TERAPIA GÊNICA NA

REESTENOSE E NA ISQUEMIA

CRíTICA DOS MEMBROS

o avanço da biologia molecular. nas últimas décadas aumentou signíficativamente nosso conhecimento sobre como os genes se expressam e são regulados nas células de mamíferos. EsseconlÍecimento foi transferido para a biologia do sistema cardiovascular, visando o tratamento de doenças. Neste artigo é feita urna revisão e atualização sobre as técnicas de terapia gênica e o seu uso emreestenoses e isquemia crítica de membros. São apresentadQs os requisitos necessários para a terapia gênica, incluindo a obtenção do material genético, a transferência do gene, a sua clonagem, os vetores para transferência genética para a célula alvo e os resultados iniciais emreestenose e isquemia crítica de membros. "

Unitermos: genes, angiogênese, hiperplasia intimai, fatores de crescimento. I.m.... ____ ~ __ ~_ ................................... _ ..... _'__' .. '

A' té pouco tempo atrás, a genética

médica se ocupava principal­mente de estudo de síndromes

e doenças raras, tais como, síndrome de Down ou trissomia do 21, síndrome de Turner, síndrome de Klinefelter, etc. A partir de 1980, houve uma verdadeira revolução no campo da genética, com a introdução da genética molecular, abrindo-se novos caminhos no estudo do câncer, diabetes, aterosclerose etc7

•

-+ Bases moleculares da doença

- D, mendelianas (1 gene)

A nova genética abriu perspectivas no estudo das doenças genéticas, como doenças mendelianas (associadas a defeitos em um gene), nas doenças de herança multifatorial, em que há uma interação entre gene e meio ambiente, nas doenças citogenéticas, associadas às aberrações no número de cromossomas, e outras doenças. Além disso, a nova genética abriu perspectivas na produção de agentes ativos, através de técnica de

- D. herança multifatorial (gene+ ambiente)

- D. citogenéticas (alteração no número de cromossomos)

- Outras

-+ Produção de agentes ativos (DNA recombinante)

- t-PA /" ( Bactéria h , _ Insulina Gene -.....,..~./' Protezna. - Hormônio de crescimento ~

- Eritropoetina, etc

-+ Terapia gênica Gene -+

Fig. 1- Perspectivas de estudo pela genética molecular.

Tratamento de Doenças

Winston Bonetti Yoshida Professor Assistente Doutor da Disciplina de Cirurgia Vascular Departamento de Cirurgia e Ortopedia. Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP - Universidade Estadual Paulista.

DNA recombinante . Segundo essa técnica, um materi al genético é introduzido em uma bactéria ou cultura de células, de modo que estas venham a produzir uma proteína de interesse. Por esta técnica, agentes tais como o ativador tecidual do plasminogênio, a insulina, o hormônio do crescimento, a eritropoetina etc. , passaram a ser produzidos em grande escala. Finalmente, a nov a genética abriu perspectivas no trata­mento de doenças. Através de tecnologia similar ao do DNA recombinante, o material genético é introduzido em um tecido com o objetivo de tratar uma determinada doença7,9 (Fig. 1). A terapia gênica (TG) seria, por defini­ção, a transferência de material genético exógeno para um tecido ou órgão, com o objetivo de produzir uma alteração provisória ou definitiva na sua função , de modo a prevenir ou tratar uma doença9,25. Essa transferência pode ser feita com modificação do DNA do tecido receptor, trocando-se ou corrigindo-se o material genético desse tecido. Entre­tanto, na prática, devido às dificuldades técnicas desses processos, o que tem sido feito é uma adição genética de um gene que produza quantidades sufici­entes do produto desejad025

•

A primeira tentativa de TG foi feita por Blaese e co1.4

, em 1990. Neste estudo, os autores resolveram testar a TG na deficiência da enzima desaminase de adenosina (deficiência da ADA), que é uma doenç a genética que acarreta imunodeficiência combinada grave, que obriga os portadores a viverem isolados do ambiente, dentro de bolhas plásticas, O tratamento convencional desta afec-

