relatado por outros

autores que observaram que epitélio tubular regenera após lesão renal aguda e que células tubulares

diferenciadas proliferam e migram para repor as células vizinhas que sofreram apoptose (LIU et al.,

2005; DUFFIELD et al., 2005; LIU & BRAKEMAN, 2008). Isso reflete a habilidade intrínsica de

sobrevivência das células tubulares para se adaptar à perda das células adjacentes por meio de

desdiferenciação e proliferação, com o intuito de repor as células que morreram com o insulto renal.

Levando em consideração a alta capacidade de proliferação das células tubulares no rim lesado,

acredita-se que as próprias células tubulares são a fonte do reparo do néfron (BONVENTRE, 2003).

Estudos foram realizados comparando a aplicação intravenosa sistêmica e a aplicação direta

na artéria renal, sendo observada uma maior melhora mais pronunciada na função renal quando

administradas arterialmente (TOGEL et al., 2008; ZONTA et al., 20 0). Outro estudo em

camundongos realizado por SCHREPFER et al. (2007) demonstrou que a aplicação por via

sistêmica intravenosa não era apropriada para atingir os seus locais de inflamação. ZONTA et al.

(2010) acreditam que isso tenha ocorrido pelo fato de haver maior migração de células para outros

rgãos quando aplicado por essa via. Atualmente acredita-se que essa migração ocorra

principalmente devido ao tamanho das CTs serem maiores que os pequenos capilares pulmonares,

formando um filtro e prendendo as células no pulmão (SCHREPFER et al., 2007; FISCHER et al.,

2009). Assim como observado por outros autores (BARBASH et al., 2003; RUSTER et al., 2006),

as AFSC administradas nesse estudo localizavam-se principalmente no pulmão e baço após 24 do

102

transplante celular. BARBASH et al. (2003) explicaram o elevado encarceramento pulmonar de

células sistemicamente infundidas, devido ao seu grande volume celular comparado aos

microcapilares pulmonares (BARBASH et al., 2003). No estudo realizado por WALCZAK et al.

(2008) o tamanho das MSCs variou entre 20 e 50 m e, embora as células fossem capazes de

ultrapassar a barreira intravascular, ocorreu o aprisionamento na vasculatura em 17% dos animais,

indicando risco evidente de oclusão vascular (WALCZAK et al., 2008).

Em modelos animais, existe uma relação direta entre a rarefação dos capilares peritubulares

e o desenvolvimento de cicatrizes glomerulares e tubulointersticiais. Ocorre redução da densidade

capilar após um mês do evento isquêmico e não há evidências de resolução após esse período,

possivelmente em decorrência da diminuição da expressão de fatores angiogênicos e o aumento da

expressão de inibidores da angiogênese (BASILE et al., 2008). Alguns pesquisadores acreditam que

isso favoreça subsequentemente o desenvolvimento de fibrose intersticial (BASILE et al., 2001;

BASILE et al., 2007). Essa lesão é progressiva visto que o aumento da fibrose irá

consequentemente comprometer a microvasculatura, diminuição da oxigenação e os nutrientes para

as células tubulares, aumento do estresse oxidativo tubular e da lesão das células tubulares,

possivelmente interferindo com o processo regenerativo e levando a uma maior fibrose (BASILE et

al., 2007). Dessa forma parece ser interessante a terapia de reposição de VEGF, o qual

possivelmente aumenta a neovascularização e diminui a inflamação (BASILE et al., 2008) e

consequentemente a fibrose, influenciando tanto a curto prazo na recuperação renal pelo aumento

da proliferação tubular, como evitando a progressão para DRC.

Em um modelo de lesão renal induzido por cisplatina, trataram-se camundongos com ESC

transduzida com VEGF, levando a um benefício na recuperação renal ainda maior do que as ESC

não transduzidas. Esses efeitos foram relacionados ao aumento da densidade microvascular e da

mitose e ao menor índice de apoptose (YUAN et al., 2011). Apesar de serem descritos diversos

benefícios do VEGF, observou-se nesse estudo uma lesão renal mais pronunciada do que o controle

no grupo tratado com hAFSC VEGF, tanto em relação à função renal quanto à necrose tubular.

