UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

CURSO DE AGRONOMIA

JOEL CABRAL DOS SANTOS

MEIOS ALTERNATIVOS PARA CULTIVO IN VITRO DE VIOLETA AFRICANA

(Saintpaulia spp.) E EFEITO DE DESCONTAMINANTES NO CULTIVO IN VITRO

DE PALMA FORRAGEIRA (Nopalea cochenilifera Salm-Dyck)

AREIA-PB

2014

ii

JOEL CABRAL DOS SANTOS

MEIOS ALTERNATIVOS PARA CULTIVO IN VITRO DE VIOLETA AFRICANA

(Saitipaulia spp.) E EFEITO DE DESCONTAMINANTES NO CULTIVO IN VITRO DE

PALMA FORRAGEIRA (Nopalea cochenilifera Salm-Dyck)

Trabalho de graduação apresentado ao Curso de Agronomia da Universidade Federal da Paraíba-Centro de Ciências Agrárias-Campus II-Areia-PB, como requisito para obtenção do título de Engenheiro Agrônomo.

Orientadora: Dra. Núbia Pereira da Costa

Co-orientador: Dr. Jacinto de Luna Batista

AREIA-PB

2014

iii

MEIOS ALTERNATIVOS PARA CULTIVO IN VITRO DE VIOLETA AFRICANA

(Saitpaulia spp.) E EFEITO DE DESCONTAMINANTES NO CULTIVO IN VITRO DE

PALMA FORRAGEIRA (Nopalea cochenilifera Salm-Dyck)

JOEL CABRAL DOS SANTOS

Monografia defendida em 23 de julho de 2014

Banca Examinadora

Profa. Dra. Núbia Pereira da Costa

Orientadora - CCA/UFPB

Prof. Dr. Américo Perazzo Neto

Examinador - CCA/UFPB

Bióloga. Lucinalva Azevedo dos Santos

Examinadora - CCA/UFPB

Eng.º Agrônomo. Tarciso Botelho Pereira Filho

Examinador – CCHSA/UFPB

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"Saí lá da minha terra Zabelê

Enfrentei intempéries nessa vida

Pra vencer muitas vezes a saída

É deixar o que gosta pra crescer

Com o diploma na mão eu posso ver

Que a metade do caminho foi andado

Mais na frente enxergo o mestrado

Doutorado e quem sabe mais vitórias

Mas sabendo que atrás de tantas glórias

Tem caminho sofrido já trilhado."

CAZUZA SALVADOR

A minha mãe (Maria do Desterro), a nova geração, minha princesa Amanda, Ana Luísa, Ana

Beatriz, Gustavo, Fernando e Flávio. Aos irmãos Dejailma, Janiel, Joelma e Deja.

DEDICO

v

AGRADECIMENTOSA toda minha família, especialmente a minha amada mãe Maria do Desterro ou

simplesmente Neném, por todo apoio e incentivo nas minhas escolhas, mesmo sem

compreender algumas vezes o que de fato estava eu a fazer.

A família, Coletivo ATISSAR , Romério, Sandra, Anael, Anaely, Almir, Iago,

Raphael, David, Lucas, Alan, Dianne (e outros que por este coletivo já passaram) sem vocês,

sem a força e sem os ensinamentos deste coletivo não teria eu chegado até aqui.

Leandra (meu amor), por todo amor, carinho, paciência, incentivos dedicados a mim

para conquistas dos meus sonhos. Sou muito Feliz por ter você em minha vida. Te amo...

Aos orientadores Profª. Núbia e Prof. Jacinto, por todos os ensinamentos acadêmicos e

da vida, pelos incentivos para que chegasse ao objetivo alcançado e por todos os conselhos e

para tomada de decisões.

A Iris por toda ajuda e incentivo, e também a sua equipe administrativa Marleide,

Luciene, Ronaldo, Renata.

A todos que de alguma forma contribuíram para construção dessa conquista, Fabiana,

Maelson, Lucy, Zé Moreira e tantos outros.

A todos os colegas e amigos da turma de Agronomia 2010.1, Renato (Caixa d`água),

Zé Marcos, Paulo (Paulo Crime), Daniel (o Bebo), Ítalo, Gilmar, Arliston, Jadison, Rafael

(Fiu-fiu), Anderson, Camila, Amanda...

Renato (Perêra), Mileny (Mimi), Mariana (Nevinha) , Carolline (Diva) por toda troca

de conhecimentos e ensinamentos, tantos momentos felizes, levaremos pra sempre essa

amizade tão bela que construímos ao longo destes anos.

Aos colegas do grupo PET - Agrobio.

Aos companheiros de quarto, Rinaldo (Binho), Cazuza (Caca), Lemerson, Ronaldo

(Baixinho) Rommel (Prata). E tantos colegas feitos ao longo destes quatro anos e meio, Haron

(Senador), Jair, Neto (Pipoca), Adelmo.

Aos companheiros de laboratório João Ítalo e Francisco (Chico) por toda ajuda na

realização deste trabalho, Lucinalva, Tarciso, Agenor...

Aos colegas do laboratório de Entomologia Robério (Presidene), Vinicius...

A nova família, que me acolheu em Areia, Adriana, Dona Zefinha, Minininha,

Conceição (Piquena), Belinha, Cecilia e Bruna.

A Universidade Federal da Paraíba, a todos os professores do CCA pelos

ensinamentos aqui recebidos.

vi

SUMÁRIO

RESUMO GERAL....................................................................................... viii

GENERAL ABSTRACT............................................................................. ix

CAPÍTULO I - CONSIDERAÇÕES GERAIS.......................................... 11

1. INTRODUÇÃO GERAL............................................................................. 12

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA.............................................................. 13

2.1 Espécies estudadas....................................................................................... 13

2.1.1 Violeta africana.............................................................................................. 13

2.1.2 Palma.............................................................................................................. 14

2.2 Micropropagação e meios de cultivo.......................................................... 16

2.3 Uso da Luz Natural...................................................................................... 18

2.4 Enraizamento e Desenvolvimento............................................................... 20

2.5 Aclimatização................................................................................................ 21

2.6 Descontaminação.......................................................................................... 22

REFERÊNCIAS........................................................................................... 24

CAPÍTULO II - ENRAIZAMENTO E DESENVOLVIMENTO IN

VITRO E ACLIMATIZAÇÃO DE BROTOS DE VIOLETA

AFRICANA EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE FÉCULA

DE MANDIOCA E EM MEIO LÍQUIDO ESTACIONÁRIO................ 37

RESUMO.................................................................................................... 38

ABSTRACT................................................................................................. 39

1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 41

2. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 42

2.1 Local e período de realização dos experimentos....................................... 42

2.2 EXPERIMENTO 1: Efeito da fécula de mandioca no enraizamento in

vitro e na aclimatização de violeta

africana.......................................................................................................... 42

2.2.1 Tratamentos.................................................................................................... 43

2.2.2 Parâmetros avaliados...................................................................................... 43

2.2.3 Aclimatização................................................................................................. 43

2.2.3.1 Tratamentos.................................................................................................... 44

vii

2.2.3.2 Parâmetros avaliados...................................................................................... 44

2.2.4 Delineamento experimental e análise estatística dos experimentos............... 44

2.3 EXPERIMENTO 2: Uso de PVC como ponte no meio líquido............... 45

2.3.1 Tratamentos.................................................................................................... 45

2.3.2 Parâmetros avaliados...................................................................................... 45

2.4 Delineamento experimental e análise estatística dos experimentos......... 46

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 46

3.1 Efeito da fécula de mandioca no enraizamento in vitro e na

aclimatização de violeta africana............................................................... 46

3.1.2 Aclimatização................................................................................................. 49

3.2 Efeito do uso de PVC como ponte no meio líquido................................... 51

4. CONCLUSÕES............................................................................................ 54

REFERÊNCIAS........................................................................................... 54

CAPÍTULO III - EFEITO DE DESCONTAMINANTE NO

ESTABELECIMENTO IN VITRO DE PALMA FORRAGEIRA

(Nopalea cochinileifera Salm-Dick).. ......................................................... 58

RESUMO...................................................................................................... 59

ABSTRACT....................................... .......................................................... 59

1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 61

2. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 62

2.1 Local e período de realização dos experimentos....................................... 62

2.1.1 Descontaminação e inoculação dos explantes................................................ 62

2.1.2 Tratamentos.................................................................................................... 63

2.1.3 Parâmetros avaliados...................................................................................... 63

2.1.4 Delineamento experimental e análise estatística dos experimentos............... 63

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 64

4. CONCLUSÕES............................................................................................ 66

REFERÊNCIAS........................................................................................... 67

viii

RESUMO GERAL

SANTOS, Joel Cabral. Meios Alternativos para Cultivo In vitro de Violeta Africana

(Saintipaulia spp) e efeito de descontaminantes no cultivo in vitro de Palma Forrageira

(Nopalea cochenilifera Salm-Dyck). 2014. 68f. Universidade Federal da Paraíba. Orientadora:

Núbia Pereira da Costa.

RESUMO: A violeta africana (Saintpaulia spp) é uma das plantas ornamentais de interior das

mais importantes, destacando-se pela beleza e delicadeza de suas flores. A palma miúda ou

doce (Nopalea cochenillifera Salm Dyck) tem se destacado pela sua resistência a cochonilha

do carmim. A cultura de tecidos de plantas vem se tornando uma técnica bastante utilizada,

mas para que esta técnica torne-se viável os custos devem ser reduzidos. Objetivou-se com

este trabalho avaliar o desenvolvimento de violeta africana e palma forrageira em meios e

ambientes alternativos para o cultivo in vitro. O trabalho foi realizado no Laboratório de

Biologia Celular e Cultura de tecidos do CCA/UFPB – Areia – PB. O trabalho foi divido em

três experimentos, utilizando-se o delineamento inteiramente ao acaso. No primeiro, brotos de

violeta africana com 0,5 cm contendo de duas a três folhas foram colocados para enraizar em

meio MS + 20 g L-1 de sacarose geleificado com ágar ou fécula de mandioca. Após o

enraizamento as plantas foram levadas para aclimatização, onde foram avaliados o percentual

de enraizamento e sobrevivência; número de folhas e de raízes; comprimento de parte aérea e

de raiz. No segundo experimento, os brotos foram colocados para enraizar em meio

semissólido e líquido utilizando pontes de PVC com papel filtro ou algodão, realizou-se as

seguintes avaliações: sobrevivência e enraizamento; número de folhas e de raízes;

comprimento de parte aérea e de raiz; massa fresca de parte aérea e de raiz; massa seca de

parte aérea e de raiz, com cinco repetições e três brotos por potes no enraizamento e três

plantas por vaso na aclimatização. No último experimento testou-se concentrações de

hipoclorito de sódio associado ou não a Tween 20 na descontaminação de palma para o

cultivo in vitro em casa de vegetação, as variáveis analisadas foram; percentagem de

contaminação; oxidação e presença de brotações, com 12 tratamentos e seis repetições. A

fécula de mandioca na concentração de 100 g L1 pode substituir o ágar no meio de cultura do

cultivo in vitro de violeta africana sendo esta concentração a mais eficiente no enraizamento e

na aclimatização. A ponte de PVC com papel filtro pode ser utilizada no enraizamento in vitro

da violeta africana em meio liquido. A manutenção dos cladódios em ambiente higienizado

associado a todos os tratamentos com NaOCl com ou sem Tween 20 é eficaz na

ix

descontaminação de explantes de palma forrageira (N. cochenillifera), havendo uma maior

presença de brotações nas concentrações de 10 e 20% de NaOCl, e ocorrendo a diminuição

quando associado ao Tween 20..

Palavras-chave: Cultura de tecidos, Cultivo in vitro em telado, Meio estacionário.

GENERAL ABSTRACT

SANTOS, Joel Cabral. Alternative means for in vitro cultivation of african violet

(saintpaulia spp.) And decontaminating effect on in vitro cultivation of forage palm

(Nopalea cochenilifera Salm-Dyck). 2014. 68f. Universidade Federal da Paraíba. Guider:

Núbia Pereira da Costa.

ABSTRACT: The african violet (Saintipaulia spp.) is one of the most important ornamental

houseplants distinguished by its beauty and delicacy of their flowers. The small forage cactus

or sweet forage cactus (Nopalea cochenillifera Salm Dyck) stands out for its resistance to

cochineal carmine. The plant tissue culture is becoming a very common technique. But for

this technique to become viable, costs must be reduced. The objective of this work was to

evaluate the development of african violet and forage cactus in alternative tissue culture

media and alternative environments to cultivate in vitro. The work was performed at the Cell

Biology and Tissue culture Laboratory of the CCA/UFPB - Areia - PB. The work was divided

into three experiments, using a completely randomized design. In the first, sprouts of african

violet with 0,5 cm containing two to three leaves were planted on MS medium + 20 g L-1

jellified sucrose agar and/or cassava starch to root. After rooting, the plants were taken for

acclimatization. Were evaluated the percentage of rooting and survival; number of leaves and

roots; length of sprout and root. Then, the sprouts were placed to root into medium semisolid

and liquid using PVC bridges with filter paper or cotton, made the following assessments:

survival and rooting; number of leaves and roots; length of sprout and root; fresh weight of

sprout and root; dry weight of sprout and root. To the rooting were used five replications and

three sprouts/pots and to acclimatization were used three plants/vase. In the last experiment

we tested concentrations of sodium hypochlorite associated or not with Tween 20 in

decontaminating forage cactus cultivation in vitro in a greenhouse. The variables analyzed

were percentage of contamination; oxidation and the presence of sprouts. Were used 12

x

treatments and six replications. The cassava starch concentration of 100 g L1 can replace the

agar in the culture medium of the culture of violet in vitro, being the most efficient

concentration on rooting and acclimatization. The bridge PVC with filter paper can be used in

the in vitro rooting african violet subjected to liquid medium. Maintenance of cladodes in

sanitized environment associated with all treatments with NaOCl with or without Tween 20 is

effective in decontamination of explants of forage Palm (N. cochenillifera), with a greater

presence of shoots at concentrations of 10 and 20% of NaOCl, and occurring to decrease

when associated with the Tween20.

Key words: Tissue culture, In vitro cultivation in screenhouse, Stationary medium

11

CAPÍTULO I

CONSIDERAÇÕES GERAIS

12

1. INTRODUÇÃO GERAL

Entre as várias técnicas utilizadas na propagação vegetativa, tem-se o cultivo in vitro,

que se fundamenta na totipotencialidade celular, teoria proposta por Haberlandt em 1902,

onde cada célula vegetal possui potencial genético para gerar um novo organismo, idêntico ao

que lhe deu origem (GEORGE, 2008). Esta forma de cultivo é considerada um requisito

essencial na transformação genética da maioria das espécies de plantas, uma vez que, nessa

condição, é possível regenerar plantas completas a partir de uma única célula geneticamente

alterada pela introgressão estável do gene exógeno (PASQUALI; ZANETTINI, 2007;

SARTORETTO et al., 2008).

A micropropagação é uma técnica muito utilizada para aquelas espécies de difícil

propagação, ou que ainda tenha elevado valor econômico e possua algum tipo de dificuldade

em sua propagação. É uma importante estratégia para o melhoramento, clonagem e

multiplicação de plantas em larga escala e para obtenção de plantas livres de vírus, com alta

qualidade fitossanitária e genética (VILLASLOBOS; THORPE, 1991).

Os fatores que mais elevam os custos na produção de mudas através do cultivo in vitro

estão relacionados com a infraestrutura e energia elétrica, pois neste método os cultivos

permanecem em condições artificiais de luz e temperatura por um longo período de tempo,

ocorrendo assim um elevado consumo de energia pelo emprego de equipamentos para

manterem as condições desejadas (STANDAERT DE METSENAERE, 1991; KODYM;

ZAPATA-ARIAS, 1999).

Outro fator que contribui diretamente para o elevado custo desta técnica é a

composição dos meios de cultura, cujos componentes podem ser substituídos, em muitos

casos, por frutas, legumes e açúcar de uso doméstico (CAMPOS, 2002) e fertilizantes

minerais (NPK) (FERREIRA et al., 2010).

Sendo assim, o ágar é um dos componentes mais dispendiosos para a cultura de

tecidos de plantas (CALDAS et al., 1998; JUNGHANS et al., 2009), espera-se com a

substituição deste, por materiais alternativos, resultados que possam fazer com que haja a

redução de custos na técnica de cultivo in vitro (FARIA et al., 2006).

Assim objetivou-se com este trabalho, testar agentes geleificantes em substituição ao

agar e meio estacionário no cultivo in vitro de violeta africana e estabelecimento in vitro de

palma forrageira em casa de vegetação em função dos agentes contaminantes.

13

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 Espécies estudadas

2.1.1 Violeta africana

A violeta africana (Saintipaulia ionantha Wendl), é uma espécie florífera, da família

Gesneriaceae, englobando mais de 120 provimentos e mais de 2000 espécies conhecidas

(TOMBOLATO et al., 1987). Tida como uma das mais populares plantas ornamentais,

existindo no mercado mundial mais de cinquenta cultivares (STANCATO et al., 2009),

Caracteriza-se por ser uma planta herbácea, possui folhas ovais, de coloração verde-escura e

de uma textura veludosa, suas flores são de cores diversas. Esta é uma das mais importantes

flores envasadas de interior (FRÁGUAS et al., 2002).