70 CIRVASC ANGIOL 16: 70-77, 1999

t

TERAPIA GÊNICA NA REESTENOSE E NA ISQUEMIA CRíTICA DOS MEMBROS

~ Síntese do cDNA

~ Transferência para bactéria

~ Clonagem (amplificação)

~ Transferir -7 cél. alvo

Promotor =

plasmidio

o . I

00 Transferência de gene /o<6~ ~ Escapar enz. lisossomais

~ Atravessar m. nuclear ~ , . , . , _ ,I_ ' _'_ cE

~~CML I ~ Escapar endonucleases

~ Incorporar ao DNA Parede arterial

~ Expressar

Fig. 2- Requisitos para terapia gênica (Adaptado de Hedin e coI. 14).

Ácidos nucléicos

cDNA

DNA

Transcriptase .. reversa

nRNA

ou proteína

Proteínas

• P. estruturais

- Colágeno

- Músculo, etc

• Enzimas

• Anticorpos

Fig. 3- Representação esquemática da síntese protéica e síntese do cDNA através da transcriptase reversa.

ção é o transplan te de medu la, com índices do sucesso em torno de 75%. A TG neste caso proporcionou resultados excelentes, porém temporários. • A TG abriu também perspectivas no tratamento de doenças cardi ovas­culares ' 4,17, especialmente nas rees­tenoses pós-angioplastias com balãos, na isquemia crítica de membros (através de angiogênese)' 8. 27 , na engenharia genética de enxertos (pavimentação com células endoteliais modificadas? e na prevenção de trombose30, diminuindo a hipercolesterolemia 13 (através do au­mento de receptores para LDLlIDL), aumentando as ati vidades da ciclo­oxigenase da proteína C ou do ativador tecidual do plasminogênio (t-PA).

REQUISITOS PARA TG

Os req ui sitos básicos para TG estão expressos na Figura 2. O primeiro deles é a obtenção ou síntese do gene que irá expressar o resultado de interesse. Em seguida esse material genético deve ser transferido para o DN A de uma bactéria, para qu e possa ser clonado e am­plificad021

• Uma vez amplificado em q uantidade suficiente, este pode ser transferido para a célula alvo. Nessa transferência, esse material deve escapar das enzimas lisossomais, deve atra­vessar a membrana nuclear, deve escapar das endonu cleases, deve ser incor­porado ao DNA da célula alvo e deve expressar a proteína de interesse. Vamos

CIR VASC ANGIOL 16: 70-77 1999

WINSTON BONETTI YOSHIDA

analisar, a seguir, cada uma dessas etapas9. 14

•

SíNTESE DO GENE

O genoma contém o conjunto completo de cromossomas com os genes carac­terísticos de cada espécie. Os genes são um segmento do DNA com o arquivo completo da seqüência de amino-ácidos de uma cadeia polipeptídica (Figura 3). No homem o número de genes é bem maior que o necessário para codificar as mais de 100.000 proteínas conhecidas, ou seja, apenas 2 - 3% do DNA humano codifica proteínas9. Os genes, para se expressarem precisam de uma seqüência promotora e uma seqüência reguladora que ativam os genes e controlam sua atividade9. A obtenção do gene para fins de TG, de modo geral, é feita pelo caminho inverso da síntese proteica e o DNA obtido dessa forma é chamado de DNA complementar, ou cDNA I4

.

