Técnicas Moleculares: PCR, Sequenciamento e Southern Blot ... 4... · ANÁLISE DA PCR Calegario et...
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Profa. Renata Faier Calegario
Técnicas Moleculares:
PCR, Sequenciamento e Southern Blot
Técnicas Sorológicas
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁSETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO
AF 073- Biotecnologia Vegetal
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ANÁLISE DA PCR
Calegario et al. Pesq. agropec. bras., Brasília, v.42, n.9, p.1335-1343, set. 2007
Detecção de begomovírus em plantas de Tabaco
Fragmento com aproximadamente 1.200 nucleotídeos para o DNA A, compreendendo as
extremidades 5' dos genes Rep e Cp e toda região comum
RepCP
1200pb
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- Apresenta alguns falsos positivos
- Importante controles +/-
- Sensível (fentograma: 10-18)
- Rápido
- Grande n° amostras
Vantagens:
Desvantagens:
PCR
Controle positivo = amostra conhecidamente positiva
Branco = sem DNA
Controle negativo = planta sadia
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PCR
- Detecção de genes em DNA genômico
- Clonagem de DNA
- Sequenciamento
- Evolução molecular
- Análise de estrutura genômica
- Identificação de mutações
- Diagnóstico de doenças: humanos, animas e de plantas
- Análise de plantas transgênicas
APLICAÇÕES
.....
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VIDEO SEQUENCIAMENTO
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HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Ácidos nucleicos: capacidade de hibridização
Sequências complementares pareiam Estrutura Duplex
Teste de complementaridade
DNA
Southern Blot Northern Blot
RNA
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Sonda: sequência complementar ao DNA alvo
SOUTHERN BLOT
Detecta fragmento do DNA específico no DNA genômico
COMO?
Introdução de nucleotídeos marcados em sequências de DNA
Sondas Radioativas = nt 32P
Não-Radioativas = nt biotina/digoxigenina (colorimétrica
ou quimioluminescente)
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SONDA: sequência complemetar ao DNA
Sequência de interesse DNA genômico
Sequência de complementarao DNA genômico
TTCCAGAA* *******
Sonda com nucleotídeos marcados
SOUTHERN BLOT
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DNA genômico
DNA genômico cortado
SOUTHERN BLOT
1° Passo: Digerir DNA genômico
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2° Passo: Gel Agarose do DNA genômico cortado
SOUTHERN BLOT
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3° Passo: Transferência do DNA do gel para membrana de nitrocelulose
SOUTHERN BLOT
Gel Agarose comDNA genômico
Membrana Nitrocelulose
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SOUTHERN BLOT
3° Passo: Transferência do DNA do gel para membrana de nitrocelulose
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Gel Agarose comDNA genômico
SOUTHERN BLOT
TRANSFERÊNCIA
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SOUTHERN BLOT
4° Passo: Hibridização da Sonda
Sonda
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DNA (-) imobilizadoSonda
Nucleotídeos marcados P32
Membrana (+)
O QUE ACONTECE NA MEMBRANA
Revelação Raio X
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5° Passo: Revelação
SOUTHERN BLOT
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Plantas Transgênicas de Soja: seleção de eventos positivos
SOUTERN BLOT
VIII Jornada Acadêmica da Embrapa Soja
Gel - 3hs
Hibridização
18hs
α32P: d-CTP3 3
4
1 11
4 4 6 66 6
4
Cópias do transgene
DNA total Hind III
Separou o gene
PCR
Souther
Blot
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SOUTERN BLOT
Plantas Transgênicas de Batata
DNA total digerido Eco RI
1 e 5: Marcador Peso Molecular2 e 4: DNA total batata transgênicadigerido co Eco RI3: DNA total batata Não-transgênicadigerido co Eco RI
Southern Blot do gel
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Possibilita rearranjos das inserções que podem levar a perda
das mesmas ou ao silenciamento
Pode comprometer o desenvolvimento e metabolismo da
planta, pelo efeito posicional das inserções
Alto número de inserções do transgene:
SOUTERN BLOT
Importante para a expressão estável
Em estudos de expressão gênica => facilita a interpretação da
real interação entre as moléculas
Poucas cópias:
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Sensibilidade (fentograma)
Quantitativa: nº de cópias do gene integradas ao genoma
Envio de membranas para outro laboratório
Demorado
Caro
Perigoso (sondas radioativas)
SOUTHERN BLOT
Vantagens:
Desvantagens:
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- Importante experimentos de Transformação => Prova
molecular da integração do gene exógeno no genoma vegetal
- Bandas com PM diferente do controle + => indicativo de
alterações no material genético
- Detecta fragmento específico em meio a milhões de
fragmentos
- Usado para distinguir estirpes de um organismo
SOUTHERN BLOT
APLICAÇÕES
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Baseado na reação antígeno – anticorpo de animais de sangue quente
Anticorpos: são proteínas produzidas pelos glóbulos brancos
(linfócitos B)
Vírus: atua como antígeno quando inoculado num animal
Substância formada em reação ao vírus: anticorpo
Antígeno: substâncias estranhas ao organismo
4. MÉTODOS SOROLÓGICOS
Propriedade proteica
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Anticorpo reconhece a CP
Portanto:
O antígeno é a proteína viral = Capa Proteica
Separação dos glóbulos vermelhos
4. MÉTODOS SOROLÓGICOS
Glóbulos Brancos - soro
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- IgG
Região
Invariável
Sítio de reconhecimento da proteína viral
Região variável
Anticorpo
Sítio de reconhecimento da proteína viral
Epitopo Epitopo
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ELISA
Western Blot
Tissue Blot
4. MÉTODOS SOROLÓGICOS
Detecta Proteína Antissoro
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Y-E
O anticorpo 2° ligado
a enzima reconhece Ac 1°
O substrato é adicionadoY
Anticorpo 1°
imobilizado pelo vírus
Vírus adsorvido
Y
Y
Y-E
IndiretoAdaptado de Zerbini, 2002
Reação
Colorimétrica
4.1 ELISA: Enzyme-linked imunosorbent assay
Extrato Vegetal
infectado
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Resultado
+
-
Absorbância Concentração viral
Leitor de Elisa: Mede absorbância (405nm)
Cor Amarela
4.1 ELISA: Enzyme-linked imunosorbent assay
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ELISA: CiLV-C / AS = CP
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Sensível (1 ng/ml)
Rápido
Baixo custo
Seguro
Várias amostras
Quantitativo
Útil para testes de rotina
Vantagens
Desvantagens
Não mede infectividade e reação inespecífica
4.1 ELISA: Enzyme-linked imunosorbent assay
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Eletrophoretic protein separation
4.2 WESTERN BLOT
Extrato vegetal
infectado
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- Enzima: fosfatase alcalina
- Quimioluminescente: CSPD ou CDP-star
- Colorimétrico: NBT/BCIP
4.2 WESTERN BLOT
Vírus
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Calegario et al., 2013
4.2 WESTERN BLOT
1- Proteína Pura2- Lesões novas3 e 4 - Lesões mais velhas5 - Planta Sadia
Western Blot: antissoro contra a CP do CLV-C (1:1000)
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Não mede a infectividade do vírus
Apresenta alguns falsos positivos
Membranas podem ser transportadas
Pode ser iniciada em campo pelo agricultor
Custo moderado
Várias amostras analisadas concomitantemente
WESTERN BLOT
Vantagens
Desvantagens