Possivelmente em decorrência de uma dose muito elevada de VEGF, tornando-se tóxico. Visto que

o volume celular das hAFSCs transduzidas com VEGF serem ainda menores do que as AFSCs não

transduzidas, descarta-se a ocorrência de fibrose por embolismo das arteríolas renais. CHADE

(2012) citou alguns possíveis riscos associados ao uso de VEGF, principalmente quando em altas

doses, entre elas o risco de hipotensão, visto que esse fator de crescimento é um potente

vasodilatador; além de aumentar a permeabilidade dos neovasos, diminuindo a sua funcionalidade e

permitindo o maior extravasamento de citocinas inflamatórias para o espaço extracelular e ainda

pelo risco de formação de tumores e arterioesclerose.

Quando mensurou-se a concentração sérica de VEGF por ELISA não observou-se um

103

aumento significativo nos grupos tratados comparado com o grupo controle. Pelo fato de o VEGF

ser um mediador parácrino, níveis sistêmicos podem não refletir adequadamente alterações no

VEGF localmente. Além disso, a determinação do nível sérico ou plasmático do VEGF pode alterar

no momento da colheita, pela sua liberação pelas plaquetas e leucócitos (SCHRIJVERS et al.,

2004), podendo ser um dos motivos de não ter sido observada elevação significativa pelo teste

ELISA do VEGF sérico nos grupos nos quais esperava-se uma elevação desse fator de crescimento:

hAFSC VEGF e hAFSC VEGF + HGF.

Observou-se um efeito benéfico da terapia com hAFSC observado pela melhora na função

renal e menor índice fibrótico a longo prazo, no entanto obteve-se um efeito ainda melhor quando

associoram-se as hAFSCs transduzidas com VEGF e HGF. Já em 24 h observou-se o efeito

renoprotetor, pela redução significativa da creatinina tanto no grupo AFSC quanto no grupo AFSC

VEGF+HGF. Em 48h esse efeito foi ainda mais pronunciado no grupo AFSC VEGF +HGF,

observado pela diferença altamente significativa do valor de creatinina em relação ao grupo

controle, provavelmente em decorrência do efeito mitogênico, indicando regeneração.

Houve um aumento significativo da mitose nos túbulos renais nos grupos hAFSC VEGF

+HGF e no grupo hAFSC VEGF, indicado pela maior expressão de Ki-67. Associou-se esse maior

número de células positivas nesses grupos ao estímulo causado pelo VEGF, visto que se sabe que

esse fator de crescimento é mitogênico, estimulando a mitose até mesmo no grupo hAFSC VEGF

no qual havia necrose tubular intensa. O maior índice nesse grupo não foi devido à presença de

miofibroblastos que também expressam marcadores mitogênicos (FORBES et al., 2000), visto que

quantificaram-se apenas as células positivas presentes nos túbulos renais. Apesar do HGF ser

também descrito como mitogênico (OHMICHI et al., 1996), não foi possível observar esse efeito

por meio de análise imuno-histoquímica.

Estudos recentes sugeriram que o HGF é uma potente proteína renotrópica que desempenha

um papel crítico na promoção da reparação e na regeneração tubular renal após os estímulos

nocivos (KAWAIDA et al., 1994; MILLER et al., 1994; NIGAM et al., 2000; VARGAS et al.,

2000), e é um potente fator de sobrevivência protegendo as células epiteliais tubulares renais da

apoptose (YANG et al., 2001; KUAN, 2008). HGF é descrito como um dos fatores de crescimento

mais importantes para a inibição de fibrose renal, visto que tem efeito anti-inflamatório pela

supressão das células NK e do TNF-α (GONG et al., 2006). Outro efeito do HGF que diminui a

ocorrência de fibrose é a modulação do equilíbrio entre a síntese de matriz extracelular e a sua

degradação pelo aumento da expressão de metaloproteinases de matriz (MMP) e redução da

produção de inibidores de MMP (MIZUNO et al., 2000). Adicionalmente, o HGF tem efeito

antagônico ao TGF-β , o qual inibe a proliferação das células dos túbulos renais in vitro e estimula

a formação de matriz extracelular, agregação celular e apoptose (NOWAK et al., 1996) além de

104

diminuir a síntese de genes associados com a matriz extracelular (fibronectina e colágeno IV).

Já havia sido realizada a transdução de MSC com HGF, no entanto utilizando vetores

adenovirais (YU et al., 2008; CHEN et al., 2011), os quais apresentam expressão transiente de HGF.

