Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Detecção de ANA por imunofluorescência.

Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Detecção de ANA por imunofluorescência

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Doenças Autoimunes

Ehrlich – “horror autotoxicus”Ehrlich – “horror autotoxicus” Owens (1945) – Apesar da partilha sanguinea os Owens (1945) – Apesar da partilha sanguinea os

gémeos bi-vitelinos não se rejeitam: tolerância gémeos bi-vitelinos não se rejeitam: tolerância imunológica ao gémeoimunológica ao gémeo

Billingham (1953) Billingham (1953) transplantes em ratinhos adultos de estirpes diferentes são transplantes em ratinhos adultos de estirpes diferentes são

rejeitadosrejeitados transplantes em ratinhos neonatais de estirpes diferentes são transplantes em ratinhos neonatais de estirpes diferentes são

aceites mesmo depois de atingirem a vida adultaaceites mesmo depois de atingirem a vida adulta Burnet (1956) Teoria da selecção clonal ou dos clones proibidosBurnet (1956) Teoria da selecção clonal ou dos clones proibidos


Mecanismos de tolerância Imunológica

Eliminação clonalEliminação clonal Anergia ClonalAnergia Clonal Supressão da resposta imunitária (células T Supressão da resposta imunitária (células T

supressoras)supressoras) Falha na apresentação antigénicaFalha na apresentação antigénica

Baixa expressão de HLA-IIBaixa expressão de HLA-II Tecidos imunológicamente privilegiados Tecidos imunológicamente privilegiados

SNC (barreira hemato-encefálica)SNC (barreira hemato-encefálica) Testiculo (baixa temperatura)Testiculo (baixa temperatura) câmara anterior do olho (elevada [TGFcâmara anterior do olho (elevada [TGF])])

Rede idiotipo-antiidiotipoRede idiotipo-antiidiotipo


Mecanismos de Indução de auto-imunidade (I)

Falha de eliminação clonalFalha de eliminação clonal Linfócitos B1(CD5+)Linfócitos B1(CD5+)

Alterações na apresentação Alterações na apresentação antigénicaantigénica

Modificações dos autoantigéniosModificações dos autoantigénios Mimetismo molecularMimetismo molecular Expressão ectópica de HLA-IIExpressão ectópica de HLA-II

Rotura de anergia clonalRotura de anergia clonal IL-2IL-2 Expressão defeituosa de fazExpressão defeituosa de faz Activação policlonalActivação policlonal

LPSLPS SuperantigéniosSuperantigénios

Rotura de anergia clonalRotura de anergia clonal Falha da regulação da resposta Falha da regulação da resposta

imunológicaimunológica Falha das células supressoras Falha das células supressoras

mantém uma resposta em mantém uma resposta em actividadeactividade

Regulação antiidiotipica Regulação antiidiotipica

• reacção cruzada com reacção cruzada com anticorpo anti bacterianoanticorpo anti bacteriano

• Anticorpos mimetizando Anticorpos mimetizando ligandos celulares, ligandos celulares, induzem respostas via induzem respostas via receptores celularesreceptores celulares

Equilibrio Th1/Th2Equilibrio Th1/Th2 Regulação neuro-hormonal da Regulação neuro-hormonal da

resposta imunológicaresposta imunológica


Patologias autoimunes sistémicas e de órgão

LESLES Lúpus discóideLúpus discóide EsclerodermiaEsclerodermia Citopenias autoimunesCitopenias autoimunes Síndrome de GoodpastureSíndrome de Goodpasture

Cirrose Biliar PrimáriaCirrose Biliar Primária Hepatite crónica activaHepatite crónica activa Síndrome Guillain-BarréSíndrome Guillain-Barré UveiteUveite Fibrose Pulmonar Idiopát.Fibrose Pulmonar Idiopát.

Artrite reumatóideArtrite reumatóide Artrite reumatóide juvenilArtrite reumatóide juvenil Sindrome de SjögrenSindrome de Sjögren DMID (Diabetes )DMID (Diabetes ) PsoriasePsoriase Doença de GravesDoença de Graves Doença de HashimotoDoença de Hashimoto Esclerose MúltiplaEsclerose Múltipla Colite ulcerosaColite ulcerosa Doença de ChronDoença de Chron Miastenia GravisMiastenia Gravis


Rheumatoid Arthritis

An autoimmune disorder affecting connective tissue.An autoimmune disorder affecting connective tissue. 3 million afflicted in US3 million afflicted in US Afflicts women during menopauseAfflicts women during menopause

48-52 years of age48-52 years of age shorten life expectancy by 3-7 yearsshorten life expectancy by 3-7 years

Afflicts men = women after 65 years of ageAfflicts men = women after 65 years of age shorten life expectancy by 7-10 years for men.shorten life expectancy by 7-10 years for men.