A violeta é uma espécie florífera perene, podendo florescer em qualquer época do ano,

é uma das espécies ornamentais mais difundidas e apreciadas, por ser uma planta de vaso,

podendo ser utilizadas como decoração em todos os ambientes (TOMBOLATO et al., 1987).

Possui flores simples ou dobradas com grande variação de cores: branca, rosa, roxo, azul ou

bicolor, que florescem o ano todo e duram de 5 a 7 dias (BIANCHINI; PANTANO, 1991). As

violetas apresentam características que as tornam populares: é de fácil cultivo, não ocupam

grandes espaços, por seu colorido podem ornamentar os mais diversos ambientes (VIOLETA

AFRICANA, 2002).

A floricultura tem se tornado uma atividade muito próspera (TERCEIRO NETO,

2004), tal segmento vem desempenhando papel significativo dentro do agronegócio brasileiro

(BORSOI, 2009). Este potencial está ligado às diversas condições climáticas do Brasil,

favorecendo o cultivo de uma grande quantidade de espécies tanto de clima tropical quanto

temperado, com possibilidade de produção em todas as estações do ano, dando garantias a

atividade, contribuindo para o aspecto social e gerando distribuição de renda, uma vez que a

floricultura é realizada na maioria por pequenos produtores (FRANÇA; MAIA, 2008;

BRAGA, 2006).

14

2.1.2 Palma

No Nordeste brasileiro predominam três cultivares de palma forrageira, das quais dois

pertencem à Opuntia fícus-indica Mill, vulgarmente conhecidas como redonda ou orelha-de-

onça e a gigante, graúda ou azeda e uma pertencente à espécie Nopalea cochenillifera Salm

Dick, denominada de miúda, língua-de-vaca ou doce (MAIA NETO, 2000).

A palma forrageira apresenta múltiplos usos, nativa do México, país que a explora

desde o período pré-hispânico, detendo a maior riqueza de cultivares (REYES-AGUERO et

al., 2005). A região Nordeste do Brasil concentra a maior área cultivada de palma forrageira

do mundo, estimada em 600 mil hectares distribuídos nos Estados da Bahia, Sergipe, Alagoas,

Pernambuco, Paraíba, Ceará e Rio Grande do Norte (LOPES, 2012). É um recurso alimentar

muito importante para os animais, pois ela é adaptada às condições edafoclimáticas da região

semiárida, essa forrageira tem sido frequentemente utilizada na alimentação de bovinos

sobretudo nos períodos de estiagem prolongada, pois possibilita altas produções de matéria

seca por unidade de área (SANTOS et al., 1997), além de ser excelente fonte de energia, rica

em carboidratos não-fibrosos (WANDERLEY et al., 2002) e nutrientes digestíveis totais

(MELO et al., 2003).

A palma forrageira (Opuntia spp.) é uma planta bem adaptada às condições semiárida,

em virtude de adaptações morfofisiológicas. Esta espécie possui mecanismo fotossintético do

tipo CAM (mecanismo ácido das crassuláceas), absorvendo gás carbônico CO2 no período

noturno e fixa-o em oxalacetato, e depois em malato e/ou aspartato, que serão transformados

em carboidratos pelo ciclo de Calvin durante o dia. Estas plantas evitam a perda de água por

abrirem seus estômatos à noite (temperatura baixa e alta umidade) e fechando-os durante o dia

(temperatura elevada e baixa umidade) obtendo assim alta eficiência no uso da água (TAIZ;

ZEIGER, 2013).

Além disso, o sistema radicular é adaptado às condições semiáridas, bem como, pode-

se observar a presença de espinhos e gloquídeos, os quais são úteis contra a perda de água;

outra adaptação é a morte e renovação de um percentual das raízes, conforme a falta de água

por períodos mais prolongados e o retorno da umidade ao solo (SAMPAIO, 2005).

A palma além de ser um alimento volumoso suculento é, dentre as forrageiras

disponíveis na região, a que possui a maior capacidade de produção de matéria fresca, e não

precisa ser armazenada como silagem ou feno, mantendo seu valor nutritivo durante todo o

período de estiagem (OLIVEIRA, et al., 2010). Utilizada em outros países em projetos de

preservação do solo para zonas áridas, produção de hortaliças, cochonilha para a produção de

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carmim e inúmeros subprodutos como queijo vegetariano, bebidas, remédios e cosméticos,

biomassa para fins energéticos (combustível ou biogás), (SÁENZ et al., 2006; CHIACCHIO

et al., 2006).

É também cultivada para produção de frutos em zonas semiáridas no mundo inteiro

com bons rendimentos. Apesar de possuir uma área restrita para apreciação e valorização, o

“fruto de palma”, tem amplas possibilidades e potencialidades de vir a ser uma alternativa

para a diversificação da produção, gerando uma fonte adicional de renda para os agricultores

(LEDERMAN, 2005). Tem-se assim, na produção desta cultura um grande potencial no que

diz respeito ao desenvolvimento das zonas áridas e semiáridas, sobretudo, nos países em

desenvolvimento, onde a exploração racional e econômica de suas espécies ajudará na

conservação do meio ambiente e segurança alimentar dos rebanhos (CHIACCHIO et al.,

2006).

Quando se procede o plantio de palma em grandes áreas, nem sempre a quantidade de

propágulos são suficientes, sendo usados cladódios doentes, desuniformes e sem a suculência

adequada para o enraizamento. Assim, várias pesquisas estão sendo realizadas para obtenção

de sua micropropagação in vitro, a exemplo de Llmoca-Zárate e Paredes-López. (1999), que

obteve melhores resultados quando acrescentou ao meio de cultivo MS (MURASHIGE;

SKOOG, 1962), 6-benzilaminopurina (BAP) a 1,00mg/L e ácido indolacético (AIA) a

5,00mg/L.

A produtividade desta cultura tem reduzido ao longo dos anos. Isso devido ao ataques

de patógenos e pragas, como a cochonilha do carmim. Espécies do gênero Dactylopius que

são criadas em cactáceas e podem se transformar em pragas se a cultura não for conduzida

tecnicamente ou se forem disseminadas livremente nas plantas cultivadas (WARUBY et al.,

2005). As cochonilhas atacam a palma, sugam as raquetes inoculando toxinas, isso fará com

que haja o enfraquecimento das plantas, provocando o amarelecimento e a queda dos

cladódios. Em ataques mais severos, quando não é adotada medida de controle, podem

ocorrer a morte da planta e a destruição do palmal (CAVALCANTI et al., 2001). Ataques

dessa cochonilha em palma cultivada foram observados nos estados de Alagoas, Pernambuco,

Paraíba, Rio Grande do Norte e Ceará (SANTOS et al., 2006).

16

2.2 Micropropagação e meios de cultivo

A técnica bem sucedida da cultura de tecido tem sido uma prática muito utilizada para

propagação assexuada de plantas, oferecendo algumas vantagens sobre os métodos

convencionais de propagação, entre elas: plantas sadias, uniformes e vigorosas durante todo o

ano; propagação vegetativa de espécies difíceis de serem propagadas por outros métodos;

obtenção de um grande número de plantas em curto espaço físico e de tempo (FRÁGUAS et

al., 2002, SCHUCH; ERIG, 2005), Couto (2003) relata que o cultivo in vitro apresenta-se

como metodologia viável para produção em grande escala de plantas de importância

econômica devido as suas vantagens, destacando-se entre elas, a manutenção das

características genéticas.

No Brasil o uso de mudas micropropagadas para implantação de novas áreas de cultivo

tem apresentado crescimento significativo nos últimos dez anos, principalmente, por

produtores mais tecnificados (SIQUEIRA et al., 2013). No entanto Silva et al. (2005),

afirmam que as mudas micropropagadas são mais caras que as produzidas convencionalmente

mesmo com todas as vantagens apresentadas. Costa et al. (2007), destacam que o uso desta

técnica em escala comercial pode ser limitado pelo seu oneroso custo de produção de mudas,

especialmente pelo elevado custo dos reagentes e equipamentos utilizados e pela relativa

baixa eficiência no desenvolvimento e multiplicação de algumas espécies.

Para que essa atividade traga resultados benéficos aos produtores é imprescindível o

uso de novas tecnologias. Assim a produção de mudas pelo cultivo de células, se torna uma

opção viável para produção de mudas em escala comercial, apresentado fidelidade genética e

livre de patógenos, em um reduzido espaço de tempo, podendo assim atender ao mercado

(TERCEIRO NETO, 2004).

A propagação in vitro é uma técnica bem sucedida, principalmente com plantas

ornamentais com muitas vantagens sobre os métodos convencionais de propagação,

permitindo a obtenção de um grande número de plantas de boa qualidade fitossanitária com

pureza varietal, como também, a aquisição de mudas em qualquer época do ano (FRÁGUAS

et al., 2002). Dentre outras vantagens da micropropagação, deve-se ressaltar a propagação

rápida mediante à indução de múltiplos brotos, resultando em material propagativo com

potencial de produção contínua (COSTA et al., 2007).

Embora seja bastante utilizada para uma gama de espécies de plantas com os mais

variados fins, o uso comercial da micropropagação e de seus produtos é ainda limitado,

principalmente pelo elevado custo dos reagentes e equipamentos utilizados. Hoje já se

17

encontra na literatura trabalhos onde se buscam técnicas que possam ser reproduzidas, pois

estas precisam ser adaptadas as características de cada cultura ou cultivar, devido as

características genéticas de cada uma, podendo apresentar resultados contrários com as

mesmas condições de cultivo (COSTA et al., 2007).

A micropropagação é realizada em quatro fases, que se inicia com o estabelecimento

da cultura in vitro, seguida pela fase multiplicação in vitro, enraizamento in vitro ou ex vitro e

aclimatização (SILVA, 2013). Nas duas primeiras fases, os explantes são cultivados

obrigatoriamente em meios de cultivo. Os componentes destes meios são em sua grande

maioria, sais minerais (macronutrientes N, P, K S, Ca, Mg), micronutrientes (Fe, Mn, Zn, B,

Cl, Mb, Co ), açúcares ( sacarose, glicose ou frutose), vitaminas e aminoácidos (tiamina,

niacina, piridoxina, glicina), Inositol, fiotohormônios (auxinas, citocininas, giberilinas, entre

outros que raramente são utilizados, ou então são produzidos pelos explantes), (PASQUAL et

al.,1998; TOMBOLATO; COSTA, 1998; CID; TEIXEIRA, 2010).

Existe uma grande quantidade de formulações de meios básicos, as quais são utilizadas

na micropropagação in vitro, podendo-se citar: O meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962),

em suas mais diversas concentrações e combinações tem sido utilizados em inúmeras espécies

com sucesso (CENTOFANTE et al., 2009); O meio WPM (LLOYD; MCCOWN, 1980) em

que as espécies lenhosas são cultivadas (PASQUAL, 2001), QL (QUOIRIN; LEPOIVRE,

1977), entre outros. O meio MS o mais amplamente utilizado no cultivo in vitro (SANTOS-

SEREJO et al., 2006). Os meios podem ser de consistência semissólida ou liquida (GUERRA;

NODARI, 2006), onde o processo de solidificação se dá pela adição de agentes geleificantes

(polímeros). A maioria dos cultivos são realizados com uso de meios de cultura semissólidos,

utilizando o ágar ou o phytagel como agentes geleificante do meio (MACEDO et al., 2003;

PEDROSO et al., 2001).

O ágar é um polissacarídeo de alto peso molecular, geleificante mais utilizado por

oferecer boas características, uma vez que apresenta um bom suporte para as plântulas, por ser

estável, com alta claridade, natureza atóxica e resistência aos metabólitos da cultura

(MCLACHLAN, 1985). Apesar destas vantagens, o ágar é um dos componentes mais caros

para a cultura de tecidos de plantas, desta forma a substituição desse componente por um

geleificante alternativo reduziria os custos com a técnica do cultivo in vitro (FARIA et al.,

2006).

Scholten e Pierik (1998), afirmam que o ágar é um agente solidificante que pode afetar

o crescimento e o desenvolvimento das culturas in vitro. Trabalhos realizados por Erig et al.

(2004), Costa et al. (2007) e Pereira et al., (2012) apresentam resultados da viabilidade do

18

uso de agentes de baixo custo, como a utilização de alguns amidos ou gomas vegetais para a

substituição do ágar. Para Erig et al., (2004); Ferri et al., (1998); Fortes et al., (1994) e Pereira

et al., (2003), podem ser citadas como vantagens destes polímeros, o baixo custo e a

facilidade de se encontrar no mercado quando comparados com o ágar, bem como um forte

aliado para maior eficiência econômica dos laboratórios.

Para Maciel (2011), os meios líquidos são ideais na micropropagação, por evitarem o

emprego de agentes geleificantes do meio de cultura. Com o uso de meios de cultura líquidos

se consegue uma boa eficiência para a micropropagação de várias cultura, como o abacaxi

(ESCALONA et al., 1999; FEUSER et al., 2001) e a cana-de-açúcar (LORENZO et al.,

1998). Trazendo como vantagens o rápido preparo, redução dos custos e maior difusão dos

componentes do meio (SIQUEIRA et al., 2013).

Estudando o emprego de meios alternativos, Guerra (1999), observou que os melhores

resultados foram obtidos quando utilizou meio líquido estacionário com ponte de papel filtro

na micropropagação de abacaxizeiro. Pereira (2003) relata que no estabelecimento de

protocolo para micropopropagação de Solanum tuberosum L. os meios de consistência

líquida, proporcionaram um significativo aumento na taxa de multiplicação (PEREIRA,

2003). Para Siqueira et al. (2013) isso se deve à maior facilidade de absorção dos nutrientes e

reguladores de crescimento, além da maior relação entre o explante e o meio. A alteração do

estado físico do meio de cultura modifica a resistência física e de contato dos explantes com o

meio, podendo influenciar no desenvolvimento de plântulas in vitro (CHEN; ZIV, 2001).

2.3 Uso da Luz Natural

No cultivo in vitro tradicional os explantes são cultivados em salas de crescimento,

onde estes são mantidos em regime de luz artificial, em sua maioria por um fotoperíodo de

16h de luz dia, seguido de 8h escuro, com temperatura constante de 25ºC ± 2, mantidas por

aparelhos de ar-condicionado, um ambiente totalmente climatizado.

Kodym e Zapata-Arias, (1999) afirmam que em 90% dos trabalhos científicos as

lâmpada fluorescentes brancas-frias são citadas como a principal fonte de luz utilizada na sala

de crescimento. Sendo que a iluminação é responsável por, aproximadamente, 65% do total

dos gastos de energia elétrica utilizada no laboratório de micropropagação, enquanto que,

25% são gastos com refrigeração, e o restante (10%) com esterilização, aquecimento, entre

outras, fazendo com que ocorra um elevado consumo de energia, isto por causa do emprego

19

de equipamentos sofisticados na manutenção das condições ambientais (STANDAERT DE

METSENAERE, 1991; KOZAI et al., 2003).

Para que esse método de propagação se torne viável, é necessário reduzir o elevado

custo de funcionamento e manutenção das salas de crescimento (BRAGA, et al., 2009; ERIG;

SCHUCH, 2005). Em meio às alternativas para diminuição dos gastos com energia elétrica na

produção de plantas in vitro, Kodym e Zapata-Arias (1999, 2001); Sendin (2001); Rocha

(2005), citam como um dos itens mais importantes, a substituição das salas de crescimento

pelo uso de luz natural, associado ou não a redução e ou eliminação da sacarose.

Para Costa (2009) além da substituição das lâmpadas fluorescentes pela luz natural se

apresentar como uma saída para redução dos custos na produção de plantas cultivadas in vitro,

o uso da luz natural oferece condições ambientais tanto de temperatura quanto de irradiância

semelhantes ao ambiente ex vitro, diminuindo assim o estresse e a morte das plantas na

aclimatização, por gerar melhorias anatômicas.

Borges et al.(2011), trabalhando na micropropagação de crisântemo com o sistema de

luz natural e artificial em diferentes concentrações de meio de cultivo, obtiveram os melhores

resultados para número de folhas, brotos e raízes e também para comprimento de parte aérea

com as plântulas cultivada in vitro no uso de luz natural, quando comparados aos dados no

cultivo com uso de luz artificial.

Fato também comprovado por Kodym e Zapata-Arias (1999) onde obtiveram maior

número de brotações de Musa sp. em casa de vegetação sob luz natural quando comparado

com sala de crescimento. Resultados semelhantes foram obtidos por Dignart (2009) no cultivo

in vitro de Cattleya sp. em casa de vegetação.

Silva et al. (2008), constataram que a perda de água em plântulas de abacaxizeiro

(Ananas comosus L. Merr), foi maior quando retiradas dos recipientes, advindas do sistema

convencional quando comparado com as planta cultivadas in vitro sob o regime de luz natural

após serem retiradas do recipiente, sendo que as plantas micropropagadas sob a luz natural

após duas horas apresentavam 18% de água a mais. Os autores afirmam que, o emprego de

luz natural, durante a fase de enraizamento in vitro, proporciona melhor desempenho

agronômico e anatômico das plantas de abacaxizeiro durante a fase de aclimatização.

