TÉCNICAS DE COAGULAÇÃO

INTRODUÇÃO As provas de coagulação exigem cuidados de ordem técnica para que os resultados obtidos

sejam os mais exatos e reprodutíveis possíveis:

a) a lesão tecidual decorrente da punção venosa deve ser mínima;

b) as seringas e os frascos de acondicionamento de sangue e plasma devem ser

plásticos ou siliconizados;

c) os coagulantes de escolha são o CITRATO DE SÓDIO usado na proporção de

uma parte de anticoagulante para nove partes de sangue;

d) o plasma deve ser separado em até 30 minutos após a coleta e, dependendo da

prova a ser executada, pode ser congelado por 4 horas, no máximo;

e) realizar os testes em duplicata e em paralelo, com um controle normal de

plasma.

1. PROVA DO LAÇO (Fragilidade Capilar)

PRINCÍPIO

A Prova do Laço ou Prova de Fragilidade Capilar, é um teste que procura avaliar a

capacidade dos vasos de resistirem a uma pressão. Em última análise, a prova avalia uma

das funções pertinentes à parte vascular da hemostasia.

TÉCNICA

a) delimitar uma área de aproximadamente 5 cm2 no antebraço do paciente,

marcando-se os sinais e manchas existentes (pintas, petéquias existentes, etc.);

b) determinar a pressão arterial do paciente (máxima e mínima) e manter o

manguito do aparelho no valor médio entre as pressões máxima e mínima, desde

que esse valor não ultrapasse a 100 mm de Hg. Caso isso ocorra, a pressão deve

ser mantida em 100 mm de Hg;

c) o manguito do aparelho deve ser mantido na pressão obtida em b), por 5

minutos;

d) retirar o aparelho e contar as petéquias (apresentam-se em forma de pontos

vermelhos-rutilante);

e) a prova é considerada POSITIVA quando forem contadas mais de 4 petéquias na

área delimitada

2. TEMPO DE SANGRAMENTO (Método de Duke)

PRINCÍPIO O Tempo de Sangramento (T.S.) avalia a capacidade de se processar a hemostasia

após o vaso ter sido lesado. O T.S. depende da função plaquetária e da integridade

funcional do vaso. O método mais comumente utilizado é o de Duke, em que é feita uma

incisão, de tamanho padronizado, medindo-se a seguir o tempo decorrido até que cessar o

sangramento, intervindo apenas os fatores plaquetário e vascular.

TÉCNICA

a) realizar assepsia do lóbulo da orelha (pode-se usar também a polpa digital) com

algodão embebido em álcool e deixar evaporar;

b) com auxílio de uma lanceta específica e de um só golpe, fazer uma incisão local,

com cerca de 2 mm de profundidade; disparar o cronômetro;

c) a cada 30 segundos recolher a gota de sangue em papel de filtro (tendo o

cuidado de que o mesmo não toque o lóbulo ou a polpa), até que a última gota

deixe apenas um sinal puntiforme no papel;

d) anotar o tempo decorrido entre a primeira e a última gota recolhidas.

Valor Normal: de 1 a 3 minutos.

INTERPRETAÇÃO

O Tempo de Sangramento é um teste indicativo de distúrbios plaquetários ( em

relação ao número à funcionalidade das mesmas) e de alterações da integridade vascular.

As alterações mais evidentes do Tempo de Sangramento são encontradas nas

púrpuras trombocitopênicas e trombopáticas.

3. TEMPO DE COAGULAÇÃO DO SANGUE TOTAL (Método de Lee-White)

PRINCÍPIO

O Tempo de Coagulação (T.C.) mede o tempo necessário para que o sangue

coagule “in vitro”.

TÉCNICA

a) proceder à punção venosa, procurando lesar os tecidos, o mínimo possível ;

b) disparar o cronômetro, assim que o sangue entrar na seringa;

c) separar 3 tubos de ensaio (10 x 120 mm), colocar 1 ml de sangue em cada um e

levá-los imediatamente em banho à 37ºC;

d) 3 minutos após a coleta, iniciar a observação do tubo 1, inclinando-o

suavemente; repetir essa observação a cada 30 segundos até que o sangue

coagule. Marcar o tempo transcorrido desde a coleta até a formação do coágulo;

e) proceder do mesmo modo com os tubos 2 e 3;

f) o Tempo de Coagulação será o obtido pela média dos tempos encontrados nos

3 tubos,

Valor Normal: de 4 a 9 minutos.

