TAS 10455 (G)-2016€¦ · รำยกำรที่ 1...

แนวปฏบตในการใชมาตรฐานสนคาเกษตร

มกษ. 10455 (G)-2559

GUIDANCE ON THE APPLICATION OF THAI AGRICULTURAL STANDARD

TAS 10455 (G)-2016

การชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกง

DIAGNOSIS OF INFECTIOUS HYPODERMAL AND

HEMATOPOIETIC NECROSIS DISEASE IN SHRIMP

ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต

กระทรวงเกษตรและสหกรณ

ICS 11.220. ISBN XXX-XXX-XXX-X

รางZ

(ราง)


มกษ. 10455 (G)-2559

GUIDANCE ON THE APPLICATION OF THAI AGRICULTURAL STANDARD

TAS 10455 (G)-2016


DIAGNOSIS OF INFECTIOUS HYPODERMAL AND

HEMATOPOIETIC NECROSIS DISEASE IN SHRIMP


กระทรวงเกษตรและสหกรณ 50 ถนนพหลโยธน เขตจตจกร กรงเทพฯ 10900

โทรศพท 0 2561 2277 โทรสาร 0 2561 3357

www.acfs.go.th

ประกาศในราชกจจานเบกษา ฉบบประกาศและงานทวไป เลม 134 ตอนพเศษ 35 ง

วนท 2 กมภาพนธ พทธศกราช 2560

(2)

คณะกรรมการวชาการพจารณามาตรฐานสนคาเกษตร

เรอง การชนสตรโรคไอเอชเอชเอนวในกง

1. นางสปราณ ชนบตร ประธานกรรมการ

2. ผแทนกรมปศสตว กรรมการ

นายทววฒน ดมะการ

นายนพพร โตะม

นางตวงทอง ปจฉมะศร

3. ผแทนส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต กรรมการ

นางอษา บ ารงพช

นายชยศร มหนตชยสกล

4. ผแทนสถาบนวจยสขภาพสตวน าจด กรมประมง กรรมการ

นางสาวพทธรตน เบาประเสรฐกล

5. ผแทนสถาบนวจยสขภาพสตวน าชายฝง กรมประมง กรรมการ

นางจ าเรญศร ถาวรสวรรณ

นางสาวอรอนงค คงทว

6. ผแทนสวนควบคมการคาสตวน าและปจจยการผลต กรรมการ

ส านกบรหารจดการดานการประมง กรมประมง

นายไกสฤษด พนพาณชย

นายจตวฒนา เหลงบ ารง

7. ผแทนคณะประมง มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรรมการ

นายประพนธศกด ศรษะภม

8. ผแทนคณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยมหดล กรรมการ

นายสรพงษ ฐตะมาด

นางสาวแสงจนทร เสนาปน

นางสาวรพพรรณ วนชวรยกจ

9. ผแทนคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรรมการ

ผชวยศาสตราจารยวศณ บญญาววฒน

นายณฎฐธน ฐตชญาพงษ

10. ผแทนสมาคมกงไทย กรรมการ

11. ผแทนสมาคมผเล ยงกงทะเลไทย กรรมการ

นายสรศกด ดลกเกยรต

(3)

12. ผแทนสมาคมเพาะเล ยงสตวน าไทย กรรมการ

นายพรศกด ลาโภดม

นางวมลมาศ เปยมสมบรณ

13. ผแทนสมาคมอาหารแชเยอกแขง กรรมการ

นายชพงษ ลอสขประเสรฐ

นางสาววาสนา ตรงใจจรง

14. รองศาสตราจารยเจนนช วองธวชชย กรรมการ

ผทรงคณวฒดานการชนสตรโรค

15. ผแทนส านกก าหนดมาตรฐาน กรรมการและเลขานการ


นางสาวมนตรา ลกขณา

นางสาวขวญหทย ทองปลาด

(4)

กระทรวงเกษตรและสหกรณไดประกาศมาตรฐานสนคาเกษตร เรอง การชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกง

(มกษ. 10455 – 2559) ส าหรบใชเปนหลกการของหองปฏบตการเพอการชนสตรโรค IHHN ในกงให

สอดคลองกบขอก าหนดขององคการโรคระบาดสตวระหวางประเทศ เพอสงเสรมใหเกดการควบคมโรคกง

ในฟารมอยางมประสทธภาพ ถกตองตามหลกวชาการและสามารถน าไปปฏบตไดจรง คณะกรรมการ

มาตรฐานสนคาเกษตรจงก าหนดมาตรฐานสนคาเกษตร เรอง แนวปฏบตในการใชมาตรฐานสนคาเกษตร

การชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกง เพอใชเปนแนวทางในการน ามาตรฐานดงกลาวไปปฏบต

มาตรฐานสนคาเกษตรน ก าหนดขนโดยใชเอกสารตอไปนเปนแนวทาง

ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต. 2556. รายงานโครงการศกษาขอมลเพอจดท าวธการ

ชนสตรโรคไอเอชเอชเอนว

World Organisation for Animal Health (OIE). 2015. Chapter 2.2.2. Infectious Hypodermal and

Haematopoietic Necrosis. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. Paris, France.

มกษ. 10455 (G)-2559



แนวปฏบตน ใหค ำอธบำยควำมทำงวชำกำรของกำรเกบตวอยำงเพอกำรชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกง

(ภำคผนวก ก) กำรชนสตรดวยวธทดสอบโรคเบองตน และกำรชนสตรดวยวธทดสอบยนยนโรคใน

มำตรฐำนสนคำเกษตร เรอง กำรชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกง (มกษ. 10455-2559) เพอเปน

ขอแนะน ำในกำรน ำมำตรฐำนดงกลำวไปปฏบต

ค าอธบาย มกษ. 10455-2559 มรายละเอยดดงน

ขอก ำหนด มกษ. 10455 พมพอยในกรอบและมค ำอธบำยขอก ำหนดอยใตกรอบ

1. ขอบขาย

มำตรฐำนสนคำเกษตรน ก ำหนดกำรชนสตรโรคไอเอชเอชเอนในกงทำงหองปฏบตกำร ครอบคลมตงแต

ตวอยำงเพอกำรชนสตร กำรตรวจรอยโรคภำยนอก (gross lesion) วธจลพยำธวทยำ (histopathological

method) และวธชววทยำระดบโมเลกล (molecular biology method)

2. นยาม

ควำมหมำยของค ำทใชในมำตรฐำนสนคำเกษตรน มดงตอไปน

2.1 โรคไอเอชเอชเอน (infectious hypodermal and hematopoietic necrosis disease; IHHN disease)

หมำยถง โรคในกงทเกดจำกกำรตดเชอไวรสไอเอชเอชเอน (infectious hypodermal and hematopoietic

necrosis virus; IHHNV) กงทไวตอกำรตดเชอ IHHNV เชน กงขำว (Litopenaeus vannamei) กงกลำด ำ

(Penaeus monodon) และกงฟำ (Penaeus stylirostris) ตรวจพบเชอไดในกงทกวยตงแตไข กงวยออน

