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Universidad Autonoma de Yucatan

Facultad de Matematicas

SEGMENTACION AUTOMATICA DECELULAS PROCESADAS POR

ELECTROFORESIS UNICELULAR ENGEL (ENSAYO COMETA)

T E S I SQUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:

Ingeniero en Computacion

PRESENTA:

Javier Luna Gonzalez

ASESORES DE TESIS:Dra. Anabel Martın Gonzalez

Dr. Carlos Brito Loeza

Merida, Yucatan, 2018

A la Facultad de Matematicas.

Reconocimientos

Quiero agradecer:A mis padres, por haberme guiado a traves de este largo camino hacia mi reali-zacion como profesionista, por haberme educado para ser un hijo de bien, y porhaberme dado el amor y atencion que han sido mi principal fuente de energıa.

A mis asesores, por haberme dotado de las herramientas y conocimientos necesa-rios durante el desarrollo de este trabajo, y por haber creıdo en mı cuando solicitesu asesorıa al iniciar el proyecto.

A mi familia, que siempre me han apoyado en mi trayectoria estudiantil y quehan estado para mı en los momentos mas importantes de mi vida, demostrandomeque el amor rompe las barreras de distancia.

A mi pareja, por haber estado a mi lado durante mi etapa universitaria, por haberdepositado su confianza en mı, y por haberme dado su apoyo y consentimientodurante todo este tiempo.

v

Resumen

La electroforesis unicelular en gel (ensayo cometa) es un metodo de confianza parala medicion del dano en el ADN de las celulas y evaluacion de la capacidad regenerativaen ellas. Dicho material danado puede ser observado a traves de un microscopio, dondelas celulas adoptan la forma de cometas; el material genetico estable permanece en lacabeza, mientras que la migracion del nucleo, la fraccion inestable de ADN, conformala cola.

Dado que el ensayo cometa es una prueba de laboratorio, en donde es posible re-gistrar los resultados en imagenes digitales, el analisis computacional obtiene un papelimportante en el proceso al brindar herramientas y algoritmos que faciliten la detecciony calculo de parametros en los cometas encontrados.

El objetivo de este trabajo es encontrar un metodo eficaz y confiable para la seg-mentacion automatica de la cabeza y cola de las moleculas del ADN procesadas porel ensayo cometa, ası como el calculo de parametros para inferir datos estadısticos enlos estudios clınicos. Para ello se propone la implementacion de tecnicas y metodosde morfologıa matematica, umbralizacion, segmentacion por regiones y algoritmos dereconocimientos de patrones para lograr la deteccion adecuada de cometas.

vii

Indice general

Indice de figuras XI

Indice de tablas XVII

1. Introduccion 191.1. Antecedentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.1.1. Sistemas automaticos de procesamiento de imagenes del ensayocometa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.1.2. Sistemas semi-automaticos de procesamiento del ensayo cometa . 231.2. Contribuciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241.3. Estructura de la tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241.4. Publicaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2. Marco Teorico 272.1. Ensayo Cometa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272.2. Procesamiento digital de imagenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.2.1. Filtrado espacial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282.2.1.1. Convolucion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302.2.1.2. Kernels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.2.2. Segmentacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322.2.2.1. Metodos de segmentacion basados en el histograma . . 322.2.2.2. Metodos de segmentacion basados en regiones . . . . . 37

2.2.3. Envolvente convexa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382.2.4. Morfologıa matematica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

2.3. Medidas de desempeno de segmentacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3. Metodologıa 453.1. Diseno experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453.2. Etapa de pre-procesamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463.3. Etapa de segmentacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

3.3.1. Procesamiento y segmentacion de regiones de cometas sin traslape 523.3.2. Procesamiento y segmentacion de regiones con traslape . . . . . 52

3.4. Etapa de post-procesamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

ix

INDICE GENERAL

4. Resultados 594.1. Analisis de la segmentacion realizada por OpenComet . . . . . . . . . . 704.2. Analisis de la segmentacion realizada por el sistema desarrollado . . . . 80

5. Conclusiones 935.1. Trabajo futuro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

Bibliografıa 95

x

Indice de figuras

1.1. Estructura de una celula del ensayo cometa . . . . . . . . . . . . . . . . 191.2. Ejemplo de segmentacion de cometas del OpenComet . . . . . . . . . . . 22

2.1. Ejemplo de suavizado de imagenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292.2. Ejemplo de eliminacion de ruido en imagenes . . . . . . . . . . . . . . . 292.3. Ejemplo de realce de imagenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292.4. Ejemplo de deteccion de bordes en imagenes . . . . . . . . . . . . . . . . 302.5. Segmentacion de objetos de interes en imagenes . . . . . . . . . . . . . . 322.6. Histograma de una imagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332.7. Segmentacion por umbralizacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332.8. Umbralizacion por el metodo de Otsu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362.9. Multi-umbralizacion por el metodo de Otsu . . . . . . . . . . . . . . . . 362.10. Ejemplo de envolvente convexa de un conjunto de puntos . . . . . . . . 382.11. Ejemplo de la primera iteracion del QuickHull, tomado de [1] . . . . . . 392.12. Ejemplo de la primera iteracion del Scan de Graham, tomado de [1] . . 392.13. Ejemplo de estructuras de morfologıa matematica . . . . . . . . . . . . . 402.14. Ejemplo de erosion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 412.15. Ejemplo de dilatacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 412.16. Ejemplo de imagen con su respectivo Ground Truth . . . . . . . . . . . 422.17. Ejemplo de desempeno de segmentacion: a) Ground Truth, b) Imagen

resultado, c) Clasificacion de pixeles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.1. Diseno modular del sistema implementado . . . . . . . . . . . . . . . . . 453.2. Ajuste inicial de la imagen de entrada: a) Imagen en formato de color

RGB, b) Imagen en escala de grises a ocho bits . . . . . . . . . . . . . . 463.3. Filtrado espacial a imagen de entrada: a) Imagen antes del filtrado es-

pacial, b) Imagen con el filtrado espacial aplicado . . . . . . . . . . . . . 473.4. Multiples niveles de Otsu: a) Imagen con filtro de mediana, b) Imagen

multi-umbralizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 473.5. Imagen con problema de iluminacion: a) Imagen con filtro de mediana,

b) Imagen multi-umbralizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 483.6. Imagen sin problema de umbralizacion: a) Imagen multi-umbralizada, b)

Imagen umbralizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

xi

INDICE DE FIGURAS

3.7. Imagen con problema de iluminacion: a) Imagen multi-umbralizada, b)Imagen umbralizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

3.8. Imagen de salida de la etapa de pre-procesamiento: a) Imagen umbrali-zada, b) Imagen sin ruido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

3.9. Procesamiento inicial a la sub-imagen de la region de interes: a) Sub-imagen de entrada, b) Sub-imagen difuminada . . . . . . . . . . . . . . 50

3.10. Umbralizacion de la sub-imagen: a) Sub-imagen difuminada, b) Sub-imagen umbralizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.11. Ejemplo de una region con traslape en los nucleos: a) Sub-imagen difu-minada, b) Sub-imagen umbralizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.12. Segmentacion final de cometas sin traslape . . . . . . . . . . . . . . . . . 533.13. Comparativa entre multi-umbralizacion global y local: a) Umbralizacion

global, b) Umbralizacion local . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533.14. Imagen de salida final del sistema de segmentacion de cometas . . . . . 543.15. Ejemplo de los datos generados por el sistema desarrollado . . . . . . . 57

4.1. Resultados de segmentacion, imagen de prueba 1: a) Imagen original, b)Imagen segmentada manualmente, c) Imagen segmentada por OpenCo-met, d) Imagen segmentada por el sistema desarrollado . . . . . . . . . . 60









xii

INDICE DE FIGURAS

4.10. Resultados de segmentacion, imagen de prueba 10: a) Imagen original,b) Imagen segmentada manualmente, c) Imagen segmentada por Open-Comet, d) Imagen segmentada por el sistema desarrollado . . . . . . . . 69

4.11. Imagenes binarias de los resultados de segmentacion del OpenComet con-tra las imagenes binarias de la segmentacion manual, imagen de prueba1: a) Segmentacion de cometas de OpenComet, b) Segmentacion de come-tas manual, c) Segmentacion de cabezas de OpenComet, d) Segmentacionde cabezas manual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70








xiii

INDICE DE FIGURAS


4.20. Imagenes binarias de los resultados de segmentacion del OpenComet con-tra las imagenes binarias de la segmentacion manual, imagen de prueba10: a) Segmentacion de cometas de OpenComet, b) Segmentacion decometas manual, c) Segmentacion de cabezas de OpenComet, d) Seg-mentacion de cabezas manual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

4.21. Imagenes binarias de los resultados de segmentacion del sistema desarro-llado contra las imagenes binarias de la segmentacion manual, imagen deprueba 1: a) Segmentacion de cometas del sistema desarrollado, b) Seg-mentacion de cometas manual, c) Segmentacion de cabezas del sistemadesarrollado, d) Segmentacion de cabezas manual . . . . . . . . . . . . . 81






xiv

INDICE DE FIGURAS





xv

Indice de tablas

1.1. Parametros extraıdos por el OpenComet . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

4.1. Desempeno de la segmentacion del OpenComet . . . . . . . . . . . . . . 804.2. Desempeno de la segmentacion del sistema desarrollado . . . . . . . . . 91

xvii

Capıtulo 1

Introduccion

El ensayo cometa se define como una prueba de laboratorio que estudia el danodel material genetico en seres vivos infringido por diferentes agentes quımicos, fısicosy biologicos [2] [3]. Es un procedimiento confiable para la deteccion y evaluacion de lacapacidad regenerativa en el ADN, lo cual se visualiza al tenir, con materiales fluores-centes, las celulas procesadas por el ensayo cometa. El material genetico expuesto seadhiera al colorante, permitiendo analizar los resultados del experimento mediante unmicroscopio con camara integrada [4].

Como resultado del ensayo cometa, existen dos partes fundamentales que se podrıanpresentar en la estructura de las celulas resultantes (ver Figura 1.1): un nucleo (deno-minado cabeza del cometa), que contiene todo el material genetico que resistio al danoinducido durante la prueba; y una cola (denominada cola del cometa), que representala porcion del nucleo que fue desplazado de este al no poseer la suficiente estabilidadgenomica [5] [6].

Figura 1.1: Estructura de una celula del ensayo cometa

El ensayo cometa ha tenido un gran impacto en areas como la biomedica y lagenomica, actuando como biomarcador en el analisis y estudio de enfermedades dege-

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1. INTRODUCCION

nerativas, tales como el cancer, diabetes, osteoporosis, enfermedad de Alzheimer, entreotros [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14]. Es un proceso en el cual las celulas adquierenla caracterıstica de heterogeneidad, que permite estudiar el comportamiento individualde estas.

Para estudiar los resultados de dicho proceso, se recurre al calculo de parametros ymedidas que se extraen de los cometas formados [15] [16]. Este calculo se realiza sobre lasimagenes obtenidas a traves del microscopio, permitiendo generar analisis estadısticosde las propiedades de los cometas para estudiar su relacion con enfermedades o agentespatogenos.