Algumas são as vantagens apresentadas pelo uso da luz natural relatados por Kodym e

Zapata-Arias (1999); Zobayed et al. (2001); Afreen et al. (2002); Kozai et al. (2003) tais

como; eliminação dos gastos com luz artificial; redução dos custos de manutenção; aumento

do crescimento das plantas; melhoria das características fisiológicas da planta, devido às

condições ambientais de cultivo serem mais naturais, redução do estresse da planta durante a

20

aclimatização, aumentando assim a sobrevivência das mudas; possibilidade de utilização de

instalações simplificadas reduzindo os custos das construções.

Contudo Erig e Schuch (2005), chamam a atenção para o fato de que a disponibilidade

de luz varia com a intensidade do sol, pois a irradiância não é mesma nas diferentes estações

do ano, dependendo essa intensidade luminosa das condições climáticas apresentada durante

cada dia. Ainda segundo estes autores existem fortes razões para que seja realizadas mais

pesquisas e implementação no Brasil, principalmente pela grande disponibilidade de luz

natural ao longo do ano. Este é um dos fatores que devem ser levados em consideração na

escolha pelo uso ou não da luz natural, entretanto para Kodym e Zapata-Arias (1999), devem

ser levado em considerações também a espécie a ser micropropagada, a técnica in vitro

utilizada (heterotrófica, fotomixotrófica ou fotoautotrófica) e o meio de cultivo a ser utilizado

(BORGES et al., 2011).

2.4 Enraizamento e Desenvolvimento

Para Berilli (2010), outro fator que vem sendo bastante discutido no meio científico da

micropropagação é o enraizamento in vitro e ex vitro. Silva (2007), afirma que para se obter

uma alta taxa de sobrevivência na aclimatização, é necessário que as plantas produzam novas

raízes em substratos, e que estes substratos ofereçam adequadas condições tanto físicas quanto

nutricionais. O completo e bom desenvolvimento do sistema radicular acarreta na diminuição

de perdas durante a aclimatização, pelo fato de que as mudas irão ser mais vigorosas

(DAMIANI; SCHUCH, 2009).

Mohammed e Vidaver (1990); Klerk et al. (1997), entre outro autores, afirmam que

uma etapa chave no cultivo in vitro é a formação de raízes adventícias, onde um maior

número de brotos enraizados, com raízes de qualidade representa um eficiente sistema de

enraizamento, onde este bom desenvolvimento é constatado pelas variáveis: número e

comprimentos de raízes, ausência de calos e por apresentar uma boa eficiência após seu

plantio em solo.

Em seu trabalho com enraizamento de porta-enxertos de Prunus, Rocha (2006),

destaca que para a indução de raízes in vitro, geralmente, os meios de cultura são acrescidos

de diferentes tipos e concentrações de auxinas, sendo estas, as variáveis que mais influenciam

no sucesso do enraizamento.

21

Para Aldrufeu (1987), a fase de enraizamento in vitro em meio geleificado como ágar

pode produzir raízes não funcionais. Skrebsky et al. (2006), chamam a atenção para um fator

importante envolvido na aclimatização ex vitro que é o substrato utilizado na propagação das

mudas, onde estes podem contribuir ou impedir no crescimento das mesmas de acordo com as

propriedades físico-químicas do meio utilizado.

Para Rocha et al. (2006), a constituição do meio de enraizamento pode afetar

diretamente a o seu desenvolvimento, apesar do ágar ser utilizado na maioria dos meios de

cultivo in vitro, tanto na multiplicação quanto no enraizamento, se tem observado que os

sistemas radiculares das brotações de frutíferas lenhosas formados nestes meios é quebradiço

e sem pelos radiculares.

Segundo Leite et al. (2002), no processo de enraizamento in vitro podem ser utilizados

na substituição do ágar substratos inertes, a exemplo da vermiculita embebida em meio de

cultura líquido, a qual pode ser uma alternativa mais barata do que o ágar. O uso de

substâncias inertes que funcionem como suporte para os brotos também foram testadas com

sucesso como no trabalho realizado por Faria et al. (2006), os autores selecionaram a espuma

de poliuretano como substituto ao ágar no meio de cultura para o crescimento in vitro da

Oncidium baueri Lindl.

2.5 Aclimatização

Por produzir mudas de alta qualidade, livre de patógenos e pragas, a cultura de tecidos

é um método de propagação muito almejado. Depois de produzida no laboratório, estas mudas

podem ser transportadas e levadas ao campo, porém, antes de chegar ao campo, estas

precisam passar por um período de aclimatização. A transferência de plântulas produzidas sob

condições controladas, para um ambiente sob condições naturais, deve ser progressiva

evitando estresses (SILVA et al., 1995), visto que transferir o material de ambiente protegido,

estéril, com açúcares e com umidade saturada, para ambiente não-estéril, sem açúcares e com

reduzida umidade, tem como consequência à morte de plantas, reduzida taxa de crescimento e

aumento no tempo para que estas plantas possam ser transplantadas (SOUZA JÚNIOR et al.,

2001).

A aclimatização de mudas é o processo pelo qual as plantas produzidas em laboratório

são transferidas para um ambiente com as condições climáticas naturais, havendo a passagem

gradual da planta da condição in vitro para a casa de vegetação, de maneira a minimizar os

22

impactos decorrentes da mudança brusca de ambiente (MOREIRA et al., 2006; PEREIRA et

al., 2005). A aclimatização representa a fase seguinte do processo de adaptação que ocorre,

essencialmente, em ambiente natural, também referida por alguns autores por enviveiramento

(GUERRA; NODARI, 2006).

Durante este processo, as microplantas irão passar por mudanças súbitas nas condições

ambientais, já que serão transferidas de um ambiente in vitro para o meio externo. Assim as

microplantas precisarão desenvolver mecanismos de controle de transpiração e condutância

estomática (DÍAZ-PEREZ et al., 1995), ativar os mecanismos de controle de perda de água

pelas células (SUTTER, 1988) e aumentar a taxa fotossintética em condições de atmosfera

mais rica em CO2 (VANTELGEN et al., 1992). Esse processo é crítico, pois a plântula passa

para um novo ambiente, onde ocorre déficit hídrico, ha mudança de estado heterotrófico para

autotrófico, a disponibilidade dos nutrientes será alteradas, e a planta estará sujeita a ataques

de patógenos (GRATAPAGLIA; MACHADO, 1990).

Assim, em função das alterações na morfologia e fisiologia induzidas durante a

micropropagação onde é reduzida a capacidade dessas plantas em suprir a necessidade de

energia e carbono por meio da fotossíntese e de manter um balanço hídrico favorável, a

aclimatização se faz necessária (ALBERT, 2004). No entanto uma das possibilidades de

redução de custos na produção de mudas micropropagadas é a diminuição do período de

aclimatização das mudas. Pois, quanto maior o período de aclimatização, maiores são os

custos com mão-de-obra, irrigação e adubação (MELLO et al., 2000).

2.6 Descontaminação

Um bom resultado no cultivo in vitro é consequência do sucesso das fases deste

processo, sendo que os resultados positivos desta fases estão ligados entre si, pois o

desempenho da etapa posterior esta relacionada com a etapa anterior (GEORGE 1993). O

estabelecimento in vitro é a primeira fase do processo de micropropagação, este tem inicio na

seleção da parte da planta que será utilizado como explante (ERIG; SCHUCH, 2003), onde o

sucesso desta fase depende da eficácia da descontaminação do explante que será introduzido

no meio de cultura

Para Erig e Schuch (2003), nesta fase inicial de microporpagação, a contaminação

pode levar a grandes perdas. Souza et al,. (2006) afirma que quando essa contaminação é

23

exógena é possível a controlar sem que ocorra maiores problemas, enquanto que a

contaminação endógena pode trazer grandes prejuízos financeiros e genético.

Visando anular ou minimizar a contaminação Erig e Schuch (2003), ressaltam que a

planta matriz deve passar por pré-tratamentos como aplicação de fungicidas e bactericidas.

Incialmente as planta devem ser mantida em ambientes protegidos como m casa de vegetação

ou câmara de crescimento, que evitam danos causados por fatores bióticos ou abióticos e,

posteriormente ataques de fungos e bactérias (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).

Entre os principais problemas ocasionados pela contaminação, pode se destacar a

competição dos microrganismos pelos nutrientes com explantes, eliminação no meio de

cultivo de compostos tóxicos aos tecidos e ainda colonização dos tecidos impedindo o seu

desenvolvimento (MONTARROYOS, 2000).

Inúmeras são as soluções para desinfecção e descontaminação dos explnates (ERIG;

SCHUCH, 2003). Gattapaglia e Machado (1998) ressaltam a mais utilizadas como, o álcool e

soluções a base de cloro, como exemplo, o hipoclorito de sódio e o hipoclorito de cálcio,

sendo o hipoclorito de sódio o mais utilizado em laboratórios de cultura de tecidos, pela

facilidade de ser encontrado no mercado.

Montarroyos (2000) afirma que as combinações dos princípios ativos podem variar e,

segundo Erig e Schuch (2003) devendo ocorrer uma adequação de acordo com cada espécie e

cada tecido vegetal a ser utilizado como explante. Além do agente descontaminante, deve-se

levar em consideração a concentração do mesmo e tempo que o material vegetal irá ficar

exposto a tal agente.

Alves et al,. (2013) no cultivo de palma (Opuntia atropes Rose e Nopalea

cochenillifera Salm Dyck) utilizou as seguintes combinações. hipoclorito de sódio 1% + 10

gotas de Tween® 20, por 15 minutos e hipoclorito de sódio 1% + cloreto de mercúrio 0,2%;

por 10 minutos.

Vasconcelos et al., (2007), utilizaram álcool etílico a 70%, durante um minuto e, em

seguida, com hipoclorito de sódio a 2%, durante 10 minutos para desifestação da Nopalea

cochenillifera Salm Dyck , obtendo apenas 10% de contaminação. Paz e Silveira (20013

aplicaram diferentes doses e tempos de imersão em álcool, hipoclorito de sódio e fungicidas,

mesmo assim não conseguiriam minimizar a contaminação, ocasionando altos índices de

oxidação.

Essa oxidação é decorrente da liberação de compostos fenólicos, precursores da

síntese de lignina, pelo tecido injuriado. Esse acúmulo de polifenóis e produtos de oxidação,

como melanina, suberina, lignina, cutina e calose em torno da superfície excisada, modificam

24

a composição do meio de cultivo e a absorção de metabólitos (ANDRADE et al., 2000).

SATO et al. (2001), afirmam que esses compostos fenólicos são oxidados pelas enzimas

polifenases, produzindo substâncias tóxicas, inibindo o crescimento dos explantes, podendo

causar sua morte, além de escurecer o meio de cultura.

REFERÊNCIAS

AFREEN, F.; ZOBAYED, S. M. A.; KOZAI, T. Photoautotrophic culture of Coffea arabusta

somatic embryos: photosynthetic ability and growth of different stage embryos. Annals of

Botany, London, v.90, p.11-19, 2002.

ALBERT, L. H. B. Aspectos morfo-anatômicos de mudas de abacaxizeiro “Smooth

Cayenne” micropropagadas. 2004. 54f. Tese (Doutorado em Fitotecnia) – Lavras – MG,

Universidade Federal de Lavras – UFL. 2004.

ALDRUFEU, A. Rooting and acclimatization of Pelargonium zonale plantlets. Acta

Horticulturae, v.212, p.: 361 – 366, 1987.

ANDRADE, M. W.; LUZ, J. M. Q.; LACERDA, A. S.; ANDRADE, P. R. Micropropagação

da aroeira (Myracroduon urundeuva Fr. All.). Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v.24, n.1,

p.174-180, 2000.

BERILLI, S. S.; Aclimatação de mudas micropropagadas e caracterização fisico-química

e sensorial de frutos de abacaxi. 2010. 126f. Tese (Doutorado em Produção Vegetal) -

Universidade Estadual do Norte Fluminense - Darcy Ribeiro – Campos dos Goytacazes – Rio

de Janeiro. 2010.

BIANCHINI, F.; PANTANO, A.C. Tudo verde. Guia de Plantas e Flores. São Paulo:

Melhoramentos, 1991. 135 p.

BORGES, D. I.; OLIVEIRA. M. C.; PENONI, E. S.; PÁDUA, T. R. P.; BRAGA, F. T.;

PASQUAL, M. Micropropagação de crisântemo (Dendranthema grandiflora Tzevele cv.

25

Rage) sob luz natural e artificial em Diferentes concentrações do meio de cultivo. Plant Cell

Cult. Micropropag., Lavras, v.7, n.1, p. 9-16, 2011.

BORSOI, N.L.; Desinfecção de explantes e cultivo in vitro de Piretro da Dalmácia

(Chrysanthemum cinerariaefolium Vis. cv. Vacaria). Dissertação (Mestrado) - Escola

Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba-SP, 2009.

BRAGA, F. T.; PASQUAL, M.; CASTRO, E. M.; DIGNART, S. L.; BIAGIOTTI, G.;

PORTO, J. M. P. Qualidade de luz no cultivo in vitro de dendranthema grandiflorum cv.

Rage: características morfofisiológicas. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 33, n. 2, p. 502-

508, 2009.

BRAGA, F.T. Ambiente de cultivo na propagação in vitro de Crisântemo (Dendranthema

grandiflora TZVELEV CV. RAGE): características anatômicas e fisiológicas. 2006. Tese

(Doutorado em Agronomia) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2006.

CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E. Meios Nutritivos. In: Torres, A.C.;

Caldas, L.S.; Buso, J.A. (Eds.). Cultura de tecidos e transformação genética de plantas.

v.1. Brasília: Embrapa CENARGEN. 1998. p.87-132.

CAMPOS, D. M. Orquídeas: Micropropagação e quimioterapia de meristemas. Ed.

Expressão e Cultura, Rio de Janeiro, 2002, 112p.

CAVALCANTI, V. A. L. B.; SENA, R. C.; COUTINHO J. L. B.; ARRUDA, G. P.;

RODRIGUES, F. B.. Controle das cochonilhas da palma forrageira. Boletim IPA Responde,

n.39, p.1-2, 2001.

CENTOFANTE, A. R.; CASTRO, E. M.; ABBADE, L. C.; PAIVA, R.; CENTOFANTE, E.

Germinação in vitro de sementes de Merremia tomentosa Hallier F.: Influência de meios de

cultura e GA3. Plant Cell Culture Micropropagation, v.5, n.2, p. 135-139, 2009.

CHEN, J.; ZIV, M. The effect of ancymidol on hyperhydricity, regeneration, starch and

antioxidant enzymatic activities in liquid-culture Narcissus. Plant Cell Reports, v. 20, n. 1, p.

22-27, 2001.

26

CHIACCHIO F.P.B.; MESQUITA A.S.; SANTOS JÚNIOR. Palma forrageira: uma

oportunidade econômica ainda desperdiçada para o semiárido baiano. Bahia Agrícola,

p.7:39-49, 2006.

CID, L.P.B; TEIXEIRA, J.B. Explante, meio nutritivo, luz e temperatura. In: CID, L.P.B

Cultivo in vitro de plantas. Brasilia: Embrapa Informação Tecnológica, 2010, 15-49.

COSTA, F. H. S.; PASQUAL, M.; ROCHA, H. S.; PEREIRA J. E. S.; CASTRO, E. M.;

MIYATA, L. Y. Crescimento e anatomia foliar de bananeiras submetidas a diferentes

condições de cultivo in vitro. Bragantia, Campinas, v.68, n.2, p.303-311, 2009.

COSTA; F. H. S.; PEREIRA, M. A. A.; OLIVEIRA, J.P.; JONNY EVERSON PEREIRA, J.

E. S. Efeito de agentes geleificantes alternativos no meio de cultura no cultivo in vitro de

abacaxizeiro e bananeira. Revista Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 31, n.1, p. 41-46,

2007.

COUTO, M. Propagação in vitro dos portaenxertos híbridos de pessegueiro ‘Barrier’ e

‘Cadman’ (Prunus sp.) 2003. 77f. Dissertação (Mestrado em Agronomia – Fruticultura de

Clima Temperado) – Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de

Pelotas, Pelotas.

DAMIANI, C. R.; SCHUCH, M. W. Diferentes substratos e ambientes no enraizamento in

vitro de mirtilo. Ciência Rural, Santa Maria, v. 39, n. 2, p.563-566, 2009.

DÍAZ-PÉREZ, J.C.; SUTTER; E.G.; SHACKEL, K.A. Acclimatization and subsequent gas-

exchange, water relations, survival and growth of microcultured apple plantlets after

transplanting them in soil. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 95, p. 225-232, 1995.

DIGNART, S. L.; CASTRO, E. M.; PASQUAL, M.; FERRONATO, A.; BRAGA, F. T.;

PAIVA, R. Luz natural e concentrações de sacarose no cultivo In vitro de Cattleya

walkeriana. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 33, n. 3, p. 780-787, 2009.

27

ERIG, A. C.; SCHUCH, M. W. In vitro rooting of quince cv. MC as rootstock for pear and

acclimatization of the rooted microcuttings. Ciência Rural, Santa Maria, v. 34, n.5, p.1443-

1449, 2004.