กงหลงวยออน กงวยรน และกงตวเตมวย

2.2 กง (shrimp and prawns) หมำยถง สตวไมมกระดกสนหลง ไดแก กงในวงศ Penaeidae และ

Palaemonidae

2.3 กำรชนสตรโรค (diagnosis) หมำยถง กำรตรวจสอบเพอกำรวนจฉยโรค

2.4 กงวยออน (larva) หมำยถง ลกกงทเพงออกจำกไขและมกำรเปลยนรปรำง 3 ระยะ คอ นอเพลยส

(nauplius) โซเอย (zoea) และไมซส (mysis) รวมใชเวลำประมำณ 8 วน ถง 11 วน

มกษ. 10455 (G)-2559

2

2.5 กงหลงวยออน (postlarva; PL) หมำยถง กงทเจรญหลงจำกระยะไมซสจนถงระยะวยรน มรยำงค

เหมอนกงตวเตมวย นยมเขยนยอวำ PL แลวตำมดวยจ ำนวนวนทกงเขำสระยะหลงวยออน

2.6 กงวยรน (juvenile) หมำยถง กงหลงระยะหลงวยออนทมลกษณะเหมอนตวเตมวยแตอวยวะสบพนธ

ยงพฒนำไมเตมท

2.7 กงตวเตมวย (adult) หมำยถง กงโตเตมท อวยวะสบพนธพฒนำเตมทแลวและสบพนธได

2.8 เลอด (haemolymph) หมำยถง องคประกอบของน ำเลอดและเมดเลอดทอยในระบบไหลเวยนเลอด

ของกง

2.9 วธทดสอบโรคเบองตน (presumptive diagnosis) หมำยถง วธกำรตรวจทำงหองปฏบตกำรเพอใช

เปนแนวทำงในกำรชนสตรโรค

2.10 วธทดสอบยนยนโรค (confirmatory diagnosis) หมำยถง วธกำรตรวจทำงหองปฏบตกำรทใชในกำร

ยนยนผลกำรชนสตรโรคและเปนวธทยอมรบวำมควำมจ ำเพำะและควำมไวสงกวำวธทดสอบโรคเบองตน

2.11 ควำมจ ำเพำะ (specificity) ของวธกำรชนสตร หมำยถง ควำมสำมำรถของวธทดสอบทใหผลกำร

ทดสอบเปนลบในกลมตวอยำงจำกตวอยำงทไมตดเชอ

2.12 ควำมไว (sensitivity) ของวธกำรชนสตร หมำยถง ควำมสำมำรถของวธทดสอบทใหผลกำรทดสอบ

เปนบวกในกลมตวอยำงจำกตวอยำงทตดเชอ

2.13 ตวอยำงควบคมผลบวก (positive control sample) หมำยถง ตวอยำงทมเชอหรอสวนประกอบของ

เชอ IHHNV ซงเมอน ำไปผำนกระบวนกำรชนสตรตำมขนตอนตำงๆ เชนเดยวกบตวอยำงทตองกำร

ทดสอบแลว ใหผลบวก

2.14 ตวอยำงควบคมผลลบ (negative control sample) หมำยถง ตวอยำงทไมมเชอหรอสวนประกอบ

ของเชอ IHHNV ซงเมอน ำไปผำนกระบวนกำรชนสตรตำมขนตอนตำงๆ เชนเดยวกบตวอยำงทตองกำร

ทดสอบแลว ใหผลลบ

รำยกำรท 1 กำรเกบตวอยำงเพอกำรชนสตร

ขอก ำหนดท 1.1 ตวอยำงเพอตรวจรอยโรคภำยนอกหรอตรวจดวยวธจลพยำธวทยำ

ขอก ำหนดท 1.1.1 ตองเปนตวอยำงกงมชวตหรอกงปวยใกลตำย และรกษำสภำพตวอยำงไวในสำรละลำย

คงสภำพเดวดสน (Davidson’s fixative)

ค าอธบาย

การเกบตวอยางกงมชวตหรอกงปวยใกลตาย มขนตอนดงน

(1) น ำกงมชวตพรอมน ำจำกบอเลยงใสถงพลำสตกหรอภำชนะอนทใหม สะอำด และเหมำะสม แยกแต

ละบอไมปะปนกน จ ำนวนตวอยำงกงขนกบขนำดของตวอยำงและภำชนะทขนสงตำมควำมเหมำะสม

มกษ. 10455 (G)-2559

3

(2) บนทกขอมล (ภำคผนวก ช) และท ำเครองหมำยตวอยำงใหครบถวนและชดเจน เชน วนเดอนปทเกบ

ตวอยำง รหสตวอยำง ชอฟำรม และขอมลสตวน ำ

(3) ในกรณทตองกำรขนสงตวอยำงมชวตไปยงหองปฏบตกำร ตองใหออกซเจนระหวำงกำรขนสงหรอม

วธกำรรกษำปรมำณออกซเจนในน ำระหวำงกำรขนสง เพอใหกงมชวตจนถงหองปฏบตกำร

การรกษาสภาพตวอยางดวยสารละลายคงสภาพเดวดสน (ภำคผนวก ค ขอ ค.1) มขนตอนดงน

(1) น ำตวอยำงกงทมชวตมำท ำกำรณยฆำต (ภำคผนวก ง)

(2) รกษำสภำพตวอยำงในสำรละลำยคงสภำพเดวดสนปรมำตรประมำณ 10 เทำของปรมำตรตวอยำงเพอ

ปองกนกระบวนกำรยอยสลำยตวเอง (autolysis) ของเนอเยอกงซงเกดขนเรวมำก ทงน

- กงวยออนระยะนอเพลยสถงกงหลงวยออน 20 วน (PL20) สำมำรถเกบรกษำสภำพทงตวได โดยแชใน

สำรละลำยคงสภำพเดวดสน

- กงหลงวยออน 21 วน (PL21) จนถงกงทมน ำหนกไมเกน 3 g ใหเปดเปลอกสวนหวขนและแชใน

สำรละลำยคงสภำพเดวดสนเพอใหสำรละลำยเขำไปทตบ-ตบออนไดดยงขน

- กงทมน ำหนกมำกกวำ 3 g ขนไปใหฉดสำรละลำยคงสภำพเดวดสนใหทวตวอยำง โดยเรมจำกตบ-ตบออนทง

พซำยและพขวำ กลำมเนอล ำตวปลองท 2-3 ดำนซำยและขวำ และล ำตวดำนทองปลองท 6 จนทงตว

อยำงเปลยนเปนสสม และน ำไปแชในสำรละลำยคงสภำพเดวดสน

-ในกรณทกงมขนำดใหญ เชน พอแมพนธกง หลงจำกฉดสำรละลำยคงสภำพเดวดสนแลวใหตดเปลอกกง

บรเวณดำนขำงล ำตว ตงแตกลำมเนอล ำตวปลองท 6 ผำนเปลอกคลมหวและอก (carapace) จนถงฐำนกร

เพอใหสำรละลำยคงสภำพเดวดสนซมเขำไปในเนอเยอสวนตำงๆ ไดดขน หลงจำกนนใหตดตำมขวำง

บรเวณหลงเปลอกคลมหวและอกกอนน ำไปแชในสำรละลำยคงสภำพเดวดสน

(3) ท ำเครองหมำยตวอยำงใหชดเจนแลวใสลงไปในภำชนะทเกบตวอยำง

(4) หลงจำกแชตวอยำงในสำรละลำยคงสภำพเดวดสนนำน 24 h ถง 48 h ระยะเวลำในกำรแชขนอยกบ

ขนำดของกง แลวน ำไปผำนกระบวนกำรเตรยมเนอเยอตอไป ในกรณทตองกำรเกบตวอยำงใหนำนขนให

เปลยนสำรละลำยคงสภำพเดวดสนเปนเอทำนอลควำมเขมขน 70%

(5) ในกรณทสำมำรถเกบรกษำตวอยำง ณ จดเกบตวอยำง ใหด ำเนนกำรรกษำสภำพตวอยำงดวย

สำรละลำยคงสภำพเดวดสน ตำมวธกำรในขอ (1)-(4)

มกษ. 10455 (G)-2559

4

รำยกำรท 1 กำรเกบตวอยำงเพอกำรชนสตร

ขอก ำหนดท 1.2 ตวอยำงเพอตรวจดวยวธชววทยำระดบโมเลกล

ขอก ำหนดท 1.2.1 ตองเปนตวอยำงกงมชวต หรอเปนอวยวะเปำหมำย ไดแก ขำวำยน ำ เหงอก

ตอมแอนเทนนอล (antennal gland) ตอมน ำเหลอง (lymphoid organ) กำนตำโดยไมมลกตำ (1) เกบตวอยำงไวในเอทำนอลควำมเขมขน 90% ถง 95% อณหภมไมเกน 4