INTERPRETAÇÃO

O Tempo de Coagulação é uma prova pouco sensível para detectarem-se alterações

no sistema global da coagulação.

Um prolongamento do Tempo de Coagulação pode ser causado por

Hipofibrinogenemia, por deficiência de alguns dos fatores do sistema intrínseco e pela

presença de anticoagulantes circulantes.

O T.C. é largamente empregado como método de controle de terapia com

anticoagulantes, especialmente no caso da heparina.

4. RETRAÇÃO DO COÁGULO (Método de Mac-Farlane)

PRINCÍPIO

Após a coagulação do sangue, o coágulo formado retrai-se ou mais precisamente,

retrai-se a rede de fibrina, retendo os elementos figurados do sangue e liberando a parte

líquida, o soro. A retração do coágulo é devida à liberação de substâncias, pelas plaquetas

localizadas nos pontos de intersecção das malhas da rede de fibrina, O volume de soro

liberado, é expresso percentualmente em relação ao volume inicial do sangue que se deixou

coagular. A retração de coágulo está relacionada diretamente ao número e à funcionalidade

das plaquetas e inversamente proporcional ao grau de anemia.

TÉCNICA

a) transferir cerca de 5 ml de sangue, sem anticoagulantes para um tubo cônico

graduado, cujas paredes foram previamente umedecidas com solução

fisiológica;

b) fechar o tubo com uma rolha provida de um fio de arame com a ponta retorcida

“em anzol”;

c) após a coagulação do sangue, colocar o tubo em banho à 37ºC por 1 hora;

d) ler, a seguir, o volume total ( coágulo e soro). Com o auxílio do fio de arame,

retirar cuidadosamente o coágulo retraído; ler o volume final do soro.

CÁLCULO: % de retração = Vol. soro x Hematócrito do paciente

Vol. total x Hematócrito normal (*)

(*) Consultar tabela.

Valor Normal: de 45 a 55%

5. TEMPO DE PROTROMBINA (Tempo de Quick de um estágio)

O teste do Tempo de Protrombina avalia a atividade coagulante do sistema

extrínseco, incluindo a protrombina (ou seja, todo o “complexo da protrombina”) e o

fibrinogênio.

TÉCNICA

a) a um tubo de 12 x 75 mm, previamente mantido a 37ºC, pipetar 0,1 ml de

tromboplastina e 0,1 ml de plasma (a tromboplastina é ativada, mantendo-se à

37ºC por 5 minutos);

b) homogeneizar delicadamente, deixando por cerca de 20 segundos no banho a

37ºC;

c) adicionar 0,1 ml de CaCl2 M/40, disparando simultaneamente o cronômetro;

d) deixar em repouso cerca de 8 segundos e a seguir iniciar a observação do

desenvolvimento da rede de fibrina (indica o ponto final da retração).

Valor Normal: de 10 a 14 segundos ( 70 a 100% de atividade).

OBSERVAÇÃO

Pode-se usar, alternativamente, tromboplastina a que foi adicionado previamente

cálcio e, nesse caso, colocam-se 0,2 ml de tromboplastina-cálcica e 0,1 ml do plasma.

Os reagentes (Tromboplastina, CaCl2) e tubos, devem estar à 37ºC.

INTERPRETAÇÃO

O reagente tromboplástico tissular utilizado no teste não contém os fatores V, VII e

X, que devem ser fornecidos pelo plasma do paciente, juntamente com a protrombina e o

fibrinogênio. Assim, a deficiência ou ausência de qualquer um desses fatores, resulta em

um prolongamento do Tempo de Protrombina.

Admitindo-se que o fibrinogênio esteja em concentração normal, o prolongamento

do Tempo de Protrombina deve-se à deficiência de alguns dos fatores do complexo da

Protrombina,

O Tempo de Protrombina pode encontrar-se alongado nos seguintes casos: presença

de anticoagulantes circulantes, na deficiência de vitamina K e nas hepatopatias de um modo

geral.

5.1 ATIVIDADE PROTROMBÍNICA

A atividade protrombínica do material é avaliada através do tempo (em segundos) e

de uma curva de atividade (previamente preparada para cada lote da tromboplastina

utilizada).

PREPARO DA CURVA DE ATIVIDADE

Faz-se uma mistura (pool) de pelo menos 3 plasmas normais obtidos do mesmo

modo; distribui-se em 10 tubos da seguinte maneira:

Tubos = 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

“Pool” plasma (ml) = 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

Sol. Fisiológica (ml) = 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

Atividade (%) = 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Com a mesma tromboplastina determina-se o Tempo de Protrombina de cada um

dos tubos; o tempo do tubo l corresponde à 100% de atividade (*).