ERIG, A. C.; SCHUCH, M. W. Tipo de explante e controle da contaminação e oxidação no

estabelecimento in vitro de plantas de macieira (Malus domestica borkh.) Cvs. Galaxy,

Maxigala e Mastergala. Revista Brasileira Agrociência, v. 9, n. 3, p.221-227, 2003.

ERIG, A. C.; SCHUCH, M. W.; Micropropagação fotoautotrófica e uso da luz natural.

Ciência Rural, v.35, n.4, 2005.

ESCALONA, M.; LORENZO, J. C.; GONZALEZ, B. L.; DANQUITA, M.; GONZALES, J.

L.; DESJARDINS, Y.; BORROTO, C. G. Pineapple (Ananas comosus (L.) Merr.)

micropropagation in temporary immersion systems. Plant Cell Reports, v.18, p.743-748,

1999.

FARIA, R. T.; DALIO, R. J. D.; UNEMOTO, L. K.; SILVA, G. L. Propagação in vitro de

Oncidium baueri Lindl. (Orchidaceae) sem uso de ágar. Acta Sci. Agron. Maringá, v. 28, n.

1, p. 7174, 2006.

FERREIRA, A.W.C.; LIMA, M.I.S.; FARIA, R.T.; RIBEIRO, P.N.J.; CASALI, C.A.

Propagação in vitro de Baptistonia pubes (Lindl.) Chiron & V.P. Castro (Oncidium pubes

Lindl.) (Orchidaceae). Acta Botânica Brasílica, Belo Horizonte. v. 24, n.3, p.: 636-639,

2010.

FERRI, V.C.; CENTELLAS, A.Q.; HELBIG, V.E. FORTES, G.R.L. Uso de ágar, amido e

ácido indolbutIlíco no enraizamento in vitro de porta-enxerto de macieira MM111. Ciência

Rural, Santa Maria, v.28, n. 4, p. 561-565, 1998.

FEUSER, S.; NODARI, R. O.; GUERRA, M. P. Eficiência comparativa dos sistemas de

cultura estacionária e imersão temporária para a micropropagação do abacaxi. Revista

Brasileira de Fruticultura, v.23, n.1, p.6-10, 2001.

28

FORTES, G.R.L.; CONCEIÇÃO, A.M.; ZANOL, G. Uso do amido comercial como meio

solidificante para enraizamento in vitro de morangueiro (Fragaria x ananassa). In:

CONGRESSO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 13., 1994, Salvador. Anais... Salvador:

Associação Brasileira de Fruticultura, 1994. p. 1113-1114.

FRÁGUAS, C. B.; PASQUAL, M.; DUTRA, L. F.; CHAGAS, E. A. Desenvolvimento in

vitro de plântulas de bromélias: sacarose e concentrações do meio MS. Revista Científica

Rural, Bagé, v. 7, n.2, p.55-63, 2002.

FRANÇA, C.A.M.; MAIA, M.B.R.; Panorama do agronegócio de flores e plantas

ornamentais no Brasil. In: CONGRESSO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ECONOMIA

ADMINISTRAÇÃO E SOCIOLOGIA RURAL, 46., 2008, Rio Branco. Anais... Rio Branco:

SOBER, 2008. p. 761-700.

GEORGE, E. F. Plant propagation by tissue culture. 3.ed. Edington: Exegetics, 2008. 479p.

GEORGE, E.F. Plant propagation by tissue culture: The Technology. 2 ed. London:

Exegetics, p.98-165, 1993.

GRATAPAGLIA, D.; MACHADO, M.A. Micropropagação. In: TORRES, A.L.; CALDAS,

L.S. Técnicas e Aplicações da Cultura de Tecidos de Plantas. Brasilia:

ABCTP/EMBRAPA - CNPH, 1990, 89 - 164 p.

GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A.C.;

CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas.

Brasília: SPI /Embrapa - CNPH, v.1, 1998. p.183-260.

GUERRA, M. P.; DAL-VESCO, L. L.; PESCADOR, R.; SCHUELTER, A. R.; NODARI, R.

O. Estabelecimento de um protocolo regenerativo para a micropropagação do abacaxizeiro.

Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.34, p. 1557-1563, 1999.

GUERRA, M. P.; NODARI, R. O. (2006) Material didático de apoio à disciplina de

Biotecnologia. Disponível em: http://www.cca.ufsc.br/lfdgv/Apostila.htm. Acesso em:

27/06/2014.

29

JUNGHANS, T. G.; SOUZA, A. S.; SANTOS-SEREJO, J. A.; SOUZA, F. V. D. Redução de

custos na micropropagação. In: Jughans, T. G.; Souza, A. S. (eds.) Aspectos práticos da

micropropagação de plantas. Cruz das Almas: Embrapa MFT, 2009. p.153-175.

KLERK, G. J.; BRUGGE, J. T.; MARINOVA, S. Effectiveness of indoleacetic acid,

indolebutyric acid and naphthaleneacetic acid during adventitious root formation in vitro in

Malus “Jork 9”. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v. 49: p. 39-44. 1997.

KODYM, A.; ZAPATA-ARIAS, F. J. Low-cost alternatives for the micropropagation of

banana. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, The Hague, v.66, p.67-71, 2001.

KODYM, A.; ZAPATA-ARIAS, F. J. Natural light as an alternative light source for the in

vitro culture of banana (Musa acuminata cv. ‘Grande Naine’). Plant Cell, Tissue and Organ

Culture, The Hague, v.55, p.141-145, 1999.

KOZAI, T.; NGUYEN, Q. T. Photoautotrophic micropropagation of woody and tropical

plants. In: JAIN, S. M.; ISHII, K. Micropropagation of woody trees and fruits. Dordrecht:

Kluwer Academic, 2003. p.757-781.

LEDERMAN, I. Produção de frutos de palma. In. MENEZES, R. S. C.; SIMÕES, D. A.;

SAMPAIO, E. V. S. B. (Eds.). A palma no nordeste do Brasil: conhecimento atual e novas

perspectivas de uso. Recife: UFPE, 2005. p. 177-197.

LEITE, G. B.; FINARDI, N.; FORTES, G. R. L. Uso de vermiculita como substrato e efeito

da luz no enraizamento in vitro da pereira, cv. Bartlett e do clone OHxF97. Ciência e

Agrotecnologia, Lavras, v. 26, n. 5, p. 997-982, 2002.

LLAMOCA-ZÁRATE, R. M.; PAREDES-LÓPEZ, O. Whole Plant Regeneration from the

Shoot Apical Meristem of Opuntia ficus-indica Mill. (Cactaceae). J. Apll. Bot-Angewandte

Botanik, Berlin, v.73, p.83-85, 1999.

LLOYD, G.; McCOWN, B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel,

Kalmia latifólia, by use of shoot-tip culture. Combined Proceedings International Plant

Propagators Society, v.30, p.421-427, 1980.

30

LOPES, E. B.; SANTOS, D. C.; VASCONCELOS, M. F. Cultivo da palma forrageira In:

LOPES, E. B. (Ed.). Palma forrageira: cultivo, uso atual e perspectivas de utilização no

semiárido nordestino. João Pessoa: EMEPA-PB, 2012. p. 21-60.

LORENZO, J. C.; GONZALEZ, B. L.; ESCALONA, M.; TEISSON, C.; ESPINOSA, P.;

BORROTO, C. Sugarcane shoot formation in an improved temporary immersion system.

Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v.54, p.197-200, 1998.

MACEDO, C. E. C.; SILVA, M. G.; NOBREGA, F. S.; MARTINS, C. P.; BARROSO, P. A.

V.; ALLOUFA, M. A. I. Concentrações de ANA e BAP na micropropagação de abacaxizeiro

L. Merril (Ananas comosus) e no cultivo hidropônico das plântulas obtidas in vitro. Revista

Brasileira de Fruticultura, Cruz das Almas, v. 25, n. 3, p. 501-504, 2003.

MACIEL, A.L.R. Micropropação do cafeeiro por embriogênese somática via biorreator

de imersão temporária. 115f. Tese (Doutorado em Agronomia / Fitotecnia) – Universidade

Federal de Lavras, Lavras, 2011.

MAIA NETO, A. L. Cultivo e utilização da palma forrageira (Opuntia ficus-indica Mill. e

Nopalea cochenillifera Salm Dyck) para produção de leite no semi-árido nordestino.

2000. 40f. (Graduação em Medicina Veterinária) - Universidade Federal da Bahia/Escola de

Medicina Veterinária/ Departamento de Produção Animal - Salvador. 2000.

MCLACHLAN, J. MACROALGAE (seaweeds): Industrial resources and their utilization.

Plant and Soil, v.89, n.1-3, p.137- 157, 1985.

MELLO, M.O.; AMARAL, A.F.C.; MELO, M. Quantificação da micropropagação de

Curcuma zedoaria Roscoe. Scientia Agricola, v.57, p.703-707, 2000.

MELO, A.A.S., FERREIRA, M.A.; VERÁS,A.S.C.; LIRA, M.A.; LIMA, L.E.;

VILELA,M.S.; MELO,E.O.S.; ARAÚJO, P.R.B. Substituição parcial do farelo de soja por

uréia e palma forrageira em dietas para vacas em lactação. Digestibilidade. Acta

Scientiarum. Animal Sciences, v.25 n.2, p.339-345, 2003.

31

MOHAMMED, G. H.; VIDAVER, W. E. The influence of acclimatization treatment and

plantlet morphology on early greenhouse performance of tissue-cultured Douglas fir

(Pseudotsuga menziessi (Mirb.) Franco). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v.21, p.

111-117, 1990.

MONTARROYOS, A. V. V. Contaminação in vitro. Associação Brasileira de Cultura de

Tecidos de Plantas Notícias. Brasília, n.36 e 37, p.5-10, 2000.

MOREIRA, M. A.; CARVALHO, J. G.; PASQUAL, M.; FRÁGUAS, C. B.; SILVA, A. B.

Efeito de substratos na aclimatização de mudas micropropagadas de abacaxizeiro cv. Pérola,

Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 30, n. 5, p. 875-879, 2006.

MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid grow and biossays with te bacco

tissue cultures. Physiologia plantarum, Copenhagem, v.15, p.473-97, 1962.

OLIVEIRA FT, SILVA JS, SILVA RP, ANDRADE-FILHO FC, PEREIRA-JUNIOR EB.

Palma forrageira: Adaptação e importância para os ecossistemas áridos e semiáridos. Revista

Verde de Agroecologia e Desenvolvimento Sustentável, Mossoró. v. 5, n.,4, p. 27-37, 2010.

PASQUAL, M. Introdução: fundamentos básicos. Lavras: FAEPE, 2001. 97 p.

PASQUAL, M.; HOFFMANN, A.; RAMOS, J.D. Cultura de tecidos vegetais: tecnologia

e aplicações; introdução; fundamentos básicos. UFLA/FAEPE. Lavras. 159 p.1998.

PASQUALI, G.; ZANETTINI, M.H.B. Transgênese florestal. In: BORÉM, A. Biotecnologia

florestal. Viçosa, MG: UFV, p.317-334. 2007.

PEDROSO, R. P.; SILVEIRA, D. G.; SILVA, S. O. Concentração de BAP e a eficiência de

micropropagação de bananeira tetraplóide (Grupo AAAB). Scientia Agrícola, Piracicaba, v.

58, n. 1, p. 73-78, 2001.

PEREIRA, E.; MATTOS, M.; FORTES, G. Identificação e controle com antibióticos de

bactérias endofíticas contaminantes e explantes de batata micropropagados. Pesquisa

Agropecuária Brasileira. v.38, p. 827-834, 2003.

32

PEREIRA, M. C. T.; NIETSCHE, S.; FRANÇA, A. C.; NUNES, C. F.; LIMA, C.;

GONÇALVES, V. D.; SALLES, B. P.; MORAIS, D. L. B.; KOBAYASHI, M. K.

aclimatização de mudas micropropagadas de bananeira sob diferentes condições de

luminosidade. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v. 27, n. 2, p. 238-240, 2005.

PEREIRA, W.J.; SILVA FILHO, R.R.; PEREIRA JUNIOR, M.A; BATISTA, K.A;

FERNANDES, K.F. Uso de goma de cajueiro em substituição ao ágar em meio de cultura.

Revista de Biotecnologia & Ciência, v. 2, n. 1, 2012.

QUOIRIN, M.; LEPOIVRE, P. Etude de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus.

Acta Horticulturae, v.78, p.437-442, 1977.

REYES-AGUERO, J.A.; AGUIRRE-RIVERA, J.R.; HERNÁNDEZ, H.M. Notas sisteméticas

y descripción detallada de Opuntia ficus-indica (L) Mill. (Cactáceae). Agrociencia, v. 39, n.

4, p. 395-408, 2005.

ROCHA, H. S. Luz e sacarose na micropropagação da bananeira“Prata Anã”: alterações

morfoanatômicas. 2005. 98f. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia), Universidade Federal de

Lavras, Lavras, 2005.

ROCHA, P. S. G., FACHINELLO, J. C.; SCHUCH, M. W.; BIANCHI, V. J. CAMPOS, R.

V. Efeito do ágar, vermiculita e sacarose no enraizamento do porta-enxerto cv. Mr. S. 2/5 in

vitro. Revista Cientifica Rural, Bagé, v. 11, n.1, p. 54-59, 2006.

ROCHA, P. S. R. Propagação in vitro de porta-enxertos de Prunus ssp. 2006, 101p. Tese

(Doutorado em Fruticultura de Clima Temperado) – Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel.

Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2006.

SÁENZ C, BERGER H, GARCÍA JC, GALLETTI L, CORTÁZAR VG, HIGUERA I,

MONDRAGÓN C, RODRÍGUEZ-FÉLIX A, SEPÚLVEDA E, VARNERO MT Utilización

agroindustrial del nopal. Boletín de servicios agrícolas de la FAO 162, Roma, 2006.

33

SAMPAIO, E.V.S.B. Fisiologia da palma. In: MENEZES R.S.C.; SIMÕES D.A, SAMPAIO

E.V.S.B. (eds). A palma no Nordeste do Brasil: conhecimento atual e novas perspectivas

de uso. Recife: Editora Universitária da UFPE, p.43-55, 2005.

SANTOS, D.C.; FARIAS, I.; LIRA, M. A.; SANTOS, M. V. F.; ARRUDA, G. P.; COELHO,

R. S. B.; DIAS, F. M. MELO, J. N. Manejo e utilização da palma forrageira (Opuntia e

Nopalea) em Pernambuco. Recife: Instituto Agronômico de Pernambuco (Documentos, 30),

48p. 2006.

SANTOS, D.C.; FARIAS, I.; LIRA, M.A.; TAVARES FILHO, J. J.; SANTOS, M. V. F.;

ARRUDA, G. P. A palma forrageira (Opuntia ficus-indica Mill e Nopalea cochenillifera

Salm-Dyck) em Pernambuco: cultivo e utilização. Recife: IPA (Documentos IPA, 25),

1997. 23p.

SANTOS-SEREJO, J. A.; JUNGHANS, T. G.; SOARES, T. L.; SILVA, K. M. Meios

nutritivos para a micropropagação de plantas. In: SOUZA, A. S.; JUNGHANS, T. G. (eds.)

Introdução à micropropagação de plantas. Cruz das Almas, BA; Embrapa MFT, 2006.

p.79-98.

SARTORETTO, M.L.; SALDANHA, C.W.; CORDER, M.P.M. Transformação genética:

estratégias e aplicações para o melhoramento genético de espécies florestais. Ciência Rural,

Santa Maria, v.38, n.3, p.861-871, 2008.

SATO, A. Y.; DIAS, H. C. T.; ANDRADE, L. A.; SOUZA, V. C . Micropropagação de Celtis

sp.: controle da contaminação e oxidação. Cerne, Lavras, v.7, n.2, p.117-123, 2001.

SCHOLTEN, H.J.; PIERIK, R. L. M. Agar as a gelling agent: diferential biological effects in

vitro. Scientia Horticulturae, Amsterdam, v.77, n.1-2, p.109-116, 1998.

SENDIN, A. P. P. M. Micropropagação de bananeira dos cultivares Maçã e Grande

Naine visando a produção de mudas de baixo custo. 2001.72f. Dissertação (Mestrado em

Genética e Melhoramento de Plantas) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz,

Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2001.

34

SILVA, A. B.; PASQUAL, M.; CASTRO, E. M.; MIYATA, L. Y.; MELO, L. A.; BRAGA,

F. T. Luz natural na micropropagação do abacaxizeiro (Ananas comosus l. Merr).

Interciência,v. 33, n. 11. 2008.

SILVA, A.T.; PASQUAL, M.; ISHIDA, J. S.; ANTUNES, L. E. C. Aclimatização de plantas

provenientes da cultura in vitro. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 30, n. 1, p.

48-53.1995.

SILVA, C. G.; DEBIASI, C.; PESCADOR, R. Enraizamento in vitro e aclimatização de

mudas micropropagadas de Aloe vera L. Revista Brasileira de Plantas Medicinais,

Botucatu, v.9, n.1, p.29-35, 2007.

