Bacharelado em Ciências BiológicasDisciplina: Monografia I

SOLICITAÇÃO DE QUALIFICAÇÃO DE ANTEPROJETO DE MONOGRAFIA

Em anexo, encaminho o Anteprojeto da Monografia de Conclusão do Curso de Ciências Biológicas – Bacharelado, declarando para os devidos fins que este trabalho é de minha inteira autoria. Solicito a composição de Banca Examinadora para a qualificação da mesma.

Nome do aluno: Jéssica Bohusch Oliseski

Matrícula: 12105333-4 Telefone(s): (51) 99685482

Endereço eletrônico: jessica.oliseski@acad.pucrs.br

Título do Anteprojeto:

COEVOLUÇÃO ENTRE FULGORA (HEMIPTERA: FULGOROMORPHA: FULGORIDAE) E SEUS SIMBIONTES.

Data: __/__/____ Assinatura do aluno: __________________________

PROTOCOLO (Para uso da secretaria)

Recebido em: __/__/____ Por: ________________________ Assinatura: ____________________________

Parecer do Professor Responsável:

Data: __/__/____

Assinatura do Professor responsável:

___________________________________________________________________

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SULFACULDADE DE BIOCIÊNCIAS

JÉSSICA BOHUSCH OLISESKI

COEVOLUÇÃO ENTRE ESPÉCIES DE FULGORA (HEMIPTERA: FULGOROMORPHA: FULGORIDAE) E SEUS SIMBIONTES.

Porto Alegre2015

JÉSSICA BOHUSCH OLISESKI

COEVOLUÇÃO ENTRE ESPÉCIES DE FULGORA (HEMIPTERA: FULGOROMORPHA: FULGORIDAE) E SEUS SIMBIONTES.

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas pela Faculdade de Biociências da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.

Porto Alegre2015

AGRADECIMENTOS

À minha mãe, Veronika Bohusch Oliseski, que com muita determinação e força

proporcionou tudo à nossa família.

Ao meu pai, Doutor Silvio Luiz Rocha Oliseski, por compreender e mostrar-se feliz

pelas minhas escolhas, sempre, e por ter influenciado meu caminho até aqui.

Ao Prof. Dr. Gervasio da Silva Carvalho, por ser meu orientador, pai, avô, amigo e

carrasco durante esses curtos 4 anos. Seus ensinamentos e azedumes serão levados sempre no

meu coração.

À pós-doutoranda Andressa Paladini, pelas conversas, ensinamentos, ideias e amizade

de que vou lembrar sempre que estiver colorindo acompanhada de uma xícara de chá.

À Thayana Tabarkiewicz, minha simbiose, por me ajudar a transformar as coisas ruins

da vida em piada.

Ao meu namorado, Tiago Corrêa Inácio, por me trazer a paz nos dias mais tensos e por

afastar meus medos com amor.

E por último, mas não menos importante, aos meus colegas de laboratório, de aula e da

vida, que diminuem o peso dos dias, quebram a rotina cansativa e acabam sendo uma família,

um apoio, uma alegria.

Prezo insetos mais que aviões.Prezo a velocidadedas tartarugasmais que a dos mísseis.Tenho em mimesse atraso de nascença.Eu fui aparelhadopara gostar de passarinhos.Tenho abundânciade ser feliz por isso.Meu quintalÉ maior do que o mundo.

(Manoel de Barros)

RESUMO

Os Fulgoromorpha, comumente chamados de cigarrinhas, constituem um grupo de insetos

sugadores de seiva do floema das plantas. O táxon compreende aproximadamente 14.000

espécies em 21 famílias. Os insetos pertencentes à Fulgoridae (Insecta: Hemiptera:

Auchenorrhyncha: Fulgoromorpha) são caracterizados principalmente por serem

extremamente grandes e robustos, tendo pelo menos de três a quatro vezes a massa corporal

de quaisquer outras espécies neotropicais, e se aproximam do tamanho do corpo de pequenos

lagartos, chegando a mimetizá-los. Esta família mostra uma notável diversidade de

associações simbióticas com bactérias. As relações simbióticas nutricionais em várias ordens

de insetos desenvolveram-se independentemente com diferentes tipos de microrganismos. Os

simbiontes têm diversos efeitos ecológicos e evolutivos em seus hospedeiros, influenciando

aspectos de interações ecológicas da nutrição à defesa. Estudos demonstram que as

associações entre microrganismos e hospedeiros multicelulares são obrigatórias, sendo

cruciais em termos evolutivos, na geração de diversidade fenotípica e na origem de fenótipos

complexos capazes de colonizar novos ambientes. Tais evidências são importantes para os

sistemas simbióticos encontrados nestes insetos. A metodologia deste estudo envolve a

utilização de metagenômica para conhecimento dos simbiontes e a realização de reações em

cadeia da polimerase (PCR) para amplificação e posterior sequenciamento de fragmentos de

DNA dos hospedeiros, representados por oito espécies de Fulgora. A análise e comparação

das topologias obtidas nos permitirá observar se no gênero Fulgora houve um processo de

coevolução com seus simbiontes.

Palavras-chave: Simbiontes. Hospedeiros. Coevolução. Fulgoridae.

ABSTRACT

The Fulgoromorpha, commonly called planthoppers, are composed by a group of plant

phloem sap feeding insects. The taxon has approximately 14.000 species in 21 families. The

insects that belong to the Fulgoridae family (Insecta: Hemiptera: Auchenorrhyncha:

Fulgoromorpha) are characterized by being extremely large and robust. They have at least

three to four times the corporal mass of any other neotropical species, and their size

approximate to small lizards, that they even mimic. This family shows a notorious diversity of

symbiotic associations with bacteria. The nutritional symbiotic relationship of several order of

insects developed independently along with different types of microorganisms. The symbionts

have several ecological and evolutionary effects on their hosts, that influence their aspects of

ecological interactions, from nutrition to defenses. Studies have shown that associations

between microorganisms and multicellular hosts are obligatory, being crucial in evolutionary

terms, in the generation of phenotypic diversity and in the origin of phenotypical complexes

that are able to colonize new environments. Such evidences are important to the symbiotic

systems found in these insects. The methodology of this study involves the use of

metagenomic for symbionts and knowledge of conducting polymerase chain reactions (PCR)

for amplification and further sequencing of DNA fragments into the host, represented by eight

species of Fulgora. The analysis and comparison of the topologies obtained allow us to

observe if there was a process of coevolution with their symbionts in the genus Fulgora.

Keywords: Symbionts. Hosts. Coevolution. Fulgoridae.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Fulgora sp................................................................................................................11

Figura 2 – Fulgora laternaria...................................................................................................11

Figura 3 - Diagrama esquemático dos passos evolutivos na aquisição de bactérias simbiontes

com ênfase em cigarrinhas (Cicadellidae)................................................................................13

Figura 4 - Espécies de Fulgoridae utilizadas para a análise de aquisição de bactérias............14

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Pesquisas de Müller sobre aquisição de bactérias....................................................14

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................... 9

1.1 SIMBIONTE.........................................................................................................................9

1.2 HISTÓRICO DO TÁXON..................................................................................................10

1.3 COEVOLUÇÃO.................................................................................................................12

2 JUSTIFICATIVA.................................................................................................................17

3 OBJETIVOS.........................................................................................................................18

3. 1 OBJETIVO GERAL..........................................................................................................18

3. 2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................................18

4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................................19

4.1 EXTRAÇÃO.......................................................................................................................19

4.2 REAÇÕES EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)........................................................19

4.3 AMPLIFICAÇÃO DE DNA DE FULGORA.....................................................................20

4.3.1 Amplificação do gene rRNA 16S.....................................................................................20

4.4 SEQUENCIAMENTO DO DNA DE FULGORA.............................................................21

4.4.1 Sequenciamento do gene 16S..........................................................................................21