๐C สงหองปฏบตกำร และ

ตรวจวเครำะหภำยใน 1 สปดำหหลงกำรเกบตวอยำง หรอ (2) แชตวอยำงในน ำแขง สงหองปฏบตกำรภำยใน 24 h และตรวจวเครำะหทนท หรอเกบตวอยำงไว

ในตแชแขงและวเครำะหภำยใน 1 สปดำหหลงกำรเกบตวอยำง

ขอก ำหนดท 1.2.2 ตวอยำงเลอดกง เจำะจำกแองเลอดใตทอง บรเวณขำวำยน ำคแรก หรอจำกแองเลอด

บรเวณขำเดนคท 3 ถงขำเดนคสดทำย โดยใชเขมและกระบอกฉดยำปลอดเชอ ทมสำรละลำยปองกนกำร

แขงตวของเลอดเกบรกษำตวอยำงไวทอณหภมไมเกน 4๐C และด ำเนนกำรตรวจตวอยำงภำยในระยะเวลำ

24 h


กำรชนสตรดวยวธชววทยำระดบโมเลกลจะตรวจหำสำรพนธกรรมของเชอในตวอยำง หำกดเอนเอ

(deoxyribonucleic acid; DNA) ของเชอเสอมสภำพหรอถกท ำลำยจะมผลตอประสทธภำพของกำรตรวจ

ดวยวธชววทยำระดบโมเลกล ตวอยำงทน ำมำชนสตรดวยวธชววทยำระดบโมเลกลสำมำรถใชตวอยำงกงม

ชวต (กำรเกบตวอยำงกงมชวตเพอสงตรวจทำงหองปฏบตกำรใหปฏบตตำมค ำอธบำยในขอก ำหนดท

1.1) หรออวยวะเปำหมำย ไดแก ขำวำยน ำ เหงอก ตอมแอนเทนนอล (antennal gland) ตอมน ำเหลอง

(lymphoid organ) กำนตำโดยไมมลกตำ เนองจำกกำรตดเชอ IHHNV ในกง ไวรสจะเพมจ ำนวนใน

นวเคลยสของเนอเยอผวใตเปลอกชนเอกโทเดรม และเมโซเดรม ดงนน เนอเยอหรออวยวะทเจรญมำจำก

ชนเอกโทเดรมและเมโซเดรมเปนตวอยำงทเหมำะสมส ำหรบกำรชนสตรโรค IHHN

การเกบตวอยางไวในเอทานอลความเขมขน 90% ถง 95%

หำกไมสำมำรถน ำตวอยำงกงมชวตสงตรวจได ใหรกษำสภำพตวอยำงกงมชวต หรออวยวะเปำหมำยไวใน

เอทำนอลโดยน ำตวอยำงแชในเอทำนอลปรมำตรประมำณ 10 เทำของปรมำตรตวอยำง มขนตอนดงน

(1) กงทมขนำดเลกกวำ 3 g ใหรกษำสภำพกงทงตวได

(2) กงทมขนำดตงแต 3 g ขนไปใหเกบตวอยำงขำวำยน ำสงตรวจหรอใหรกษำสภำพกงทงตวได

(3) สำมำรถเกบตวอยำงยอยรวมเปน 1 ตวอยำง (pooled samples) ได โดย 1 ตวอยำงรวมมำจำก

ตวอยำงยอยไมเกน 5 ตวอยำง กรณทเปนตวอยำงไข กงวยออนและกงหลงวยออนซงมขนำดเลกสำมำรถ

รวมกนไดมำกกวำ 5 ตวอยำงยอยเปน 1 ตวอยำงรวม เชน ตวอยำงไขประมำณ 150 ฟองหรอมำกกวำ

มกษ. 10455 (G)-2559

5

ตวอยำงกงวยออนประมำณ 50 ตว ถง 150 ตว ทงนใหพจำรณำขนำดและอำยของตวอยำงตำมควำม

เหมำะสม



(5) หำกไมสำมำรถสงตวอยำงไดทนท ควรเกบตวอยำงทอณหภมไมเกน 4๐C ทงนใหสงตวอยำงไป

หองปฏบตกำรและตรวจหำ DNA ของเชอไวรสภำยใน 1 สปดำหหลงกำรเกบตวอยำง

การแชตวอยางในน าแขง

หำกไมสำมำรถน ำตวอยำงกงมชวตสงตรวจได ใหรกษำสภำพตวอยำงกงมชวต หรออวยวะเปำหมำยแช

ในน ำแขง มขนตอนดงน

(1) น ำตวอยำงกงใสถงพลำสตกทใหม และสะอำด ระบหมำยเลขตวอยำงใหชดเจนไมลบเลอน ปดปำกถง

ใหสนท โดยแยกตวอยำงกงแตละบอไมใหปะปนกน จ ำนวนกงในแตละถงขนกบขนำดของกง และภำชนะ

ทใชขนสง

(2) น ำถงบรรจตวอยำง แชน ำแขงหรอน ำแขงแหงในภำชนะทใชขนสง



(4) รบน ำสงหองปฏบตกำรภำยใน 24 h เพอตรวจหำสำรพนธกรรมของเชอไวรสทนท หำกตรวจไมไดทนท

ใหเกบตวอยำงไวในตแชแขงและตรวจภำยใน 1 สปดำหหลงจำกกำรเกบตวอยำงนน

(5) กรณทไมสำมำรถสงตวอยำงภำยใน 24 h ได ใหแชแขง (frozen) ตวอยำง แลวรบน ำสงหองปฏบตกำร

การเกบตวอยางเลอดกง

เกบตวอยำงเลอดกงประมำณ 100 µl โดยใชเขมและกระบอกฉดยำปลอดเชอทมสำรละลำยปองกนกำร

แขงตวของเลอด (ภำคผนวก ค ขอ ค.2) ในอตรำสวนทเทำกนกบเลอด (1 : 1)

รำยกำรท 2 กำรชนสตรดวยวธทดสอบโรคเบองตน (1) วธกำรตรวจรอยโรคภำยนอก (gross lesion)

ขอก ำหนดท 2.1 ตรวจสภำพภำยนอกของตวอยำงกง เพอดรอยโรคอยำงใดอยำงหนงหรอหลำยอยำง

รวมกน ดงตอไปน แคระแกรน (Runt Deformity Syndrome; RDS) มควำมผดปกตของเปลอกท ำใหตว

คดงอหรอสน กรโคงงอหรอบด (bent rostrum) หนวดกงหงกงอ (brittle, wrinkled antenna) หวกงโปง

พอง (bubble head) หรอมกำรผดรปทปลองทองท 6

มกษ. 10455 (G)-2559

6


องคกำรโรคระบำดสตวระหวำงประเทศ (World Organisation for Animal Health; OIE) ไดรวบรวมขอมลของ

วธตำงๆ ทใชในกำรชนสตรโรค IHHN ในกง และจดล ำดบวธกำรชนสตรโรค ดงกลำว (ภำคผนวก ข ตำรำงท ข.