SILVA, I. M. C. Cultivo in vitro de Pyrus sp., cultivares Carrick, Cascatense e Ya-Li. 85

f. Tese (Doutorado em Fisiologia Vegetal) – Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2013.

SILVA, M. C. A.; TARSITANO, M.A.A.; BOLIANI, A. C. Análises técnica e econômica da

cultura da bananeira ‘Maçã’ (Musa spp.) na região noroeste do Estado de São Paulo. Revista

Brasileira de Fruticultura, v.27, p.139-142, 2005.

SIQUEIRA, D. L.; SANTOS, D.; SALOMÃO, L. C. C.; SILVA, F. F., BARROS, Z. J.

Micropropagação da bananeira ‘Maçã’, cultivada in vitro em diferentes volumes de meio

líquido. Revista Ceres, Viçosa, v. 60, n.6, p. 745-751, 2013.

SKREBSKY, E. C.; NICOLOSO, F. T.; MALDANER, J.; Substratos na aclimatização de

Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen produzida in vitro sob diferentes doses de sacarose.

Ciência Rural, Santa Maria, v.36, n.5, p.1416-1423, 2006.

SOUZA JÚNIOR, E.E.; BARBOZA, S.B.S.C.; SOUZA, L.A.C. Efeito de substratos e

recipientes na aclimatização de plântulas de abacaxizeiro Ananas comosus (L.) Merril cv.

pérola. Pesquisa Agropecuária Tropical, v.31, p.147-151, 2001.

35

SOUZA, A. S.; LEDO, C. A. S; SILVEIRA, D. G; SOUZA, F. V. D; FARIA, G. A; NETO,

H. P. S; SANTOS SEREJO, J. S; SILVA, K. M; COSTA, M. A. P. C; SOARES, T. L;

JUNGHANS, T. G; ALMEIDA. W. B. Introdução à micropropagação de plantas. Cruz das

Almas: Embrapa Mandioca e Fruticultura, 2006, 152p.

STANCATO, G. C; NÉRI, F. C. S; TAVARES, A. R; Micropropagação de violeta africana.

Revista Brasileira de Horticultura Ornamental, v.15, n, 2, p. 165-170, 2009.

STANDAERT DE METSENAERE, R. E. A. Economic considerations. In: DEBERGH, P.C.;

ZIMMERMAN, R. H. (eds). Micropropagation. 1991. p.131-140.

SUTTER, E. Stomatal and cuticular water loss from apple, cherry and sweetgum plants after

removal from in vitro culture. Journal of American Society for Horticultural Science,

Washington, v.113, n.2, p.234-238, 1988.

TAIZ L, ZEIGER E. Fisiologia Vegetal. 5ª Ed. Porto Alegre: Artmed, 2013.509p.

TERCEIRO NETO. C, P. C.; HERNANDEZ, F. F. F.; BEZERRA, SOUSA, F. C.; R. F.;

CAVALCANTI, M. L. F. Efeito de diferentes substratos na aclimatização “ex vitro” de mudas

de Violeta Africana (Saintpaulia ionantha Wendl). Revista de Biologia e Ciências da Terra.

Campina Grande v. 4, n. 2, 2004.

TOMBOLATO, A. F. C.; CASTRO, C. E. F.; MATTHEUS, L. A. F.; TAMADA, E. T.

Violeta africana. 4. ed. Campinas: Instituto Agronômico, 1987. (Boletim técnico, 200).

TOMBOLATO, A. F. C.; COSTA, A. M. M. Micropropagação de Plantas Ornamentais.

Boletim técnico 174. Campinas, IAC, 1998.

VANTELGEN, H.J.; VANMIL, A.; KUNNEMAN, B. Effect of propagation and rooting

condition on acclimatization of micropropagated plants. Acta Botanica Neerlandica,

Amsterdan, v.41, n.4, p.453-459, 1992.

VILLALOBOS, V. M.; THORPE, T. A. Micropropagación: concepto, metodología y

resultados. In: ROCA, W. M.; MROGISNKI, L. A. (ed.). Cultivo de tejidosenla

agricultura: fundamentos y aplicaciones. Cali: CIAT, 1991. cap.6, p.127-142.

36

VIOLETA AFRICANA, Flores e folhas. 2002. Disponível em:

http//www.jardimdeflores.com.br/floresefolhas/violetaafricana.html. Acesso em: 01/07/2014.

WANDERLEY, W. L.; FERREIRA, M. A.; ANDRADE, D. K. B.; VÉRAS, A. S. C.; LIMA,

L. E.; DIAS, A. M. A. Palma forrageira (Opuntia fícus indica Mill) em substituição à silagem

de sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench) na alimentação de vacas leiteiras. Revista

Brasileira de Zootecnia. v.31, n.1, p. 273-281, 2002.

WARUMBY, J. F.; ARRUDA FILHO, G.P.; CAVALCANTI, V. A. L. B. Pragas da palma.

In: MENEZES, R. S. C; SIMÕES, D. A.; SAMPAIO, E. V. S. B (Eds.). A palma no

Nordeste do Brasil. 1.ed. Recife: UFPE; Editora Universitária, 2005. p.65-80.

ZOBAYED, S. M.; AFREEN, F.; KOZAI, T. A. Physiology of Eucalyptus plantlets grown

photoautotrophically in a scaled-up vessel. In vitro. Cellular and Developmental Biology

Plant, New York, v.37, p.807-813, 2001.

37

CAPÍTULO II

ENRAIZAMENTO E DESENVOLVIMENTO IN VITRO E ACLIMATIZAÇÃO DE

BROTOS DE VIOLETA AFRICANA EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE

FÉCULA DE MANDIOCA E EM MEIO LÍQUIDO ESTACIONÁRIO

38

RESUMO: A violeta africana (Saintpaulia spp.) é umas das mais importantes plantas

ornamentais de cultivo em vaso devido a suas belas flores. Objetivou-se com este trabalho

avaliar o enraizamento e desenvolvimento in vitro de brotações de violeta africana utilizando

fécula de mandioca, como alternativa em substituição ao ágar, bem como a aclimatização

destas mudas, em meio líquido estacionário com pontes. O trabalho foi realizado no

laboratório de Biologia Celular e Cultura de Tecidos Vegetais e em casa de vegetação do

CCA/UFPB – Areia – PB. Os brotos de violetas foram oriundos de terceiro subcultivo, com

aproximadamente 0,5 cm contendo de duas a três folhas. Este capítulo foi dividido em dois

experimentos. Experimento 1: Os tratamentos foram constituído de meio MS + 20 g L-1 de

sacarose onde foram gelificados, T1 = 07 g L-1 de ágar (convencional / testemunha); T2 = 100

g L-1 de fécula de mandioca; T3 = 150 g L-1 de fécula de mandioca; T4 = 200 g L-1 de fécula

de mandioca. Foram feitas as seguintes avaliações: percentual de sobrevivência e de brotos

enraizados; número de folhas; número de raiz; comprimento da parte aérea e comprimento de

maior raiz. Para aclimatização foram utilizados vaso preto comercial com substrato

vermiculita + terra vegetal na proporção de 1:1, garrafas PET cortadas com aproximadamente

10 cm de altura, utilizadas como câmara úmida, as plantas permaneceram no laboratório por

uma semana, em seguida foram transferidas para casa de vegetação, onde permaneceram por

mais 43 dias sob tela com 50% de sombreamento. Utilizou-se DIC com quatro tratamentos e

cinco repetições com três brotos por pote para o enraizamento e três plantas por vaso na

aclimatização, e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade,

utilizando o software SAS 9.2. Experimento 2: Inicialmente, foram preparadas as “pontes”,

utilizando PVC e sobre estas, foram postos papel filtro e algodão para serem colocadas dentro

de recipientes para servirem de apoio aos explantes. As pontes de PVC foram cortadas com

auxílio de estilete, com tamanho de aproximadamente 5,5 x 5 cm, no centro de cada ponte, foi

feito um corte de 4 cm para a fixação do papel e um furo para fixar o algodão. Os tratamentos

utilizados constituíram-se de meio semissólido e líquido, o meio utilizado foi MS + 20 g.L -1

de sacarose, onde T1 = 07 g L-1 de ágar (convencional / testemunha); T2 = ponte de PVC com

Papel Filtro; T3 = ponte de PVC com Algodão. Os parâmetros avaliados foram os mesmos do

experimento anterior. Utilizou-se o DIC com três tratamentos, dez repetições de três brotos

por pote de cultivo. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias foram

comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando o software SAS 9.2. A

fécula de mandioca na concentração de 100 g L1 fécula pode substituir o ágar no meio de

cultura do cultivo in vitro de violeta sendo esta concentração a mais eficiente no enraizamento

39

e na aclimatização. A ponte de PVC com papel filtro pode ser utilizada no enraizamento da

violeta africana in vitro em meio íiquido.

Palavras-chave: Fécula, meio de cultura, aclimatização, enraizamento, PVC

ABSTRACT: The African violet (Saintipaulia spp.) is one of the more important ornamental

houseplants. The objective of this study was to evaluate the in vitro rooting and development

of sprouts of african violet using cassava starch as an alternative to replace agar as well as the

acclimatization of these seedlings, acclimatization liquid medium with bridges. The work was

performed at the Laboratory of Cell Biology and Plant Tissue Culture and at greenhouse

located in the CCA/UFPB - Areia - PB. The sprouts of violets were coming from the third

subculture, with approximately 0,5 cm containing two to three leaves. This chapter is divided

into two experiments. Experiment 1: The treatments consisted of MS medium + 20 g L-1

sucrose which were gelled, T1 = 0,7 g L-1 agar (conventional/control); T2 = 100 g L-1 of

cassava starch; T3 = 150 g L-1 of cassava starch; T4 = 200 g L-1 of cassava starch. Were

evaluated: percentage of survival and rooted sprouts; number of leaves; number of roots;

sprout length and length of the longest root. For acclimatization commercial black vase with

vermiculite + topsoil 1:1, PET bottles cut to approximately 10 cm in height, used as a moist

chamber, the plant remained in the laboratory for a week then were used were transferred to

greenhouse, where they remained for 43 more days under canvas with 50% shading. Was

used DIC with four treatments and five replications with three sprouts per pot for rooting and

three plants per pot during the acclimatization. The means were compared by Tukey test at

5% probability using SAS 9.2 software. Experiment 2: Initially, were prepared as "bridges"

using PVC and were placed filter paper and cotton in the containers to serve as a support for

the explants. The bridges PVC were cut with bistouries - sizes of approximately 5,5 x 5,0 cm

in the center of each bridge. A cut was made 4 cm for fixing the paper and a post hole pair

cotton. The treatments consisted of semi-solid and liquid medium. The medium was MS + 20

gL-1 sucrose, where T1 = 07 g L-1 agar (conventional/ control); T2 = bridge PVC with filter

paper; T3 = PVC with Cotton Bridge. The parameters evaluated were the same as in the

previous experiment. Was used a DIC with three treatments, ten repetitions and three sprouts

per growing pot. Data were subjected to analysis of variance and means were compared by

Tukey test at 5% probability using SAS 9.2 software. The cassava starch concentration of 100

g L-1 can replace starch in the agar culture medium cultivation in vitro of violet being the

40

most efficient concentration on rooting and acclimatization. The bridge PVC with filter paper

can be used in the in vitro rooting African violet in liquid medium.

Key words: Starch, medium, acclimatization, rooting, PVC

41

1. INTRODUÇÃO

A violeta africana (Saintpaulia spp.) é uma espécie que vem sendo cultivada no Brasil

há muito tempo, isto se deve ao fato de ser uma espécie delicada e o colorido das suas flores,

um atrativo. Sua origem se deu nas montanhas de Usambra, Leste da África, onde foi

encontrada pela primeira vez em 1892 pelo Barão Walter Von Saint Paul (PASQUAL et al.,

1996).

O mercado mundial de flores está crescendo, destacando-se principalmente os Estados

Unidos, seguidos por outros países como: Holanda e Itália. A principal demanda para a

floricultura é o mercado interno, pois possui um grande potencial de expansão (JUNQUEIRA;

PEETZ, 2008).

A cultura de tecidos de plantas, também conhecida como cultivo in vitro ou

micropropagação, vem se tornando uma técnica bastante utilizada visando suprir a demanda

cada vez mais tecnificada e com uma alta capacidade de multiplicação em grande escala, de

mudas livres de patógenos (MENDES et al., 1996).

Para que a técnica da micropropagação de mudas torne-se viável, e de menor custo,

podendo assim competir com as demais formas de propagação tradicional, os custos devem

ser reduzidos (ALTMAN, 1999). Também é necessário o ajuste de alguns fatores como às

desordens fisiológicas, contaminações por microrganismos, baixo percentual de taxa de

sobrevivência na aclimatização ex vitro (KURATA; KOZAI, 1992; KOZAI; KUBOTA,

2001) além do que, manter funcionando as salas de crescimento com controle de luz e

temperatura onera em muito os custos (STANDAERT DE METSENAERE, 1991; KODYM;

ZAPATA-ARIAS, 1999).

Todo o ágar consumido nos laboratórios do Brasil é importado, o que agrega mais custo

às pesquisas (PEREIRA et al., 2012). Alguns trabalhos no sentido de substituir o ágar vem

sendo desenvolvidos, como a exemplo de goma de cajueiro, amido de milho e fécula de

mandioca, subprodutos da indústria alimentícia.

No cultivo in vitro o emprego do meio líquido seria muito importante, uma vez que

substituem os agentes solidificantes, como exemplo, o ágar, que onera bastante esta técnica. O

cultivo mais uniforme é obtido, quando se utiliza o sistema de cultivo líquido, além disso,

entre outras vantagens pode-se citar a facilidade de retirar o meio sem que haja mudança de

recipiente, a esterilização é mais fácil, visto que pode ser realizada por meio de filtragem, as

repicagens podem ser reduzidas e recipientes maiores podem ser usados (ETIENNE;

BERTHOULY, 2002).

42

Assim com este trabalho, objetivou-se avaliar o enraizamento e desenvolvimento in vitro

de brotações de violeta africana utilizando fécula de mandioca, como alternativa em

substituição do ágar, bem como a aclimatização destas mudas, e o enraizamento em meio

líquido estacionário com pontes.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Local e período de realização dos experimentos

O trabalho de pesquisa foi conduzido no laboratório de Biologia Celular e Cultura de

Tecidos Vegetais e em casa de vegetação do Departamento de Ciências Biológicas – DCB do

Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba, Areia-PB. Entre os meses de

junho/2013 e fevereiro/2014.

2.2 EXPERIMENTO 1: Efeito da fécula de mandioca no enraizamento in vitro e na

aclimatização de violeta africana.

Foram utilizadas brotações do terceiro subcultivo de violeta africana, com tamanho de

aproximadamente 0,5 cm contendo de duas a três folhas. A fécula de mandioca utilizada

como agente geleificante, foi a tradicional comumente encontrada em supermercado e feiras

livres da região, sendo que a utilizada no referido experimento foi adquirida em um

supermercado da cidade de Areia-PB.

Procedeu-se o processo de formulação dos meios, os recipientes utilizados foram

frascos de vidros com capacidade de 250 ml com tampas BIO SAMA® PP – 74. Nesses

recipientes, foi adicionado o meio MS (Murashige & Skoong 1962) suplementado com 20 g/L

de sacarose, onde foi adicionado ágar comercial ou fécula de mandioca nas concentrações

previstas para cada um dos tratamentos, o pH foi ajustado para 5,8; a esterilização foi

realizada em autoclave a 120ºC durante 20 minutos a pressão de 1atm. Foi utilizado 50 ml de

meio em cada pote. A inoculação dos explantes foi realizada em capela de fluxo laminar.

Após a inoculação os potes foram mantidos em sala de crescimento com temperatura de 25ºC

± 2 mantido por aparelho de ar-condicionado e fotoperíodo de 16 horas/luz branca controlado

por timer programado.

43

2.2.1 Tratamentos

Os tratamentos utilizados constituíram-se de diferentes concentrações de fécula de

mandioca e uma concentração de ágar:

Meio 1 (T1) = MS + 20 g.L-1 de sacarose + 07 g L-1 de ágar (convencional /

testemunha);

Meio 2 (T2) = MS + 20 g.L-1 de sacarose + 100g de fécula de mandioca;

Meio 3 (T3) = MS + 20 g.L-1 de sacarose + 150g de fécula de mandioca;

Meio 4 (T4) = MS + 20 g.L-1 de sacarose + 200g de fécula de mandioca.

2.2.2 Parâmetros avaliados

Foram realizadas avaliações 90 dias após a inoculação, sendo analisado o percentual

de brotos enraizados - % BE, número de folhas - NF; número de raiz - NR; comprimento da

parte aérea – CPA (mm) e comprimento de maior raiz – CMR (mm) com auxilio de

paquímetro digital. Ao serem retiradas do meio de cultivo in vitro, as raízes das plantas foram

lavadas para retirado o excesso do meio aderido às raízes e posteriormente realizada as

avaliações.