1.1. Antecedentes

Durante las ultimas dos decadas, los trabajos que proponen metodos para la auto-matizacion de la deteccion de regiones de interes en imagenes, ası como su respectivocalculo de parametros, han ido en aumento [17] [18] [19], generando sistemas que hanpermitido procesar los resultados de manera rapida y eficiente. Estos sistemas varıanen sus funcionalidades y caracterısticas de uso, pero es posible clasificarlos en dos ca-tegorias principales: automaticos, los cuales no necesitan la intervencion del usuariopara realizar tanto la segmentacion de los cometas, como la extraccion de sus propie-dades; y semi-automaticos, los cuales necesitan el apoyo del usuario para realizar lasegmentacion de los cometas.

1.1.1. Sistemas automaticos de procesamiento de imagenes del ensayocometa

Bocker et al. [20] presentan un sistema integrado de software y hardware para proce-sar, segmentar y clasificar imagenes de celulas del ensayo cometa de forma automatica,basando su analisis en tecnicas de morfologıa matematica. Dividen su desarrollo en tresetapas que operan de manera paralela y sincronizada. La primera etapa se denominasearching and autofocus, que opera sobre el modulo de autoenfoque del microscopio y seencarga de localizar las areas mas lumninosas de la laminilla del microscopio, suponien-do que estas son las areas que contienen celulas del ensayo cometa. La siguiente etapa,grabbing and administration, adquiere las imagenes de los cometas y las almacena en launidad de procesamiento central de la computadora. La ultima etapa, recognition andanalysis, el sistema realiza un filtrado de las imagenes adquiridas mediante morfologıamatematica y correccion de sombreado; y realiza la segmentacion de los cometas endos etapas: la primera consiste en umbralizar globalmente la imagen para determinarla cantidad de ruido que permanece en ella; posteriormente umbraliza adaptivamente,esto es, determina un valor de umbral mediante histeresis [21]. Este software funcionade manera adecuada bajo las siguientes condiciones: los cometas no deben presentardemasiada degradacion y no deben estar traslapados con otros cometas.

Gyori et al. [22], proponen una herramienta de libre licencia para la deteccion au-tomatica de las celulas procesadas por el ensayo cometa llamada OpenComet. El soft-

20

1.1 Antecedentes

ware procesa imagenes en escala de grises con celulas del ensayo cometa. Si la imagen esa color (multiples canales), el sistema se queda con el canal de luminosidad que poseamayor informacion, debido a que se deduce que las zonas mas iluminadas de la imagenrepresentan las porciones de ADN de las celulas. Despues, se realiza un filtrado de ruidoy una correccion global del fondo de la imagen para proceder con una umbralizacionadaptativa de la imagen por el metodo de Huang [23], que determina el valor de umbralal minimizar la medida de difusion en la imagen. Se binariza la imagen tomando comoreferencia el valor de umbral encontrado en la paso anterior y se obtiene una imagenbinaria, para despues aplicar filtrado de morfologıa matematica y eliminar las zonasmuy pequenas que se clasifican como ruido en la imagen. Para identificar a los come-tas traslapados asumen dos hipotesis: los cometas forman regiones convexas, es decir,que no poseen irregularidades al aplicarles algoritmos de convex hull [24]. La segundasuposicion es que los cometas son simetricos debido a la naturaleza de la aplicaciondel ensayo cometa, y suponer que los cometas tendran una orientacion con respecto aleje horizontal de la imagen. Una vez identificadas las regiones de cometas individua-les y las regiones de cometas con traslapes, se procede a segmentar las cabezas de loscometas individuales, con la principal suposicion de que el area de la cabeza de loscometas es la que posee mayor luminosidad. Debido a la naturaleza de la prueba y delos resultados de las celulas, es posible que los cometas representen severo dano en elmaterial genetico de las celulas, lo que se visualiza en un cometa sumamente fragmen-tado y con posiblemente mayor luminosidad en la region de su cola. Dado estos casos,los autores toman una segunda suposicion: analizar el perfil del cometa para encontrarel lımite entre la cabeza y la cola del cometa. Primero, aplican la suposicion de la regionmas luminosa y prosiguen con el analisis del perfil. Por ultimo, realizan una extraccionde parametros (ver tabla 1.1) sobre los cometas segmentados. Para que su desempenosea correcto, su sistema requiere que las imagenes posean ciertas condiciones; una deestas se refiere a la orientacion de los cometas, la cual siempre debe estar definida deizquierda a derecha; por otro lado, el sistema es muy sensible a ruido en la imagen ymanchas en las laminillas del microscopio. El formato de imagen de salida se apreciaen la figura 1.2

Vojnovic et al. [25] desarrollaron un sistema con alta sensibilidad y rendimiento, quees capaz de procesar imagenes del ensayo cometa a razon de un cometa por segundo.Su metodo comienza con obtener una imagen normalizada y correccion de los nivelesde grises de la imagen de entrada. Para localizar las regiones de interes, se aplicauna umbralizacion a los cometas para obtener una imagen binaria de las regiones masluminosas. Suponiendo que los cometas representan dichas regiones, el valor del umbralcorresponde a un 20 % del pico maximo en el histograma de la imagen de entrada. Esteproceso de segmentacion por umbralizacion arroja una imagen con cometas completos,es decir, cabeza y cola. Para separar estas areas recurren a algoritmos binarios deregion growing. Las regiones de interes demasiado grandes son generalmente rechazadas,asumiendo que pertenecen a cometas con traslape. Para delimitar la cabeza de loscometas utilizaron el algoritmo CHARM (Compact Hough And Radial Map), que mezclala transformada compacta de Hough para segmentar circunferencias con la delineacion

21

1. INTRODUCCION

Figura 1.2: Ejemplo de segmentacion de cometas del OpenComet

Parametros Descripcion

Area Numero de pixeles dentro de la region (Cometa, cola y ca-beza)

Longitud Longitud en pixeles (Cometa, cola y cabeza)

Contenidode ADN

Suma de la intensidad de los pixeles dentro del area de laregion (Cometa, cola y cabeza)

Intensidadpromedio

Contenido de ADN dividido entre su area (Cometa, cola ycabeza)

% ADN Porcentaje del contenido de la region (cabeza o cola) enrazon al contenido del cometa

Momentode cola

Longitud de la cola multiplicado por el porcentaje de ADNde la cola

MomentoOlive

Producto del porcentaje de ADN de la cola por la distanciaentre los centroides de la cabeza y la cola

Tabla 1.1: Parametros extraıdos por el OpenComet

22

1.1 Antecedentes

de la region segmentada mediante la orientacion de los pixeles de los bordes de lacabeza, los cuales se obtienen a traves de mascaras de Sobel [26]. En su sistema definenel calculo de tres parametros: momento Kent del cometa [27], porcentaje de ADN enla cabeza y la cola, y la longitud de la cola.

1.1.2. Sistemas semi-automaticos de procesamiento del ensayo cometa

Kiziltan y Yurtcu [28], presentan un sistema semi-automatico y comparan su desem-peno contra los resultados del software de libre licencia CometAssay. Su programa fuedesarrollado en Borland Delphi en su version 6.0, y ejecutado en Microsoft Windows98 y superiores. Las imagenes de entrada deben estar en formato JPEG. Mediante lainterfaz grafica, el usuario tiene la opcion de realizar calibracion metrica, ajustar elvalor de umbral del color de la imagen y la resolucion angular/radial de la misma.Despues, el usuario debe evaluar la imagen para determinar los objetos que son co-metas y descartar las estructuras que no lo son. Una vez identificados los cometas, elusuario debe dar clic en el centro de la cabeza y la cola del cometa, de esta forma, elsoftware realiza una segmentacion automatica de ambas regiones de interes medianteel algoritmo de mapeo radial. El algoritmo utiliza los valores de umbral y resolucionpredefinidos por el usuario para evaluar los bordes de la cabeza del cometa. Si el usua-rio no queda satisfecho con la segmentacion realizada, este tiene la opcion de reajustarmanualmente la region segmentada con las herramientas de reajuste de formas. Paracada cometa procesado, el software genera sus parametros para fines del usuario, don-de segun los autores, tres de ellos son aceptados como buenos indicadores de dano enel ADN: porcentaje de ADN en la cola, momento de cola y momento Olive [29]. Losdemas parametros computados son: area, longitud, contenido de ADN y porcentaje decontenido de ADN, para los cometas, cabezas y colas. Para validar su segmentacion,analizaron 20 cometas en su sistema y en el OpenComet, donde la segmentacion de esteultimo era menos uniforme que su sistema propuesto. Concluyen con que sus resultadosfueron bastante similares respecto a los del OpenComet, conjeturando que los sistemasautomaticos y los semi-automaticos proporcionan resultados similares y de confianzapara su posterior tratamiento estadıstico, segun lo requiera el investigador que estetrabajando con el ensayo cometa y su proposito.

Helma et al. [30], desarrollaron un sistema de dominio publico basado en los siste-mas comerciales de analisis de imagenes del ensayo cometa, con el proposito de generaruna herramienta sin licencia comercial que estuviera al alcance de los investigadores.La interfaz grafica de su programa le permite al usuario discriminar los resultados desus analisis, determinando cuales de los cometas fueron correctamente segmentados ycuales regiones segmentadas son incorrectas o no corresponden a cometas propiamente.Para realizar la segmentacion de los cometas, el software comienza con definir automati-camente un umbral para distinguir entre los objetos de la imagen y su fondo, valor quees posible ajustar mediante las herramientas interactivas del programa. Cabe recalcarque los cometas son analizados uno por uno, es decir, de acuerdo a las regiones queel umbral haya detectado, se procesan en ventanas separadas los cometas encontrados.Una vez seleccionado un cometa a analizar, se localiza el centro de su cabeza, el cual se

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1. INTRODUCCION

asume que debe estar ubicado en el punto maximo de intensidad. Para ello ubican lasregiones que esten entre un 80 % y 100 % del nivel maximo de intensidad del cometa,para despues quedarse con el area mas grande de pixeles encontrados en este rangode valores. Es importante senalar que cuando existe un gran dano en el ADN de lascelulas (la cabeza no necesariamente es la region con mayor luminosidad), el softwareno trabaja de manera apropiada.