4.5 ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS.............................................................................21

4.6 FILOGENIA.......................................................................................................................21

5 RESULTADOS ESPERADOS E PERSPECTIVAS..........................................................23

REFERÊNCIAS..................................................................................................................24

APÊNDICE A......................................................................................................................26

APÊNDICE B......................................................................................................................27

9

1 INTRODUÇÃO

1.1 SIMBIONTE

As bactérias são microrganismos altamente adaptáveis com características necessárias

para habitar praticamente todos os ecossistemas, incluindo viver dentro de outros organismos.

Embora microrganismos patogênicos que têm efeitos prejudiciais sobre animais e plantas

venham sendo amplamente estudados, a grande maioria dos relacionamentos na natureza

representam associações simbióticas benéficas e sustentáveis (1).

Muitos invertebrados abrigam bactérias simbiontes. Muitas vezes a codependência é

mútua (2). Em animais invertebrados, tais bactérias simbióticas são frequentemente

transmitidas para seus descendentes. Embora a prevalência de simbiose tenha sido

reconhecida com base em observações de microscopia (2), a maioria dos aspectos das origens

e funções simbióticas era misteriosa antes da idade de técnicas moleculares (3).

Os simbiontes têm diversos efeitos ecológicos e evolutivos em seus hospedeiros,

influenciando aspectos de interações ecológicas, da nutrição à defesa, e afetando o sistema

reprodutivo, com consequências para a estrutura da população, isolamento reprodutivo e

especiação (3).

Os simbiontes também permitem a seus hospedeiros sobreviver em dietas restritas, que

se constituem como uma única fonte alimentar. Assim, os simbiontes fornecem aos seus

respectivos hospedeiros suplementos nutricionais como aminoácidos e vitaminas do complexo

B (4, 5). Apenas insetos da ordem Hemiptera utilizam a seiva do floema como principal ou

única fonte de alimento. Esse estilo de vida evoluiu várias vezes entre os hemípteros,

envolvendo a maioria dos Sternorryncha e muitos Auchenorryncha (6). Em razão das

qualidades nutricionais desbalanceadas do conteúdo floemático, todos os hemípteros que se

alimentam unicamente de seiva elaborada necessitam de microrganismos simbiontes (7).

10

Análises filogenéticas com dados moleculares demonstram a estabilidade desses

mutualistas obrigatórios por longos períodos evolutivos, variando de dezenas a centenas de

milhões de anos, o que permitiu aos seus hospedeiros explorarem fontes nutricionais e

habitats inadequados. Assim, a aquisição desses microrganismos pode ser vista como uma

inovação fundamental na evolução do hospedeiro (8).

1.2 HISTÓRICO DO TÁXON

Os Fulgoridae (Insecta: Hemiptera: Auchenorrhyncha: Fulgoromorpha), comumente

chamados de cigarrinhas, constituem um grupo de insetos sugadores de seiva do floema de

plantas. O táxon compreende aproximadamente 14.000 espécies em 21 famílias, incluindo

Fulgoridae, família à qual pertencem as espécies estudadas neste projeto. As interações destas

cigarrinhas com plantas hospedeiras são essenciais não só como fontes de alimento, mas

também como oviposição, como locais de acasalamento e como abrigo. Espécies de diferentes

famílias atuam como pragas de culturas agrícolas em todo o mundo, danificando as plantas

por ovipositar nos tecidos vegetais e alimentar-se do floema, por vezes podendo inocular uma

série de patógenos. Alguns são causadores de doenças proporcionando sérios danos em uma

grande variedade de plantações economicamente importantes (9).

As espécies incluídas em Fulgora são caracterizadas principalmente por serem

extremamente grandes e robustas, tendo pelo menos de três a quatro vezes a massa corporal

de quaisquer outras espécies neotropicais de Fulgoromorpha e se aproximando do tamanho do

corpo de pequenos lagartos, chegando a mimetizá-los. A maior característica está na cabeça,

que apresenta um processo proeminente inflado, assemelhando-se a um amendoim ou a uma

cabeça de jacaré, incluindo manchas oculares falsas nas asas posteriores (10) (Figuras 1 e 2).