2.2.3 Aclimatização

Após as avaliações do enraizamento e desenvolvimento dos brotos, iniciou-se o

processo de aclimatização. Foram utilizados como recipientes vasos preto comercial, com

capacidade de 200 ml e garrafas de politereftalato de etileno – PET, para formar a câmara

úmida, estas foram cortadas na altura de 10 cm a partir da base e com furos na base. Em cada

tratamento 15 plantas foram distribuídas em cinco vasos. O substrato utilizado em todos os

tratamentos foi composto de vermiculita + terra vegetal na proporção de 1:1. As plantas

permaneceram em ambiente de laboratório por um período de sete dias, para que ocorresse

uma mudança gradual de ambiente evitando assim estresse e consequentemente morte das

plântulas, em seguida as mesmas foram levadas para casa de vegetação.

Os furos dos recipientes que funcionaram como câmara úmida só foram realizados

após uma semana, para evitar a desidratação das plântulas. A câmara úmida permaneceu por

44

mais 22 dias, proporcionando um microclima com elevada umidade, assemelhando-se às

condições do interior do recipiente de micropropagação. Foram feitas regas quando

necessárias, e estas ocorreram quando visualmente se observava que a umidade do substrato e

da câmara estavam baixas

As mudas permaneceram em casa de vegetação por mais 43 dias, até completa

aclimatização, sob tela com 50% de sombreamento. Aos 60 dias foram realizadas as

avaliações relacionadas a percentual de sobrevivência e ao desenvolvimento das plantas.

2.2.3.1 Tratamentos

Os tratamentos foram os mesmo que constituíram o do enraizamento e

desenvolvimento das mudas de violeta africana, ou seja, influencia de diferentes

concentrações de fécula de mandioca no meio de cultura.

2.2.3.2 Parâmetros avaliados

Avaliou-se o percentual de sobrevivência (% SV), número de folhas (NF); número de

raízes (NR); comprimento da parte aérea - CPA (mm) e comprimento da maior raiz – CMR

(mm) com auxilio de um paquímetro digital.

2.2.4 Delineamento experimental e análise estatística dos experimentos

Adotou-se nestes experimentos o delineamento inteiramente casualizado (DIC), quatro

tratamentos (Meio 1; Meio 2; Meio3 e Meio 4) com cinco repetições de três brotos por pote

de cultivo, bem como três plantas por vaso na aclimatização. Os dados foram submetidos à

análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de

probabilidade, utilizando o software SAS.9.2 (2010).

45

2.3 EXPERIMENTO 2: Uso de PVC como ponte no meio líquido

Foram utilizados brotações do terceiro subcultivo de violeta africana, com tamanho de

0,5 cm contendo de duas a três folhas. Inicialmente, foram preparadas as “pontes”, utilizando

PVC (policloreto de vinila, de uso comum em forro de residências) e sobre estas, foram

postos papel filtro e algodão à serem colocadas dentro dos recipientes para servirem de apoio

aos explantes. As pontes de PVC foram cortadas com auxílio de estilete, com tamanho de

aproximadamente 5,5 x 5 cm, de tal forma que a sua passagem no recipiente ocorresse sem

nenhuma barreira, no centro de cada ponte, foi feito um corte de 4 cm para a fixação do papel

ou do algodão. Os recipientes utilizados foram frascos de vidros com capacidade 250 ml com

tampas BIO SAMA® PP – 74. Nesses recipientes, foram adicionados o meio MS (Murashige

& Skoong 1962) suplementando com 20 g/L de sacarose, e para a testemunha adicionou 7g de

ágar comercial, o pH foi ajustado a 5,8; a esterilização foi realizada em autoclave a 120ºC

durante 20 minutos. Foi utilizada 50 ml de meio em cada pote. Os brotos foram inoculados

em capela de fluxo laminar.

Após a inoculação os potes foram mantidos em sala de crescimento com temperatura

de 25ºC ± 2 mantido por aparelho de ar-condicionado e fotoperíodo de 16 horas/luz branca

controlado por timer programador manual, para que ocorresse o processo de formação do

sistema radicular.

2.3.1 Tratamentos

Os tratamentos utilizados constituíram-se de meio semissólido e líquido:

Meio 1 (T1/AGAR)= MS + 20 g.L-1 de sacarose + 07 g L-1 de ágar (convencional /

testemunha);

Meio 2 (T2/PVC-PF) = MS + 20 g.L-1 de sacarose + ponte de PVC com Papel Filtro;

Meio 3 (T3/PVC-A) = MS + 20 g.L-1 de sacarose + ponte de PVC com Algodão.

2.3.2 Parâmetros avaliados

Foram realizadas avaliações aos 91 dias após a inoculação, sendo analisado o

percentual de enraizamento (% ENR), número de folhas (NF); número de raízes (NR);

46

comprimento da parte aérea - CPA (mm), comprimento de maior raiz - CMR (mm) estas duas

variáveis foram avaliadas com auxilio de paquímetro digital, massa fresca de parte aérea

(MFPA), massa fresca de raiz (MFR), massa seca de parte aérea (MSPA), massa seca de raiz

(MSR), para estas avaliações foi utilizada balança analítica de precisão.

2.4 Delineamento experimental e análise estatística dos experimentos

Adotou-se nesse experimento o delineamento inteiramente casualizado (DIC), três

tratamentos (ÁGAR; PVC-PF e PVC-A) com dez repetições de três brotos por pote de

cultivo. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas pelo

teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando o software SAS.9.2 (2010).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Efeito da fécula de mandioca no enraizamento in vitro e na aclimatização de violeta

africana.

De acordo com os dados apresentados na Tabela 1, pode-se observar que 100% das

plantas emitiram raizes em todos os meios estudados. Para a variável número de folhas (NF) o

tratamento em que se utilizou MS + 200 g/L de fécula de mandioca (T4) apresentou a menor

média 16,67 seguido do meio MS + 100 g/L de fécula de mandioca (T2) 20,87, os demais

tratamentos apresentaram resultados iguais estatisticamente, MS + 7 g de ágar (T1); MS +

150 g/L de fécula de mandioca (T3) 26,03; 22,33 consecutivamente. Para o número de raízes

(NR) as melhores médias foram obtidas nos T1 e T2 sendo de 33,71 e 29,33 folhas

respectivamente, porém este último não diferiu estatisticamente dos tratamentos T3 e T4. No

comprimento de parte aérea (CPA) as melhores médias podem ser observadas nos T4

28,13mm e T2 28,05mm, porém não diferindo estatisticamente do T3 (25,28mm), o T1

apresentou o menor valor médio de 18,40, diferindo negativamente dos demais tratamentos.

Os maiores valores médios para o comprimento de raiz (CMR) que foram obtidos nos

tratamentos T2, T4 e T3, com 13,23; 13,12 e 11,68 mm, respectivamente, sendo que o T1

apresentou novamente a menor média 8,66 mm mas se igualando estatisticamente ao T3.

47

Todos os meios geleificados com a fécula de mandioca apresentaram uma consistência

menos firme quando comparado ao ágar, deixando assim o meio não tão sólido, fato também

comprovado por Erig et al.(2004), que substituiu parcialmente o ágar do meio por amido de

mandioca, na multiplicação in vitro de macieira

Outro fato relevante que pode ser constatado, foi que os meios que levaram na sua

composição a fécula, mostraram-se com um maior grau de dificuldades para realizar a sua

remoção das raízes das plantas bem como apresentou uma maior dificuldade para efetuar a

contagem e medição dessas raízes, fazendo com que o manipulador tenha uma maior atenção,

sendo que esta dificuldade aumentava a medida que a concentração de fécula era maior.

Com relação ao número de folhas, foi observado que o tratamento F3 apesar de

apresentar a menor média, apresentou folhas mais bem desenvolvidas com uma uniformidade

entre as repetições e os três explantes de cada repetição, a mesma característica pôde ser

observada no meio com ÁGAR.

Tabela 1. Percentual de enraizamento e valores médios das variáveis, número de folhas - NF,

número de raízes - NR, comprimento de parte aérea - CPA (mm) e comprimento de

maior raiz - CMR (mm) e de violeta africana, nos tratamento, T1= MS + 7g de ágar

(AGAR); T2= MS + Fécula de Mandioca 100 g/L (F1), T3= MS + Fécula de

Mandioca 150 g/L (F2) e T4= MS + Fécula de Mandioca 200 g/L (F3).

TRAT % ENR NF NR CPA (mm) CMR (mm)

T1 100 a 26,43 a 33,71 a 18,40 b 8,64 b

T2 100 a 20,87 bc 29,33 ab 28,05 a 13,23 a

T3 100 a 22,33 ab 23,93 b 25,28 a 11,68 ab

T4 100 a 16,67 c 23,67 b 28,13 a 13,12 a

*Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey a 5% de probabilidades.

Trabalhando com enraizamento de Prunus sp. in vitro, Tibola et al., (2004),

encontraram o melhor resultado para número médio de raízes (4,94) quando substituíram

totalmente o ágar por vermiculita, seguido da substituição parcial ágar + vermiculita (3,33) e

ágar/tradicional (2,56), se assemelhando com o presente trabalho. Erig et al. (2004) também

trabalhando com a substituição parcial ou total do ágar por agentes geleificantes alternativos

48

no meio de cultivo, em multiplicação de macieira, para número médio de gemas, o meio MS

+ ágar e MS + Agar + amido de milho apresentaram valores iguais estatisticamente.

Ainda foi observado que ao usar o meio de cultura WPM (Wood Plant Media

(LLOYD e McCOWN, 1980) os autores puderam constatar que os valores para o número

médios de gemas foi igual, quando usou somente ágar e substituição parcial por amido de

milho ou de mandioca, mostrando assim que a utilização de amido/fécula é tecnicamente

viável, como agente geleificante no meio de cultura.

Costa et al. (2007), verificaram que a percentagem de desenvolvimento das gemas de

abacaxi da cultivar Rio Branco foi significativamente superior quando estas foram cultivadas

em meios suplementados com fécula de mandioca, combinado ou não com ágar. Para o

número de folhas, altura de brotações e aspecto geral das brotações, os referidos autores não

encontraram nenhuma diferença significativa.

Lima-Nishimura et al. (2003), ressaltam que apesar da desvantagem apresentada

pelos amidos, que é a pouca transparência, que dificulta a detecção de contaminantes, fato

também detectado por Erig et al. (2004) e também constatado no presente trabalho, onde os

meios são mais esbranqueçidos com pouca transparência, sendo que esta desvantagem é

superada quando se consideram a sua abundância na natureza, baixo custo e sendo este entre

os polissacarídeos, a substância de maior importância fisiológica (FERRI et al., 1998).

Viaganó et al. (2007), concluíram com seu trabalho de enraizamento in vitro de porta

enxerto de Prunus cv. Mr. S. 1/8 que é possível um alto percentual de enraizamento

substituindo parcialmente o ágar por vermiculita. Este fato também foi constatado neste

trabalho na substituição total do ágar por 100 g de fécula de mandioca. Ferri et al., (1998)

trabalhando no enraizamento in vitro de macieira, encontraram o melhor valor médio (6 raizes

por explantes) no meio solidificado com 50 g de fécula de mandioca.

Os dados aqui encontrados diferem dos encontrados por Galdiano Júnior et al.

(2012), onde a substituição total do ágar pela fécula de mandioca foi prejudicial ao

crescimento de Cattleya loddigesii in vitro, pois foram verificadas as menores médias para

todas as variáveis avaliadas. Para Caldas et al. (1998); Erig et al., (2004) e Costa et al. (2007)

a escolha de um ou outro agente geleificante depende da espécie de planta e, também, das

condições de cultivo, como por exemplo, o meio de cultura.

A fécula de mandioca é um polissacarídeo facilmente encontrado nas feiras livres e

em supermercados da região Nordeste, 1000 g de amido de mandioca custa em média R$ 3,50

na cidade de Areia-PB, enquanto que 500 g de ágar custa em média R$ 500,00. A quantidade

mínima de fécula (100g/L) acrescida ao meio de cultura apresentou para a maioria das

49

variáveis estudadas, média melhor ou igual estatisticamente às plantas cultivadas no meio

onde se utilizou ágar, se apresentando assim, como um bom substituto no cultivo in vitro.

Com base nessas observações pode se calcular a relação custo benefício destes solidificantes.

A cada dez litros de meio de cultivo, utilizando esta concentração de solidificante ter-se-á um

gasto bem reduzido se comparado ao ágar. O custo médio de produção de um litro de meio

solidificado com 100g de amido de mandioca, baseado na pesquisa de preço realizado no

município de Areia-PB é de R$ 0,35 em quanto que o mesmo solidificado com ágar sai em

média por R$ 7,00. Tendo assim uma diferença de R$ 6,65 em cada litro de meio de cultura.

Isto representa uma grande economia principalmente para as biofábricas de plantas.

3.1.2 Aclimatização

As temperaturas na casa de vegetação durante a aclimatização foi de média máxima 34

e média mínima de 23o C, a umidade relativa de 74 %.. Na Tabela 2 estão apresentados os

resultados de sobrevivência e desenvolvimento dos brotos enraizados cultivados em diferentes

concentrações de fécula de mandioca. Pode-se observar que para a percentagem de

sobrevivência (%SOB) não houve diferenças significativas, sendo que os maiores percentuais

93,33% e 80% foram obtidas no T2 (MS + 20g de sacarose + 100g de fécula de mandioca) e

T3 (MS + 20g de sacarose + 150g de fécula de mandioca) respectivamente, seguidos das

médias do tratamento T4 (MS + 20g de sacarose + 200g de fécula de mandioca) 66,67% e T1

(MS + 20g de sacarose + 7g de Ágar) 60%. Para variável NF (número de folha) o T2

apresentou a melhor média 22,21 apesar de não diferir estatisticamente dos tratamentos T3 e

T1, onde as médias destes não apresentaram diferença do tratamento T4.

Nos T2, T3 e T1 observa-se que não houve significância entre as médias apresentadas

13,21; 12,75 e 8,44 respectivamente para o NR (número de raiz), sendo que o T4 apresentou a

menor média 8,60. Para as variáveis CPA (comprimento de parte aérea) CMR (comprimento

de maior raiz) os tratamento foram iguais estatisticamente entre si,

Lemos et al. (2001), conduziram aclimatização de plantas de bananeiras

micropropagadas em sistemas de biorreatores, e obtiveram cerca de 70% de mudas

aclimatadas. Sutter (1988), destaca que, submetidas a aclimatização, as plantas oriundas do

cultivo in vitro são colocada em uma condição de estresse, como alta transpiração associada à

alta condutividade hídrica, provocando baixa funcionalidade ou ausência de controle sobre o

fechamento dos estômatos, acarretando altas taxas de mortalidades.

50

TABELA 2. Valores médios das variáveis, percentagem de sobrevivência (% SOB) número

de folhas -NF, número de raízes -NR, comprimento de parte aérea -CPA (mm)

e comprimento de maior raiz -CMR (mm), de violeta africana, de nos

tratamento: T1= MS + 7g de ágar (AGAR); T2= MS + Fécula de Mandioca

100 g/L (F1), T3= MS + Fécula de Mandioca 150 g/L (F2) e T4= MS + Fécula

de Mandioca 200 g/L (F3) aos 60 dias de aclimatizadas.

TRAT % SOB NF NR CPA mm CMR mm

T1 60,00 a 18,22 ab 8,44 b 34,95 a 28,89 a

T2 93,33 a 22,21 a 13,21 a 45,92 a 28,80 a

T3 80,00 a 20,42 ab 12,75 a 38,87 a 25,51 a

T4 66,67 a 15,50 b 8,60 b 34,95 a 24,48 a

*Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey a 5% de

probabilidades.

O resultados médios aqui apresentados para o NF foram bem superiores aos

encontrado por Terceiro Neto et al. (2004) na aclimatização de violeta africana

micropropagadas in vitro em diferentes substratos, onde a maior média 8,93 para o substrato

plantagro. Costa (2003) lembra que o número de folhas nem sempre é um critério adequado

para se estimar o crescimento vegetal, podendo ser muito variável em relação à idade da

planta.

Tibola et al.(2004) obtiveram a maior taxa de sobrevivência na aclimatização de porta-

enxertos de Prunus sp quando os brotos foram cultivados em meios compostos por ágar e

vermiculita ou apenas vermiculita.

Araújo et al. (2002), observaram que o enraizamento in vitro de A. vera exerceu

influência sobre a sobrevivência das plântulas na fase de aclimatização, sendo uma fase

indispensável na micropropagação desta espécie. O mesmo pode ser observado no trabalho

aqui realizado, onde o T1 apresentou boas condições para o enraizamento da violeta,

refletindo assim na aclimatização das mesmas, onde as melhores médias foram as do meio

solidificado com 100g de fécula de mandioca exceto para CMR.

