Tecnologia do DNA Recombinante

Tecnologia do DNA Recombinante

The Roundup Ready Story

• Glifosato (Glyphosate) é um herbicida de amplo espectro

• Ingrediente ativo do herbicida Roundup; • Mata todas as plantas com que entra em contato;• Inibe uma enzima chave (EPSP synthase) no metabolismo de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano).

• Planta morre porque faltam aminoácidos

• Um gene que produz uma enzima resistente (EPSP synthase) ao glifosato permite que as culturas sobrevivam mesmo quando pulverizadas

+ glifosato

X

Plantas sensíveis ao Roundup

X

X

Ácido chiquimico + fosfoenolpiruvato

Ácido 3-Enolpiruvil chiquímico -5-fosfato(EPSP)

Planta EPSP synthase

Aminácidos aromáticos

Sem aminoácidos, planta morre

X

BacteriaEPSP synthase

Ácido chiquimico + fosfoenolpiruvato

Ácido 3-Enolpiruvil chiquímico -5-fosfato(EPSP)

Aminácidos aromáticos

Plantas resistentes ao Roundup

+ Glifosato

Com aminoácidos, planta vive

RoundUp não tem efeito;Enzima é resistente ao herbicida

Teste em campo dos transgênicos

Não-transgênicos

Transgênicos

Resistência a herbicida

Milho RoundUp Ready

Antes Depois

Flavr Savr (Calgene)

O tomate Flavr Savr, foi desenvolvido pela Calgene, uma companhia de biotecnologia com base em Davis, na Califórnia. Vários anos se passaram até que o FDA aprovasse o transgênico. O FDA não exige aprovação, no entanto a Calgene submeteu voluntariamente o FlavrSavr para aprovação em 1989. Em 1994, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos aprovou que este não apresentava risco ao ambiente.

Flavr Savr (Calgene)Tomate transgênico Tomate tradicional

SUPERMERCADO

O tomate tradicional tem de ser colhido verde, para não ser esmagado durante o transporte.

O tomate tradicional é vaporizado com

etileno para induzir a maturação.

O tomate transgênico amadurece na planta, ficando com mais sabor. Mantém-se firme após a colheita.

Flavr Savr

Gene Flavr SavrDNA

RNA mensageiro

RNA inativado

Gene que amolece o tomate (poligalacturonase)

Engenharia genética e Culturas GM Tecnologia do DNA recombinante:

permite a transferência direta de um ou alguns genes entre organismos não

relacionados ou uma modificação através da remoção de um gene ou ainda

alteração na região codante ou no controle da expressão gênica (promotores).

"What is most needed are even- handed, case-by-case assessments of the

benefits and potential pitfalls of GE in comparison with other crop

improvement techniques."

Paul Gepts. University of California Davis. Plant Science.

Estudo Dirigido

1. Tecnologia do DNA recombinante;

2. Variabilidade Genética e o Melhoramento Genético;

3. Definição de Enzimas de Restrição;

4. Tipos de extremidades que são geradas por enzimas de restrição;

5. Aplicações das Enzimas de Restrição;

6. Vetores e Plasmídios;

7. Características dos Vetores de clonagem;

8. Definição de Transformação Genética;

9. Tipos de transformação genética em Bactérias;

Biotecnologia

Metodologias chaves que permitiram avanços inéditos:

(i) A descoberta de enzimas que modificam as moléculas de DNA de

modo que elas posso ser unidas em novas combinações;

(ii) A demonstração de que as moléculas de DNA podem ser

clonadas, propagadas e expressas em bactérias;

(iii) O desenvolvimento de métodos para sintetizar quimicamente e

sequenciar as moléculas de DNA ;

(iv) O desenvolvimento do método de amplificação do DNA in vitro

(reação em cadeia da DNA polimerase).

Personal Reflections on the Origins and Emergence of

Recombinant DNA Technology Paul Berg and Janet E. Mertz (DOI: 10.1534/genetics.109.112144)

Tecnologia do DNA Recombinante é um conjunto de

ferramentas moleculares (técnicas) que permite aos cientistas

identificar, isolar, modificar e multiplicar genes de quaisquer

organismos.

• Enzimas de Restrição e ligação;

• Vetores;

• Transformação Genética;

• PCR;

• Eletroforese;

• Bibliotecas Genômicas;

• Sequenciamento de DNA;

• Hibridização.