É composta por oito espécies: Fulgora linnaeus, F. castresii, F. crocodilia, F. lampetis, F.

laternaria, F. lucífera, F. riograndensis e F. cearenses (10). A família à qual pertence Fulgora

mostra uma notável diversidade de associações simbióticas com bactérias (11).

11

Figura 1 – Fulgora sp.

Fonte: Imagem da autora.

Nota: Espécime consta no Museu de Ciências e Tecnologia da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS).

Figura 2 – Fulgora laternaria

Fonte: Imagem da autora.

Nota: Espécime consta no Museu de Ciências e Tecnologia da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS).

12

1.3 COEVOLUÇÃO

A diversidade microbiana representa o mais vasto repertório genético do planeta.

Entretanto, apenas uma pequena fração dessa diversidade é conhecida. O sequenciamento

massivo tem proporcionado a caracterização de organismos não cultivados que compõem as

comunidades microbianas (12).

O biólogo Paul Ernest Christof Buchner citou Auchenorrhyncha como o "reino das

fadas de simbiontes", e descreveu uma grande diversidade de associações simbióticas em

diferentes espécies (11). Dados de sequências de nucleotídeos permitem a discriminação

inequívoca do tipo de simbionte e a reconstrução das suas relações evolutivas entre si e para

com outras bactérias (11). Os dados da sequência têm contribuído muito para o conhecimento

de simbiontes. Esta abordagem é possibilitada pelo PCR, seguido do sequenciamento de

fragmentos de DNA (11).

O grupo de insetos que inclui cigarras e cigarrinhas (Hemiptera: Auchenorrhyncha),

mostra uma notável diversidade de associações simbióticas. Müller estudou centenas de

espécies de cigarrinhas na tentativa de reconstruir a evolução dessa diversidade

desconcertante de associações (2). Estudos filogenéticos moleculares têm melhorado muito

nossa compreensão das origens e evolução das simbioses animais, validando e estendendo a

tese de Buchner ao afirmar que muitas dessas associações têm longas histórias evolutivas.

Tais estudos têm mostrado repetidamente que simbiontes nutricionais evoluíram em paralelo

com os seus hospedeiros (13).

13

Figura 3 - Diagrama esquemático dos passos evolutivos na aquisição de bactérias simbiontes

com ênfase em cigarrinhas (Cicadellidae)

Fonte: Moran, 2007 (13).

Nota: Diagrama mostrando Fulgoromorpha com aquisição de novos simbiontes.

Na tabela 1, podemos observar que pesquisas de Müller apontam duas bactérias

presentes em Fulgoridae: Sulcia e Vidania. Porém, na figura 4 podemos ver que as análises

foram realizadas apenas em espécies de outros gêneros que não Fulgora. Devido ao hábito

alimentar e às características semelhantes dos indivíduos da família, há a hipótese de que

Fulgora demonstre aquisição destas mesmas bactérias. Um estudo mais aprofundado de seus

hospedeiros promete fornecer informações importantes sobre como a simbiose bacteriana é

gerida pelos animais que servem como hospedeiros, podendo ser encontrados indivíduos

incluídos em Archaea.

14

Tabela 1 - Pesquisas de Müller sobre aquisição de bactérias

Fonte: Urban e Cryan (14).

Figura 4 - Espécies de Fulgoridae utilizadas para a análise de aquisição de bactérias

Fonte: Urban e Cryan (14).