51

3.2 Efeito do uso de PVC como ponte no meio líquido

Verifica-se na Tabela 3, que o tratamento MS + ponte PVC com papel filtro (T1-PVC-

PF, meio liquido), apresentou significativamente os melhores resultados para as variáveis:

número de raiz (NR) 15,11, comprimento de parte aérea (CPA) 21,45mm, comprimento de

maior raiz (CMR) 22,52 mm, massa fresca de parte aérea (MFPA) 1,3230 g, massa fresca de

raiz (MFR) 0,1260 g e massa seca de raiz (MSR) 0,0122 g, superando o meio tradicional

(sólido) que utilizou ágar para o cultivo. Para o número de folha (NF) e massa seca de parte

aérea, o T1 e T2 foram iguais estatisticamente com 13,80/13,93 e 0,0469/0,0535

respectivamente. Nas variáveis NF, NR e CMR o meio tradicional (T1) diferiu do meio MS +

ponte de PVC com algodão (T3), não apresentando diferenças significativas para as demais

variáveis. Ou seja, o meio líquido utilizando a ponte de PVC com algodão apresentou-se, na

maioria das variáveis estudadas, igual ao meio semissólido, diferindo apenas em três das nove

variáveis apresentadas. O meio líquido estacionário PVC-PF foi superior ao meio líquido

PVC-A em todas as variáveis analisadas, não diferindo estatisticamente na vairavel % ENR.

Camolesi et al. (2010), avaliando o enraizamento in vitro de mudas micropropagadas

de bananeiras em diferentes meios de cultivo, obtiveram o maior número de raízes para

cultivar Nanicão Jangada e Nanicão Grand Naine, quando estas foram cultivadas em meio

líquido (6,32 e 5,70 raízes por broto respectivamente), diferindo significativamente da cultivar

Maçã que apresentou 4, 92 raízes. Para Lins et al. (2003), plantas que no final do cultivo in

vitro apresentam um sistema radicular bem desenvolvido, tanto qualitativamente quanto

quantitativo, são mais consistentes na aclimatização. Sugere-se assim que os resultados

obtidos em meio líquido podem variar de acordo com a espécie ou cultivar que se trabalha.

Os resultado aqui encontrados para massa fresca corroboram com os de Siqueira et al.

(2013), em seu trabalho com micropropagação da bananeira “Maçã” cultivada sobre

diferentes quantidade de meio líquido estacionário, onde obtiveram resultados maiores para

massa fresca e seca quando os explantes foram cultivados em meios líquidos no volumes de

20 a 25 mL.

Os mesmos autores não obtiveram diferenças significativas na taxa de multiplicação

destas plantas quando comparado o meio líquido com o meio semissólido, obtendo uma

média geral de 1,54 brotos por explantes nos tratamentos de meio líquido e semissólido,

resultados que diferiram dos encontrado por Costa et al., (2007) que obteve a menor taxa de

brotos no meio liquido no cultivo da cultivar Grand Naine.

52

Pode ser verificado por Lemos et al. (2001), que quando se utilizou o meio líquido

estacionário ou imersão temporária, os explantes aproveitaram melhor o meio de cultivo, onde

a água, nutrientes e reguladores de crescimento puderam ser absorvidos com mais facilidade

por todas as partes, isso devido a maior relação existente entre o explante e o meio.

Em pequenos recipientes com uma grande quantidade de meio, como por exemplo, em

tubos de ensaio contendo 25 mL de meio líquido estacionário, que foram utilizados por

Domingues et al. (1995), os explantes ficam completamente imersos no meio, a aeração é

deficiente, ocorrendo assim o acúmulo de gases prejudiciais ao desenvolvimento das plantas

(LEMOS et al., 2001) e ainda com possiblidade de déficit de CO2 e assim apresentar baixas

médias de multiplicação (SIQUEIRA et al., 2013). Também pela imersão contínua em meio,

os tecidos e órgão das plantas podem sofrer com a hiperidricidade, que dependendo da espécie

e do meio, pode causar sérios danos fisiológicos que irão afetar o crescimento e

desenvolvimento da planta (TEIXEIRA, 2001).

Ainda para Siqueira et al.(2013), é viável que os volumes entre 20 e 25 mL de meio

líquidos forneçam a quantidade adequada de nutrientes, podendo volumes inferiores causarem

depleção muito rápida. Sendo que para prevenção e obtenção de ótimo crescimento de plantas

nesse meio e nestes volumes, seria necessária a sua renovação frequente. Requerendo assim

mais mão de obra ou investimento de automação do sistema como o uso de BIT`s

(Biorreatores de Imersão Temporária) ou agitadores mantido sob agitação constante do meio

por uso de maquinas agitadoras.

O uso de PVC com suportes de papel ou algodão como ponte é uma ótima saída para

se trabalhar com meio líquido em potes de cultivo contendo uma quantidade de 50 mL de

meio de cultura, sem trazer problemas como a hiperidricidade dos explantes, pois o mesmo

permite que o explante permaneça em constate contato com uma quantidade adequada de

meio, onde a absorção se torna mais fácil, ainda oferecendo as condições de arejamento de um

meio semissólido ou sólido.

O emprego dos meios líquidos é feito com o uso de máquinas agitadoras ou

biorreatores de imersão temporária, demandando assim um alto investimento para aquisição

de equipamentos, pois no sistema estacionário se tem grandes problemas com a oxigenação e

hiperidricidade. O uso do PVC apresenta uma redução nos custos de produção in vitro, uma

vez que este material é de baixo custo e encontrado facilmente no mercado, seu preço médio

é de R$ 16,00 o m2, além disso, as mesmas pontes podem ser utilizadas em vários cultivos,

antes de serem descartadas.

53

TABELA 3. Valores médios das variáveis, percentagem de sobrevivência (% SOB), número de folhas (NF), número de raízes (NR), comprimento de parte aérea (CPA) e comprimento de maior raiz (CMR), massa fresca de parte aérea (MFPA), massa fresca de raiz (MFR), massa seca de parte aérea (MSPA), massa seca de raiz (MSR) de violeta africana, de acordo com cada tratamento, MS + 7g de ágar (AGAR); MS + ponte de PVC com papel filtro (PVC-PF) e MS + Ponte de PVC com algodão (PVC-A).

TRAT % ENR NF NR CPA (mm) CMR (mm) MFPA (g) MFR (g) MSPA (g) MSR (g)

AGAR 100 a 13,80 a 11,40 b 15,05 b 13,61 b 0,9103 b 0,0725 b 0,0469 ab 0,0066 b

PVC-PF 100 a 13,93 a 15,11 a 21,45 a 22,52 a 1,3230 a 0,1260 a 0,0535 a 0,0122 a

PVC-A 76 a 11,32 b 8,52 c 14,29 b 6,83 c 0,6386 b 0,0490 b 0,0469 b 0,0065 b

*Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey a 5% de probabilidades..

54

4. CONCLUSÕES

A fécula de mandioca pode ser utilizada no meio de cultura no cultivo in vitro de

violeta africana como agente geleificante em substituição ao ágar, sendo a concentração de

100 g fécula L1 de meio cultura a mais indicada.

A concentração de 100 g fécula L1 de meio de cultura durante o enraizamento

mostrou-se a mais eficiente na aclimatização das plantas de violeta.

O meio liquido utilizando ponte de PVC com papel filtro foi a mais eficiente e pode

ser utilizado no enraizamento e desenvolvimento in vitro de violeta africana em substituição

ao meio semissólido.

REFERÊNCIAS

ALTMAN, A. Plant biotechnology in the 21 st century: the challenges ahead. EJB Electronic

Journal of Biotechnology , Valparaiso, v.2, n.2, p.51-55, 1999.

ARAÚJO, P. S.; SILVA, J. M. O. D.; NECKEL, C. A.; IANSSEN, C.; OLTRAMARI, A. C.;

PASSOS, R..; TIEPO, E.; BACH, D. B.; MARASCHIN, M. Micropropagação de Babosa

(Aloe Vera - Liliaceae). Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento. n. 25. p 54-57, 2002.

CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E. Meios Nutritivos. In: Torres, A. C.;

Caldas, L. S.; Buso, J. A. (Eds.). Cultura de tecidos e transformação genética de plantas.

v.1. Brasília: Embrapa CENARGEN, 1998. p.87-132.

CAMOLESI, M. R.; MARTINS, A. N.; SOUZA, L. D.; SACONI,C. G. Enraizamento in vitro

de mudas micropropagadas de bananeira (musa sp.) em diferentes meios de cultivo. Ciência e

Agrotecnologia, Lavras, v. 34, n. 6, p. 1446-1451, 2010.

COSTA, A. M. G. Substrato e adubação mineral na formação de porta-enxerto de

gravioleira (Anonna muricata L.) em tubete. 2003. 45f. Dissertação (Mestrado em

Agronomia/Fitotecnia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2003.

55

COSTA; F. H. S.; PEREIRA, M.A.A.; OLIVEIRA, J.P.; PEREIRA, J. E. S. Efeito de agentes

geleificantes alternativos no meio de cultura no cultivo in vitro de abacaxizeiro e bananeira.

Revista Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 31, n.1, p. 41-46, 2007.

DOMINGUES, E. T.; TULMANN NETO, A.; MENDES, B. M. J. Cultura de ápices

caulinares de Musa sp, var. Maçã: estabelecimento, propagação e enraizamento in vitro.

Scientia Agrícola, 52:387-394, 1995.

ERIG, A. C.; SCHUCH, M. W. In vitro rooting of quince cv. MC as rootstock for pear and

acclimatization of the rooted microcuttings. Ciência Rural, Santa Maria, v. 34, n.5, p.1443-

1449, 2004.

ETIENNE, H.; BERTHOULY, M. Temporary immersion systems in plant micropropagation.

Pant Cell Tissue and Organ Culture, Amsterdam, v. 69, n. 3, p. 215-231, 2002.

FERRI, V.C.; CENTELLAS, A.Q.; HELBIG, V.E. FORTES, G.R.L. Uso de ágar, amido e

ácido indolbutlíco no enraizamento de in vitro de porta-enxerto de macieira MM111. Ciência

Rural, Santa Maria, v.28, n. 4, p. 561-565, 1998.

GALDIANO JÚNIOR, R. F.; Mantovani, C.; Lemos, M. E. G. Seleção de agentes alternativos

ao ágar para propagação de plântulas de Cattleya loddigesii Lindley (Orchidaceae). Revista

Brasileira de Ciências Agrárias, vol. 7, p. 756-760,2012.

JUNQUEIRA, A.H.;PEETZ, M.S. Mercado interno para os produtos da floricultura brasileira:

características, tendências e importância socioeconômica recente. Revista Brasileira de

Horticultura Ornamental, Campinas, v. 14, n. 1, p. 37-52, 2008.

KODYM, A.; ZAPATA-ARIAS, F.J. Natural light as an alternative light source for the in

vitro culture of banana (Musa acuminata cv. ‘Grande Naine’). Plant Cell, Tissue and Organ

Culture, The Hague, v.55, p.141-145, 1999.

KOZAI, T; KUBOTA, C. Developing a photoautotrophic micropropagation system for

woody plants. Journal of Plant Research, Tokyo, v.114, p.525-537, 2001.

56

KURATA, K.; KOZAI, T. Transplant production systems. Dordrecht : Kluwer Academic,

1992. 299p.

LEMOS, E. E. P.; FERREIRA, M. S.; ALENCAR, L.M.; OLIVEIRA, J. G. L.;

MAGALHÃES, V.S. Micropropagação de clones de banana CV. Terra em biorreator de

imersão temporária. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v.23, n.3, p.482-487,

2001.

LIMA-NISHIMURA, N.; QUOIRIN, M.; NADDAF, Y.G. et al. A xyloglucan from seeds of

the native Brazillian species Hymenaea courbaril from micropropagation of Marubakaido and

Jonagored apples. Plant Cell Reports, New York, v.21, n.5, p.402-407, 2003.

LINS, G.M. de L.; TRINDADE, A.V.; ROCHA, H.S. Utilização de Gigaspora margarita em

plantas micropropagadas de bananeira em diferentes estádios de enraizamento. Revista

Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v.25, n.1, p.143-147, 2003.

LLOYD, G.; McCOWN, B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel,

Kalmia latifólia, by use of shoot-tip culture. Combined Proceedings International Plant

Propagators Society, v.30, p.421-427, 1980.

MENDES, B. M. J.; MENDES, F. J.; TULMANN NETO, A.; DEMÉTRIO, C. G. B.;

PUSKE, O. R. Efficacy of banana plantlet production by micropropagation. Pesquisa

Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 31, n. 12, p. 863-867, 1996.

MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid grow and biossays with te bacco

tissue cultures. Physiologia plantarum, Copenhagem, v.15, p.473-97, 1962.

PASQUAL, M.; MACIEL, A.L.R.; SILVA, A. B. Enraizamento de brotações de violeta

africana (Saintpaulia ionantha Wendl.): Efeitos da incubação em ácido indolbutírico.

Ciência e agrotecnologia, Lavras, v.20, n.4, p. 462-467, 1996.

PEREIRA, W.J.; SILVA FILHO, R.R.; PEREIRA JUNIOR, M.A; BATISTA, K.A;

FERNANDES, K.F. Uso de goma de cajueiro em substituição ao ágar em meio de cultura.

Revista de Biotecnologia & Ciência, . v. 2, n. 1, 2012.

57

SIQUEIRA, D. L.; SANTOS, D.; SALOMÃO, L.C.C.; SILVA, F.F., BARROS, Z.J.

Micropropagação da bananeira ‘Maçã’, cultivada in vitro em diferentes volumes de meio

líquido. Revista Ceres, Viçosa, v. 60, n.6, p. 745-751, 2013.

STANDAERT DE METSENAERE, R.E.A. Economic considerations. In: DEBERGH, P.C.;

ZIMMERMAN, R.H. (eds). Micropropagation. 1991. p.131-140.

SUTTER, E. Stomatal and cuticular water loss from apple, cherry and sweetgum plants after

removal from in vitro culture. Journal of American Society for Horticultural Science,

Washington, v.113, n.2, p.234-238, 1988.

TEIXEIRA, J. B. Biorreator de imersão temporária desevolvido pela Embrapa -

Recursos Genéticos e Biotecnologia. In: Simpósio Brasileiro de Pesquisa dos Cafés do

Brasil (2. : 2001 : Vitória, ES). Anais. Brasília, D.F. : Embrapa Café, 2001. (CD-ROM), p.

278-284.

TERCEIRO NETO. C, P. C.; HERNANDEZ, F. F. F.; BEZERRA, SOUSA, F. C.; R. F.;

CAVALCANTI, M. L. F. Efeito de diferentes substratos na aclimatização “ex vitro” de mudas

de Violeta Africana (Saintpaulia ionantha Wendl). Revista de Biologia e Ciências da Terra.

Campina Grande v. 4, n. 2, 2004.

TIBOLA, C. S.; RADMANN, E. B.; RODRIGUES, A. C.; FORTES, G. R. L.;

FACHINELLO, J. C. Diferentes meios de cultivo no enraizamento in vitro de porta-enxertos

de Prunus sp. Revista Brasileira Agrociência, v.10, n. 2, p. 191-195, 2004.

VIAGANÓ, R. C.; BIANCHI, V. J.; ROCHA, P. S.G.; SCHUCH.M. W.; FACHINELLO , J.

C. Enraizamento in vitro do porta-enxerto de Prunus cv. Mr. S. 1/8: concentrações de IBA em

meio de cultura acrescido de Ágar ou vermiculita. Bioscience Journal, Uberlândia, v. 23, n.

3, p. 60-65, 2007.

58

CAPÍTULO III

EFEITO DE DESCONTAMINANTE NO ESTABELECIMENTO IN VITRO DE

PALMA FORRAGEIRA (Nopalea cochinileifera Salm-Dick)

59

RESUMO: A palma miúda ou doce (Nopalea cochenillifera Salm Dyck) tem se destacado

pela sua resistência a cochonilha do carmim, espécie do gênero Dactylopius. O objetivo nesse

trabalho foi de avaliar a eficiência da descontaminação utilizando concentrações de

hipoclorito de sódio associadas ou não a tween 20 no estabelecimento in vitro da palma-doce

N. cochenillifera Salm-Dyck em casa de vegetação. Utilizou-se como fonte de explantes

brotos e destes, gemas com 0,5 cm2 que foram submetidas à descontaminação e inoculação

em MS + 20 g de sacarose L-1 + 0,5 mg L-1 BAP e incubados em sala de cultivo. Os

tratamentos foram constituídos de NaOCl 2,5% de cloro ativo nas concentrações de 0, 10, 20,

30, 40 e 50% (v/v), e nas mesmas concentrações acrescidas de duas gotas de Tween 20. O

cultivo foi realizado em casa de vegetação e aos 21 dias foi realizada a avaliação para

verificar a efetividade dos tratamentos quanto à presença de contaminação, oxidação e

presença de brotações. Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado, com 12

tratamentos e seis repetições. Os dados obtidos foram submetidos a teste de regressão

binomial utilizando o software SAS 9.2. A manutenção dos cladódios em ambiente

higienizado associado a todos os tratamentos com NaOCl com ou sem Tween 20 é eficaz na

descontaminação de explantes de palma forrageira (N. cochenillifera), havendo uma maior

presença de brotações nas concentrações de 10 e 20% de NaOCl, e ocorrendo a diminuição

quando associado ao Tween 20.