Lee et al. [31], desarrollaron HiComet, un sistema para la deteccion de celulas en elensayo cometa con una mınima intervencion por el usuario, definiendo el valor para laumbralizacion de los cometas. La caracterıstica principal de su metodo es que procesanlos cometas de las imagenes sin importar la cantidad de cometas que existan en ella, sulocalizacion o estado del cometa, es decir, es un sistema muy robusto. Para segmentary clasificar los cometas, dividen su metodo en cuatro secciones. El pre-procesamientoincluye un suavizado de la imagen de entrada, mediante filtros espaciales de promedioo mediana. La etapa de binarizacion consiste en extraer todas las regiones de interes dela imagen analizando el histograma de la imagen y ubicando el punto de localizaciondel primer valle en el. La etapa de filtrado y correccion de traslapes incluye la elimina-cion de los falsos positivos detectados en la seccion anterior; para separas los cometascon traslape, utilizan una secuencia de algoritmos: parten de la mascara obtenida enlos pasos anteriores, aplican la transformada de distancia para detectar multiple zo-nas de intensidad, seguido de una transformada de ondıcula, para finalmente aplicaruna transformacion divisoria y obtener regiones separadas de los cometas con traslape.Ellos suponen que las imagenes estaran muy bien definidas y que los traslapes entrecometas seran notorios, lo que no es cierto en la mayorıa de los casos, pues las image-nes de cometas presentan bastante ruido en ellas y es casi imposible detectar las lıneasdivisorias entre los cometas, ademas de que estas son muy irregulares. En su ultima eta-pa, caracterizacion y clasificacion, extraen los parametros de los cometas segmentados,incluyendo areas, cabezas, colas y momentos de cola.

1.2. Contribuciones

La principal contribucion de este trabajo es la realizacion de un sistema de analisiscomputacional que permite examinar imagenes del ensayo cometa de maneraautomatica, detectando los cometas dentro de ellas, esten o no traslapados, parapoder extraer sus parametros.

El trabajo tambien explora distintos algoritmos de procesamiento en imagenesque en conjunto ofrecen resultados de calidad que permiten que la extraccion decaracterısticas de una imagen sea transparente.

1.3. Estructura de la tesis

A continuacion se menciona una breve descripcion de la organizacion por capıtulosde este trabajo.

24

1.4 Publicaciones

Capıtulo 1.- Introduccion. En este capıtulo se aborda la justificacion de estetrabajo, y el motivo para desarrollar el sistema de analisis de cometas.

Capıtulo 2.- Marco teorico. En este capıtulo se habla de todos los conceptos yherramientas computacionales utilizados en la elaboracion de este proyecto.

Capıtulo 3.- Metodologıa. En este capıtulo se habla acerca de como se realizoeste proyecto, partiendo desde la construccion de la base de datos en entrenamiento yevaluacion, la estrategia para analizar los cometas, la extraccion de los parametros y eldesarrollo del sistema en general.

Capıtulo 4.- Resultados. Se aborda todos los resultados que se obtuvieron du-rante la experimentacion, ademas de presentar los calculos para determinar el nivel deconfianza del sistema.

Capıtulo 5.- Conclusiones. Se presenta un analisis detallado de la problematica,los contratiempos que surgieron ademas de los obstaculos durante la elaboracion delproyecto.

1.4. Publicaciones

El presente trabajo tuvo las siguientes publicaciones en extenso:

Javier Luna-Gonzalez, Anabel Martin-Gonzalez, Carlos Brito-Loeza y Elda Pacheco-Pantoja. Analisis computacional en imagenes de electroforesis unicelular en gelmediante algoritmos de segmentacion automatica. International Symposium onIntelligent Computing Systems (ISICS), pp. 67-72, 2018.

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Capıtulo 2

Marco Teorico

En este capıtulo se describiran los diferentes conceptos y metodos utilizados en laimplementacion del sistema computacional propuesto en este trabajo.

2.1. Ensayo Cometa

Una manera rapida y economica de determinar el dano en el acido desoxirribonu-cleico (ADN) de las celulas es mediante la electroforesis unicelular en gel, o ensayocometa. Se basa en la fragilidad que poseen las estructuras danadas al ser sometidas asustancias con un pH superior a un valor de 13 y a una electroforesis, tecnica que inducela separacion de moleculas segun la movilidad de estas expuestas a un campo electri-co. Los fragmentos de ADN que migran del nucleo debido a su inestabilidad geneticaforman lo que se conoce como la “cola del cometa”, mientras que los fragmentos quepermanecieron en el nucleo de la celula constituyen lo que se conoce como “cabeza delcometa”.

Para llevar a cabo un ensayo cometa se requiere seguir una metodologıa. Existenmultiples protocolos para desarrollar tecnicas de ensayo cometa, a continuacion se des-cribe la que se utilizo para la obtencion de las imagenes utilizadas en este proyecto.

Se extrae una muestra sanguınea periferica (12 ml), del sujeto de prueba, mediantevenopuncion y se recolecta en un tubo con anticoagulante.

Se centrifuga la muestra sanguınea para aislar las celulas mononucleares de sangreperiferica, los globulos blancos en este caso.

Las celulas aisladas se someten a una prueba de viabilidad celular mediante latecnica de azul de metileno.

Se realiza un conteo celular de la muestra para ajustar la cantidad a 300,000celulas por cada laminilla.

Las celulas son sometidos a un proceso de estres oxidativo con peroxido dehidrogeno (H2O2), de las cuales se obtienes dos muestras, donde a una se le aplicaH2O2 al 5 %, mientras que a la segunda muestra se le aplica un 10 % del H2O2.

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2. MARCO TEORICO

Ademas, se produce otra muestra de control en la cual unicamente se diluyen lascelulas con PBS (solucion acuosa y salina).

Las tres laminillas generadas se someten a lisis y desnaturalizacion, procesos enlos cuales se rompen las membranas del nucleo celular para dejar expuestas lasmoleculas del ADN.

Posteriormente, las laminillas son sometidas a electroforesis alcalina directamente.

Cuando se retiran, y despues de que las laminillas se sequen, se tinen con 20 µlde bromuro de etidio.

Las laminillas se examinan con un aumento mediante un microscopio con camaraintegrada y un software que permita capturar las imagenes.

2.2. Procesamiento digital de imagenes

Una imagen puede ser definida matematicamente como una funcion bidimensionalf(x, y), donde x y y son coordenadas espaciales (en un plano), y f en cualquier par decoordenadas es la intensidad o nivel de gris de la imagen en esa coordenada [32]. Unaimagen digital se compone de un numero finito de elementos, cada uno con un lugar yvalor especıficos. A cada uno de estos elementos se le denomina pixel.

Se le llama procesamiento digital de imagenes, a los procesos cuyas entradas y salidasson imagenes, que ademas extraen atributos de ellas, incluyendo el reconocimiento deobjetos individuales [32].

2.2.1. Filtrado espacial

Los filtros digitales en el dominio del espacio son uno de los principales metodosutilizados en el procesamiento digital de imagenes. Se utilizan para distintos propositos:

Suavizado de imagenes (ver Figura 2.1): Reduccion de las variaciones de intensi-dad entre los pixeles vecinos [32].

Eliminacion de ruido (ver Figura 2.2): Modificar aquellos pixeles que son muydistintos a sus pixeles vecinos [32].

Realce de imagenes (ver Figura 2.3): Aumentar las variaciones de intensidad [32].

Deteccion de bordes (ver Figura 2.4): Identificar las regiones en la imagen dondese producen cambios bruscos en la intensidad de los pixeles [32].

En todos los casos anteriores, el resultado sobre cada pixel depende de los pixeles desu entorno, es decir, las operaciones espaciales de filtrado se definen en un entorno devecindad del pixel ubicado en el punto (x, y). Los filtros en el dominio espacial puedenclasificarse como lineales (convolucion digital en imagenes) y no lineales (filtrado pormedidas estadısticas).

28

2.2 Procesamiento digital de imagenes

Figura 2.1: Ejemplo de suavizado de imagenes

Figura 2.2: Ejemplo de eliminacion de ruido en imagenes

Figura 2.3: Ejemplo de realce de imagenes

29

2. MARCO TEORICO

Figura 2.4: Ejemplo de deteccion de bordes en imagenes

2.2.1.1. Convolucion

Se le denomina convolucion a la operacion matematica definida entre las funcionesf y g, donde t representa el tiempo y η el corrimiento en la funcion g, de acuerdo a lasiguiente formula:

(f ∗ g)(t) =

∫ ∞−∞

f(η)g(t− η)dη (2.1)

donde el intervalo de integracion depende del dominio sobre el cual esten definidas lasfunciones f y g

En el caso discreto y aplicado a procesamiento de digital de imagenes, dada unaimagen f(x, y) y una mascara w(x, y), la imagen resultante g(x, y) consiste en realizarla operacion:

g(x, y) =

a∑s=−a

b∑t=−b

w(s, t)f(x+ s, y + t) (2.2)

El entorno del punto (x, y) que se considera en la imagen para obtener la mascarag(x, y) esta determinado por el tamano y forma de la mascara, y el contenido de estadetermina el tipo de filtrado que se aplique a la imagen [33].

2.2.1.2. Kernels

En el procesamiento digital de imagenes, se le denomina Kernel o matriz de convo-lucion, a la mascara predefinida que sera convolucionada con la imagen de entrada. Elcontenido del kernel utilizado, ası como su tamano y dimension, dependera del efectoque se desee tener en la imagen [32].

El kernel examina, sucesivamente, cada pixel de la imagen. Se define un pixel centralel cual sera el resultado de la convolucion entre el kernel y la imagen, donde los pixelesalrededor de dicho pixel central se multiplican con los correspondientes pixeles de la

30


imagen, luego se suman las multiplicaciones y el resultado es el nuevo valor en el imagende salida.

125 126 128

126 125 126

126 128 129

∗0 1/5 0

1/5 1/5 1/5

0 1/5 0

= 126.2

En el ejemplo, el resultado viene de la operacion:

0∗125+1/5∗126+0∗128+1/5∗126+1/5∗125+1/5∗126+0∗126+1/5∗128+0∗129 = 126.2(2.3)

Un punto importante a mencionar del ejemplo, es que se pierden los bordes de laimagen debido a la naturaleza de la convolucion, por lo que existen distintos tipos detratamiento para esta situacion, ya sea rellenar los bordes de cero, duplicar los valoresvecinos, agrandar en un pixel la imagen original, entre otros.

Algunos de los tipos de kernels que existen se describen a continuacion:

Kernel de promedio o de medias: Es el filtro mas simple que existe para suavizarimagenes, es decir, reducir las variaciones entre los pixeles vecinos de una imagen.Algunas de las desventajas de este filtro es que es bastante sensible a cambioslocales y que puede generar intensidades en la imagen que no aparecıan antes enella.

1/9 1/9 1/9

1/9 1/9 1/9

1/9 1/9 1/9

Kernel gaussiano: Se utiliza para difuminar imagenes y eliminar ruido. Es similaral de medias, pero su contenido se calcula por medio de aproximaciones de lafuncion gaussiana:

G(x, y) =1

2πσ2e−

x2+y2

2σ2 (2.4)

1 2 1

2 4 2

1 2 1

*1/16

Kernel de medianas: Similar al de medias, pero ordenando los pixeles correspon-dientes de la imagen al kernel y ubicando el valor medio de ellos y colocandonosen el correspondiente pixel de la imagen de salida. Sirve para eliminar ruido.