15

A motivação evolutiva para assimilar genes estranhos decorre do fato óbvio de que as

espécies diferem em conjuntos de genes e de capacidades correspondentes. Assim, a

associação íntima entre duas linhagens pode facilmente surgir através da seleção natural,

atuando dentro de cada espécie para corrigir alelos que promovem a estreita associação com

as outras espécies. Embora as diferenças nas capacidades metabólicas entre espécies sejam

evidentes, a genômica está fornecendo uma visão detalhada de como essas diferenças

surgiram (13). Há provas esmagadoras de que existe uma associação obrigatória entre

microrganismos e hospedeiros multicelulares, sendo crucial em muitos acontecimentos

marcantes na evolução, na geração de diversidade fenotípica e na origem de fenótipos

complexos capazes de colonizar novos ambientes. Tal evidência é abundante para os sistemas

simbióticos encontrados em insetos, em grande parte por causa dos estudos moleculares e

genômicos (13).

A metagenômica vem sendo aplicada para responder questões fundamentais da

microbiologia ambiental como: quantos são? Quem são? E fazendo o quê? Por isso, a

metagenômica representa uma importante ferramenta para estudo da ecologia microbiana e

prospecção do potencial metabólico através da análise da diversidade taxonômica e

localização de genes e operons responsáveis pela síntese de moléculas com propriedades de

interesse biotecnológico (12, 15, 16).

O sequenciamento do gene rRNA 16S permite a identificação de células, mesmo em

pequenas quantidades, o que proporciona informações sobre a composição taxonômica da

comunidade microbiana. A construção de bibliotecas genômicas de rRNA 16S representa uma

ótima ferramenta para a análise da diversidade molecular de comunidades de microrganismos

(28).

A análise do genoma é uma ferramenta essencial para determinar as relações

evolutivas. A sequência completa do DNA de um organismo define a sua natureza com

precisão. Como o DNA está sujeito a mudanças aleatórias que se acumulam durante longos

períodos de tempo, o número de diferenças entre as sequências de DNA de dois organismos

pode proporcionar uma direta, objetiva e quantitativa indicação da distância evolutiva entre

eles (12).

16

Portanto, a partir da análise de processos de metagenômica será possível um

conhecimento amplo em relação aos simbiontes existentes nas espécies de Fulgora, indo além

das pouquíssimas diferenciações morfológicas que determinam as diferenças dessas oito

espécies de cigarrinhas e visualizando as diferenças fisiológicas que as denominam diferentes.

17

2 JUSTIFICATIVA

O entendimento classificatório de qualquer táxon leva a um sistema de referência para

qualquer discussão em biodiversidade, conservação e sustentabilidade. Promove informações

que serão utilizadas convenientemente pela agricultura, além de outros campos do

conhecimento, no manejo adequado dos recursos. A filogenia sempre será uma representação

hipotética que nos dá uma ideia de como aquele determinado grupo de espécies estão

relacionadas entre si.

Dados de sequências genômicas, juntamente com análises evolutivas, trouxeram novas

complementações importantes para a nossa compreensão da evolução biológica. Uma das

maiores revelações se dá na medida em que adaptação biológica e inovação fenotípica, dentro

de uma linhagem genética particular, têm dependido de adoção de sistemas funcionais já

altamente especializados de outras linhagens, muitas vezes apenas remotamente relacionadas

com o destinatário (11).

Muitos grupos de insetos têm se diversificado com base em associações simbióticas

adquiridas no início de suas histórias evolutivas. As associações resultantes são altamente

complexas, envolvendo muitas vezes tipos de células especializadas, mecanismos de

desenvolvimento que assegurem a transferência de simbiontes entre as gerações e

mecanismos de controle da proliferação simbionte e localização. Vários simbiontes

frequentemente coexistem no mesmo hospedeiro, resultando em coadaptação entre vários

genomas filogeneticamente distantes (13).

18

3 OBJETIVOS

3. 1 OBJETIVO GERAL

Identificar os simbiontes de maior abundância, pelo método de metagenômica,

ocorrentes de modo semelhante ou não nas 8 espécies de Fulgora e verificar o processo de

coevolução a partir de análise molecular de Fulgora em comparação com os simbiontes.