Quando se injetaram-se 1x106 MSCs derivadas do cordão umbilical transduzidas com HGF,

utilizando vetores adenovirais em ratos com lesão I/R houve melhora significativa da função renal

somente 72 horas após o tratamento comparado com os outros grupos, caracterizado pelo efeito

mitogênico, antiapoptótico e anti-inflamatório desse fator de crescimento (CHEN et al., 2011). LIU

et al. (2011) também observaram a prevenção da fibrose renal em modelos de obstrução ureteral

unilateral em MSC transduzida com HGF, sendo observado esse mesmo resultado em

camundongos com lesão renal espontânea, no qual o HGF inibiu o TGF- β (MIZUNO et al., 998).

Em ratos tratados com HGF humano e de ratos por 28 dias, observou-se proteinúria,

albuminúria e hipertrofia glomerular apenas quando se administrou HGF humano, além do depósito

de anticorpos contra HGF humanos em áreas mesangiais e de estimular a produção de TGF-β .

Esses autores concluíram que esse efeito ocorre mediado por deposição de imuno-complexos

(MIZUNO et al., 2011). Esse mesmo efeito foi observado por IDO et al. (2011) quando o HGF foi

administrado por 14 dias, sendo observado que a lesão ocorre de maneira dose-dependente.

Observou-se proteinúria e albuminúria a partir de quatro dias após o início do tratamento, no

entanto sem que houvesse aumento de ureia e creatinina. Os valores de proteína e albumina

retornaram aos valores basais após a interrupção do tratamento, no entanto ocorreram alterações

histológicas, tais como deposição hialina nos glomérulos e túbulos e hipertrofia renal. No presente

estudo também se observou aumento da necrose tubular e de cilindros hialinos no grupo tratado

com 1x 106

hAFSC HGF. Acredita-se que isso tenha ocorrido por duas hipóteses: formação de

embolismo renal, já que três animais morreram imediatamente após o transplante celular e

observou-se aumento do volume celular nas hAFSC HGF favorecendo a oclusão vascular, ou uma

dose tóxica de HGF, já que esse efeito não foi observado no grupo tratado com metade do número

de hAFSC HGF. Existe ainda a possibilidade de ter ocorrido deposição de imunocomplexos, já que

as hAFSC administradas foram transduzidas com HGF humano.

A redução na expressão de α-SMA e TGF-β é indicadora de inibição da fibrose, visto que os

miofibroblastos aumentam a deposição de matriz extracelular, levando à atrofia tubular e

glomerular e o TGF- β é um mediador central que regula a transdiferenciação de células epiteliais

tubulares em miofibroblastos α-SMA-positivos (EFSTRATIADIS et al., 2009). Observou-se

redução da expressão de α-SMA e TGF-β em 48h nos grupos hAFSCs , hAFSC VEGF+HGF e

hAFSC HGF, coincidindo o resultado com a fibrose intersticial aos dois meses nos grupos hAFSC e

hAFSC VEGF+HGF, mas não no grupo hAFSC HGF indicando que provavelmente nesses animais

a fibrose ocorreu por outra via ou inicialmente o HGF pode inibir o TGF- β , no entanto ap s o

105

período de avaliação, perdeu-se o equilíbrio entre esses fatores de crescimento em decorrência da

intensa necrose tubular, ocorrendo liberação de TGF-β pelas células inflamat rias e

consequentemente inibindo a transcrição do gene HGF (INOUE et al., 2002), desenvolvendo o

processo fibroso (HAYASHI et al., 2010). Outros grupos também observaram a redução da

expressão de TGF- β e α-SMA em ratos em que se induziu DRC pelo modelo nefrectomia 5/6

quando administraram-se plasmídeos expressando HGF (WANG et al., 2011).

Visto que a efetividade terapêutica das MSCs em lesões renais agudas é mediada

primariamente por um mecanismo parácrino, a presença prolongada das MSCs no local de lesão

poderia melhorar ainda mais a efetividade das células administradas (TOGEL et al., 2008). Dessa

forma, estratégias que aumentem o índice de adesão e enxertia e a quimiotaxia para diferentes

órgãos alvos estão em desenvolvimento e incluem a engenharia genética de propriedades de

superfície (SACKSTEIN et al., 2008).