EtiologyEtiology Combination of factors including a genetic predisposition Combination of factors including a genetic predisposition

and triggered by unknown infectious agent (possibly EBV).and triggered by unknown infectious agent (possibly EBV).


Clinical Manifestations

Joint problems over timeJoint problems over time Occur symmetricallyOccur symmetrically Alteration in the wristAlteration in the wrist

Ulnar driftUlnar driftBoutonniere deformityBoutonniere deformitySwan-neck deformitySwan-neck deformity

Rheumatoid nodulesRheumatoid nodules


EXAMPLE OF ARTHRITIS OF THE LEFT KNEE


Systemic Lupus Erythmatosus

Chronic, inflammatory, autoimmune Chronic, inflammatory, autoimmune disorderdisorder 2 types: discoid and systemic2 types: discoid and systemic

Etiology - unclearEtiology - unclear May be several risk factors - infection, May be several risk factors - infection,

exposure to UVB, environmental irritantsexposure to UVB, environmental irritants


Systemic Lupus Erythmatosus

PathophysiologyPathophysiology Produce autoantibodies due to defect in T-Produce autoantibodies due to defect in T-

suppressor cells; NK cells are also suppressedsuppressor cells; NK cells are also suppressed

Autoantibodies - antinuclear antibodies (ANA) Autoantibodies - antinuclear antibodies (ANA) when cell dies, nuclei bind with ANA, forms when cell dies, nuclei bind with ANA, forms

immune complex that stimulates immune complex that stimulates inflammatory responseinflammatory response

Immune complex also stimulates activation Immune complex also stimulates activation of complementof complement


Discoid Lupus


Lupus


Discoid Lesions: a thick, disk-like rash that scars, usually on sun-exposed areas

Malar Rash (Butterfly Rash)

Arthritis: inflammation of peripheral joints with tenderness, swelling or effusion with skin changes


Oral Ulcers

Pericarditis


Diagnóstico de D. Autoimune (I)

Provas directasProvas directas

Reprodução num recipiente Reprodução num recipiente normal por transferência de normal por transferência de anticorposanticorpos Não aplicável ao HomemNão aplicável ao Homem

Provas indirectasProvas indirectas

Reprodução em animais Reprodução em animais por imunização com auto-por imunização com auto-

antigéniosantigénios Requer conhecimento do Requer conhecimento do

auto-antigénioauto-antigénio Requer a administração Requer a administração

de potentes adjuvantesde potentes adjuvantes Por transferência de Por transferência de

Linfócitos para ratinhos Linfócitos para ratinhos SCIDSCID

Identificação de auto-anticorpos Identificação de auto-anticorpos ou células T auto-reactivas nos ou células T auto-reactivas nos órgãos alvoórgãos alvo


Diagnóstico de D. Autoimune (II)

Provas circunstanciaisProvas circunstanciais Associação com outras doenças auto-imunesAssociação com outras doenças auto-imunes Infiltração linfocitica nos órgãos afectadosInfiltração linfocitica nos órgãos afectados Associação com determinados haplotipos HLAAssociação com determinados haplotipos HLA Detecção sérica de autoanticorposDetecção sérica de autoanticorpos Resposta favorável a imuno-supressoresResposta favorável a imuno-supressores


Clinical Criteria Lab Criteria

Pregnancy Loss-Recurrent spontaneousabortion-Unexplained fetal death

Thrombosis-Venous thrombosis-Arterial Thrombosis,stroke

AutoimmuneThrombocytopenia

Other Disorders-Autoimmune hemolyticanemia-Transient ischemicattacks-Amaurosis fugax-Chorea gravidarum-Livedo reticularis

LupusAnticoagulant

AnticardiolipinAntibodies>15-20 IgG bindingunits

Suggested Clinical and Laboratory Criteria For The Diagnosis of Antiphospholipid Syndrome


How is Lupus diagnosed?

When a doctor thinks a patient may have When a doctor thinks a patient may have Lupus, an ANA blood test is ordered. Lupus, an ANA blood test is ordered.