3. 2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Comparar a filogenia entre hospedeiro e seus simbiontes.

Mostrar que adaptações biológicas e inovações fenotípicas dependem da adoção de

sistemas funcionais de outras linhagens.

19

4 MATERIAL E MÉTODOS

Os locais de realização da pesquisa serão os laboratórios de Entomologia e de Biologia

Molecular da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS) e o Instituto

do Petróleo e dos Recursos Naturais do TecnoPuc para os métodos de metagenômica. Os

espécimes de Fulgora ssp. serão obtidos na coleção entomológica do Museu de Ciências e

Tecnologia da PUCRS.

4.1 EXTRAÇÃO

Para a extração, será utilizado um abdome de cada um dos espécimes para a obtenção

da sequência dos simbiontes e uma perna, previamente macerada, para a obtenção da

sequência de cada espécie de Fulgora. Os abdomens dos espécimes ou a musculatura da perna

serão submergidos em solução contendo 180µl de buffer ATL e 20µl de proteinase K (mistura

para lise celular) incubadas por 12 horas a 55°C. Neste extrato será posteriormente utilizado o

Qiagen DNEasy Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA), seguindo um protocolo com os

seguintes passos: adição em cada amostra de buffer AL (lise celular), etanol 100% e

posteriormente utilização da centrífuga em combinação com a lavagem das amostras com

buffer AW (lavagem) e buffer AE (eluição).

4.2 REAÇÕES EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)

As reações em cadeia da polimerase (PCR) serão conduzidas utilizando-se 25µl total

de produto: 17,5µl de água pura, 2,5µl de tampão 10X buffer para PCR, 1,5 µl de sal MgCl2

(25mM) 2,0µl de DNTP’s (10mM), 0,5µl de primers e 0,15µl de polimerase Ampli-Taq (PE

20

Applied Biosystem, Foster City CA) com o seguinte protocolo de ciclos: 30 segundos a 94°C

para desnaturação inicial seguidos de 30–35 ciclos de 1 minuto cada a 40–60°C para

anelamento, 1 minuto a 72°C, terminando com 7 minutos incubando a 72°C. Controles

negativos serão incluídos em todas as reações para a detecção de possíveis contaminações.

4.3 AMPLIFICAÇÃO DE DNA DE FULGORA

Adiciona-se o tampão, enzima TAQ, água, sal (cloreto de magnésio), primers e os

nucleotídeos sintéticos. Os componentes são adicionados na máquina de reações em cadeia de

polimerase, na qual ocorrerão de 30 a 35 ciclos compostos por temperatura de desnaturação,

temperatura de anelamento e temperatura para funcionamento da enzima. O produto bruto é

posto no gel de agarose para verificar a amplificação. Esta amostra é purificada e mandada

para sequenciamento.

4.3.1 Amplificação do gene rRNA 16S

A reação de PCR para amplificação do gene rRNA 16S é realizada utilizando-se

iniciadores desenhados para o anelamento em regiões conservadas dentro de rRNA 16S

específicos para Eubacteria, gerando fragmentos de aproximadamente 1,5kb. O programa

utilizado será: 95º C por 3 minutos, seguido de 25 ciclos de 95º C por 1 minuto, 51º C por 1

minuto e 30 segundos e 72º C por 3 minutos. A extensão final ocorre na temperatura de 72º C

por 30 minutos. Reação: 10, 8 L água milli Q; 2 L Tampão 10X; 2 L dNTP (10mM); 2

L BSA 10X; 1 L PR (5mM); 1 L PF (5mM); 0,2 L Taq (5U/µL); 1 L DNA (50ng)

para um volume total de 20 L.

Após a verificação do material amplificado, uma corrida em gel de agarose 1% TAE

1X é realizada para sacar as bandas correspondentes aos produtos de amplificação do gene

21

rRNA 16S. A purificação é realizada com kit comercial Ultra Clean DNA Purification (Mo

Bio). A efetividade da purificação é verificada em gel de agarose 1% TBE 1X.