31

2. MARCO TEORICO

56 60 50

30 32 49

38 58 67

∗(3x3 kernel mediana) = 50

2.2.2. Segmentacion

La segmentacion subdivide una imagen en sus partes constituyentes u objetos, con elfin de separar las regiones de interes del resto de la imagen (ver Figura 2.5). Es por elloque el nivel al que se quiera llevar a cabo la segmentacion depende mucho del problemaa resolver. De esta forma, es posible abordar tecnicas de segmentacion desde distintasperspectivas, como la clasificacion de los pixeles indicando a que clases pertenecen cadauno, o definiendo bordes de los objetos, o analizando las regiones similares entre sı [32].

Figura 2.5: Segmentacion de objetos de interes en imagenes

Ası mismo, la segmentacion puede distinguirse se acuerdo a su modo de operacioncomo automatica, o semi-automatica. La primera, es una de las tareas mas difıciles delprocesamiento digital de imagenes, y consiste en realizar la separacion de objetos delfondo de la imagen sin la mas mınima intervencion del usuario. En cambio, la segmen-tacion semi-automatica, puede recurrir a la intervencion del usuario, proporcionandociertos datos que faciliten el proceso de la segmentacion.

2.2.2.1. Metodos de segmentacion basados en el histograma

El histograma de una imagen digital es una funcion discreta que representa ladistribucion de los niveles de intensidad en ella. En el caso de una imagen en escala degrises con una profundidad de 8 bits, el rango de niveles de grises varia de 0 a 255 (verFigura 2.6), y su funcion se representa mediante la siguiente formula:

p(rk) =nkn

(2.5)

donde rk es el k-esimo nivel de gris, nk es el numero de pixeles de la imagen con esenivel de gris y n el numero total de pixeles de la imagen.

El histograma proporciona informacion util sobre la probabilidad de apariencia delos pixeles en la imagen, lo que permite realizar ciertas operaciones en las imagenes

32


Figura 2.6: Histograma de una imagen

con base en su histograma. Una de esas operaciones es la segmentacion por umbraliza-cion [32].

La umbralizacion es una tecnica muy utilizada en segmentacion, y su objetivo esencontrar el valor optimo en el rango del histograma de la imagen de tal modo que segenere una nueva imagen binaria, donde se pueda separar el fondo de la imagen originaly los objetos de interes de ella (ver Figura 2.7). Esta puede ser abordada de formaglobal o local, dependiendo la naturaleza del problema a solucionar. La perspectivaglobal trata de encontrar el valor de umbralizacion considerando todos los pixeles de laimagen de entrada. En cambio, el enfoque local realiza el proceso en sub-ventanas dela imagen, ofreciendo resultados distintos de acuerdo a la distribucion de los pixeles enla region seleccionada.

Figura 2.7: Segmentacion por umbralizacion

Como se observa en la Figura 2.7, uno de los retos en esta tecnica es definir un

33

2. MARCO TEORICO

metodo para seleccionar de forma optima y automatica el valor de umbralizacion. Parael ejemplo de dicha figura, se escogio de forma manual un valor de 150 para umbralizar.Otsu [34], propone un metodo global para resolver este problema, basado en medidasestadısticas del histograma de la imagen. El algoritmo de Otsu consiste en seleccionarel umbral maximizando la varianza, medida de dispersion entre los pixeles, entre lasdos clases de la imagen, el fondo y los objetos de interes, mediante una busqueda ex-haustiva. Al mismo tiempo, se busca minimizar lo mas posible la varianza entre lospixeles de una misma clase. El algoritmo de Otsu se describe en los siguientes pasos:

Paso 1: Sean L valores en el histograma, N = n1, n2, ...nL pixeles en la imagen,se obtiene el histograma normalizado de la imagen inicial como una distribucionde probabilidad p:

pi = ni/N, pi ≥ 0,

L∑i=1

pi = 1 (2.6)

Paso 2: Se dividen los pixeles en dos clases, C0 y C1 (fondo y objetos de interesrespectivamente) de acuerdo a un valor inicial de umbral k. Entonces, C0 contienea los pixeles con niveles [1, ..., k], y C1 contiene los pixeles con niveles [k+1, ..., L].De este modo, las probabilidades de ocurrencia de cada clase son dadas por:

ω0 = Pr(C0) =k∑

i=1

pi = ω(k) (2.7)

ω1 = Pr(C1) =

L∑i=k+1

pi = 1− ω(k) (2.8)

ademas

µ0 =

k∑i=1

iPr(i|C0) =

k∑i=1

ipi/ω0 = µ(k)/ω(k) (2.9)

µ1 =L∑

i=k+1

iPr(i|C1) =L∑

i=k+1

ipi/ω1 =µT − µ(k)

1− ω(k)(2.10)

donde

ω(k) =k∑

i=1

pi (2.11)

y

34


µ(k) =

k∑i=1

ipi (2.12)

son el momento acumulativo cero y uno, respectivamente, del histograma, y

µT = µ(L) =L∑i=1

ipi (2.13)

es la media total de los pixeles de la imagen original.

Paso 3: Se calculan las varianzas de las clases, es decir, los segundos momentosacumulativos:

σ20 =

k∑i=1

(i− µ0)2Pr(i|C0) =

k∑i=1

(i− µ0)2pi/ω0 (2.14)

σ21 =L∑

i=k+1

(i− µ0)2Pr(i|C1) =L∑

i=k+1

(i− µ1)2pi/ω1 (2.15)

Paso 4: Se calculan las siguientes medidas de discriminacion:

λ = σ2B/σ2W , κ = σ2T /σ

2W , η = σ2B/σ

2T (2.16)

donde

σ2W = ω0σ20 + ω1σ

21 (2.17)

σ2B = ω0(µ0 − µT )2 + ω1(µ1 − µT )2 = ω0ω1(µ1 − µ0)2 (2.18)

σ2T =L∑i=1

(i− µT )2pi (2.19)

es la varianza de la clase perteneciente, la varianza entre las clases y la varianzatotal de los niveles de gris, respectivamente.

Paso 5: Se itera para encontrar el valor de umbral optimo k∗ que maximice η dela ecuacion 2.16, de acuerdo a las siguientes ecuaciones derivadas de 2.7 y 2.10:

η(k) = σ2B/σ2T (2.20)

σ2B(k) =[µTω(k)− µ(k)]2

ω(k)[1− ωk](2.21)

y el umbral optimo k∗ es:

σ2B(k∗) = max1≤k<L

σ2B(k) (2.22)

35

2. MARCO TEORICO

Figura 2.8: Umbralizacion por el metodo de Otsu

En la Figura 2.8, el valor calculado por el algoritmo de Otsu es de 116.Una extension al algoritmo de Otsu implica encontrar mas de un valor optimo

de umbralizacion. Por ejemplo, si en lugar de encontrar un valor para segmentar dosregiones, queremos dos valores para tres regiones, los criterios de discriminacion seextienden a:

1 ≤ k1 < k2 < L, para las clases C0 = [1, ..., k1], C1 = [k1+1, ..., k2], C2 = [k2+1, ..., L].(2.23)

σ2B(k1∗, k2∗) = max1≤k1<k2<L

σ2B(k1, k2) (2.24)

Figura 2.9: Multi-umbralizacion por el metodo de Otsu

En la Figura 2.9, se encontraron cuatro valores para segmentar la imagen, generando5 regiones distintas. Los valores encontrados fueron 79, 111, 138 y 169.

36


2.2.2.2. Metodos de segmentacion basados en regiones

La segmentacion basada en regiones de una imagen digital [32], consiste en generaruna particion de la imagen en k regiones con las siguientes propiedades:

Las regiones resultantes, R1, R2, ..., Rk, de la particion deben ser mutuamenteexcluyentes.

Ri ∩Rj = ∅, i 6= j (2.25)

La union de las regiones debe ser la imagen completa I.

k⋃i=1

Ri = I (2.26)

Todas las regiones deben ser conexas, es decir, que todos sus pixeles esten conec-tados.

Las regiones resultantes deben ser homogeneas para cada una.

El crecimiento de regiones, Region growing [35, 36], es un procedimiento que agrupalos pixeles o subregiones que cumplan ciertos criterios de similaridad. Generalmente elproceso inicia en puntos “semilla”, donde el algoritmo empieza a “crecer”las regiones deinteres con aquellos pixeles vecinos que cumplan los criterios de homogeneidad, hastaque ya no se cumplan las condiciones deseadas.

Existen diferentes criterios de similaridad, u homogeneidad, que se pueden utilizarpara analizar los pixeles crecientes:

Homogeneidad por media, umbral simetrico:

∀x ∈ R : |I(x)− µ| ≤ s (2.27)

Suma de diferencias de cuadrados:

∑x∈R

(I(x)− µ)2 (2.28)

Diferencia de valor respecto al valor del punto semilla:

∀x ∈ R : |I(x)− I(xs)| ≤ T (2.29)

Umbrales arbitrarios inferiores y superiores:

∀x ∈ R : TL ≤ I(x) ≤ TU (2.30)

37

2. MARCO TEORICO

Entrada: Xs = (xs, ys) el punto semilla1: Se agrega el punto semilla a la cola de pixeles por visitar, Qx

2: mientras Qx 6= ∅ hacer3: Extraer el primer pixel de la cola de pixeles por visitar, px4: si px es homogeneo entonces5: px se selecciona como segmentado, Rs

6: Se anaden los pixeles vecinos de px a Qx

7: fin si8: fin mientras9: devolver Rs

Algoritmo 1: Region Growing

2.2.3. Envolvente convexa

Se dice que un conjunto es convexo si, dados dos puntos cualesquiera dentro delconjunto, el segmento que une a dichos puntos esta contenido dentro del conjunto. Otrapropiedad fundamental es que la interseccion de dos conjuntos convexos es siempre unconjunto convexo.

La envolvente convexa se define como, dado un conjunto de puntos en el planoP = p1, p2, ..., pn (con n mayor o igual que dos), el menor convexo que contenga a todoslos puntos [37] (ver Figura 2.10). Otra propiedad de la envolvente convexa es que, laenvolvente convexa de un conjunto P coincide con la interseccion de todos los convexosque contienen al conjunto P .

Figura 2.10: Ejemplo de envolvente convexa de un conjunto de puntos

Existen una variedad de algoritmos que encuentran la envolvente convexa de unconjunto de puntos:

38


QuickHull [38]: Basa su procesamiento en eliminar los puntos que es un hechono van a formar parte de la envolvente convexa (ver Figura 2.11). Inicia su cicloencontrando los 4 puntos extremos en las direcciones norte, sur, este y oeste yformar el cuadrilatero que se define con las uniones de dichos cuatro puntos; lospuntos dentro de este cuadrilatero no es posible que pertenezcan a la envolventeconvexa pues no son extremos, por lo que son descartados rapidamente. Los pun-tos fuera del cuadrilatero son tratados como regiones independientes, y el procesoes encontrar el punto mas alejado al segmento de lınea que los divide, y desecharlos puntos que queden dentro de la nueva figura contenida en el triangulo formadocon el segmento de lınea y el punto mas lejano. Se repite el proceso hasta que yano hayan puntos fuera dentro del polıgono que se vaya formando. Su complejidades cuadratica.