1) เพอควำมเหมำะสมในกำรน ำไปใชวนจฉยโรค IHHN อยำงมประสทธภำพในสภำวกำรณทมขอจ ำกดในกำร

เกบตวอยำง หรอเครองมอส ำหรบตรวจวนจฉยทแตกตำงกนไป

วธกำรตรวจรอยโรคภำยนอกถอเปนวธทดสอบโรคเบองตนส ำหรบกำรชนสตรโรค IHHN ในกงเพอใหไดขอมล

เพมเตมประกอบกำรชนสตรโรค แตไมเหมำะสมส ำหรบยนยนกำรตดเชอ IHHNV นอกจำกนพฤตกรรมท

เปลยนแปลงในกงทตดเชอ เชน กำรกนอำหำรลดลง เคลอนทชำลง เจรญเตบโตชำ ออนแอ จะไมจ ำเพำะตอกำร

ตดเชอ IHHNV สำมำรถพบกำรตดเชอ IHHNV ไดในกงทกวย ดงนน ในกงทยงไมโตเตมวย หรอกงทไมแสดง

อำกำรภำยนอก เชน กงกลำด ำจะตรวจอำกำรทำงคลนกหรอรอยโรคภำยนอกไดยำก ทงน กำรตรวจอำกำรทำง

คลนกและพฤตกรรมทเปลยนแปลงจงไมเหมำะสมในกำรใชตรวจเพอใหกำรรบรองวำปลอดจำกโรค IHHN

(IHHN disease freedom)

กำรตรวจรอยโรคภำยนอกเปนกำรตรวจสภำพโดยทวไปของตวอยำงกง และเกบขอมลลกษณะทพบ

เปรยบเทยบกบกงทมสภำพปกต ดงนนหำกตวอยำงทน ำมำชนสตรไมสด หรอเสอมสภำพ หรอเกดกำร

ยอยสลำยตวเองจะไมสำมำรถตรวจรอยโรคได กงทตดเชอจะพบรปรำงผดปกต (ภำคผนวก ฉ ภำพท ฉ.1)

รำยกำรท 2 วธทดสอบโรคเบองตน (2) วธจลพยำธวทยำ

ขอก ำหนดท 2.2 น ำตวอยำงเนอเยอทผำนกระบวนกำรรกษำใหคงสภำพและกำรเตรยมเนอเยอมำยอม

ดวยสฮมำทอกซลนและอโอซน (hematoxylin and eosin หรอ H&E)

ขอก ำหนดท 2.3 ตรวจตวอยำงเนอเยอทไดดวยกลองจลทรรศน จะพบรอยโรคทำงจลพยำธวทยำ คอ

อนภำคฝงใน รปรำงกลม ตดสแดงอยภำยในนวเคลยสของเซลลทตดเชอ (Cowdry A type eosinophilic

intranuclear inclusions)


วธจลพยำธวทยำถอเปนวธทดสอบโรคเบองตนส ำหรบกำรชนสตรโรค IHHN ในตวอยำงเนอเยอกง

เนองจำกเปนวธทมขอจ ำกดหลำยประกำร โดยเฉพำะในกงวยออนทมขนำดเลกมำก หรอกงทไมแสดงอำกำร

ภำยนอก อำจตรวจไมพบรอยโรคทำงจลพยำธวทยำทชดเจนและรอยโรคทำงจลพยำธวทยำทตรวจพบไมม

ควำมจ ำเพำะ

การเตรยมเนอเยอมายอมดวยส H&E

1. น ำเนอเยอตวอยำงทผำนกำรรกษำสภำพในสำรละลำยคงสภำพเดวดสนไปฝงในพำรำฟน (embedding)

มกษ. 10455 (G)-2559

7

ตำมขนตอนดงน

1.1 น ำเนอเยอแชในสำรละลำยเรยงตำมล ำดบ ดงน

- แชในเอทำนอลควำมเขมขน 70% ขวดทหนง ไวนำน 1 h

- แชในเอทำนอลควำมเขมขน 70% ขวดทสอง ไวนำน 1 h





- แชในเอทำนอลสมบรณขวดทหนง ไวนำน 1 h

- แชในเอทำนอลสมบรณขวดทสอง ไวนำน 1 h

- แชในไซลนขวดทหนง ไวนำน 1.5 h

- แชในไซลนขวดทสอง ไวนำน 1.5 h

1.2 น ำเนอเยอแชในพำรำฟนเหลวทอนขวดทหนงเปนเวลำ 2 h แลวแชตอในพำรำฟนเหลวทอนขวดทสองอก 2 h

1.3 น ำเนอเยอวำงลงในแมพมพ (embedding mold) ทมพำรำฟนเหลว วำงแทนยด (cassette) บนแมพมพ

แลวเทพำรำฟนเหลวใหทวมแทนยด น ำแมพมพทมตวอยำงวำงบนถำดทเยน (cool tray) ทงไวจนพำรำฟน

แขงตวจงน ำตวอยำงออกจำกแมพมพ แลวเกบไวทอณหภมหอง

1.4 ตดเนอเยอทฝงในแทงพำรำฟนดวยเครองตดชนเนอ (microtome) ใหมควำมหนำ 4 µm ถง 6 µm แลว

จดวำงบนสไลด

2. กำรยอมส H&E มขนตอนดงน

2.1 ละลำยพำรำฟนออกจำกแผนเนอเยอบนสไลดทอณหภม 60 ๐C นำน 30 min แลวน ำไปแชในไซลน

2.2 แชสไลดเนอเยอในเอทำนอลสมบรณ นำน 5 min และเอทำนอลควำมเขมขน 95% นำน 5 min ตำมล ำดบ

2.3 ลำงสไลดเนอเยอดวยน ำไหลผำน นำน 5 min

2.4 จมสไลดเนอเยอลงในสฮมำทอกซลน นำน 5 min ถง 7 min

2.5 ลำงสไลดเนอเยอดวยน ำไหลผำน นำน 15 s ถง 30 s ตรวจสอบขนตอน

2.6 จมสไลดเนอเยอลงในสอโอซน นำน 30 s ถง 60 s

2.7 ขจดน ำออกจำกสไลดเนอเยอดวยเอทำนอลควำมเขมขน 95% และเอทำนอลสมบรณตำมล ำดบ

2.8 แชในไซลนนำน 5 min

มกษ. 10455 (G)-2559

8

2.9 หยดเพอรเมำต (Permount) 1 หยด ปดสไลดดวยกระจกปดสไลด

การตรวจรอยโรคทางจลพยาธวทยา

น ำสไลดเนอเยอตรวจดดวยกลองจลทรรศนทก ำลงขยำย 400 เทำ กงทตดเชอ IHHNV จะพบลกษณะ

รอยโรคทำงจลพยำธวทยำจ ำเพำะ คอ อนภำคฝงใน รปรำงกลม ตดสแดงอยภำยในนวเคลยสของเซลลท

ตดเชอ (ภำคผนวกท ฉ ภำพท ฉ.2) อยำงไรกตำมลกษณะรอยโรคทำงจลพยำธวทยำทพบอนภำคฝงใน รปรำงกลม ตดสแดงอยภำยใน

นวเคลยสของเซลลทตดเชอ IHHNV ไมสำมำรถแยกจำกกำรตดเชอ White Spot Syndrome Virus

(WSSV) ได เนองจำกมรอยโรคทำงจลพยำธวทยำทไมแตกตำงกน

รำยกำรท 3 กำรชนสตรดวยวธทดสอบยนยนโรคโดยวธชววทยำระดบโมเลกล:

: วธปฏกรยำลกโซพอลเมอเรส (Polymerase Chain Reaction; PCR)

ขอก ำหนดท 3.1 วธชววทยำระดบโมเลกลทใชในมำตรฐำนฉบบน คอ วธ PCR เปนวธทดสอบยนยน

ส ำหรบกำรชนสตรโรค IHHN ในกง (1) กำรสกด DNA

(2) กำรเพมจ ำนวน DNA เปำหมำยแบบทวคณโดยใชไพรเมอรจ ำเพำะจนมจ ำนวนมำกพอทจะตรวจพบได (3) กำรแยกแถบ DNA ดวยวธอเลกโทรโฟรซส (electrophoresis)