4.4 SEQUENCIAMENTO DO DNA DE FULGORA

Cada gene será sequenciado separadamente para cada combinação de primers. Todos

os dados cromatográficos das sequências serão revisados, editados e as fitas complementares

do DNA combinadas para a obtenção de uma fita consenso utilizando-se o programa

Sequencher 4.8. A utilização das fitas complementares (obtendo-se uma fita consenso)

permite uma maior confiabilidade nas posições nucleotídicas a serem utilizadas para o

posterior alinhamento.

4.4.1 Sequenciamento do gene 16S

Será realizado em parceria com o Instituto do Petróleo e dos Recursos Naturais do

TecnoPuc a partir da utilização do Ion Torrent PGM, que utiliza chips semicondutores,

tecnologia de sequenciamento mais simples, rápida, rentável e escalável do que outras

tecnologias de sequenciamento clássicas. A partir de uma biblioteca de DNA previamente

amplificada, o Ion Torrent PGM produzirá sequências que posteriormente serão, através de

análises de bioinformática, classificadas e ordenadas por abundância.

4.5 ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS

O alinhamento inicial de todas as sequências de DNA e rRNA 16S será realizado em

ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw), utilizado quando as sequências têm tamanho

próximo. A partir do alinhamento é obtida a matriz pelo mesmo programa.

22

4.6 FILOGENIA

O estudo das relações evolutivas é feito a partir de três programas:

Tree analysis using New Technology (TNT): realiza a análise de parcimônia.

Garli 2.0: para obtenção de máxima verossimilhança.

MrBayes: programa de inferência bayesiana, estatística que descreve as incertezas

sobre quantidades invisíveis de forma probabilística.

Os três programas são aplicados tanto para matriz dos simbiontes quanto para a matriz

das 8 espécies de Fulgora. A aplicação dos três programas resultará em três topologias de

simbiontes e três topologias de cada cigarrinha. As topologias serão comparadas para a

obtenção de uma topologia final de cada Fulgara e simbionte. Com as topologias finais será

possível verificar a coevolução entre hospedeiro e seus simbiontes.

A descrição dos procedimentos de materiais e métodos para os fulgorídeos seguiu o

padrão de elaboração descrito na tese de Paladini A., 2012 (17).

23

5 RESULTADOS ESPERADOS E PERSPECTIVAS

Com a realização deste trabalho espera-se obter os sequenciamentos dos genes das oito

espécies de Fulgora, realizar o alinhamento dos genes e inferir uma filogenia. A partir disso,

será possível realizar a comparação com a filogenia obtida dos simbiontes mais abundantes

selecionados por metagenômica, tornando, então, viável a análise da hipótese de coevolução

entre os espécimes de Fulgora em comparação com seus simbiontes.

24

REFERÊNCIAS

1. Moran NA. Symbiosis. Current Biology. 16 (20).

2. Buchner P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. New York, N.Y.: Interscience;1965.

3. Moran NA, McCutcheon JP and Nakabachi A. Genomics and Evolution of Heritable Bacterial Symbionts. Rev. Genet. 2009 04 30;42:165-190.

4. Buchner P. Endosymbioosis of animals with plant microorganisms. New York: J. Wiley, p. 909, 1865.

5. Nogge G. Significance of Symbionts for the maintenance of na optional nutritional state for successful reproduction in hematophagous arthropods. Parasitology, Cambridge, v.82, p.101-104, 1981.

6. Dolling W R. The Hemiptera. Oxford University. 1991. 274p.

7. Douglas AE. Phloem-sap feeding by animals: problems and solution. Journal of Experimental Botany, Oxford, v.57, p.747-754, 2006.

8. Moran NA, Telang A. Bacteriocyte – associated Symbionts of insects. Bioscience, Washington, DC, v.48, p.295-304, 1998.