Valor Normal: 70 a 100% de atividade.

Obs.: O sangue não deve ter mais do que 4 horas de coleta (fatores, como o V,

degradam-se, mesmo mantendo-se o sangue em congelador).

(*) Uma preparação de tromboplastina é considerada de boa qualidade, quando o seu 100%

de atividade, frente a um “pool” de plasmas normais, corresponder a um Tempo de

Protrombina entre 12 e 14 segundos.

6. TEMPO DE RECALCIFICAÇÃO DO PLASMA (T.R.P.)

PRINCÍPIO

A adição de íons cálcio ao plasma (ou sangue) citratado, desencadeia o processo da

coagulação, visto que, com exceção dos íons cálcio (complexados pelo citrato), o plasma

deve conter todos os fatores plasmáticos da coagulação.

O teste avalia todo o sistema de coagulação, principalmente o sistema intrínseco.

TÉCNICA a) a um tubo mantido previamente a 37 C adicionar 0,2 ml de plasma e 0,2 ml de

CaCl 2 M/40. Disparar o cronômetro, homogenizar;

b) deixar em repouso em banho à 37 C, por 30 segundos e a seguir iniciar a

observação da formação de fibrina, inclinando-se levemente o tubo;

c) marcar o tempo decorrido até a formação da fibrina.

Valor Normal: 80 a 120 segundos.

INTERPRETAÇÃO

O TRP encontra-se alterado nos casos de deficiência de um ou mais dos fatores V,

VIII, IX, X, XI e XII, avaliando ainda a Protrombina (II), o Fibrinogênio (I) e a presença

de anticoagulantes.

O resultado é altamente influenciável pelo número de plaquetas existentes no

plasma

7. TEMPO DE CEFALINA OU TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL (T.T.P.)

Trata-se de uma prova de recalcificação na qual, a fim de eliminar-se a influências das

plaquetas (visto que o número das mesmas interfere no TRP), adiciona-se uma quantidade

ótima de fosfolipídeos ( cefalina ou tromboplastina, por ex.).

Técnica

a. pipetar para um tubo de ensaio, 0,l ml de plasma (pobre em plaquetas) e 0,l ml de

cefalina. Homogenizar;

b. incubar por l20 segundos em banho à 37 C, agitando a mistura a cada l0

segundos;

c. adicionar 0,l ml de CaCl 2 M / 40 ; disparar o cronômetro: d. marcar o tempo de coagulação ( tempo de formação da fibrina).

Valor normal: 40 a 60 segundos.

INTERPRETAÇÃO O TTPA é uma prova sensível para avaliar alterações no processo da coagulação.

O alongamento do TTPA, é indicativo de alteração dos fatores V, VII, IX, X, II e I,

ou ainda, de quando existirem anticoagulantes circulantes.

8. TEMPO DE TROMBOPLASTINAPARCIAL ATIVADA (TTPA) OU TEMPO DE KAOLIN-CEFALINA

O TTPA também consiste em uma prova de recalcificação em que as variáveis

constituídas pelo número de plaquetas e pelo grau de ativação dos fatores XI e XII são

eliminadas através da adição de um fosfolípede e de um ativador (celite ou caolin, por

exemplo). Com a adição dessas substâncias, conseguem-se resultados mais reprodutíveis e

uma sensibilidade maior do que nas determinações do T.R.P. e T.T.P.

TÉCNICA

a) em um tubo de ensaio, previamente aquecido a 37ºC, pipetar 1 ml de cefalina;

incubar a 37ºC por 1 minuto;

b) a seguir, adicionar 0,1 ml de caolin; após 2 minutos recalcificar com 0,1 ml de

CaCl2 e disparar o cronômetro;

c) marcar o tempo de formação de fibrina;

d) colocar 0,1 ml de plasma a um tubo mantido previamente a 37º C. Incubar por 1

minuto.

e) adicionar 0,2 ml da mistura cefalina-caolin; incubar por 3 minutos;

f) adicionar 0,1 ml de CaCl2 M / 40; disparar o cronômetro;

g) marcar o tempo de formação da fibrina.

INTERPRETAÇÃO

O TTPA é uma prova sensível para avaliar alterações no processo de coagulação.

O alongamento do TTPA é indicativo de alteração dos fatores V, VII, IX, X, II e I,

ou ainda, de quando existirem anticoagulantes circulantes.