A síntese proteica começa pela trans­crição, ou seja, o RNA nuclear copia uma seqüência de bases que codifica deter­minada proteína. Ainda dentro do núcleo da célula, o RN A sofre um proces­samento, com a retirada dos INTRONS, que são seqüências sem função codifi­cada, permanecendo apenas os EXONS, que contêm a informação codificada. O RN A processado atravessa a membrana nuclear, passando a ser chamado de RN A mensageiro (mRNA) e ao nível do ribossoma é feito o processo de TRA­DUÇÃO, em que cada seqüência de 3 bases (CÓDONS) codifica um amino­ácido de cadeia polipeptídica. O caminho inverso dessa seqüência pode ser feito com auxílio de uma enzima descoberta nos vírus, chamada de transcriptase reversa . Assim, conhecendo-se a se­qüência de amino-ácidos de uma cadeia polipeptídica ou o seu mRN A, pode-se sintetizar o DNA complementar (cDNA) correspondente, que será diferente do DNA original apenas pela ausência da seqüência de INTRONS. O cDNA assim obtido, é muito utilizado em TG9.

71

TERAPIA GÊNICA NA REESTENOSE E NA ISQUEMIA CRíTICA DOS MEMBROS

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Endonucleases (EcoRi)

-+ DNA cortado tende a se religar

-+ Pedaços de DNA de diferentes espécies cortados pela mesma enzima tendem a se religar com seu gene complementar

t DNAligase

-se um DNA r

· .. 1··· ~ I ii [ t i I

~ÀÀT T C

CTTAAG

... . .. ! ... .,

G

CTT A II ! ! ! II

'" ) ... .", ,;; ,

j I j 1 1 ClAATTC

CT1'AAG ! ! : ! ! ! . ...

/

Fig. 4- Representação esquemática da utilização da enzima de restrição na tecnologia do DNA recombinante (Adaptado de Farah9

).

TRANSFERÊNCIA DE GENES (DNA RECOMBINANTE)

Além da síntese do cDNA, constitui o requisito seguinte para a TG, e trans­ferência do material genético para uma bactéria e para outra célula. Isto é feito através da tecnologia do DNA recom­binante9. Essa tecnologia foi concebida a partir da observação da ação e reação do ataque de vírus bacteriólogos em bactérias. As bactérias resistentes a esses vírus possuem enzimas, denominadas de enzimas de restrição (Figura 4), que reconhecem uma seqüência da cadeia do DNA viraI e cortam de forma precisa o DNA, fazendo a leitura da seqüência de pares de bases nos 2 sentidos. P"or exemplo, a enzima Eco-Ri corta o DNA toda vez que encontra a seqüência -GAATTC- e -CTTAAG-. O DNA da própria bactéria não é cortado porque este possui grupos metila em seu DNA, que impede a ação enzimática9. Assim, se colocarmos em um tubo de ensaio um DNA humano e a enzima de restrição denominada Eco-Ri, o DNA vai ser cortado ao nível das seqüências acima referidas. Se colocarmos em um outro tubo de ensaio o DNA de uma outra bactéria susceptível à referida enzima, o DNA da mesma vai ser cortado da mesma

forma. Uma característica importante nos dois casos, é que, ao se retirar a referida enzima, e colocando-se a enzima DNA ligase, o DNA tende a se religar com os seus os fragmentos complementares9. Assim, se colocarmos no mesmo tubo de ensaio, o DNA humano e o DNA bacteriano e adicionarmos a mesma enzima de restrição, os materiais gené­ticos vão ser cortados da mesma maneira, nas seqüências características da enzima adicionada. Porém, ao colocarmos o DNA ligase, os fragmentos comple­mentares dos DNA's humano e bacte­riano vão se acoplar, gerando assim um DNA composto por material genético humano e bacteriano, que é chamado de DNA recombinante. Essa tecnologia é fundamental para a TG9.