9. Oliseski J, Carvalho G. Estudos taxonômicos dos Fulgoromorpha (Insecta: Hemiptera: Auchenorrhyncha) da coleção do Museu de Ciências e Tecnologia da PUCRS (MCTP). Seminário Interno de Avaliação da Iniciação Científica - PUCRS. FAPERGS; 2014.

10. O’Brien LB. New World Fulgoridae, part I: genera with elongate head processes. Tallahassee. Florida, USA. Entomology, Florida A & M University;1956.

11. Moran NA, Tran P and Gerardo NM. Symbiosis and Insect Diversification: an Ancient Symbiont of Sap-Feeding Insects from the Bacterial Phylum Bacteroidetes. Applied and Environmental Microbiology. 2005 08 23;71(12):8802-8810.

12. Rodrigues TB. Diversidade metagenômica microbiana de de biomas terrestres e marinhos [tese]. Rio de Janeiro (RJ): Universidade Federal do Rio de Janeiro; 2011.

13. Moran NA. Symbiosis as an adaptive process and source of phenotypic complexity. PNAS. 2007 05 15;104(1):8627-8633.

14. Urban JM, Cryan JR. Two ancient bacterial endosymbionts have coevolved with the planthoppers (Insecta: Hemiptera: Fulgoroidea). BMC Evolutionary Biology 2012, 12:87. 1-19.

25

15. Steele HL and Streit WR. Metagenomics: Advances in ecology and biotechnology. FEMS Microbiology Letters 247, p.105-111, 2005.

16. Handelsman J. Metagenomics: Application of Genomics to Uncultured Microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev 68, p.669-685, 2004.

17. Paladini A. Filogenia dos Cercopídeos Neotropicais (Hemiptera, Cercopidae, Tomaspidinae). Curitiba (PR): Universidade Federal do Paraná; 2012.

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APÊNDICE A - Cronograma

Atividades Jan - Abril Mai - Ago Set -Dez Jan - Abril Mai - Ago Set - Dez

Análise morfológica dos espécimes pertencentes a Fulgora

X

Seleção dos espécimes para retirada do abdome X X

Realização do PCRX X X

Extração de DNAX X X

Sequenciamento dos genes bacterianos X X

Sequenciamento dos genes de Fulgora X X

Edição de sequênciasX X

Alinhamento de todas as sequências X X

Construção das filogeniasX X

Cladogramas comparativosX X

Discussão dos resultadosX

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APÊNDICE B – Orçamento

O orçamento abaixo requer principalmente a aquisição de materiais para uso no

laboratório de molecular. O orçamento inclui a compra de uma licença do programa

computacional Sequencher (GeneCodes Corporation, Ann Arbor) para o laboratório de

entomologia, pagamento do serviço de sequenciamento pela empresa Macrogen e material de

consumo utilizado no laboratório molecular diariamente.

Materiais de consumo Propósito Preço (R$)

QJAGEN DNeasy Blood and TissueKit (150U)

Kit para extração de 250 amostras de DNA. 1.745.00

Iniciadores (Primers)Síntese de fitas de

oligonucleotídeos para utilização no PCR.

1.500.00

Go Taq Flexi DNA polimeraseDNA polimerase para

amplificação. 1.446.00

Set de dNTPs (100mM)Desoxiribonucleotídeos para amplificação por

PCR.750.00

1kb DNA ladder Marcador de peso. 700.00

GelRed 10,000x in Water (0,5ml)Corante fluorescente para

ácidos nucleicos para observação dos produtos de PCR após eletroforese.

700.00

Outros reagentes e consumíveis plásticos de uso rotineiro no laboratório de

biologia molecular

Reagentes de uso geral no laboratório, por exemplo,

álcool etílico, agarose, TBE, ponteiras de pipetas,

microtubos de PCR, luvas, etc.

3.000.00

Serviços de terceiros Propósito Preço (R$)

Sequenciamento na Macrogenhttp://dna.macrogen.com/eng/

Reações de purificação, sequenciamento e leitura

do gel de sequenciamento. 20.000.00