Other tests such as an anti-dsDNA, anti-Sm, Other tests such as an anti-dsDNA, anti-Sm, anti-Ro/SS-A, and anti-RNP also may be anti-Ro/SS-A, and anti-RNP also may be ordered to determine if a patient has Lupus.ordered to determine if a patient has Lupus.

Complement tests are performed to measure Complement tests are performed to measure the amount of complement proteins the amount of complement proteins circulating in the blood.circulating in the blood.


Diagnostic Studies

ANAs are the best screening testANAs are the best screening test Antibodies to double-stranded DNA (dsDNA) and Antibodies to double-stranded DNA (dsDNA) and

to Sm are relatively specific for SLEto Sm are relatively specific for SLE Determining the complete autoantibody profile of Determining the complete autoantibody profile of

each patient helps predict clinical subsets. High each patient helps predict clinical subsets. High serum levels of ANAs and anti-dsDNA and low serum levels of ANAs and anti-dsDNA and low levels of complement usually reflect disease levels of complement usually reflect disease activity, especially in patients with nephritisactivity, especially in patients with nephritis


Algorithm for the diagnosis of SLE. ANA, antinuclear antibody; ACR, American College of Rheumatology; CTD, connective tissue disease; WBC, white blood cell count; RBC, red blood cell count, *, recommended in initial evaluation.


Diagnóstico de D. Autoimune (II)

Provas circunstanciaisProvas circunstanciais Associação com outras doenças auto-imunesAssociação com outras doenças auto-imunes Infiltração linfocitica nos órgãos afectadosInfiltração linfocitica nos órgãos afectados Associação com determinados haplotipos HLAAssociação com determinados haplotipos HLA Detecção sérica de autoanticorposDetecção sérica de autoanticorpos Resposta favorável a imuno-supressoresResposta favorável a imuno-supressores


Doenças associadas a ANA


Auto-antigénios detectáveis com as células Hep-2


Protocolo para detecção de ANA com células Hep-2 (II)

Soro colhido fresco ou a 4ºC (1-2 semanas) Soro colhido fresco ou a 4ºC (1-2 semanas) ou a –20ºC (periodos + longos) ou a –20ºC (periodos + longos)

Evitar ciclos congelar/descongelarEvitar ciclos congelar/descongelar Congelação pode concentrar o soro Congelação pode concentrar o soro (liofilização)(liofilização)

Testar diluições seriadas do soro em PBS Testar diluições seriadas do soro em PBS (1:40, 1:80, 1:160,...) (1:40, 1:80, 1:160,...) (semi-quantificação do título, (semi-quantificação do título, melhores padrões, evitar falsos positivos )melhores padrões, evitar falsos positivos )


Protocolo para detecção de ANA com células Hep-2 (II)

Láminas com as células Hep-2 em monocamada (vários poços/lâmina). Láminas com as células Hep-2 em monocamada (vários poços/lâmina). Deixar as lâminas chegar a RT antes de abrir o pacote selado.Deixar as lâminas chegar a RT antes de abrir o pacote selado.

Adicionar o soro diluído a testar, e incubar 30 min em incubadora Adicionar o soro diluído a testar, e incubar 30 min em incubadora húmida a RThúmida a RT

Lavar com PBSLavar com PBS Adicionar o secundário (cabra, ovelha ou coelho) marcado com FITC, Adicionar o secundário (cabra, ovelha ou coelho) marcado com FITC,

e incubar como acimae incubar como acima Universal (anti IgH de IgG,IgM,IgA não purificado)Universal (anti IgH de IgG,IgM,IgA não purificado) Anti-IgG (as mais importantes p/ diagnóstico)Anti-IgG (as mais importantes p/ diagnóstico) Anti-IgM (SLE pediátrico)Anti-IgM (SLE pediátrico)

Lavar com PBSLavar com PBS Contrastar com 1 a 2 gotas de Azul de Evan’s a 1% por 100 mL PBSContrastar com 1 a 2 gotas de Azul de Evan’s a 1% por 100 mL PBS Lavar com PBSLavar com PBS Montar em glicerolMontar em glicerol


Padrões Hep-2 (I)


Padrões Hep-2 (II)


Padrões Hep-2


Padrões gerais ANA (Nucleares)


Tipos de padrões Hep-2


Resolução de Problemas

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