Sugere-se maior investigação do efeito deletério observado pela administração de 1x106

AFSC transduzidas tanto com VEGF e quanto com HGF no tratamento de lesão renal isquêmica.

Caso esse efeito ocorra devido a uma eventual dose tóxica desses fatores de crescimento, indicam-

se exames para mensurar a secreção desses pelas AFSCs, sendo então possível calcular uma dose

terapêutica. Essa dose seria individual, dependendo da linhagem utilizada, visto que depende da

porcentagem de células eficientemente transduzidas, e que estejam secretando tais proteínas.

Apesar de não ter sido até o momento relatada a ocorrência de tumores após administração

de AFSC, observou-se nesse estudo ....A formação do tumor cutâneo em um rato do grupo VEGF

pode ter sido ao acaso, ou em decorrência das altas concentrações de VEGF. É necessária a

realização de testes, tais como HLA-AB, para avaliar se as hAFSC estariam presentes na massa

tumoral, confirmando que as células transplantadas foram a causa desse tumor. Nesse mesmo

animal e em outros dois animais do mesmo grupo observaram-se altas concentrações de VEGF

detectado por ELISA. Sabe-se que massas tumorais secretam VEGF (PINEDO et al., 2000),

sugerindo dessa forma, que pode ser que outros animais apresentassem massas tumorais que não

foram observadas quando se realizou a eutanásia. Outra possibilidade é que algumas hAFSCs

VEGF transplantadas teriam enxertado em algum órgão e estariam secretando VEGF.

Após o transplante renal observa-se a ocorrência de fibrose intersticial e atrofia tubular, o

que leva posteriormente à perda e à disfunção do aloenxerto (PARK et al., 2010). Essa fibrose

intersticial está associada não somente ao uso de imunossupressores e pela rejeição, mas também

devido à lesão de I/R (BASILE et al., 2001), o que pode ocasionar atraso no retorno da função do

enxerto e até mesmo da sobrevivência do órgão transplantado (YARLAGADDA et al., 2009). Dessa

forma, a terapia celular com AFSC transduzida com VEGF e HGF poderia ser útil em casos de

transplante renal por modular a fibrose no órgão transplantado, por meio de maior

106

neovascularização e inibição de TGF-β do que as AFSCs não transduzidas.

107

5. CONCLUSÃO

Diante dos resultados, pode-se concluir que a terapia celular utilizando a associação das

células mesenquimais estromais derivadas do líquido amniótico humanas transduzidas (AFSC) com

VEGF e HGF resultou em efeito renoprotetor ainda maior do que sua forma não transduzida após

evento isquêmico em ratos, observado tanto a curto prazo, pelo maior índice mitogênico, melhor

função renal e inibição de genes fibrogênicos, quanto a longo prazo pelo menor índice fibrótico. A

ação mitogênica ocorreu pelo secreção de VEGF e a ação antifrótica pela secreção de HGF, fazendo

dessa associação interessante para casos isquêmicos renais, tais como casos de cirurgias extensas

hipotensivas ou transplante renal.

108

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125

7.ANEXOS

Anexo 1- Sequenciamento do plasmídeo codificandoVEGF

ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCAT

GCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTG

GTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGAC

ATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTG

ATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCC

AACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATG

AGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAA

AATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACG

TGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAAC

GAACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGTGA

126

Anexo 2- Sequenciamento do HGF

ATGTGGGTGACCAAACTCCTGCCAGCCCTGCTGCTGCAGCATGTCCTCCTGCATCTCCTC

CTGCTCCCCATCGCCATCCCCTATGCAGAGGGACAAAGGAAAAGAAGAAATACAATTCAT

GAATTCAAAAAATCAGCAAAGACTACCCTAATCAAAATAGATCCAGCACTGAAGATAAAA

ACCAAAAAAGTGAATACTGCAGACCAATGTGCTAATAGATGTACTAGGAATAAAGGACTT

CCATTCACTTGCAAGGCTTTTGTTTTTGATAAAGCAAGAAAACAATGCCTCTGGTTCCCC

TTCAATAGCATGTCAAGTGGAGTGAAAAAAGAATTTGGCCATGAATTTGACCTCTATGAA

AACAAAGACTACATTAGAAACTGCATCATTGGTAAAGGACGCAGCTACAAGGGAACAGTA

TCTATCACTAAGAGTGGCATCAAATGTCAGCCCTGGAGTTCCATGATACCACACGAACAC

AGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACCTACAGGAAAACTACTGTCGAAATCCT