(4) กำรตรวจหำล ำดบสำรพนธกรรมเพอยนยนควำมจ ำเพำะของแถบ DNA

ขอก ำหนดท 3.2 ในกำรตรวจวนจฉยโรคทกครงตองมตวอยำงควบคมผลบวกและตวอยำงควบคมผลลบ


วธชววทยำระดบโมเลกลทใชในมำตรฐำนฉบบน คอ วธ PCR เปนวธทดสอบยนยนส ำหรบกำรชนสตร

โรค IHHN ในกง ทงน ในกำรทดสอบยนยนผลบวกและผลลบของเชอ IHHNV โดย OIE แนะน ำให

ยนยนผลกำรทดสอบจำกวธชนสตรทำงชววทยำระดบโมเลกลอยำงนอย 2 วธรวมกน โดย 2 วธดงกลำว

ตองตรวจสอบ DNA ทต ำแหนงตำงกน

กำรตดเชอ IHHNV พบไดในกงทกวย และวธ PCR สำมำรถใชชนสตรโรค IHHN ไดในกงทกวย

เนองจำกเปนวธทมควำมเหมำะสม มควำมจ ำเพำะและควำมไวของวธกำรชนสตร โดยสำมำรถตรวจหำ

DNA ของเชอไวรสในเนอเยอและอวยวะเปำหมำย

แนวปฏบตทอธบำยสำระส ำคญของกำรชนสตรดวยวธ PCR น น ำมำจำก Manual of Diagnostic Tests for

Aquatic Animals ของ OIE (2015) ซงเปนเพยงตวอยำงเพอใชเปนเอกสำรส ำหรบน ำไปใชท ำควำม

เขำใจ อำจใชวธ PCR อน ไพรเมอร เวลำ อณหภม สำรเคม และเครองมอทแตกตำงจำกทระบได หำกได

มกษ. 10455 (G)-2559

9

ทดสอบแลววำมควำมไวและควำมจ ำเพำะของวธกำรชนสตรเทยบเทำหรอดกวำ และไดรบกำรเผยแพรใน

วำรสำรทำงวชำกำร

1. กำรสกด DNA

OIE เสนอใหใชชดสกดDNA ส ำเรจรปเพอกำรสกดDNA เปำหมำยจำกตวอยำง โดยชดสกด DNA ม

จ ำหนำยจำกหลำยบรษทแตกตำงกน เชน บรษท Roche Diagnostics บรษท Qiagen หรอสำรเคมทใชสกด

จำกบรษท Gibco Life Sciences ส ำหรบแนวปฏบตของกำรสกด DNA ในแนวปฏบตน ยกตวอยำงวธกำร

สกดโดยชดสกด DNA ของบรษท Gibco Life Sciences (DNAzol® Reagent) ในกำรสกด DNA

เปำหมำยจำกตวอยำง โดยระบขนตอนดงน

1.1 กำรบดตวอยำงกงหรอเนอเยอกง

- น ำตวอยำงกงหรอเนอเยอทรกษำสภำพในเอทำนอลควำมเขมขน 90% หรอ 95% มำชงน ำหนกประมำณ

25 mg ถง 50 mg ใน microtubes

- กรณทตองกำรสกด DNA จำกตวอยำงเลอดกงจะใชเลอดกงประมำณ 100 µl ทเกบตำมวธกำรขอ 1.2.2

ใหน ำตวอยำงไปปนตกตะกอนทแรงเหวยง 8,500 g นำน 10 min ถง 15 min เพอแยกสวนใสดำนบนทม

สำรละลำยปองกนกำรแขงตวของเลอดออกจำกตวอยำง

- ใส DNAzol® Reagent ปรมำณ 1 ml แลวท ำตวอยำงใหเปนเนอเดยวกน

- ใช micropipette ดดและปลอย (pipette up and down) เนอเยอทบดใหเปนเนอเดยวกนแลวสำมถงสครง

เพอไมใหเนอเยอทบดจบตวกนเปนกอน

1.2 กำรปนเหวยง

- น ำเนอเยอทบดเปนเนอเดยวกนแลวมำปนเหวยง ทแรงเหวยง 10,000 g นำน 10 min ทอณหภมหอง

หรออณหภม 4 ๐C

- ใช micropipette ดดเฉพำะสวนใส ใสใน microtubes หลอดใหม (ขนตอนนจะแยกเศษเนอเยอ

อำรเอนเอและ polysaccharide ออกจำกสำรละลำยทม DNA )

1.3 กำรตกตะกอน DNA

- เตมเอทำนอลสมบรณ ปรมำณ 0.5 ml จำกนนผสมกบสำรละลำยทม DNA โดยใชวธพลก microtubes

ขนลง หำมใชเครองเขยำ (vortex)

- ทงไวทอณหภมหองเปนเวลำ 1 min ถง 3 min จะเหนตะกอนDNA สขำวขน

- แยกตะกอน DNA ใสใน microtubes หลอดใหม หรอดดสวนใสทงใหหมด (อำจปนเหวยงทแรงเหวยง 4,000 gนำน 1 min ถง 2 min ทอณหภมหอง หรออณหภม 4 ๐C จะชวยแยกตะกอน DNA ไดดขน)

1.4 ลำง DNA

- เตมเอทำนอลควำมเขมขน 75% ปรมำณ 0.8 ml ถง 1.0 ml

- ลำงตะกอน DNA โดยใชวธพลก microtubes ขนลง หำมใชเครองเขยำ แลวดดเอทำนอลควำมเขมขน 75% ทง

- ลำงตะกอน DNA ดวยเอทำนอลควำมเขมขน 75% ซ ำอกครงหนงแลวดดเอทำนอลควำมเขมขน 75% ทง

มกษ. 10455 (G)-2559

10

1.5 ละลำย DNA เปดฝำ microtubes ทงไวประมำณ 5 s ถง 15 s เพอใหเอทำนอลระเหยออกใหหมด (หำก

DNA สมผสอำกำศนำนจะท ำใหกำรละลำย DNA ยำกขน)

- เตมโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) ควำมเขมขน 8 mM ปรมำณ 0.2 ml ถง 0.3 ml (เตมอยำงชำๆ)

เพอท ำละลำย DNA

- ไดสำรละลำย DNA เพอน ำไปทดสอบในขนตอไป

- DNA ทละลำยดวย NaOH ควำมเขมขน 8 mM เกบไวทอณหภม 4 ๐C ไดนำนหลำยเดอน หำกเกบ DNA

ทอณหภม -20 ๐C จะเกบไดนำนอยำงนอยหนงป

- ปรบคำ pH ของ DNA ทละลำยดวย NaOH ควำมเขมขน 8 mM โดยเตม 0.1 M หรอ 1 M HEPES

(free acid) ตอ NaOH ควำมเขมขน 8 mM ปรมำณ 1 ml

2. กำรเพมจ ำนวน DNA เปำหมำย

OIE ใหตวอยำงไพรเมอรทใชในกำรตรวจเชอ IHHNV ในกง รำยละเอยดตำมภำคผนวก จ ตำรำงท จ.1 และให

ตวอยำงวธกำรเพมจ ำนวน DNA เปำหมำย โดยระบขนตอนดงน

1.1 ตงสภำวะในขนตอนตำงๆ ของเครอง thermocycler เพอเพมจ ำนวนDNA เปำหมำย ดงน

ขนท ขนตอน อณหภม เวลำ รอบ

1 Hot start 95 ๐C 5 min 1

2 Denaturation 95 ๐C 30 s

Annealing 55 ๐C 30 s 35

Extension 72 ๐C 1 min

3 Final extension 72 ๐C 7 min 1

4 ลดอณหภมของเครอง 4 ๐C

2.2 เตรยมสำรผสม PCR cocktail ในตวอยำง 1 หลอดประกอบดวย

DD H2O 32.5 µl

10X PCR buffer 5 µl

10 mM dTTP 1 µl

10 mM dATP 1 µl

10 mM dCTP 1 µl

10 mM dGTP 1 µl

25 mM MgCl2 4 µl

Forward primer (100 ng/µl) 1.5 µl

Reverse primer (100 ng/µl) 1.5 µl

AmpliTaq Gold 0.5 µl

มกษ. 10455 (G)-2559

11

2.3 จำกนนเตม DNA ตนแบบ (DNA template) ปรมำณ 1 µl ลงในสำรผสม PCR cocktail ทเตรยมไว

