Técnicas de microscopia de contraste Técnicas de microscopia de contraste 1.Fluorescência; 2.Luz...

Técnicas de microscopia de Técnicas de microscopia de contrastecontraste

1.1. Fluorescência;Fluorescência;2.2. Luz polarizada;Luz polarizada;3.3. Contraste de fase;Contraste de fase;4.4. Campo escuro;Campo escuro;5.5. Contraste interferencial.Contraste interferencial.

Contraste : interações luz e matériaContraste : interações luz e matéria

Em amostras que dão contraste de até 3%, estas Em amostras que dão contraste de até 3%, estas técnicas melhoram o contraste, permitindo a técnicas melhoram o contraste, permitindo a visualização pelo olho humano.visualização pelo olho humano.

Reações com a luzReações com a luz

LUZLUZ

absorçãoabsorção

Transmissão = Transmissão = luz + fluorescência – (absorção + refração luz + fluorescência – (absorção + refração + reflexão)+ reflexão)

reflexãoreflexão

fluorescênciafluorescência

refraçãorefração


Reações com a luzReações com a luz Espectro de luz visívelEspectro de luz visível (quanto maior o (quanto maior o , menor a , menor a energia) energia)


i

r

ARAR

TECIDOTECIDO

ARAR

TECIDOTECIDO

1ª interação ao 1ª interação ao entrar no tecidoentrar no tecido

2ª interação: 2ª interação: dentro do tecidodentro do tecido

iARAR

TECIDOTECIDO

e/oue/ou == menor intensidade menor intensidade de luz transmitidade luz transmitida

Quais interações resultam nesta Quais interações resultam nesta imagem?imagem?


1

2

3

5yy

xx

1,5

2

3

4

Vetor campo elétricoVetor campo elétricoEE

OndaOnda

• PolarizaçãoPolarização é a natureza vetorial da luz é a natureza vetorial da luz

• Propriedades fundamentais da luzPropriedades fundamentais da luz

- - intensidade;intensidade; - freqüência;- freqüência;

- coerência;- coerência; - polarização.- polarização.

4

• Contraste: tipos de amostraContraste: tipos de amostra1) 1) AmplitudeAmplitude: alteram a intensidade da luz transmitida. Amostras transparentes coradas causam o : alteram a intensidade da luz transmitida. Amostras transparentes coradas causam o

mesmo efeito.mesmo efeito.

2) 2) FaseFase: não absorvem luz, mas causam mudança de fase nos comprimentos de onda que a : não absorvem luz, mas causam mudança de fase nos comprimentos de onda que a atravessam.atravessam.

Amostra transparente

Amostra tipo amplitude

Amostra tipo fase

Amostra tipo misto (maioria)


Sem retardo de fase: amplitude aumentada

Retardo de fase de 90º: amplitude reduzida

Retardo de fase de 180º: amplitude zero

Onda A

Onda B

Resultante

Onda A

Onda B

Resultante

Onda A

Onda B

Resultante

Interferência construtiva

Interferência construtiva

Interferência destrutiva

Reações com a luzReações com a luz Tipos de reflexãoTipos de reflexão

regularregular difusadifusa



- reflexão regular;reflexão regular;- transmissão;transmissão;- absorçãoabsorção



- reflexão regular;reflexão regular;- pouca transmissão;pouca transmissão;- absorção.absorção.



- reflexão regular;reflexão regular;- transmissão;transmissão;- absorção.absorção.


Reações com a luzReações com a luz Tipos de reflexãoTipos de reflexão

DifusaDifusa RegularRegular


Reações com a luzReações com a luz TransmissãoTransmissão


ReflexãoReflexão

1 4

2

3

5

6


Reações com a luzReações com a luz Reflexão e TransmissãoReflexão e Transmissão


Reações com a luzReações com a luz Na face oclusalNa face oclusal


Reações com a luzReações com a luz FluorescênciaFluorescência

Aminoácidos fluorescentesAminoácidos fluorescentes

- - TirosinaTirosina; ; - - FenilalaninaFenilalanina; ; - - TriptofanoTriptofano..excitexcit 275 nm275 nm 260 nm260 nm 295 nm295 nmemissemiss 304 nm304 nm 282 nm282 nm 353 nm353 nm

Compostos aromáticos fluorescentesCompostos aromáticos fluorescentes

-porfirinas (sangue, pigmentos naturais, bactérias)porfirinas (sangue, pigmentos naturais, bactérias)..excitexcit 390-440 nm390-440 nmemissemiss 615 nm615 nm e 675 nme 675 nm


Fluorescências dos tecidos dentaisFluorescências dos tecidos dentais durosduros

excit ótimaexcit ótima emiss máxemiss máx cromóforocromóforoDentina#Dentina#

380 nm380 nm 440 nm440 nm ??

Esmalte#Esmalte#280 nm280 nm 420 nm420 nm ditirosinaditirosina

Cálculo dental*Cálculo dental*407 nm407 nm 604 e 656 nm604 e 656 nm

hematoporfirinahematoporfirinadicátiondicátion

416 nm416 nm 617 e 669 nm617 e 669 nm431 nm431 nm 635 e 683 nm635 e 683 nm

# Zijp, Optical propeties of hard dentasl tissues, Thesis, 2001; # Zijp, Optical propeties of hard dentasl tissues, Thesis, 2001; * Reis et al., Applied Spectr. 2001; * Reis et al., Applied Spectr. 2001;


300 400 500 600 700 800

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Região de sobreposiçãoin

ten

sid

ad

e d

e f

luo

resc

ên

cia

comprimento de onda (nm)

Dentina 380 nm Esmalte 280 nm Cemento 380 nm Cálculo 407 nm

Fluorescências dos tecidos dentaisFluorescências dos tecidos dentais durosduros

Observar comportamento Gaussiano das curvas de fluorescênciaObservar comportamento Gaussiano das curvas de fluorescência


Reações com a luzReações com a luz FluorescênciaFluorescência

400 450 500 550 600 650 700 750 800 850-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

inte

nsi

da

de

comprimento de onda (nm)

Hematoporfirina em 410 nm


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