CGAGGGGAAGAAGGGGGACCCTGGTGTTTCACAAGCAATCCAGAGGTACGCTACGAAGTC

TGTGACATTCCTCAGTGTTCAGAAGTTGAATGCATGACCTGCAATGGGGAGAGTTATCGA

GGTCTCATGGATCATACAGAATCAGGCAAGATTTGTCAGCGCTGGGATCATCAGACACCA

CACCGGCACAAATTCTTGCCTGAAAGATATCCCGACAAGGGCTTTGATGATAATTATTGC

CGCAATCCCGATGGCCAGCCGAGGCCATGGTGCTATACTCTTGACCCTCACACCCGCTGG

GAGTACTGTGCAATTAAAACATGCGCTGACAATACTATGAATGACACTGATGTTCCTTTG

GAAACAACTGAATGCATCCAAGGTCAAGGAGAAGGCTACAGGGGCACTGTCAATACCATT

TGGAATGGAATTCCATGTCAGCGTTGGGATTCTCAGTATCCTCACGAGCATGACATGACT

CCTGAAAATTTCAAGTGCAAGGACCTACGAGAAAATTACTGCCGAAATCCAGATGGGTCT

GAATCACCCTGGTGTTTTACCACTGATCCAAACATCCGAGTTGGCTACTGCTCCCAAATT

CCAAACTGTGATATGTCACATGGACAAGATTGTTATCGTGGGAATGGCAAAAATTATATG

GGCAACTTATCCCAAACAAGATCTGGACTAACATGTTCAATGTGGGACAAGAACATGGAA

GACTTACATCGTCATATCTTCTGGGAACCAGATGCAAGTAAGCTGAATGAGAATTACTGC

CGAAATCCAGATGATGATGCTCATGGACCCTGGTGCTACACGGGAAATCCACTCATTCCT

TGGGATTATTGCCCTATTTCTCGTTGTGAAGGTGATACCACACCTACAATAGTCAATTTA

GACCATCCCGTAATATCTTGTGCCAAAACGAAACAATTGCGAGTTGTAAATGGGATTCCA

ACACGAACAAACATAGGATGGATGGTTAGTTTGAGATACAGAAATAAACATATCTGCGGA

GGATCATTGATAAAGGAGAGTTGGGTTCTTACTGCACGACAGTGTTTCCCTTCTCGAGAC

TTGAAAGATTATGAAGCTTGGCTTGGAATTCATGATGTCCACGGAAGAGGAGATGAGAAA

TGCAAACAGGTTCTCAATGTTTCCCAGCTGGTATATGGCCCTGAAGGATCAGATCTGGTT

TTAATGAAGCTTGCCAGGCCTGCTGTCCTGGATGATTTTGTTAGTACGATTGATTTACCT

AATTATGGATGCACAATTCCTGAAAAGACCAGTTGCAGTGTTTATGGCTGGGGCTACACT

GGATTGATCAACTATGATGGCCTATTACGAGTGGCACATCTCTATATAATGGGAAATGAG

AAATGCAGCCAGCATCATCGAGGGAAGGTGACTCTGAATGAGTCTGAAATATGTGCTGGG

GCTGAAAAGATTGGATCAGGACCATGTGAGGGGGATTATGGTGGCCCACTTGTTTGTGAG

CAACATAAAATGAGAATGGTTCTTGGTGTCATTGTTCCTGGTCGTGGATGTGCCATTCCA

AATCGTCCTGGTATTTTTGTCCGAGTAGCATATTATGCAAAATGGATACACAAAATTATT

TTAACATATAAGGTACCACAGTCATAG

127

ANEXO 3- Escores de lesão avaliados em cortes histológicos renais corados por H&E após 48

horas de isquemia e reperfusão renal.