CLONAGEM

Para se usar o cDNA, em TG, é preciso produzi-lo em grande quantidades. A tecnologia do DNA recombinante permite a clonagem e amplificação desse material. Clonagem significa copiar e multiplicar o material genético de interesse. Para isso, em geral se usam bactérias. Algumas bactérias têm um DNA circular, cuja função não está ainda bem estabelecida, denominado de plasrrúdio. Se colocarmos no mesmo tubo de ensaio o material

WINSTON BONETTI YOSHIDA

genético humano, o plasrrúdio e a mesma enzima de restrição, o material genético humano será incorporado ao plasrrúdio após a colocação de DNA ligase9. Normalmente se utilizam plasrrúdios que contêm dois genes que conferem re­sistência a dois antibióticos. Semeando­se as bactérias em meios de cultura com um ou outro antibiótico, as seguintes situações podem ocorrer9: 1. Bactéria sensível aos dois antibióticos­bactéria não incorporou o plasmídio. 2. Bactéria resistente aos dois antibió­ticos- plasrrúdio não incorporou o cDNA no lugar do gene de resistência. 3. Bactéria sensível a um antibiótico­bactéria possui o plasmídio recom­binante, pois o cDNA entrou no lugar de 1 gene de resistência. Assim, as bactérias com plasmídios formarão colônÍas na placa de cultura e cada colônia terá um plasrrúdio com material genético humano próprio. Separando-se cada colônia e semeando-as em placas diferentes, cada placa terá um clone geneticamente igual da bactéria. A partir daí é só descobrir qual clone contém o gene de interesse e multiplicá-lo indefinidamente em placas de cultura para se obter grande quantidade do plasrrúdio com o cDNA. O plasrrúdio pode ser isolado ou separado das bactérias através de técnicas químicas (incubação com NaOH) ou físicas (ultracentrifugação )9,25.

TRANSFERÊNCIA DE GENES PARA A CÉLULA ALVO­

VETORES

Uma vez obtido o cDNA em quantidades adequadas, este precisa ser transferido para a célula alvo para que possa se expressar e agir no sentido da produção de proteínas que contribuam para a pre­venção ou tratamento da doença. A transferência do material genético pode ser feita por meio de métodos físicos, métodos químicos ou através de vetores biológicos, sendo os dois últimos os mais usados para TG14

,21

(Figura 5).

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TERAPIA GÊNICA NA REESTENOSE E NA ISQUEMIA CRíTICA DOS MEMBROS

Célula Alvo

Vírus DNA

Solução lipídica

+

recombinante

I o ... @-......

Vesícula de lipossomo

o

Fig. 5 - Representação esquemática da transferência de genes por meio de vírus ou lipossomos (Adaptado de Hedin e coi. 14). A - vírus; B - lipossomos

ESTRATÉGIAS PARA INTRODUZIR DNA ESTRANHO NO VASO

-+ Transferência "ex-vivo" (indireta) - Remoção de células vasculares - Introdução do material genético desejado - Reintrodução da célula genéticamente

modificada no vaso

-+ Aplicação clínica - Células endoteliais - Revestimento de segmentos arteriais

de endotelizados - Revestimento de próteses arteriais e

enxertos autólogos - Revestimento de "Stents"

A

=== ===

f

=-= ===

WIt;JSTON BONETTI VOSHIDA

reações inflamatórias agudas e, além disso, proteínas das células alvo podem ser usadas para replicar os vírus mo­dificados8. 10, 14, 21.

TRANSFERENCIA DO MATERIAL GENÉTICO NOS VASOS

SANGüíNEOS

Existem duas estratégias para se introduzir DNA estranho nos vasos sangüíneos lo. Uma delas é a transferência "ex-vivo", ou indireta, em que se faz a remoção de células vasculares (endoteliais), coloca-se em meio de cultura para multiplicação, introduz-se o material genético desejado e se reintroduz as células geneticamente modificadas no vaso (Figura 6). Essa técnica seria potencialmente usada no revestimento de segmentos arteriai s deendotelizados, no revestimento de próteses arteriais e enxertos autólogos e no revestimento de "stents" ou endo­próteses. Esta teria a vantagem de ser altamente eficiente em termos de percentual de células transgênicas conseguidas, mas é uma técnica de custo elevado para se retirar as células, para cultivar e transformar e para se reimplantar essas células. Além disso, ocorre perda da expressão genética com o fluxo sangüíneo. Uma outra alternativa é a transferência

Fig. 6- Estratégia indireta de transferência de material genético em vasos direta "in vivo" 5. Para tal há necessidade sangüíneos.