ปรมำณ 49 µl แลวผสมใหเขำกน สดทำยจะมปรมำณโดยรวมเทำกบ 50µl โดยใหผสมสำรบนภำชนะทม

อณหภมไมเกน 4 °C

2.4 น ำตวอยำงเขำเครอง thermocycler และใหเครองท ำงำนตำมสภำวะทตงไว

2.5 เมอเครอง thermocycler ท ำงำนเสรจสนแลว น ำ PCR product จำกตวอยำงททดสอบมำแยกแถบ

DNA ดวยวธ agarose gel electrophoresis

3. แยกแถบ DNAดวยวธ agarose gel electrophoresis

3.1 วำงแผน agarose gel ควำมเขมขน 1.5% ในเครอง electrophoresis

3.2 ใสสำรละลำย 1XTBE (Tris, boric acid, EDTA) ลงในเครองใหทวมแผน agarose gel

3.3 ผสมสยอม (6X loading dye) ปรมำณ 1 µl กบ PCR product ปรมำณ 5 µl ใสลงในหลมของ agarose gel

3.4 ใช DNA ladder ขนำด 100 base pairs (bp) เปน marker

3.5 แยก DNA ดวยกระแสไฟฟำท 100 volt เวลำประมำณ 40 min

3.6 กำรอำนผลแถบ DNA ของ PCR product

- น ำแผน agarose gel ไปยอมดวย ethidium bromide ควำมเขมขน 0.5 µg/ml หรอใชสำรยอม DNA ชนด

อนนำนประมำณ 10 min

- ใชน ำกลนลำง ethidium bromide สวนเกนออกจำกแผน agarose gel

- วำงแผน agarose gel บนเครอง UV transilluminator

- อำนผลแถบ DNA ของ PCR product แถบ DNA ทยอมดวยสำรยอม DNA จะเรองแสง

- บนทกภำพ

3.7 กำรแปลผลจะแตกตำงกนขนกบไพรเมอรทใชทดสอบ โดยเทยบกบตวอยำงควบคมผลบวกและตวอยำง

ควบคมผลลบ (ภำคผนวก จ และภำคผนวก ฉ ภำพท ฉ.3) ในกำรตรวจวนจฉยโรคทกครงตองมตวอยำง

ควบคมผลบวกและตวอยำงควบคมผลลบเพอยนยนควำมถกตองของกระบวนกำรตรวจ

4. ตรวจหำล ำดบสำรพนธกรรมจำก PCR product เพอยนยนควำมจ ำเพำะของแถบ DNA

มกษ. 10455 (G)-2559

12

ภาคผนวก ก

โรคไอเอชเอชเอน

(ค ำอธบำยขอก ำหนด 1.1)

โรคไอเอชเอชเอน (infectious hypodermal and hematopoietic necrosis disease; IHHN disease) เกด

จำกเชอ IHHNV หรอมชอพองวำ PstDNV (Penaeus stylirostris densovirus) เปน Parvovirus ทจดอย

ในสกล Brevidensovirus และวงศ Parvoviridae เชอ IHHNV เปนDNA ไวรสสำยเดยว (single-stranded

DNA) รปรำง icosahedral ขนำดเสนผำนศนยกลำง 20 nm และเปนไวรสทมขนำดเลกทสดทพบวำ

กอใหเกดโรคในกงกลมพเนยด (Penaied) ปจจบนมรำยงำนของเชอ IHHNV ทกอใหเกดโรค ไดแก จโน

ไทป 1และจโนไทป 2 สวนจโนไทป 3A และจโนไทป 3B เปนDNA บำงสวนของไวรสทพบแทรกอยใน

DNA (endogenous viral element; EVE) ของกงกลำด ำและไมกอใหเกดโรค

เชอ IHHNV จโนไทป 1 พบไดในสหรฐอเมรกำ เอเชยตะวนออก และพบในประเทศฟลปปนสเปนสวน

ใหญ เชอ IHHNV จโนไทป 2 พบไดในเอเชยตะวนออกเฉยงใต เชอ IHHNV จโนไทป 3A พบไดใน

แอฟรกำตะวนออก อนเดยและออสเตรเลย และเชอ IHHNV จโนไทป 3B พบไดในเขตอนโดแปซฟก

ตะวนตก (the western Indo-Pacific) ไดแก มำดำกสกำร มอรเชยส และแทนซำเนย

กงทไวตอกำรตดเชอ IHHNV คอ กงกลมพเนยด ไดแก กงขำว (Litopenaeus vannamei) กงกลำด ำ

(Penaeus monodon) และกงฟำ (P. stylirostris) โดยกำรตดเชอ IHHNV สำมำรถพบไดในกงทกวย

ตงแตไข กงวยออน กงหลงวยออน กงวยรน และกงตวเตมวย

กำรแพรเชอม 2 แบบ คอ กำรแพรเชอแนวระนำบ (horizontal transmission) สวนใหญเกดจำกกงกน

กนเอง (cannibalism) หรอรบเชอผำนทำงน ำทปนเปอนเชอ (contaminated water) และกำรแพรเชอแบบ

แนวดง (vertical transmission) พบวำเชอ IHHNV สำมำรถผำนจำกพอแมกงไปสลกกงรนตอไปได

โดยทวไปไขจำกแมพนธกงทตดเชอปรมำณสง (high virus load) จะไมสำมำรถพฒนำและฟกได แตใน

กรณทมกำรเจรญและฟกจะพบควำมชกของกำรตดเชอ IHHNV ในลกกงสง กงทตดเชอสำมำรถพบรอย

โรคอยำงใดอยำงหนงหรอหลำยอยำงรวมกน ดงตอไปน แคระแกรน (Runt Deformity Syndrome; RDS)

มควำมผดปกตของเปลอกท ำใหตวคดงอหรอสน กรโคงงอหรอบด (bent rostrum) หนวดกงหงกงอ

(brittle, wrinkled antenna) หวกงโปงพอง (bubble head) หรอมกำรผดรปทปลองทองท 6

มกษ. 10455 (G)-2559

13

ภาคผนวก ข

การจดล าดบวธการชนสตรโรคเพอการเลอกใช

(ค ำอธบำยขอก ำหนดท 2.1)

ตารางท ข.1 การจดล าดบวธการชนสตรโรค IHHN (rating of test)

วธชนสตร

ตรวจเฝาระวง (surveillance) วธทดสอบโรค

เบองตน

(presumptive

diagnosis)

วธทดสอบ

ยนยนโรค

(confirmatory

diagnosis)

กงวยออน

(larvae)

กง

หลงวยออน

(PL)

กงวยรน

(juveniles)

กงโตเตมวย

(adults)