Figura 2.11: Ejemplo de la primera iteracion del QuickHull, tomado de [1]

Scan de Graham [39]: Genera una lista de los puntos extremos ordenados (verFigura 2.12). Trabaja con los angulos formados entre las tuplas de 3 puntosque se puedan formar, quedandose con los angulos positivos. Su complejidad esO(nlogn).

Figura 2.12: Ejemplo de la primera iteracion del Scan de Graham, tomado de [1]

39

2. MARCO TEORICO

2.2.4. Morfologıa matematica

La morfologıa matematica estudia el comportamiento de las estructuras geometricasaplicadas em imagenes digitales, fundamentadas en las operaciones de conjuntos [32].Estas tecnicas pueden aplicarse tanto a imagenes binarias como a escala de grises. Lasoperaciones morfologicas pueden simplificar datos en una imagen, preservando sus ca-racterısticas principales y eliminando aspectos irrelevantes en ella. Para ello, se utilizanestructuras geometricas (ver Figura 2.13), denominadas mascaras, que operan sobre lasimagenes de entrada, logrando distintos resultandos segun el contenido y tamano de lamascara.

Figura 2.13: Ejemplo de estructuras de morfologıa matematica

Es un proceso similar al de la convolucion en imagenes, ya que la mascara se mul-tiplica punto a punto por la sub-ventana correspondiente de la imagen de entrada, ysegun la operacion que se realice, el resultado puede ser 0 o 1. En general, las diversastecnicas y metodos derivan de dos operaciones morfologicas primarias: erosion y dila-tacion. Cabe recalcar que todas las operaciones que se mencionen seran sobre imagenesbinarias.

La erosion C entre una imagen binaria A y su correspondiente estructura morfologi-ca B se define matematicamente por la siguiente funcion:

C = AB = {x|Bx ⊆ A} (2.31)

Esta operacion tambien se conoce como fit de una imagen, ya que para que el pixelanalizado pertenezca a la imagen resultante, la mascara centrada sobre el pixel tieneque encajar sobre la imagen de entrada [40] (ver Figura 2.14).

La erosion de una imagen ayuda a eliminar regiones muy delgadas, reducir el tamanode los objetos y falsas separaciones entre ellos.

La dilatacion C entre una imagen binaria A y su correspondiente estructura mor-fologica B se define matematicamente por la siguiente funcion:

C = A⊕B = {x|(B)x ∩A 6= ∅} (2.32)

donde B se define como la reflexion de B, dada por:

40

2.3 Medidas de desempeno de segmentacion

Figura 2.14: Ejemplo de erosion

B = {x|x = −b, b ∈ B} (2.33)

Esta operacion tambien se conoce como hit de una imagen, ya que para que el pixelanalizado pertenezca a la imagen resultante, la mascara centrada sobre el pixel solotiene que corresponder a cualquier pixel de la sub-ventana [40] (ver Figura 2.15).

Figura 2.15: Ejemplo de dilatacion

La dilatacion de una imagen ayuda a aumentar el area de los objetos y los huecospequenos que estos posean, ası como intensificar los puntos de toda la imagen.

2.3. Medidas de desempeno de segmentacion

La precision y la exhaustividad [41] son conceptos que permiten determinar que tanbien o mal se desempena un sistema de acuerdo a lo esperado contra lo proporcionadopor el sistema. De acuerdo a estas dos definiciones primero es necesario abordar cuatroconceptos basicos sobre este tema.

En el ambiente de pruebas, en general se busca comparar los resultados obtenidosen la fase de experimentacion contra los resultados esperados, conjunto al que se ledenomina Ground Truth. La naturaleza de los resultados esperados depende mucho delexperimento como tal. En el caso de imagenes, el Ground truth suele ser un conjuntode imagenes segmentadas de forma manual por un experto en el area, listas para sercomparadas contra las imagenes segmentadas por el sistema a evaluar (ver Figura 2.16).

41

2. MARCO TEORICO

Figura 2.16: Ejemplo de imagen con su respectivo Ground Truth

De acuerdo al Ground Truth y a la imagen resultante del sistema a evaluar, esposible obtener cuatro tipos de resultados a nivel de pixel:

Verdaderos positivos (True Positives (TP)): Son todos los pixeles que fueronclasificados correctamente como objetos o regiones de interes (ver Figura 2.17).

Verdaderos negativos (True negatives (TN)): Son todos los pixeles que fueronclasificados correctamente como parte del fondo de la imagen, es decir, todos lospixeles que no pertenecen a objetos o regiones de interes (ver Figura 2.17).

Falsos positivos (False Positives (FP)): Son todos los pixeles que fueron clasifi-cados como parte del objeto o region de interes, pero que segun el Ground Truthno lo son (ver Figura 2.17).

Falsos negativos (False negatives (FN)): Son todos los pixeles que fueron clasifi-cados como parte del fondo de la imagen, pero que segun el Ground Truth no loson (ver Figura 2.17).

(a) (b) (c)

Figura 2.17: Ejemplo de desempeno de segmentacion: a) Ground Truth, b) Imagen resul-tado, c) Clasificacion de pixeles

De acuerdo con esta clasificacion de pixeles, existen ciertas medidas de desempenoque nos permiten evaluar el desempeno de los sistemas de segmentacion en imagenes:

42

2.3 Medidas de desempeno de segmentacion

Precision: Se define como el numero de TP divido entre la suma de los TP ylos FP. Esta medida determina que proporcion de identificaciones positivas fuecorrecta.

P =TP

TP + FP(2.34)

Exhaustividad: Se define como el numero de TP divido entre la suma de losTP y los FN. Esta medida determina que proporcion de verdaderos positivos seidentifico correctamente.

R =TP

TP + FN(2.35)

43

Capıtulo 3

Metodologıa

En este capıtulo se presentan los diferentes metodos empleados para el desarrollo deeste trabajo de investigacion. Se definen las etapas en las que se desarrollo el algoritmoy los diversos metodos y tecnicas empleadas para realizar la segmentacion de las celulasen las imagenes. Al final se detalla el diseno experimental para evaluar el funcionamientodel sistema.

El sistema fue desarrollado en MATLAB R2014b, en una computadora portatilASUS de 64 bits, con procesador interno Intel Core i7, memoria RAM de 8 GB y discode estado solido de 512 GB, en sistema operativo Linux Ubuntu 16.04.

Se diseno el sistema de acuerdo al esquema de la Figura 3.1

Figura 3.1: Diseno modular del sistema implementado

3.1. Diseno experimental

En total se logro recopilar un total de 52 imagenes de resultados del ensayo cometa.Debido al limitado numero de imagenes disponibles, se tomo la decision de dividir labase de datos en tres grupos:

37 imagenes que sirvieron para ajustar el sistema y hacer las pruebas experimen-tales durante el desarrollo de los algoritmos.

45

3. METODOLOGIA

5 imagenes de validacion cruzada que no se procesaron hasta que el sistema es-tuviera finalizado, para realizar las correcciones necesarias segun el resultado dedichas imagenes.

10 imagenes para las pruebas finales, de las cuales se midio el desempeno delsistema que sera reportado.

3.2. Etapa de pre-procesamiento

El objetivo de este modulo es recibir las imagenes de entrada, independientementede su formato, tamano, resolucion o iluminacion.

La imagen es cargada a traves de una funcion que despliega una ventana del direc-torio configurado y le permite al usuario seleccionar la imagen que desea procesar. Soloes posible procesar una imagen a la vez por el sistema. Una vez cargada la imagen, sealmacena su nombre sin formato para los archivos de salida.

El siguiente paso es convertir la imagen a su correspondiente en escala de grises,en caso de estar en formato de color RGB; ası como transformar la resolucion de laimagen a 8 bits, para tener una imagen con una escala de grises que vaya de 0 a 255sus valores de intensidad (ver Figura 3.2).

(a) (b)

Figura 3.2: Ajuste inicial de la imagen de entrada: a) Imagen en formato de color RGB,b) Imagen en escala de grises a ocho bits

Posteriormente, a la imagen resultante se le aplica un filtro de medianas con unaventana de 11×11 (ver Figura 3.3). Se selecciono esta medida de manera experimental,siendo este tamano de ventana el mas optimo para las imagenes de pruebas preliminares.

El objetivo de aplicar este primer filtro es difuminar los cometas de la imagen parareconocer la mayor cantidad de cola por parte de los cometas, debido a que dichas zonaspueden poseer demasiados pixeles dispersos.

El siguiente paso es aplicar de forma global el metodo multi-umbral de Otsu paracalcular tres valores que permitieran crear cuatro niveles de iluminacion en la imagen(ver Figura 3.4).

46

3.2 Etapa de pre-procesamiento

(a) (b)

Figura 3.3: Filtrado espacial a imagen de entrada: a) Imagen antes del filtrado espacial,b) Imagen con el filtrado espacial aplicado

(a) (b)

Figura 3.4: Multiples niveles de Otsu: a) Imagen con filtro de mediana, b) Imagen multi-umbralizada

47

3. METODOLOGIA

Debido a la naturaleza de las imagenes del ensayo cometa, se realiza un pequenoajuste al valor que divide el fondo de la imagen del primer nivel de cometas, con el finde recuperar la mayor cantidad de area de las colas de cometas.

Ciertas imagenes del ensayo cometa poseen problemas de iluminacion, lo que oca-siona que el primer nivel detectado de Otsu tenga problemas y abarque mas area quela deseada, lo que podemos apreciar en la Figura 3.5:

(a) (b)

Figura 3.5: Imagen con problema de iluminacion: a) Imagen con filtro de mediana, b)Imagen multi-umbralizada

Para solucionar el problema de la iluminacion, se formulo un criterio segun el por-centaje de nivel color cian en la imagen. Si hay menos del 40 % de pixeles color cianrespecto a toda la imagen, significa que dicho nivel sera tomado como parte de lasregiones de interes, en este caso, los cometas (ver Figura 3.6); de otro modo, solo setomaran en cuenta los niveles de color amarillo y rojo como cometas (ver Figura 3.7).

(a) (b)

Figura 3.6: Imagen sin problema de umbralizacion: a) Imagen multi-umbralizada, b)Imagen umbralizada

48

3.2 Etapa de pre-procesamiento

(a) (b)

Figura 3.7: Imagen con problema de iluminacion: a) Imagen multi-umbralizada, b) Imagenumbralizada

El 40 % fue seleccionado por mejor desempeno a lo largo de todas las imagenes deajustes preliminares.

El ultimo filtro que se aplica es por areas, eliminando todas aquellas regiones quetengan alta probabilidad de ser ruido sobrante de las etapas de filtrado. Para ello, seencuentra un salto entre las areas mas chicas respecto a las areas que potencialmentepertenecen a cometas. Este umbral es limitado a un area de 170 pixeles, siendo este unnumero obtenido en la etapa de pruebas preliminares con el respaldo de que las imagenessiguen el estandar de resolucion de 8 bits, y esa area de 170 es lo suficientemente pequenacomo para desechar regiones menores o iguales a ella (ver Figura 3.8).