O método químico consiste em colocar o plasrnídio recombinante em uma sorução Iipídica que acaba formando uma vesícula Iipossômica em tomo do plasrnídio. Os lipossomos são vesículas lipídicas, positivamente carregadas artificialmente, que incorporam cDNA-plasrnídios car­regados negativamente 10. Essa vesícula, sendo lipídica, atravessa a membrana celular e nuclear e carrega consigo o plasmídio para dentro da célula e do núcleo. O problema desse método é a baixa eficiência9, 10, 14.

O outro método utilizado é através dos vírus I. 9, 10, 14. Para tal, os vírus devem sofrer uma modificação, com a retirada de genes

que fazem sua replicação, e introdução, no seu lugar, do material genético que se deseja transferir à célula alvo. Os vírus entram na célula alvo e liberam o material genético, o qual se incorpora ao genoma da célula. Para esse fim, podem ser usados os retrovírus (vírus com RNA). ou adenovírus (vírus com DNA). Os retrovírus são muito eficientes em células em di visão, mas pouco eficientes em células estáveis como por exemplo, o endotélio. Além disso, os retrovírus podem eventualmente ativar oncogenes. Os adenovírus, por outro lado, são mais eficientes em células estáveis, mas costumam desencadear reação imunológica nas células alvo , com

CIR VASC ANGIOL 16: 70-77, 1999

de se utilizar catéteres para liberação endovascular, os quais levam o material genético na sua extremidade5, 8, 10. I I, 14. 21.

Vários tipos de catéteres foram criados para se fazer a liberação endovascular "in vivo" do material genético (Figura 7). O primeiro a ser criado foi o catéter com duplo balão, com orifício entre os dois balões20

. Os dois balões insuflados isolam um trecho do vaso sangüíneo e, pelo orifício, o sangue é retirado e, em seguida, o material genético é intro­duzido. Uma vez que o material genético tenha sido mantido em contato com a parede vascular por algum tempo (em geral 30 - 40 min)8, o excesso é retirado pelo orifício e os balões desinsuflados

73

TERAPIA GÊNICA NA REE~TENOSE E NA ISQUEMIA CRíTICA DOS MEMBROS .

A B

C D

(a)

Perioratedballoon

E -3~ ( ~ ~ F Hydropl..-iNd bfAlloon

Fig. 7- Catéteres usados para transferência direta de material genético em vasos sangüíneos. A - catéter duplo balão; B - catéter multiperfurado; C - catéter poroso; D - catéter multicanal; E - catéter HidrogelR; F - catéter DispatchR•

para permitir a passagem do fluxo sangüíneo e a retirada do catéter. A desvantagem deste catéter é que os balões podem causar trauma vascular e que estes não podem ser usados na circulação coronariana porque, nesta, ramos arteriais importantes emergem no intervalo entre os dois balões (por onde o material genético pode escapar) e por causa de longo período de isquemia necessário para se transferir o material genéticos. Um outro tipo de catéter criado permitiu uma transferência mais rápida do material genético para a parede vascular. Esse catéter apresenta um balão multiperfurado em sua extremidade, sendo o material genético praticamente injetado na parede vascular através de múltiplos jatos que saem através dos orifícios do balão. O problema deste catéter é a possível lesão endotelial causada por esses jatos. Para contornar esse problema, foi criado um catéter-balão semelhante, porém, no qual o balão é microporoso e o material genético é liberado mais lenta e delica­damente. A desvantagem deste instru­mento é que ocorre grande perda de material genético na circulação distal durante a insuflação desse balão. Em função desses problemas foi criado o

catéter balão multicanelado, que apresenta um balão principal, que interrompe o fluxo sangüíneo, e envol­vendo esse balão principal existe uma série de outros pequenos balões que são multiperfurados por onde o material genético é aspergido na parede vascular. Em um outro tipo de catéter o balão é revestido por uma película de um material hidrófilo chamado de HidrogelR