Gross sign d d d d d d

Histopathology d d c c a b

PCR a a a a a a

Sequence d d d d d a

ทมำ: ดดแปลงจำก Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals ของ OIE, 2015 หมำยเหต

a = วธทแนะน ำใหใชในกำรชนสตร เนองจำกมกำรใชอยำงแพรหลำย มประโยชน มควำมจ ำเพำะและ

ควำมไวของวธกำรชนสตร

b = วธมำตรฐำนในกำรชนสตรทมควำมจ ำเพำะและควำมไวของวธกำรชนสตร c = วธทใชไดในบำงกรณเนองจำกมขอจ ำกดบำงประกำร

d = วธทไมแนะน ำเปนวธทไมเหมำะสม

กำรชนสตรโรค IHHN ในกงดวยวธทำงหองปฏบตกำร ไดแก กำรตรวจรอยโรคภำยนอก วธจลพยำธวทยำและ

วธชววทยำระดบโมเลกล เมอไดผลตรวจทำงหองปฏบตก ำรแลวเจำหนำทผ รบผดชอบตำม

พระรำชบญญตโรคระบำดสตว พ.ศ. 2558 ควรพจำรณำวทยำกำรระบำดพยำธก ำเนดและอำกำรของโรค

IHHN รวมดวยเพอใหกำรปองกนและควบคมโรคเปนไปอยำงมประสทธภำพ วตถประสงคของกำร

ชนสตรโรค IHHN คอ เพอยนยนกำรระบำดของโรค ตรวจพสจนกำรตดเชอไวรสในพอแมพนธกงและลก

พนธกงกอนกำรปลอยลงเลยง และกำรเฝำระวงโรค

มกษ. 10455 (G)-2559

14

ภาคผนวก ค

การเตรยมสารเคม

(ค ำอธบำยขอก ำหนดท 1.1 1.2.2 และ 3.1)

ค.1 สำรละลำยคงสภำพเดวดสนปรมำณ 1,000 ml

เอทำนอลควำมเขมขน95% 330 ml

ฟอรมำลน (ฟอรมำลดไฮด 37% ถง 39%) 220 ml

กรดแอซตกเขมขน (glacial acetic acid) 115 ml

น ำกลน 335 ml

ค.2 สำรละลำยปองกนกำรแขงตวของเลอดปรมำณ 1,000 ml โซเดยมคลอไรด (sodium chloride) 26.3 g

ไทรโซเดยมซเทรต (trisodium citrate) 8.8 g

กรดซทรก (citric acid) 5.5 g

EDTA 3.7 g

วธกำรเตรยม

1. ชงสวนประกอบตำงๆ ใหครบ เตมน ำกลนปรมำณ 700 ml แลวปรบ pH ใหได 7.0 ดวย NaOH

2. น ำไปท ำใหปรำศจำกเชอดวยหมอนงอดไอน ำ (autoclave) ทแรงดน 15 ปอนดตอตำรำงนว อณหภม 121°Cนำน 15 min

3. ทงไวใหเยนเตมกลโคสควำมเขมขน 1 mol ปรมำณ 100 ml โดยชงกลโคส 39.6 g ละลำยในน ำกลน 200 ml

4. เตมน ำกลนใหครบ 1,000 ml

ค.3 5XTBE (Stock solution)

tris base 54 g

กรดบอรก (boric acid) 27.5 g

0.5 M EDTA (pH 8) 20 ml

มกษ. 10455 (G)-2559

15

ภาคผนวก ง

การท าการณยฆาตในกง


กำรท ำกำรณยฆำตในกงทระบในแนวปฏบตฉบบน มจดประสงคเพอลดควำมเจบปวดและทรมำนของกง

ตำมหลกสวสดภำพสตว กอนน ำไปเตรยมตวอยำงเพอกำรชนสตรโรค ซงปจจบนมวธกำรท ำกำรณยฆำต

ในสตวน ำทไมมกระดกสนหลง (aquatic invertebrate) อยหลำยวธ เชน กำรใหยำสลบเกนขนำด กำรใช

สำรเคมหรอกำรท ำลำยสมองและปมประสำททส ำคญ ทงน OIE ยงไมมขอก ำหนดเฉพำะส ำหรบ

กำรท ำกำรณยฆำตในกง จงอำจใชวธอนทแตกตำงจำกทระบไดหำกไดรบกำรทดสอบแลววำเปนวธทม

ประสทธภำพในกำรลดควำมเจบปวดและทรมำนใหกบกงและไดรบกำรเผยแพรในวำรสำรทำงวชำกำร

กำรท ำกำรณยฆำตตองกระท ำอยำงรวดเรวเพอลดควำมเจบปวดทรมำนของกง ไมควรปลอยใหกงตำยจำก

กำรขำดออกซเจน หรอใชสำรเคมทมฤทธในกำรกดกรอนท ำลำยเนอเยอกงใหกงไดรบบำดเจบและเกด

ควำมเจบปวดทรมำน โดยวธกำรใดวธกำรหนงดงน

1. น ำกงครงละ 1 ตว ใสในถงพลำสตกทบรรจน ำทมควำมเคมเทำกบน ำในบอเลยงกงพอทวมตวแลว

น ำไปฝงในน ำแขงบดทมน ำผสม (ice slurry) ทอณหภมประมำณ 0 °C โดยมสดสวนระหวำงน ำแขง:น ำ

เทำกบ 3:1 จนกงหมดควำมรสก จำกนนใหแชหรอฉดกงดวยสำรเคมทนท เชน สำรละลำยคงสภำพเดวดสน

หรอเอทำนอลควำมเขมขนมำกกวำ 70%

2. น ำกงแชในสำรออกฤทธทท ำใหหมดควำมรสก เชน น ำมนกำนพล (clove oil) หรอยจนอล (eugenol)

โดยควำมเขมขนของน ำมนกำนพลหรอยจนอลทแนะน ำใหใช คอ 0.125 ml/L แตไมแนะน ำใหใช

สำรไอโซยจนอล (isoeugenol) เนองจำกเปนสำรทอำจกอมะเรงได

มกษ. 10455 (G)-2559

16

ภาคผนวก จ

ไพรเมอรทใชในการตรวจเชอ IHHNV


ตารางท จ.1แสดงล าดบนวคลโอไทดของไพรเมอรทใชในการตรวจเชอ IHHNV

ไพรเมอร ล าดบของนวคลโอไทด ขนาดแถบ DNA Annealing

temperature

Accession

number base pairs (bp)

389F 5´-CGG-AAC-ACA-ACC-CGA-CTT-TA-3´ 389 72°C AF218266

389R 5´-GGC-CAA-GAC-CAA-AAT-ACG-AA-3´ 71°C

77012F 5´-ATC-GGT-GCA-CTA-CTC-GGA-3´ 356 68°C AF218266

77353R 5´-TCG-TAC-TGG-CTG-TTC-ATC-3´ 63°C

392F 5´-GGG-CGA-ACC-AGA-ATC-ACT-TA-3´ 392 68°C AF218266

392R 5´-ATC-CGG-AGG-AAT-CTG-ATG-TG-3´ 71°C

309F 5´-TCC-AAC-ACT-TAG-TCA-AAA-CCA-A-3´ 309 68°C AF218266

309R 5´-TGT-CTG-CTA-CGA-TGA-TTA-TCC-A-3´ 69°C

MG831F 5´-TTG-GGG-ATG-CAG-CAA-TAT-CT-3´ 831 58°C DQ228358

MG831R 5´-GTC-CAT-CCA-CTG-ATC-GGA-CT-3´ 62°C

ทมำ: Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals ของ OIE, 2015

การแปลผล

1. เมอทดสอบดวยไพรเมอร 389F/389R

หำกพบแถบ DNA ขนำด 389 bp ใหอำนผลเปนบวก เมอเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลบวก

หำกไมพบแถบ DNA ขนำด 389 bp ใหอำนผลเปนลบ เมอเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลลบ










5. เมอทดสอบดวยไพรเมอร MG831F/MG831R หำกพบแถบ DNA ขนำด 831 bp ใหอำนผลเปนบวก เมอเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลบวก


มกษ. 10455 (G)-2559

17

ภาคผนวก ฉ

ภาพประกอบการชนสตรโรค IHHN

(ค ำอธบำยขอก ำหนดท 2.1 2.3 และ 3.1)