Clonagem Molecular

Transgênia

Marcadores Moleculares

Enzimas de restrição (cortam o DNA em sequências específicas)

Enzimas de ligação (ligam sequências de DNA)

DNA Recombinante(DNA quimera; construção sintética)

1. ENZIMAS DE MODIFICAÇÃO DO DNA:

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO:

Proteínas que reconhecem e clivam (CORTAR) a molécula de

DNA em sequências específicas, geralmente de 4, 6 e 8 pares de

bases (pb) – sequências palíndromicas

Características:

Enzimas de restrição são endonucleases;

Enzimas de bactérias;

Diferentes linhagens de bactérias produzem diferentes enzimas

de restrição;

O nome da enzima é derivado do nome da linhagem e espécie

bacteriana em que foi isolada;

Cortam DNA sempre em sequências definidas e sempre de

maneira consistente;

Ferramenta básica em clonagem de genes.

As enzimas de restrição são nomeadas de acordo com a

bactéria que a produziu

RY 13

Exemplo: EcoR I

Escherichia

coli

1º enzima a ser

descoberta nesta

bactéria

Gênero

CepaEpíteto

específico

Ordem de

descoberta

Nomenclatura:

A ligação fosfodiéster é quebrada entre as bases específicas,

uma em cada fita de DNA.

EXTREMIDADES COESIVAS

Algumas enzimas geram extremidades

protuberantes 5’ (5' overhangs) - EcoRI

Algumas enzimas geram extremidades

protuberantes 3’ (3' overhangs) - PstI

Algumas enzimas geram extremidades

abruptas (blunt ends)- SmaI

Mecanismo de defesa presente quando da entrada de DNA de fago na

célula

Combinação de enzimas de restrição com metilases

hidrólise do DNA “estranho”

proteção do DNA celular relativamente as enzimas de restrição

através da adição de grupos metil às bases A ou C

DNA metilase possui a mesma sequência de reconhecimento que os

enzimas de restrição

Sistema de restrição/modificação

Sistema de restrição/modificação

GAATTC

CTTAAG

GAATTC

CTTAAG

G

CTTAA

AATTC

G

AATTC

G

G

CTTAA

G

CTTAA

AATTC

G

G

CTTAA

AATTC

G

G

CTTAA

AATTC

G

EcoRI

DNA LigaseEcoRI sticky end EcoRI sticky end

Juang RH (2004) BCbasics

DNA recombinante

cromossomo plasmídeos

cromossomo plasmídeos

Divisão celular

ocorrem naturalmente em algumas bactérias;

são moléculas de DNA dupla fita e circular;

muitas vezes carregam genes para resistência a antibióticos;

replicação independente da replicação cromossômica (apresentam

uma origem de replicação independente).

2. VETORES:

CONJUGAÇÃO BACTERIANA

Vetores de clonagem

Plasmídeos modificados que permitem a construção de um DNA

recombinante

devem apresentar origem de replicação;

devem apresentar um gene para seleção (gene para resistência a

antibiótico);

devem apresentar múltiplos sítios de clonagem (poli-linker)

Origem de replicação

Genes para resistência a

antibióticos

Permite que a célula hospedeira

cresça em meio seletivo

Múltiplos sítios de

clonagem

Permite a inserção de DNA exógeno

Poli-linker (sítio múltiplo de clonagem)

Vetor de clonagem

DNA de interesse

EcoRIEcoRI

EcoRI

Extremidades coesivas

Ligação

DNA recombinante

Enzima de Restrição

Enzima de Ligação

Uma geração: 20 minutos

3. TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA:

Transformação química

Eletroporação

Transformação: introduzir DNA dentro da célula bacteriana

Transformação química: Cálcio + choque térmico

Suspensão de células

eletrodo eletrodo

cuveta

Eletroporação

Clones resistentes a ampicilina

Clones sensíveis a ampicilina

MC + ampicilina

Células transformadas

Células controle (não transformadas)

Prepara a construção sintética

Célula de E.coli

Transformação

Meio seletivo

Clones recombinantes

DNA

Célula humana

Enzima de restrição

Enzima de restrição

Vetor de clonagem

DNA

Gene de interesse

Vetor

CLONAGEM MOLECULAR

Eletroforese de DNA 3. ELETROFORESE:

Eletroforese

5ul

Mapa de Restrição

A B 10 kb

8 kb2 kb

A

7 kb3 kb

B

5 kb3 kb2 kb

A+B

C A B A+B M

Enzimas de restrição

Juang RH (2004) BCbasics

Cromossomos homólogos

Regiões homólogas codificam para o mesmo gene

Cromátides irmãs

Aplicação

Cromossomos homólogos contém DNA que

codifica par os mesmos genes. Neste

exemplo, os dois cromossomos tem os

mesmos genes nas mesmas posições

(representados pelas tiras coloridas), mas

versões diferentes desse genes (representados

pelas tonalidades diferentes de cada cor).

Indivíduo 1

Homólogo 1

Homólogo 2

3 kb

2 kb 1 kb

Homólogo 13 kb

Homólogo 23 kb

3kb

2kb

3kb

1kb

Indivíduo 2

Aplicação

Gene A

Gene a

Sítio para a enzima d restrição EcoRI

Estudo Dirigido

1. Tecnologia do DNA recombinante;

2. Variabilidade Genética e o Melhoramento Genético;

3. Definição de Enzimas de Restrição;

4. Tipos de extremidades que são geradas por enzimas de restrição;

5. Aplicações das Enzimas de Restrição;

6. Vetores e Plasmídios;

7. Características dos Vetores de clonagem;

8. Definição de Transformação Genética;

9. Tipos de transformação genética em Bactérias;

"The emergence of recombinant DNA technology occurred via the

appropriation of known tools and procedures in novel ways that had broad

applications for analyzing and modifying gene structure and organization of

complex genomes. Although revolutionary in their impact, the tools and

procedures per se were not revolutionary. Rather, the novel ways in which they

were applied was what transformed biology."

Paul Berg and Janet E. Mertz (Personal Reflections on the Origins and Emergence of

Recombinant DNA Technology, DOI: 10.1534/genetics.109.112144)

..nothing in the man-made world rivals the complexity and diversity of

this earth’s organisms. No man-made information

system invented to date comes anywhere close to

containing the amount of information encoded in their

genomes or encompassing the complexity of the intricate

machinery for their functioning. We have

learned enough to reveal how much we do not know

and to acknowledge that nature’s secrets are not beyond

our capabilities of discovery...

Paul Berg and Janet E. Mertz (Personal Reflections on the Origins and Emergence of

Recombinant DNA Technology, DOI: 10.1534/genetics.109.112144)

Histórico do Uso de Tecnologias em Plantas

Mutações induzidas por químicos e/ou radiação aumentar a frequência de variação

genética.

Mutant variety database http://mvd.iaea.org/

rice has registered 824 varieties, barley (312), wheat (274), maize (96), common bean (57), tomato

(20), potato (16), sugarcane (13), soybean (2)…

Tecnologia de sementes híbridas para gerar plantas heterozigotas com melhor

desempenho produtivo e resistente a pragas e doenças.

Sementes hibridas e Linhagens puras

http://www.isaaa.org/resources/publications/agricultural_biotechnology/download/Agricultural_Biotec

Parental 1 Parental 2X

F1

F2

F3

F4

F5

F6

Hibrido

Linhagem Pura Estável

Hibridização

Repetições de auto-polinização e seleção

Cultura de tecidos Cultivo de células de plantas, tecidos ou órgãos em meio de cultura

especialmente formulados. Em condições apropriadas uma planta inteira pode ser regenerada.

Micropropagação é um método de cultura de tecidos desenvolvido para a produção de

material vegetal livre de doenças e para a rápida produção de muitas plantas de maneira

uniforme. Células meristemáticas são cultivadas em meios de cultura especiais e tradadas com

hormônios vegetais para produzir plantas similares.

Melhoramento em base em seleção assistida por marcadores moleculares Localizar marcas

(sequências de DNA) localizadas próximas a genes que codificam características desejáveis

(marcas moleculares ligadas a genes de interesse) que segregam juntas na progênie mapa de

ligação genética.

…molecular marker-assisted breeding, an agricultural biotechnology tool is already a

routine step in breeding of most crops where the gene and the markers for a specific

trait are known.