, o qual é impregnado com material genético. Em contato com o meio sangüíneo solubiliza­se e permite a transferência do DNA para a parede vascular. A desvantagem deste catéter é que para não ocoo·er a solubili­zação precoce do HidrogelR, este precisa ser introduzido dentro de uma bainha, sendo o balão exposto somente no local onde se fará a introdução do material genético. Para circulação coronariana em especial, foi criado um catéter denominado DispatchR

• Este é composto por um balão helicoidal que, ao ser insuflado, isola vários segmentos vasculares da circu­lação sangüínea, ao mesmo tempo que arma e abre uma luz no mesmo, por onde o fluxo sangüíneo pode continuar passando, sem causar isquemia. En­quanto isso, por entre as alças helicoi­dais dos balões, o material genético pode

WINSTON BONETTI YOSHIDA

ficar em contato com a parede vascular. Mais recentemente, tem sido feita com sucesso a introdução de material gené­tico (para estimular a angiogênese) por via intramuscular, em casos de isquemia de membros3

•

EXPERIÊNCIA PIONEIRA COM TRANSFERÊNCIA DE GENE EM

VASOS SANGüíNEOS

A primeira evidência experimental da possibilidade de transferência genética em vasos sangüíneos, foi feita por Nabel e coI. em 19902°. Neste trabalho, os autores fizeram a transferência do gene da ~ -galactosidase para a parede da artéria ilíaca de porcos, utilizando o catéter com duplo balão e retrovírus e lipossomas como vetores do material genético. A expressão da ~ -galac­tosidase é avaliada no tecido com o corante X-GAL, que se torna azul na presença de atividade da ~-galacto­sidase. Os autores mostraram que o retrovírus era mais eficiente que os lipossomas para a transferência de genes e que a expressão genética diminuía com o tempo. Mais recentemente, esse mesmo grupo de pesquisadores demonstrou que não só as paredes arteriais normais, mas também as ateroscleróticas são capazes de incorporar e expressar o material genético introduzid024

.

TERAPIA GÊNICA NA REESTENOSE

Um importante alvo da TG é a rees­tenose. Trata-se de uma complicação muito freqüente , ocorrendo em 30 a 35 % das angioplastias coronarianas. Além disso, o seu tratamento é muito caro, custando cerca de U$ 2 bilhões/ ano só nos EUA, e costuma ser refratária a todos os agentes farmacológicos até agora testados. Fi­nalmente, a proliferação das células musculares lisas, seria um atrativo im­portante para a estratégia da TG". O modelo experimental clássico para o estudo da reestenose e hiperplasia

74 elR VASe ANGIOL 16: 70-77, 1999

TERAPIA GÊNICA NA REESTENOSE E NA ISQUEMIA CRíTICA DOS MEMBROS

intimai é o modelo do catéter de Fogarty passado várias vezes na carótida de ratos ou coelhos8, 22. Após as sucessivas passagens do catéter de Fogarty, ocorre a remoção do revestimento endotelial, expondo o colágeno subendotelial. Com isso ocorre agregação das plaquetas no segmento deendotelizado e, depois de alguns dias, há ativação de células musculares lisas (CML) que acabam migrando depois de quatro dias para íntima, onde proliferam depositando matriz extracelular e causando uma hiperplasia intimaI (HI) com estenose vascular l6

•

Vários trabalhos experimentais foram feitos com sucesso no sentido de prevenir a HI. Assim, foram feitas transferências de DNA inibindo a expressão da divisão das CML, trans­ferência de genes inibidores da divisão das CML, transferência de genes da NO­sintase, com diminuição da reendo­telização e da proliferação da CML 14.