ฉ.1.1

ฉ.1.2

ฉ.1.3

ภาพท ฉ.1 กงปกต (ฉ.1.1) และ กงทพบลกษณะ Runt Deformity Syndrome (ฉ.1.2-ฉ.1.3)

ทมำ: ผชวยศำสตรำจำรยวศณ บญญำววฒน คณะสตวแพทยศำสตร มหำวทยำลยเกษตรศำสตร (ฉ.1.1)

หนวยวจยเพอควำมเปนเลศเทคโนโลยชวภำพกง มหำวทยำลยมหดล (ฉ.1.2-ฉ.1.3)

มกษ. 10455 (G)-2559

18

ฉ.2.1 ตอม antennal ทตดเชอ IHHNV

ฉ.2.2 ตอม antennal ทตดเชอ IHHNV

ฉ.2.3 เสนประสำททตดเชอ IHHNV

ภาพท ฉ.2 แสดงลกษณะทำงจลพยำธวทยำในเนอเยอกงทตดเชอ IHHNV พบอนภำคฝงใน

รปรำงกลม ตดสแดงอยภำยในนวเคลยสของเซลลทตดเชอ (Cowdry A type eosinophilic

intranuclear inclusions)

ทมำ: หนวยวจยเพอควำมเปนเลศเทคโนโลยชวภำพกง มหำวทยำลยมหดล

มกษ. 10455 (G)-2559

19

ฉ.3.1 ใชไพรเมอร 389F และ 389R ฉ.3.2 ใชไพรเมอร 77012F และ 77353R

ฉ.3.3 ใชไพรเมอร 392F และ 392R ฉ.3.4 ใชไพรเมอร 309F และ 309R

M = 100 bp molecular marker

S1-S3 = Unknown sample 1-3

P = positive control (IHHNV infected sample)

N = negative control (IHHNV negative sample)

ภาพท ฉ.3 แสดงตวอยำงผลกำรชนสตรเชอ IHHNV ดวยวธ PCR โดยใชไพรเมอรแตกตำงกนจะ

พบแถบ DNA ขนำดแตกตำงกน

ทมำ: รองศำสตรำจำรยเจนนช วองธวชชย คณะสตวแพทยศำสตร จฬำลงกรณมหำวทยำลย

300

200

M S1 S2 S3 P N

100

400

1,000

500 389 bp

M S1 S2 S3 P N

200

100

400

1,000

356 bp

500

300

M S1 S2 S3 P N

200

100

400

1,000

392 bp 500

300

M S1 S2 S3 P N

309 bp

1,000

500

300

200

100

400

มกษ. 10455 (G)-2559

20

ภาคผนวก ช

ตวอยางแบบบนทกขอมลเพอประกอบการวนจฉยโรค

(ค ำอธบำยขอก ำหนดท 1.1 และ 1.2)

ว/ด/ป ทรบตวอยาง....................................... รหสตวอยาง.......................................

1. ขอมลฟารม

1.1 ชอ-สกล ผสงตวอยำง…………………………………………………………โทรศพท………………………………………………

1.2 ชอ-สกลเจำของฟำรม…………………………………………………………โทรศพท………………………………………………

เลขทบตรประชำชน……………………………………………………………………………………………………………………………

ทอยปจจบน………………………………………………………………………………………………………………………….……………

1.3 ชอฟำรม………………………………………………หมำยเลขทะเบยนฟำรม………………………………………………………

ทตงฟำรม เลขท…………หมท………ต ำบล……………………อ ำเภอ…………………จงหวด………………………………

1.4 ประเภทประกอบกำร

โรงเพำะฟก โรงอนบำล ฟำรมเลยง

ทรวบรวม/โรงคดบรรจ กระชง อน.............................

1.5 มำตรฐำนฟำรม

GAP เลขท......................................................................... .......................

CoC เลขท.................................................................................................

อนๆ.................................................................................... .....................

2. ขอมลสตวน า

2.1 ประเภทสตวน ำทสงตรวจ

สตวน ำตรวจสขภำพทวไป สตวน ำปวย สตวน ำน ำเขำ-สงออก

อนๆ......................................................................................... ...................

2.2 ชนดสตวน ำ

ชอสำมญ....................................... ชอวทยำศำสตร.....................................

2.3 จ ำนวนสตวน ำทสงตรวจ

.................................................................................... ..............................ตวตอถง

2.4 อำยสตวน ำ

................................................................................................ ..............................

2.5 อำกำรทวไปทสำมำรถสงเกตเหน……………………………………………………………………………………………..………

มกษ. 10455 (G)-2559

21

2.6 ปรมำณของสตวน ำทปวย

(%).........................................................................................................................

2.7 แหลงทมำของลกพนธสตวน ำ

น ำเขำจำกตำงประเทศ ระบแหลง…………………………………………………………….…………………………

จำกกำรเพำะเลยงเองภำยในประเทศ ระบแหลง……………………………………………………....……...

รวบรวมจำกธรรมชำต ระบแหลงทมำ....................................................................

ลกพนธผำนกำรตรวจเชอ ระบ.............................................................................

2.8 ชนดและขนำดของบอเลยง/รวบรวม

บอซเมนต ขนำด............. บอดน ขนำด.............. ตกระจก ขนำด................

ถงไฟเบอร ขนำด............ กระชง ขนำด.............. อนๆ..............................

2.9 อตรำควำมหนำแนน (ตวตอตำรำงเมตร).........................................................................

3. ขอมลคณภาพน าเลยง

3.1 แหลงน ำทใชเลยงสตวน ำ

น ำทะเล ระบแหลง............................................................................................

น ำประปำ น ำบำดำล แหลงน ำธรรมชำต น ำฝน อนๆ ..................

3.2 คณสมบตน ำ

สน ำ (color).................................................................................... ................

ควำมเคมน ำ.................................... อณหภมน ำ..........................................

ควำมเปนกรด-ดำง (pH).................. คำบโอด..............................................

ปรมำณออกซเจนละลำยน ำ (Dissolved Oxygen หรอ DO).....................................

ควำมเปนดำงทงหมด (total alkalinity)............ ควำมกระดำง (hardness)............

แอมโมเนยทงหมด (NH3)............................. ไนไตรต (NO2) ........................

4. ขอมลดานอาหาร

4.1 ชนดอำหำร

อำหำรส ำเรจรป ระบยหอ..............................................................................

อำหำรมชวต ระบชนด.........................................แหลงทมำ............................

อำหำรสมทบ ระบชนด........................................แหลงทมำ............................

อนๆ ระบ...................................................................................................

4.2 อตรำกำรใหอำหำร (%) และควำมถ (ครงตอวน).........................................................

มกษ. 10455 (G)-2559

22

5. ผลการวนจฉย

5.1 สขภำพทวไป

ผำน

ไมผำน สงทตรวจพบ....................................................................................

5.2 ปรสต

ระบ ชนด............................................. วธตรวจ..........................................

5.3 แบคทเรย

ระบ ชนด............................................. วธตรวจ...........................................

ชนดยำทแนะน ำ...........................................................................................

5.4 ไวรส

ระบ ชนด............................................. วธตรวจ..........................................

5.5 อนๆ ระบ.............................................................................................................

6. ค าแนะน า

............................................................................................................................. .....

................................................................................................................................ ..

............................................................................................................................. .....

ชอผวนจฉยและใหค ำแนะน ำ.............................................

(...................................................)

วนท...............เดอน......................พ.ศ.............

ทมำ: สถำบนวจยสขภำพสตวน ำชำยฝง กองวจยและพฒนำประมงชำยฝง กรมประมง

TAS 10455 (G)-2016€¦ · รำยกำรที่ 1...

Documents

Transcript of TAS 10455 (G)-2016€¦ · รำยกำรที่ 1...