(a) (b)

Figura 3.8: Imagen de salida de la etapa de pre-procesamiento: a) Imagen umbralizada,b) Imagen sin ruido

49

3. METODOLOGIA

3.3. Etapa de segmentacion

El objetivo de este modulo es delimitar las regiones de cometas, ası como sus respec-tivas cabezas (si es que las tienen). Se divide a su vez en dos sub-secciones, una dedicadaa procesar los cometas con solo un nucleo, y otra para los que presentan traslapes.

Para discernir entre los cometas de un nucleo y los traslapados, se diseno una funcionque recibiera una sub-imagen que contenga unicamente la region de interes a analizar. Aesta imagen se le aplica un filtro de medias con una ventana de longitud variable, dondesu valor, windowsize, se determina mediante la ecuacion 3.1, tomando como referenciael numero de filas y columnas de la sub-imagen, r′ y c′ respectivamente:

windowsize =

{floor(

√r′) si r′ <= c′

floor(√c′) de otro modo

(3.1)

Se tomo la raız cuadrada ya que se requerıa una funcion que creciera lento, es decir,que su valor no incrementara demasiado a tamanos de sub-imagenes mas grandes, yaque los filtrados con ventanas de gran tamano provocan que el procesamiento sea maslento.

La imagen se difumina para reducir el ruido dentro de los cometas y evitar detectarzonas que no pertenecen a cabezas, y mas bien son ruido interno (ver Figura 3.9).

(a) (b)

Figura 3.9: Procesamiento inicial a la sub-imagen de la region de interes: a) Sub-imagende entrada, b) Sub-imagen difuminada

A esta nueva imagen difuminada, la umbralizamos mediante el metodo de Otsu,aumentando el valor de umbralizacion en un 50 % para resaltar las regiones mas lumi-nosas de la sub-imagen, lo que potencialmente se refieren a cabezas de cometas (verFigura 3.10).

En este punto, se contabiliza el numero de regiones continuas distintas a cero encon-tradas por la previa umbralizacion. Si el numero de regiones es distinto a uno, se regresauna bandera indicando que la sub-imagen contiene mas de un nucleo. Si se encontro

50

3.3 Etapa de segmentacion

(a) (b)

Figura 3.10: Umbralizacion de la sub-imagen: a) Sub-imagen difuminada, b) Sub-imagenumbralizada

una region de interes, se inicia un proceso de verificacion, ya que algunos cometas estantan unidos que sus cabezas suelen quedar en una misma region, lo que podrıa arrojarfalsos cometas con unico nucleo (ver Figura 3.11).

(a) (b)

Figura 3.11: Ejemplo de una region con traslape en los nucleos: a) Sub-imagen difumi-nada, b) Sub-imagen umbralizada

El proceso para detectar estas regiones consiste en aplicar un ciclo de erosionesde morfologıa matematica, creciendo la ventana con cada iteracion. Las condicionesde paro son: iterar hasta que no quede nada de la region de interes, en este caso secorrobora que solo existıa una cabeza en el sub-imagen; iterar hasta que el numero deregiones en la sub-imagen sea mayor a uno, en este caso se regresa la bandera indicandoque la sub-imagen contiene mas de una cabeza.

En caso de que la bandera indique que solo existe un nucleo, se procede a hallar

51

3. METODOLOGIA

cualquiera de los puntos que pertenezcan a la zona mas iluminada de la region encon-trada, como posible punto de semilla de referencia para delimitar el area de la cabeza.Es en este punto donde se procesan de forma distinta las regiones con y sin traslape.

3.3.1. Procesamiento y segmentacion de regiones de cometas sin tras-lape

Antes de segmentar el area de la cabeza del cometa, se determina si el centroobtenido en el proceso anterior es el indicado, de acuerdo a la multi-umbralizacionglobal de la etapa de pre-procesamiento.

Para ello, se determina si en la correspondiente sub-imagen multi-umbralizada, exis-ten regiones rojas, que son las de mayor luminosidad. Si existe al menos un punto, setoma el primero que se encuentre y se envıa al algoritmo de segmentacion de cabezas;de otro modo, se toma el punto encontrado en el metodo previo.

Para segmentar el area de las cabezas, se recurre al algoritmo de Region Growing,tomando como punto semilla el mencionado en el parrafo anterior. La salida del algo-ritmo de segmentacion por crecimiento de regiones es una imagen binaria que contieneel area de la cabeza de los cometas, a la cual se le extrae su contorno, y se le aplica elalgoritmo Convex Hull para eliminar las irregularidades del borde.

Finalmente se le asigna un numero al cometa y en la imagen de salida se dibujauna lınea verde sobre el contorno de la region, que representa al cometa en sı, a laque tambien se le encuentra una envolvente convexa; una lınea roja que representa elcontorno del area de su cabeza; un punto azul en el centroide del area de la cabezasegmentada; y por ultimo el numero que se le asigne al cometa, como se puede apreciaren la Figura 3.12.

Para cada cometa analizado, se almacenan sus areas de cabezas encontradas, su-mando los pixeles que regresa el metodo de Region Growing.

3.3.2. Procesamiento y segmentacion de regiones con traslape

Cuando se tiene una region con traslape de cometas, se realizan dos etapas. En laprimera, almacenamos todas las areas de posibles cabezas dentro de las regiones contraslape, y se unen a las area de los cometas sin traslape. Posterior a ello, se calcula unvalor promedio de cabezas y su respectiva desviacion estandar. Esto es con el objetivode discriminar entre regiones que no pertenezcan a cabezas de cometas, y mas biensean residuos que no necesariamente se deban contabilizar.

En la segunda etapa, analizamos todas las regiones con traslape, y a cada una, sele calcula de manera local otra imagen multi-umbralizada de Otsu con tres valores,generando los respectivos cuatro niveles descritos en la seccion 3.2 (ver Figura 3.13).Esto permite ser mas selectivos al momento de localizar las areas que corresponden alas cabezas dentro del area de traslape.

De igual forma, y para detectar la mayor parte de areas rojas, el tercer umbral sereduce en un 20 % de su valor obtenido.

52

3.3 Etapa de segmentacion

Figura 3.12: Segmentacion final de cometas sin traslape

(a) (b)

Figura 3.13: Comparativa entre multi-umbralizacion global y local: a) Umbralizacionglobal, b) Umbralizacion local

53

3. METODOLOGIA

El siguiente paso es determinar las regiones rojas y amarillas resultantes de la multi-umbralizacion local. Como se aplico de forma local y no global, siempre van a existirregiones rojas, y lo que se hace a continuacion es evaluar para cada region aislada roja,si su area esta por arriba del 10 % de la media de areas de cabezas, desechando lasque no cumplan la condicion. Las regiones que superan este filtro, son sometidas a otracondicion ahora respecto a la desviacion estandar de las areas, para tratar los casos detraslapes de cabezas.

Si la region es mayor a una desviacion estandar de las areas de cabezas, se repiteel proceso de aplicar Otsu local pero ahora unicamente en la region roja, forzando aencontrar un valor que divida lo mas posible la region, separando las cabezas unidas.

Al final, se dibujan todas las regiones rojas como cabezas y/o fragmentos con unalınea roja, marcando su centro de masa con un punto azul. Para separar estos cometas deno traslapados, su contorno de la region traslapada se pinta de color amarillo, marcandola region con un numero como identificador (ver Figura 3.14).

Figura 3.14: Imagen de salida final del sistema de segmentacion de cometas

54

3.4 Etapa de post-procesamiento

3.4. Etapa de post-procesamiento

A continuacion, se detalla el calculo de los parametros que se extrajeron de lasregiones que contienen cometas con y sin traslape, ası como las medidas tomadas paraprocesar los parametros de las regiones con traslape.

Area del cometa: Suma de todos los pixeles dentro del area delimitada por lospuntos que formaron la envolvente convexa del cometa. Para el caso de las regionescon traslape, se da la suma total de toda el area con traslape sin aplicar ConvexHull.

Area de la cabeza: Suma de todos los pixeles dentro del area delimitada por lospuntos que formaron la envolvente convexa de la cabeza del cometa. Para el casode las regiones con traslape se da la suma total de todos los pixeles, dentro de suenvolvente convexa, de todas las cabezas encontradas dentro de esa region.

Area de la cola: Es el area del cometa menos el area de la cabeza, para amboscasos.

Contenido ADN del cometa: Suma de todos los niveles de intensidad en escalade grises de los pixeles dentro del area delimitada por los puntos que formaron laenvolvente convexa del cometa. Aplica para ambos casos.

Contenido ADN de la cabeza: Suma de todos los niveles de intensidad en escalade grises de los pixeles dentro del area delimitada por los puntos que formaron laenvolvente convexa de la cabeza del cometa. Aplica para ambos casos.

Contenido ADN de la cola: Es el contenido ADN del cometa menos el contenidoADN de la cabeza, para ambos casos.

Intensidad promedio de cometa: Contenido de ADN del cometa dividido entre elarea del cometa. Aplica para ambos casos.

Intensidad promedio de la cabeza: Contenido ADN de la cabeza divido entre suarea. Aplica para ambos casos.

Intensidad promedio de la cola: Si el area de la cola fue cero, su intensidad prome-dio tambien es cero. Si es distinto de cero, la intensidad promedio es el contenidoADN de la cola dividido entre su area. Aplica para ambos casos.

Porcentaje de ADN en la cabeza: Contenido ADN de la cabeza dividido entre elcontenido ADN del cometa. Aplica para ambos casos.

Porcentaje de ADN en la cola: Si el contenido de la cola fue cero, su porcentajeigual es cero, de lo contrario su porcentaje ADN de cola es el contenido ADN dela cola dividido entre el contenido ADN del cometa. Aplica para ambos casos.

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3. METODOLOGIA

Longitud de cometa: Distancia medida en pixeles del eje mayor de la elipse quemejor se le ajusta a la region del cometa. No aplica para traslapes.

Longitud de cabeza: Distancia medida en pixeles del eje de la elipse que mejor seajuste a la cabeza del cometa con la misma orientacion que el cometa. No aplicapara regiones con traslape.

Longitud de cola: Longitud de cometa menos longitud de cabeza. No aplica pararegiones con traslape.

Momento de cola: Porcentaje de ADN de la cola entre la longitud de la cola. Noaplica para traslapes.

Momento Olive: Porcentaje de ADN de la cola multiplicado por la distancia entreel centro de la cabeza y el centroide del cometa. No aplica para traslapes.

Numero de cabezas: Cantidad de regiones correspondientes a cabezas encontradasdentro de un area de traslape. No aplica para regiones sin traslape.

Area de cometa por cabeza: Estimacion del area de un cometa segun el numerode cabezas encontradas dentro del area de traslape. No aplica para regiones sintraslape.