Além disso , foi feita com sucesso a terapia gênica "suicida", em que foi transferido para a parede vascular o gene da Timidino-quinase que por si só não é tóxica para as CML. Entretanto, quando se adiciona ao animal o Ganciclovir, o produto do gene passa a ser tóxico para asCMU6•

A título de exemplo, no trabalho de Chang e col. 6, foi utilizado o modelo experimental de deendotelização de artéria ilíaca de porcos com catéter de Fogarty. Nos animais controle houve maior hiperplasia intimai, caracteri'zada por aumento da relação neoíntima/média, e nos animais que receberam o gene do retinoblastoma (proteína que inibe a progressão do ciclo celular), tendo como vetor um adenovírus, houve diminuição significante dessa relação íntima/média em comparação ao controle. Em um outro exemplo Neschis e coJ.22 produziram espessamento intimai em artéria femoral de coelhos com o catéter de Fogarty. Os autores verificaram diminuição significante da relação íntima/ média nos animais que receberam ma­terial genético expressando a proteína

anti-fator de crescimento de fibroblastos básico (anti-bFGF) , em relação ao controle, que não recebeu material genético e em relação aos animais que receberam o gene que expressa a b­galactosidase e que não tem nenhuma interferência no processo de hiperplasia intimal. Se de um lado os estudos experimentais foram um sucesso, de outro lado, os estudos clínicos foram todos desa­pontadores l4

. Para explicar esse fato , levantaram-se as seguintes hipóteses: o delineamento dos trabalhos clínicos, sem possibilidade de controle de todas as variáveis, seria diferente do delinea­mento dos trabalhos experimentais, em que a maior parte das variáveis pode ser controlada; a fisiopatologia da HI em artérias humanas, com aterosclerose, seria diferente das artérias normais de ratos ou de outros animais de expe­rimentação; o mecanismo da reestenose seria, na verdade, mais complexo, envolvendo o remodelamento e con­tração vascular lo• 14, 16.

TERAPIA GÊNICA NA ISQUEMIA CRíTICA

Outro importante alvo da TG é a isquemia crítica de membros, através da transferência de material genético expressando fatores de crescimento da angiogênese . A angiogênese é um processo biológico pelo qual nossos vasos sangüíneos se desenvolvem a partir de uma vasculatura pré-existente. Ocorre brotamento de novos vasos sangüíneos a partir de pequenos vasos pré-existentes, estando en vol vidos neste processo as células endoteliais e os pericitos. Esse processo é modulado por estimuladores, inibidores e pelo fluxo sangüíneo ' 8.

Os fatores de crescimento são polipépti­des originalmente isolados de estudos com tumores. São conhecidos mais de uma dezena desses fatores l 8, mas so­mente dois têm sido empregados em TG: o bFGF (fator de crescimento de fibro­blastos básico), que é um potente