9. FIBRINOGÊNIO (Método de Ratnoff-Menzie)

PRINCÍPIO

O fibrinogênio do plasma pode ser separado das demais proteínas plasmáticas pela

sua transformação em fibrina: submete-se a fibrina à digestão em meio alcalino, havendo

liberação de aminoácidos, entre os quais, a tirosina. Esta pode ser dosada através da medida

de intensidade da cor azul que se desenvolve com o reativo de Folin-Ciocalteau.

TÉCNICA

a) colocar em tubo de ensaio de 20 x 200mm;

1- 10 ml de solução fisiológica

2- 0,5 ml de plasma

3- 0,05 ml de trombina (25 U/ml)

4- bastão de vidro;

b) girar o bastão mergulhado na solução. Utilizando-se a trombina, a coagulação se

processa em 2 ou 3 minutos. Com o decorrer da coagulação, os fios de fibrina

aderem ao bastão.

Embora a reação possa se desenvolver à temperatura ambiente, a mesma se

processa mais eficientemente quando realizada à 37ºC; assim, deve-se manter o

tubo da reação em banho à 37ºC, por 30 minutos, girando-se o bastão a cada 5-

10 minutos, de tal forma que a fibrina se enovele no bastão.

c) desprezar a solução contida no tubo e lavá-lo 3 vezes com solução fisiológica

para eliminar qualquer interferente. O bastão deve ser retirado e lavado 3 vezes

com jatos de solução fisiológica; o coágulo aderido deve ser comprimido

cuidadosamente em papel de filtro, após cada lavagem.

d) recolocar o bastão no tubo, com a fibrina aderida ; adicionar ao tubo 1,0 ml de

NaOH a 10%. Colocar o tubo em Banho-Maria por 10 minutos, tomando-se o

cuidado de cobrí-lo com papel alumínio, para evitar evaporação.

e) após o resfriamento do tubo em temperatura ambiente, adicionar sucessivamente

e na ordem:

1- 7,0 ml de H2O destilada

2- 3,0 ml de Na2CO3 a 20%. Agitar

3- 1,0 ml de reativo de Folin (diluído 1/3 em H2O). Agitar;

f) deixar em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos. Ler em

espectrofotômetro à 650 nm contra um branco, preparando da seguinte maneira:

Branco: - 1,0 ml de NaOH 10%

- 7,0 ml de água destilada

- 2,0 ml deNa2CO3 20%

- agitar

- 1,0 ml de Reativo de Folin

Deixar em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos;

g) a D.O. da cor desenvolvida no sistema a dosar, é diretamente proporcional à

concentração de fibrinogênio ou tirosina, até a quantidade de 0,35 mg de tirosina

(caso a intensidade da cor obtida for superior àquela obtida com 0,35 mg, diluir

a solução e fazer o cálculo proporcional);

h) a quantidade de tirosina correspondente à leitura é determinada em uma curva

padrão de tirosina. Para a conversão da quantidade de tirosina em fibrina,

multiplica-se o valor obtido, pela constante que é a quantidade de tirosina

contida na fibrina, em função do teor de Nitrogênio. Faz-se o cálculo de mg% de

fibrinogênio em função da quantidade de plasma usada para a dosagem (ex.: se

usarmos 0,5 ml de plasma, multiplicamos por 200).

Valor Normal: 165 a 485 mg%

Padrão 1- preparar, a partir da solução estoque de tirosina (20 mg% em HCl 0,1N), uma

solução de uso ¼ (uma parte de solução padrão e 3 partes de água destilada);

2- pipetar para um tubo:

- 1,0 ml da solução de tirosina ¼

- 6,0 ml de água destilada

- 1 ml de NaOH 10%

- 3,0 ml de Na2CO3 20%

- agitar

- 1 ml de Folin

- agitar.

RECOMENDAÇÕES DOS LIMITES TERAPÊUTICOS DA ANTICOAGULAÇÃO ORAL (8)

INR INDICAÇÃO VALOR ALVO VALORES LIMITES

Profilaxia do tromboelismo 2,5 2 - 3

venoso (cirurgia de alto risco)

Tratamento de trombose venosa 3 2 - 4

profunda – prevenção da embolia

em pacientes com fibrilação atrial,

doença cardíaca valvular ou

válvulas biológicas. Profilaxia de

tromboelismo venoso (cirurgia de

quadril)

Embolismo sistêmico recorrente. 3,5 3 - 4, 5

Prótese valvular cardíaca.