Dano de degradacion: Segun el porcentaje de ADN de la cola, se asignan cinconiveles de dano al cometa segmentado, aplica para ambos casos:

• Nivel 0: 0 % al 20 %

• Nivel 1: 20 % al 40 %

• Nivel 2: 40 % al 60 %

• Nivel 3: 60 % al 80 %

• Nivel 4: 80 % al 100 %

Por ultimo, se ofrecen medidas de estadısticas centrales respecto a todos los come-tas encontrados, separando cometas con y sin traslape. Se calcula la media, mediana,maximo y mınimo del conjunto de cometas.

Se generan dos archivos de salida en formato .csv para su posterior uso por losinvestigadores que deseen trabajar con el ensayo cometa. En un archivo se almacenantodos los datos y medidas estadısticas de los cometas sin traslape, y en el otro losparametros de los cometas traslapados (ver Figura 3.15).

56

3.4 Etapa de post-procesamiento

Figura 3.15: Ejemplo de los datos generados por el sistema desarrollado

57

Capıtulo 4

Resultados

En el presente capıtulo se mostraran los resultados obtenidos a traves de la evalua-cion de las imagenes designadas para medir el desempeno del sistema desarrollado.

El procedimiento de pruebas fue el siguiente:

Se obtuvieron diez imagenes resultantes del ensayo cometas, las cuales no fueronusadas para la etapa de pruebas preliminares.

Con la ayuda de un experto del area biologica, se realizo una segmentacion manualde las diez imagenes para pruebas finales. Para ello, se generaron dos imagenespor cada una de las imagenes de pruebas: una para segmentar cabezas y otra parasegmentar el area total del cometa.

Las imagenes de prueba se procesaron por dos sistemas: OpenComet y el sistemadesarrollado en este proyecto de tesis.

Para cada resultado proporcionado por ambos sistemas, se generaron las corres-pondientes imagenes de cometas y areas de cabezas.

En total, se obtuvieron 60 imagenes que se utilizaron para las pruebas finales deeste trabajo de investigacion.

Cada imagen de cada sistema se comparo con la correspondiente imagen de lasegmentacion manual.

Se generaron los 4 valores de pixeles para medir el desempeno de la clasifica-cion de pixeles en la imagen para cada software, para ası, calcular la precision yexhaustividad.

Como son 10 imagenes por sistema, se obtiene el promedio de la precision yexhaustividad para imagenes de cabezas y cometas.

Se presentan los resultados de manera comparativa del desempeno de ambossistemas.

59

4. RESULTADOS

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.1: Resultados de segmentacion, imagen de prueba 1: a) Imagen original, b)Imagen segmentada manualmente, c) Imagen segmentada por OpenComet, d) Imagen seg-mentada por el sistema desarrollado

60

Las imagenes de pruebas finales, junto con las respectivas segmentaciones dadas porOpenComet y el sistema desarrollado, ası como la segmentacion manual de cada una,se aprecian en las figuras de la 4.1 a la 4.10.

En la Figura 4.1, se observa la principal mejora del sistema desarrollado respectoal OpenComet, la cual se refiere a la segmentacion de las cabezas de los cometas.Por ejemplo, en el cometa marcado con el numero uno del inciso c, se aprecia unasegmentacion de cabeza que casi cubre todo el cometa; por otro lado, ese mismo cometaen el inciso d, tiene un area de cabeza mas especıfica y que tiene un mejor desempenocomparando el cometa segmentado en el inciso b. Tambien un punto negativo parael sistema desarrollado es que segmenta y clasifica como cometas aquellas zonas queno son celulas, y mas bien son residuos de los materiales del ensayo cometa, como elcometa 14 del inciso d.

(a) (b)

(c) (d)


En la Figura 4.2, se aprecia otra de las ventajas del sistema desarrollado sobre

61

4. RESULTADOS

el OpenComet, la cual se refiere a proporcionar segmentacion de todas las zonas quepudieran ser cabezas o fragmentos de estas, dentro de las areas de cometas con traslape.Lo que OpenComet hace es encontrar la zona mas luminosa que este mas a la izquierda,determinando que esa es la cabeza del area total de traslape, ignorando las demas zonas.

(a) (b)

(c) (d)


En la figura 4.4, lo que el sistema desarrollado realiza es segmentar como fragmentosde cabeza del cometa todas aquellas zonas de alta luminosidad, es por ello que seobservan varias regiones con contornos rojos. Tambien, se observa que el OpenCometclasifica de manera incorrecta todas las regiones muy chicas de la imagen como si fueranpequenos cometas.

En la Figura 4.6, se resalta una de las areas de oportunidad del sistema desarrollado,que es cuando hay muchos cometas agrupados en una zona, lo que hace que el sistemasegmente un area general y muy grande de la zona de los cometas. Sin embargo seaprecia que hasta para un experto es difıcil determinar con exactitud los contornos de

62

(a) (b)

(c) (d)


63

4. RESULTADOS

(a) (b)

(c) (d)


64

(a) (b)

(c) (d)


65

4. RESULTADOS

los cometas en este tipo de zonas. El OpenComet ni siquiera intenta clasificar esa zonade aglomeramiento de cometas.

(a) (b)

(c) (d)


La imagen de la Figura 4.7 expone el problema de el exceso de residuos y basuraen la imagen, ya que imposibilita la segmentacion adecuada de los cometas, marcandocomo cabezas regiones que no lo son. En el caso del OpenComet aquellas regiones quecontienen mucha basura las marca como desconocidas, sin proveer mediciones de ellas.

Las figuras de la 4.8 a la 4.10 son otros ejemplos de problemas de iluminaciony enfoque, lo que altera el resultado de las segmentaciones. No obstante en todas seaprecia la ventaja del sistema desarrollado que radica en la mejora de la segmentacionde las cabezas de los cometas que clasifica correctamente, haciendo que los datos demedicion de los cometas sean mas exactos y precisos.

66

(a) (b)

(c) (d)


67

4. RESULTADOS

(a) (b)

(c) (d)


68

(a) (b)

(c) (d)


69

4. RESULTADOS

4.1. Analisis de la segmentacion realizada por OpenCo-met

Para cada una de las diez imagenes, se generaron dos imagenes binarias: una co-rresponde a las regiones de los cometas y la otra a las regiones de las cabezas dentrode los cometas. De igual forma, se generan estas mismas imagenes para la segmenta-cion manual, con el objetivo de comparar y medir el desempeno del OpenComet. Lacomparacion de las diez imagenes de pruebas se aprecia en las figuras de la 4.11 a la 4.20

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.11: Imagenes binarias de los resultados de segmentacion del OpenComet contralas imagenes binarias de la segmentacion manual, imagen de prueba 1: a) Segmentacion decometas de OpenComet, b) Segmentacion de cometas manual, c) Segmentacion de cabezasde OpenComet, d) Segmentacion de cabezas manual

En todas las figuras de la 4.11 a la 4.20, se aprecia que la segmentacion de cabezasdel OpenComet es muy imprecisa, lo que altera considerablemente la veracidad de losparametros extraıdos de los cometas.

Para medir cuantitativamente el desempeno final del OpenComet, se calcula elnumero de pixeles TP, TN, FP y FN. Esto se realiza tanto para la imagen prueba

70

4.1 Analisis de la segmentacion realizada por OpenComet

(a) (b)

(c) (d)


71

4. RESULTADOS

(a) (b)

(c) (d)


72


(a) (b)

(c) (d)


73

4. RESULTADOS

(a) (b)

(c) (d)


74


(a) (b)

(c) (d)


75

4. RESULTADOS

(a) (b)

(c) (d)


76


(a) (b)

(c) (d)


77

4. RESULTADOS

(a) (b)

(c) (d)


78


(a) (b)

(c) (d)


79

4. RESULTADOS

(la del OpenComet en este caso) y la imagen Ground Truth (la imagen segmentadamanualmente). Con dichos datos, se calcula la precision (P ) y la exhaustividad (R) decada una de las diez imagenes de prueba. En la tabla 4.1 se muestran estos resultados,ası como un promedio y desviacion estandar de cada columna.

Precisionde cometas

Exhaustividadde cometas

Precisionde cabezas

Exhaustividadde cabezas

Imagen deprueba 1

88.28 % 73.34 % 12.96 % 79.76 %

Imagen deprueba 2

94.24 % 43.17 % 39.07 % 38.65 %

Imagen deprueba 3

90.87 % 71.69 % 9.35 % 50.13 %

Imagen deprueba 4

32.87 % 85.93 % 3.38 % 100 %

Imagen deprueba 5

86.91 % 66.04 % 22.42 % 74.71 %

Imagen deprueba 6

78.80 % 23.81 % 18.91 % 20.19 %

Imagen deprueba 7

85.44 % 45.92 % 48.68 % 72.78 %

Imagen deprueba 8

73.71 % 27.80 % 0 % 0 %

Imagen deprueba 9

81.70 % 31.91 % 28.25 % 38.77 %

Imagen deprueba 10

56.03 % 87.65 % 8.61 % 54.08 %

Promedio 76.88 % 55.72 % 19.16 % 52.90 %

Desviacionestandar

18.88 % 24.08 % 15.71 % 29.98 %

Tabla 4.1: Desempeno de la segmentacion del OpenComet

4.2. Analisis de la segmentacion realizada por el sistemadesarrollado

Para medir el desempeno de las imagenes segmentadas por el sistema desarrollado,se siguio el mismo proceso que en la seccion 4.1. La comparacion entre la segmentacionmanual y la realizada por el sistema desarrollado se puede apreciar en las figuras dela 4.21 a la 4.30

Se aprecia que la segmentacion dada por el sistema propuesto, tanto para cometas

80

4.2 Analisis de la segmentacion realizada por el sistema desarrollado

(a) (b)

(c) (d)

Figura 4.21: Imagenes binarias de los resultados de segmentacion del sistema desarro-llado contra las imagenes binarias de la segmentacion manual, imagen de prueba 1: a)Segmentacion de cometas del sistema desarrollado, b) Segmentacion de cometas manual,c) Segmentacion de cabezas del sistema desarrollado, d) Segmentacion de cabezas manual

81

4. RESULTADOS

(a) (b)

(c) (d)


82


(a) (b)

(c) (d)


83

4. RESULTADOS

(a) (b)

(c) (d)


84


(a) (b)

(c) (d)


85

4. RESULTADOS

(a) (b)

(c) (d)


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(a) (b)

(c) (d)


87

4. RESULTADOS

(a) (b)

(c) (d)


88


(a) (b)

(c) (d)


89

4. RESULTADOS

(a) (b)

(c) (d)


90


como para sus cabezas, es mucho mas precisa a comparacion con la segmentacion deOpenComet. El area de los cometas se ve afectada cuando la imagen tiene problemasde iluminacion o excesos de residuos de materiales en el fondo.

De la misma forma que en la seccion 4.1, para calcular el desempeno de segmentaciondel sistema desarrollado, se calcula el numero de TP, TN, FP y FN de todas las imagenesy se generan los respectivos valores de precision (P ) y exhaustividad (R). En la tabla4.2 se muestran estos resultados, ası como un promedio y desviacion estandar de cadacolumna.