Rato Grupo DT CH NT IMI MIT

34 AFSC 2 2,5 1,5 0 1-5\HPF

35 AFSC 1,5 0,5 1 0,5 1-3\HPF

41 AFSC 1,5 3 3 0 1-5\HPF

42 AFSC 0,5 2 1,5 0 1-3\HPF

51 AFSC 0,5 1,5 2 0 1-2\HPF

52 VEGF 0,5 4,5 4 0 1-3\HPF

53 VEGF 0 4 4 0,5 1\HPF

54 VEGF 1,5 4,5 2,5 1 1-3\HPF

57 Control 2 4 4 2 1-4\HPF

60 HGF 0,5 4 4 1,5 1-3\HPF

61 Control 1,5 2,5 2 0 1-3\HPF

62 Control 1,5 5 1,5 0 1-2\HPF

63 Control 2 4,5 2 1 1-3\HPF

64 HGF 1 4,5 2 0,5 1-9\HPF

65 HGF+VEGF 1 2 1 2,5 1-2\HPF

66 HGF+VEGF 2 2 1 0,5 1-2\HPF

67 HGF 3 5 3,5 2,5 1-4\HPF

68 HGF 2 3,5 3 0,5 1\HPF

69 HGF 1,5 2,5 1 0 1\HPF

70 VEGF 1 2 1,5 2 1-3\HPF

71 VEGF 2 3 2,5 0,5 1-2\HPF

72 HGF+VEGF 2,5 4 3 2 1-3\HPF

73 HGF+VEGF 2,5 2 1 1,5 1-4\HPF

74 HGF+VEGF 2,5 4 3 1,5 1-3\HPF

75 Control 1,5 5 3,5 2,5 1-3\HPF

76 sham 0 0 0 0 0

77 sham 0 0 0 0 0

78 sham 0 0 0 0 0 DT: dilatação tubular; NT: necrose tubular; CH: cilindros hialinos; IMI: infiltrado mononuclear intersticial; MIT:

mitoses.

128

ANEXO 2 – Imagem da análise morfométrica para quantificação de células positivas pra KI-67.

Observar que as células já contadas ficam marcadas para que não seja duplamente quantificada.

129

ANEXO 3 - Escores de lesão avaliados em cortes histológicos renais corados por H&E após dois

meses de lesão por isquemia e reperfusão renal.

Nº rato DT NT CH IMI PFI PFSC ECG AG

19 0 0 0 0 0 0,2 0 0

20 3* 0 0 3,5 3 2 0,5 0,2

21 2* 0 0,2 3 3 2 0,5 0,5

22 0,5 0 0,2 0,5 1 1 0,5 0,5

23 1* 0 0 1,5 2 0,5 0,5 0,5

24 0,5* 0 0,2 1 0,5 0 0,5 0,5

25 0,5* 0 0 1,5 1 0,5 0,5 0,2

26 0,5* 0 0 1 0,5 0 0,2 0,2

27 1,5* 0 0 2,5 2 0,5 0,5 0,2

28 1,5* 0 0 1,5 1,5 1 1 1

29 1,5* 0 1 3,5 4 3,5 2 1,5

30 1,5* 0 0,5 3 3,5 3,5 1 0,5

31 1,5* 0 0,2 3,5 4 4 1 0,5

32 0,8 0 0 1 1,5 2 1 0,5

33 1 0 0 2,5 2,5 0,5 1,5 0,8

36 1* 0 0 2,5 1,5 3 1 0,5

38 1 0 0 1,5 2,5 0,5 0,5 1

39 3* 0 0 0,5 0,5 0,5 1 0,5

43 1,5* 0 0 3 4 4 1,5 1

44 2* 0 1,5 3,5 3,5 2 1,5 1

45 1,5* 0 0,2 3,5 3,5 2,5 2 1,5

46 1,5* 0 0,5 3,5 4 4,5 2 1

48 2* 0 0,2 4 3 3 1 0,5

49 1,5* 0 0 2,5 3,5 4 0,2 0,2

50 2* 0 0,2 3,5 2,5 3 0,5 0,2

58 4,5* 0 2 5 5 5 2 1

Sham 1 0 0 0 0 0 0 0 0

Sham 2

Sham 3 DT: dilatação tubular; NT: necrose tubular; CH: cilindros hialinos; IMI: infiltrado mononuclear intersticial; PFI:

proliferação fibrosa interna; PFSC: proliferação fibrosa subcapsular; ECG: espessamento da cápsula glomerular; AT:

atrofia glomerular. * indica dilatação acentuada dos túbulos (hidronefrose).

130

ANEXO 4- Imagem da análise morfométrica para Tricrômico de Massom. Mensuração da área de

fibrose.

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