Palavras-chave: Descontaminação, temperatura ambiente, fotoautotrofismo

ABSTRACT: The small or sweet forage cactus (Nopalea cochenillifera Salm Dyck) stands

out for its resistance to cochineal carmine, species of the genus Dactylopius. The objective of

this study was to evaluate the efficiency of decontamination using concentrations of sodium

hypochlorite associated or not with Tween 20 in vitro establishment of sweet cactus Nopalea

cochenillifera Salm-Dyck in greenhouse. Was used as a source of explants and these sprouts,

axillary buds of 0,5 cm2 were subjected to decontamination and inoculation MS + 20 g L-1

sucrose + 0.5 mg L-1 BAP and incubated in a culture room. The treatments consisted of

NaOCl 2,5% of active chlorine in the concentrations 0, 10, 20, 30, 40 and 50% (v/v), and the

same concentrations plus two drops of Tween 20. The culture were realized in the greenhouse

and at 21 days the assessment was conducted to verify the effectiveness of treatments for the

presence of contamination, oxidation and the presence of sprouts. Were used a completely

randomized design with 12 treatments and six replications. Data were subjected to binomial

60

regression using SAS 9.2 software. Maintenance of cladodes in sanitized environment

associated with all treatments with NaOCl with or without Tween 20 is effective in

decontamination of explants of forage Palm (N. cochenillifera), with a greater presence of

shoots at concentrations of 10 and 20% of NaOCl, and occurring to decrease when associated

with the Tween20.

Keywords: Decontamination, room temperature, photoautotrophic

61

1. INTRODUÇÃO

A palma forrageira Opuntia ficus indica (L) Mill, é muito utilizada no nordeste

brasileiro, na alimentação humana e animal. Originaria do continente americano, adaptou-se

muito bem as regiões Semiáridas do Brasil, sobretudo por ser muito resistente a longos

períodos de estiagem, característica bastante seletiva (ALMEIDA NETO et al., 2005). A

palma Miúda ou doce (Nopalea cochenillifera Salm Dyck) tem se destacado pela sua

resistência a cochonilha do carmim, espécie do gênero Dactylopius, e por apresentar maior

valor nutritivo comparada com outros genótipos como a Gigante e a Redonda cultivados no

Estado da Paraíba (VASCONCELOS et al., 2007).

No processo de cultivo in vitro tradicional em salas de crescimento o que mais onera

são os gastos com energia elétrica, assim vêm se buscando alternativas a essas condições

controladas, como a substituição das salas totalmente climatizadas por condições ambientais,

tais como o uso de luz natural e temperatura ambiente no cultivo in vitro. Uma das principais

vantagens do cultivo com o uso de deluz natural é que além da economia se obtêm plantas

mais adaptadas às condições ambientais sofrendo menos na aclimatização (STANDAERT DE

METSENAERE, 1991; KODYM; ZAPATA-ARIAS, 1999; KOZAI et al., 2003)

Nos últimos anos, foram desenvolvidas técnicas de cultivo in vitro para mais de mil

espécies, incluindo as cactáceas. As Opuntias se multiplicam por estaquia dos cladódios, e a

necessidade de grandes quantidades de material demandado por grandes plantações é um sério

problema prático, sendo usados cladódios doentes, desuniformes e sem a suculência adequada

para o enraizamento (FROTA et al., 2004)

Por essas razões, aplicam-se técnicas de cultivo in vitro para se obter um sistema

eficiente de multiplicação em grande escala. Essa eficiência implica uma alta taxa de

multiplicação, uniformidade genética, peso e volume reduzido em comparação com o método

convencional (VILLALOBOS, 2001). As técnicas de cultura de tecidos vegetais in vitro têm

sido aplicadas com êxito em várias espécies de Opuntias (FROTA et al., 2004) e para

Nopalea cochenilifera, com o objetivo de obtenção de um sistema eficiente de multiplicação

da palma forrageira (VASCONCELOS et al.,2007; ALVES et al., 2013).

Frota et al., (2004) testaram o efeito do BAP e do AIA na multiplicação e

enraizamento in vitro de 10 clones de Opuntia fícus indica L. obtendo a concentração de 1,00

mg/L, e 5,00 mg/L proporcionando a melhor média de raízes respectivamente para BAP e

AIA. Trabalho realizado por Vasconcelos et al., 2007, estabeleceu protocolo para a

multiplicação in vitro da palma miúda, indicando 0,1 mg L-1 de AIA para ser utilizado na

62

etapa de multiplicação. Já Alves et al. (2013), ao testarem o efeito de BAP na regeneração em

Opuntia e Nopalea recomenda valores de 3,7 μM BAP, e 4,5 μM BAP respectivamente.

De acordo com Oliveira et al. (2000), um dos principais problemas do cultivo in vitro

é a contaminação por fungos e bactérias no laboratório, levando a grande perda dos explantes.

Estudando o protocolo de estabelecimento para Opuntia ficus indica, Paz e Silveira (2013)

não obtiveram resultados satisfatório por causa da alta taxa de contaminação ocorrida na

multiplicação.

Um outro problema enfrentado no cultivo in vitro é a oxidação, esse processo ocorre

devido à liberação de compostos fenólicos, pelos tecidos injuriados (ALVES et al., 2013).

Para García-Saucedo et al. (2005), os compostos fenólicos podem modificar a composição

química do meio de cultura e dificultar a absorção dos nutrientes provocando a oxidação e

morte dos explantes, compostos que estão presentes em grandes quantidades nos tecidos da

Opuntia spp.

Desta forma objetivou-se neste trabalho avaliar a eficiência da descontaminação com

diferentes concentrações de hipoclorito de sódio associadas ou não a Tween 20 no

estabelecimento in vitro da palma-doce Nopalea cochenillifera Salm-Dyck em casa de

vegetação com uso de luz natural e temperatura ambiente.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Local e período de realização dos experimentos

O trabalho de pesquisa foi conduzido no Laboratório de Biologia Celular e Cultura de

Tecidos Vegetais e em casa de vegetação do Departamento de Ciências Biológicas – DCB do

Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba, Areia-PB. Entre os meses de

agosto a setembro de 2011.

2.1.1 Descontaminação e inoculação dos explantes

Utilizou-se como fonte de explantes brotos (mantidos em ambiente de laboratório) da

Nopalea cochenillifera Salm-Dyck, cultivar Palmepa PB1, obtida na Estação Experimental de

Lagoa Seca-PB, pertencente a Empresa Estadual de Pesquisa Agropecuária-EMEPA-PB.

63

Os brotos foram lavados em água corrente e descontaminados em álcool 70% (v/v) por

um minuto e hipoclorito de sódio (NaOCl 2,5% de cloro ativo) com e sem Tween 20 na

concentração prevista para cada tratamento, submetidos a agitação mecânica por 20 minutos.

Após a descontaminação os brotos foram enxaguados na capela de fluxo laminar para retirada

do excesso do hipoclorito, cortados em segmentos de aproximadamente 0,5 cm2 e inoculados

em tubos de ensaio (2,5 x 15 cm) contendo 5 mL de meio de cultura. O meio utilizado foi MS

de Murashige Skoog (1962) 0,5mg/l BAP (6-benzilaminopurina) 7 g/L de Ágar, 20 g/L de

sacarose e pH ajustado para 5.8, em seguida autoclavado a 120ºC a 1atm por 20 minutos.

Após a inoculação os tubos foram vedados com papel alumínio e filme de PVC e levados para

a casa de vegetação.

2.1.2 Tratamentos

Os tratamentos utilizados constituíram-se de diferentes concentrações NaOCl

acrecidos ou não de duas gotas de Tween 20 em cada 100 mL se solução: T1= 0% NaOCl de ;

T2 = 10% de NaOCl; T3 = 20% de NaOCl; T4= 30% de NaOCl; T5= 40% de NaOCl; T6=

50% de NaOCl;T7= 0% de NaOCl+Twee 20; T8= 10% de NaOCl+Twee 20; T9= 20% de

NaOCl+Twee 20; T10= 30% de NaOCl+Twee 20; T11= 40% de NaOCl+Twee 20; T12=50%

de NaOCl+Twee 20.

2.1.3 Parâmetros avaliados

Foram realizadas avaliações diariamente durante 21 dias após a inoculação, sendo

analisada a contaminação, oxidação e presença de brotações.

2.1.4 Delineamento estatístico

Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado, com 12 tratamentos e seis

repetições. Os dados obtidos foram submetidos a teste de regressão binomial utilizando o

software SAS 9.2 (2010)

64

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na casa de vegetação a UR mínima média foi 60% e máxima média de 85%,

temperatura mínima média de 17ºC e máxima média de 37ºC.

Verificou-se que não houve contaminação em nenhum dos tratamentos. Fato este que

diferiu dos dados encontrados por Paz e Silveira (2013), onde a contaminação chegou a 90%

na micropropagação de Opuntia fícus-indica, vale salientar que este experimento foi

conduzido em sala de crescimento. Vasconcelos et al., (2007) ao desinfestarem os cladódios

de N. cochenilefera mantidos em casa de vegetação com álcool 70% por um minuto e

hipoclorito de sódio 2% por 10 minutos, conseguiram manter a contaminação relativamente

baixa, 10%. Erig e Schuch (2003) ao lavarem em água corrente os brotos de macieira para

micropropagação aumentaram a contaminação bacteriana, diferindo do que ocorreu no

presente trabalho.

Segundo Pereira et al., (2003) os microrganismos contaminantes competem com os

explantes pelos nutrientes do meio de cultura, eliminando no meio metabólitos tóxicos,

podendo ocasionar a morte dos explantes. Este fato pode ser atribuído aos cladódios que

forma utilizado como fonte de explantes terem sido acondicionados em laboratório. Ambiente

protegido de intemperes e ataque de insetos, como sugerido por Grattapaglia e Machado

(1998).

Apesar de eficiente na descontaminação dos explantes, doses elevadas de hipoclorito

com e sem Tween provocam efeito fitotóxico, ocasionando a oxidação destes explantes

(Figura 1). Nas concentrações de 0 a 20% de NaOCl com e sem Tween não houve oxidação

significativa, no entanto, a partir da concentração de 20% com e sem Tween percebe-se um

aumento no percentual de oxidação dos explantes, este aumento permaneceu contínuo, para o

tratamento de Hipoclorito com Tween, até a concentração de 50%, atingindo valores

superiores a 50% de oxidação. Por outro lado, o tratamento com Hipoclorito sem Tween, a

partir da concentração de 40%, manteve o percentual de oxidação inferior a 34%.

65

Figura 1: Oxidação em explantes de palma-doce (N. cochenilefera) submetidos à

descontaminação com diferentes concentrações de NaOCl acrescido ou não de

Tween 20, em casa de vegetação, Areia-2011.

O tratamento com apenas hipoclorito, manteve níveis satisfatórios de brotação até a

concentração de 20%, a partir desta concentração, houve diminuição continua do percentual

de brotos, atingindo valores mínimos a partir da concentração de 40% (Figura 2). Por outro

lado a adição do Tween ao hipoclorito influenciou negativamente na presença de brotações,

associado a isto, doses mais elevadas do hipoclorito com o Tween promoveram menor

brotação.

Alves et al., (2013) relacionaram a baixa percentagem de brotações na multiplicação

de Opuntia atropes Rose e Nopalea cochenillifera Salm-Dick a alta taxa de oxidação. Os

autores utilizaram na descontaminação hipoclorito de sódio 1% +10 gotas de Tween 20, por

15 minutos e/ou hipoclorito de sódio 1% + cloreto de mercúrio 0,2%; por 10 minutos.

Resultados semelhantes também foram encontrados por Paz e Silveira 2013, no cultivo in

vitro de Opunita fícus indica, ocorrendo 100% de oxidação, redução na porcentagem de

brotações e até mesmo causando a morte dos explantes.

Cid (1999) revela que as oxidações dos fenóis pela polifenoxidase impedem em alguns

casos, a metabolização dos hormônios das classes das auxinas e das citocininas, estes, são

importantes na ativação do ciclo celular. Souza et al.(2011), afirmam que a oxidação inibe o

crescimento e a multiplicação das células, ocasionadas pela redução da velocidade do

66

metabolismo celular. Isto explica em parte o fato de que os tratamentos que receberam doses

de hipoclorito de sódio acima de 20% terem tido um porcentagem baixa de brotações.

Figura 2: Presença de brotações em explantes de palma-doce submetidos à descontaminação

com diferentes concentrações de NaOCl acrescido ou não de Tween 20, cultivados

em condições de telado, Areia-2011.

4. CONCLUSÕES

A manutenção dos cladódios em ambiente higienizado associado a todos os

tratamentos com NaOCl com ou sem Tween 20 é eficaz na descontaminação de explantes de

palma forrageira (N. cochenillifera);

As concentrações de 10 e 20% (v/v) de NaOCl apresenta maior presença de brotações

no cultivo in vitro de palma forrageira (N. cochenillifera) em casa de vegetação;

A presença de brotos é proporcionalmente reduzida com o aumento das concentrações

de NaOCl na presença de Tween 20.

67

REFERÊNCIAS

ALMEIDA NETO, J. X.; MEDEIROS, F. P. M.; MELO, A. J. M.; SILVA, J. C.; DANTAS,

J. P. Avaliação do efeito mutagênico da palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill) através

do Teste de Micronúcleos em medula óssea de ratos (Rattus novergicus, linhagem Wistar) IN

VIVO. Revista de Biologia e Ciência da Terra. v.5, n. 2, 2005.

ALVES, F. A. L.; SOARES, W. S.; FERNANDES, Y. T. D.; RÊGO, M. M. Efeito de

benziladenina na regeneração de duas variedades de palma forrageira (Opuntia spp.). Scientia

Plena, v.9, n.6, 2013.

CID, L. P. B. Suspensão celular. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Eds).

Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: CBAB/ EMBRAPA,

1999. p. 183-260.

ERIG, A. C.; SCHUCH, M. W. Tipo de explante e controle da contaminação e oxidação no

estabelecimento in vitro de plantas de macieira (Malus domestica borkh.) Cvs. Galaxy,

Maxigala e Mastergala. Revista Brasileira Agrociência, v. 9, n. 3, p.221-227, 2003.

FROTA, H. M.; CARNEIRO, M. S. S.; LLAMOCA ZÁRATE, R. M.; CAMPOS,F. A. P.;

PEIXÔTO, M. J. A. Proliferação e enraizamento in vitro de brotos de palma forrageira -

Opuntia ficus-indica (L.) MILL. Acta Scientiarum. Biological Sciences. Maringá, v. 26, n.

2, p. 235-238, 2004.

GARCÍA-SAUCEDO, P. A.; VALDEZ-MORALES, M.; VALVERDE, M. E.; CRUZ-

HERNÁNDEZ, A.; PAREDES-LÓPEZ, O. Plant regeneration of three Opuntia genotypes

used as human food. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80: 125-219, 2005.

KODYM, A.; ZAPATA-ARIAS, F.J. Natural light as an alternative light source for the in

vitro culture of banana (Musa acuminata cv. ‘Grande Naine’). Plant Cell, Tissue and Organ

Culture, The Hague, v.55, p.141-145, 1999.

68

KOZAI, T.; NGUYEN, Q.T. Photoautotrophic micropropagation of woody and tropical

plants. In: JAIN, S. M.; ISHII, K. Micropropagation of woody trees and fruits. Dordrecht:

Kluwer Academic, p.757-781. 2003.

OLIVEIRA, R. P. D.; SILVEIRA, D. G.; SILVA, S. D. O. E. Efeito da desinfestação e do uso

de meios indicadores de contaminação na micropropagação de bananeira. Revista Brasileira

de Fruticultura, Jaboticabal, v.22, n.1, p. 57-61, 2000.

PAZ, G. V. S.; SILVEIRA, D. G. Estabelecimento de protocolos para a multiplicação in

vitro de palma forrageira [Opuntia ficus-indica (l.) Mill]. (2013). Disponivel em:

http://www2.uefs.br/semic/upload/2011/2011XV-033GRE948-210.pdf. Acesso em:

17/07/2014.

PEREIRA, E.; MATTOS, M.; FORTES, G. Identificação e controle com antibióticos de

bactérias endofíticas contaminantes e explantes de batata micropropagados. Pesquisa

Agropecuária Brasileira. v.38, p. 827-834, 2003.

SOUZA, J. C.; ZAFFARI, G. R. Indução e multiplicação in vitro de massa celular

indiferenciada de mentrasto (Ageratum conyzoides l. Sieber). Plant Cell Cult.

Micropropag., Lavras, v.7, n.1, p. 17-21, 2011.

STANDAERT DE METSENAERE, R.E.A. Economic considerations. In: DEBERGH, P.C.;

ZIMMERMAN, R.H. (eds). Micropropagation. 1991. p.131-140.

VASCONCELOS, A. G. V; LIRA, M. A.; CAVALCANTI, V. A. L.; SANTOS, M. V. F.;

CÂMARA, T.; WILLADINO, L. Micropropagação de palma forrageira cv. Miúda (Nopalea

cochenillifera - Salm Dyck). Revista Brasileira de Ciências Agrárias. v.2, n.1, p.28-31,

janeiro-março., 2007.

VILLALOBOS, A.V.M. Aplicação do cultivo de tecidos para a micropropagação de

Opuntia sp. Agroecologia, cultivo e usos da palma forrageira. Roma: FAO Produção e

Proteção vegetal, 1995. Tradução (Sebrae/PB), 2001. Paper 132, p. 216, p. 72-78.