Precisionde cometas

Exhaustividadde cometas

Precisionde cabezas

Exhaustividadde cabezas

Imagen deprueba 1

71.93 % 95.96 % 61.74 % 61.31 %

Imagen deprueba 2

79.31 % 97.19 % 64.31 % 94.62 %

Imagen deprueba 3

71.96 % 85.21 % 22.73 % 84.77 %

Imagen deprueba 4

100 % 52.50 % 11.51 % 75.31 %

Imagen deprueba 5

71.14 % 88.53 % 50.84 % 91.61 %

Imagen deprueba 6

70.67 % 80.70 % 48.17 % 45.41 %

Imagen deprueba 7

68.43 % 82.78 % 50.41 % 48.83 %

Imagen deprueba 8

28.11 % 82.55 % 0.05 % 98.28 %

Imagen deprueba 9

35.80 % 94.75 % 50.56 % 74.14 %

Imagen deprueba 10

22.04 % 99.64 % 62.82 % 74.63 %

Promedio 61.93 % 85.98 % 42.31 % 74.89 %

Desviacionestandar

24.88 % 13.60 % 22.70 % 18.39 %

Tabla 4.2: Desempeno de la segmentacion del sistema desarrollado

91

Capıtulo 5

Conclusiones

En este proyecto se desarrollo un sistema para procesar y analizar las imagenes ob-tenidas por el ensayo cometa, basado en el analisis de la distribucion y comportamientode los pixeles de las imagenes de entrada, mediante algoritmos de segmentacion basadaen el crecimiento de regiones y de la multi-umbralizacion basada en el histograma dela imagen.

La contribucion principal de este trabajo es la mejora en la precision en la que sesegmentan las cabezas de las celulas, ademas de procesar de forma mas eficiente loscometas traslapados.

El tema de la iluminacion y enfoque de la imagen fue bastante relevante en el desa-rrollo del sistema, ya que muchos softwares no son capaces de realizar las correccionesde fondo de acuerdo a la distribucion de niveles de intensidad en la imagen de entrada.

El uso del algoritmo Region Growing para delimitar el area de las cabezas de loscometas, resulto bastante eficiente para la diversidad de casos de cometas que su puedenpresentar el las imagenes del ensayo cometa.

Procesar los cometas traslapados resulto ser el reto mas grande del proyecto, ya quedebido a la naturaleza del ensayo cometa, las imagenes pueden estar congestionadas decometas, por lo que el traslape es un caso muy comun.

5.1. Trabajo futuro

A pesar que el metodo propuesto en este trabajo dio mejores resultados de la seg-mentacion de cometas traslapados, todavıa queda un amplio espacio de desarrollo paramejorar las tecnicas y metodos que brinden una segmentacion aun mas precisa de aque-llos cometas sobrepuestos.

Una de las tecnicas que se tienen planeado implementar para este tipo de imagenesson los algoritmos de segmentacion basados en los contornos activos de formas, debidoa la flexibilidad de estos algoritmos de ajustar una curva de acuerdo al comportamientode las regiones de interes.

Otra area potencial para experimentar es el uso de metodos de aprendizaje au-tomatico, especıficamente los algoritmos de deep learning, en el cual es necesario teneruna extensa base de datos de imagenes, ademas de equipo de alto poder de computo.

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Bibliografıa

[1] “Fundamentos Geometrıa Computacional .” http://aiweb.techfak.

uni-bielefeld.de/content/bworld-robot-control-software/. xi, xi,39

[2] V. McKelvey-Martin, M. Green, P. Schmezer, B. Pool-Zobel, M. De Meo, andA. R. Collins, “The single cell gel electrophoresis assay (comet assay): A europeanreview,” vol. 288, pp. 47–63, 08 1993. 19

[3] D. W. Fairbairn, P. Olive, and K. O’Neill, “The comet assay: a comprehensivereview,” vol. 339, pp. 37–59, 03 1995. 19

[4] N. Singh, M. T. McCoy, R. Tice, and E. L. Schneider, “A simple technique forquantitation of low-levels of dna damage in individual cells,” Experimental CellResearch, vol. 175, pp. 184–191, 04 1988. 19

[5] E. Rojas, M. Lopez, and V. Mahara, “Single cell gel electrophoresis assay: Metho-dology and applications,” vol. 722, pp. 225–54, 03 1999. 19

[6] M. Klaude, S. Eriksson, J. Nygren, and G. Ahnstrom, “The comet assay: Mecha-nisms and technical considerations,” vol. 363, pp. 89–96, 07 1996. 19

[7] A. Rodrıguez-Rey, E. Noris-Garcıa, and M. T. Fundora Torres, “Principios y rele-vancia del ensayo cometa,” Revista Cubana de Investigaciones Biomedicas, vol. 35,pp. 184 – 194, 2016. 20

[8] A. R Collins, “The comet assay for dna damage and repair: Principles, applications,and limitations,” vol. 26, pp. 249–61, 04 2004. 20

[9] C. D. G.R. Wasson, V.J. McKelvey-Martin, “The use of the comet assay in thestudy of human nutrition and cancer,” vol. 23, p. 153–162, 2008. 20

[10] A. C. M. Dusinska, “The comet assay in human biomonitoring: gene-environmentinteractions.,” Mutagenesis, vol. 23 3, pp. 191–205, 2008. 20

[11] P. Olive, “Impact of the comet assay in radiobiology,” Mutagenesis, vol. 681,pp. 13–23, 2009. 20

95

http://aiweb.techfak.uni-bielefeld.de/content/bworld-robot-control-software/

http://aiweb.techfak.uni-bielefeld.de/content/bworld-robot-control-software/

BIBLIOGRAFIA

[12] A. Jha, “Ecotoxicological applications and significance of the comet assay,” vol. 23,pp. 207–21, 06 2008. 20

[13] Y. T.-W. Anderson, D. and D. McGregor, “Comet assay responses as indicatorsof carcinogen exposure,” pp. 539–555, 1998. 20

[14] E. I Cortes-Gutierrez, M. Davila-Rodrıguez, J. Fernandez, C. Lopez, A. Gosalbez,and J. Gosalvez, “New application of the comet assay: Chromosome-comet assay,”vol. 59, pp. 655–60, 05 2011. 20

[15] T. Kumaravel, B. Vilhar, S. P Faux, and A. Jha, “Comet assay measurements: Aperspective,” vol. 25, pp. 53–64, 12 2007. 20

[16] J. Ashby, H. Tinwell, P. Lefevre, and M. Browne, “The single cell gel electrophoresisassay for induced dna damage (comet assay): measurement of tail length andmoment,” Mutagenesis, vol. 10, pp. 85–90, 1995. 20

[17] K. J. M. C. B. P. e. a. Barber PR, Vojnovic B, “Automated counting of mammaliancell colonies,” Physics in Medicine & Biology, vol. 46, p. 63, 2001. 20

[18] P. Barber, B. Vojnovic, J. Kelly, C. R Mayes, P. Boulton, M. Woodcock, andM. C Joiner, “An automated colony counter utilising a compact hough transform,”01 2000. 20

[19] K. Kim, J. Jeon, W. Choi, P. Kim, and Y.-S. Ho, “Automatic cell classificationin human’s peripheral blood images based on morphological image processing,”vol. 2256, pp. 225–236, 01 2001. 20

[20] W. Bocker, W. Rolf, T. Bauch, W.-U. Muller, and C. Streffer, “Automated cometassay analysis,” Cytometry, vol. 35, no. 2, pp. 134–144, 1999. 20

[21] Z. P., “Methoden der digitalen bildverarbeitung.,” 1991. 20

[22] B. Gyori, G. Venkatachalam, P. Thiagarajan, D. Hsu, and M.-V. Clement, “Open-comet: An automated tool for comet assay image analysis,” vol. 2, pp. 457–65, 012014. 20

[23] L.-K. Huang and M.-J. Wang, “Image thresholding by minimizing the measures offuzzines,” vol. 28, pp. 41–51, 01 1995. 21

[24] T. Acharya, A. K. Ray, and A. Gallagher, “Image processing: Principles and ap-plications,” vol. 15, p. 9901, 2005. 21

[25] B. Vojnovic, P. Barber, P. Johnston, H. C Gregory, B. Marples, M. C Joiner,and R. J Locke, “A high sensitivity, high throughput, automated single-cell gelelectrophoresis (’comet’) dna damage assay,” 03 2003. 21

[26] I. Sobel, “An isotropic 3 3 image gradient operator,” 02 2014. 23

96

BIBLIOGRAFIA

[27] C. Kent, J. Eady, G. Ross, and G. Steel, “The comet moment as a measure of dnadamage in the comet assay,” International Journal of Radiation Biology, vol. 67,pp. 655–660, 1995. 23

[28] E. Kiziltan and E. Yurtcu, “Semi-automatic scoring tool for comet assay,” vol. 9,pp. 27–33, 11 2015. 23

[29] P. Olive and J. Banath, “Olive, p.l. & banath, j.p. the comet assay: a method tomeasure dna damage in individual cells. nat. protoc. 1, 23-29,” vol. 1, pp. 23–9,02 2006. 23

[30] C. Helma and M. Uhl, “A public domain image-analysis program for the single-cellgel- electrophoresis (comet) assay,” vol. 466, pp. 9–15, 04 2000. 23

[31] T. Lee, S. Lee, W. Y. Sim, Y. Mi Jung, S. Han, J.-H. Won, H. Min, and S. Yoon,“Hicomet: A high-throughput comet analysis tool for large-scale dna damage as-sessment,” vol. 19, 02 2018. 24

[32] R. E. W. Rafael C. Gonzalez, Digital Image Processing. 28, 30, 32, 33, 37, 40

[33] A. V. Oppenheim, A. S. Willsky, and S. H. Nawab, Signals & Systems (2Nd Ed.).1996. 30

[34] N. Otsu, “A threshold selection method from gray-level histograms,” pp. 62–66,1979. 34

[35] J. Fan, G. Zeng, M. Body, and M.-S. Hacid, “Seeded region growing: An extensiveand comparative study,” vol. 26, pp. 1139–1156, 2005. 37

[36] F. Y. Shih and S. Cheng, “Automatic seeded region growing for color image seg-mentation,” Image Vision Comput., vol. 23, no. 10, pp. 877–886, 2005. 37

[37] G. Mei, J. C. Tipper, and N. Xu, “An algorithm for finding convex hulls of planarpoint sets,” pp. 888–891, 2012. 38

[38] C. B. Barber, D. P. Dobkin, and H. Huhdanpaa, “The quickhull algorithm forconvex hulls,” ACM Trans. Math. Softw., 1996. 39

[39] M. M. Atwah, J. Baker, and S. G. Akl, “An associative implementation of graham’sconvex hull algorithm.,” pp. 273–276, 01 1995. 39

[40] J. Yossi Gil and R. Kimmel, “Efficient dilation, erosion, opening and closing algo-rithms,” vol. 24, pp. 1606– 1617, 2003. 40, 41

[41] D. M. W. Powers, “Evaluation: From precision, recall and f-measure to roc., infor-medness, markedness & correlation,” Journal of Machine Learning Technologies,pp. 37–63, 2011. 41

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