CIR VASC ANGIOL 16: 70-n, 1999

WINSTON BONETTI YOSHIDA

estimulador da vasculogênese, com atividade vasodilatadora e de abertura de circulação colateral e o VEGF (fator de crescimento do endotélio vascular), que é uma glicoproteína estimuladora da angiogênese, estimulando a dissolução da matriz, a migração celular, a prolife­ração e adesão celular e a formação de tubos. Unger e coJ.29, verificaram que a infusão de bFGF na circulação distal coronariana de cães, com ligadura proximal da artéria coronária esquerda, promove aumento do fluxo sangüíneo no epicárdio, endo­cárdio e total, em avaliação feita com microesferas radioativas. Foi feita infusão diária de bFGF através de catéter colocado num ramo distal coronário por 5 dias/sem/4 sem. Pu e coI. 23, fizeram a infusão de VEGF na dose de 4 mg/dia/lO dias por via 1M em membros isquêmicos de coelhos e a avaliação arteriográfica após 10 dias mostrou aumento da circulação colateral nos animais tratados com VEGF, em relação aos controles, tratados com solução salina. Utilizando-se agora da tecnologia da TG, Mesri e coI. 19, fizeram a transferência de gene de VEGF em peritôneo de camun­dongos usando como vetor o adenovírus (vírus Herpes modificados). Os. autores demonstraram aumento significante da quantidade de hemoglobina peritoneal nos animais tratados com essa TG. Takeshita e coI. 28 fizeram, em um modelo de isquemia de membros em coelhos, a transferência do gene da VEGF por via endovascular, utilizando o plasmídio como vetor e a técnica do catéter HidrogelR

, mencionado anteriormente. Os autores verificaram aumento do fluxo sangüíneo para o membro isquêmico e também aumento da relação capilar/ miócito em cortes histológicos. Essa mesma técnica foi usada pela primeira vez em seres humanos por Isner e coI. 15, em uma paciente diabética com isquemia do MID, sem possibilidade de restauração cirúrgica. Foi utilizado plasmídio com ph VEGF introduzido por

75

TERAPIA GÊNICA NA REESTENOSE E NA ISQUEMIA CRíTICA DOS MEMBROS

catéter HidrogelR na artéria poplítea. Houve aumento da circulação colateral avaliada por arteriografia um mês depois e houve melhora clínica da paciente. Entretanto, com o aparecimento de um angioma no dorso do pé após um mês e após cinco meses a paciente sofreu amputação. Mais recentemente, foi publicado por Baumgartner e coI. 3 o tratamento de dez extremidades de nove pacientes com is­quemia crítica de membros inferiores, através da injeção 1M de plasmídio com phVEGF. Houve aumento transitório dos níveis séricos de VEGF (técnica de Elisa) e aumento significante do índice de pressão tornozelo-braço feito com Doppler (0,33±0,05 para 0,48±0,03, p= 0,02). Em oito membros a arteriografia mostrou melhora da circulação colateral.

SUMMARY

Em 4/7 membros houve cicatrização ou melhora de úlceras . Dos 10 membros, três sofreram amputação abaixo do joelho. Apesar do sucesso inicial, ainda restam algumas dúvidas em relação à angiogênese: não se sabe se a nova rede arterial é estável; os fatores de crescimento aparentemente neces­sitam de isquemia para funcionar (controverso); poucos fatores de crescimento foram testados até agora; os sistemas de implante endo ­vascular não foram estudados comparativamente; a segurança da técnica precisa ainda ser comprovada quanto às áreas não alvo e quanto ao desenvolvimento de tumores; o trauma do catéter pode causar ateroscleroseI4,18 .

GENE THERAPY FOR RESTENOSIS ANO CRITICAL ISCHEMIA OF L1MBS

The advances in molecular biology over the lasf decade have increased our knowledge of how gene are expressed and regulated in mammalian celIs. This knowIedge has been translated to investigatíons of the biology of the cardiovascular system, targeting the treatment of díseases. This artic1e focuses the techníques of gene therapy, providiug an overview of the methodology for gene achievement, its c10ning and delivery, and gives examples oflaboratory and cliuical molecular genetic treatrnent of restenosis and criticallimbs ischemia. Key-words: genes, angiogenesis, intimal hyperplasia, growth factors.

WINSTON BONETTI YOSHIDA

CONCLUSÃO

A TG ainda é uma técnica experimental com potencial terapêutico a ser testado em humanos. Esta tecnologia deve envolver uma equipe multidisciplinar em que deve ser incluído também o cirurgião vascular e angiologista. A segurança dessa técnica ainda não está totalmente esclarecida, quanto aos territórios não alvo e quanto à oncogênese. O seu sucesso depende de conhecimento da fisiopatologia das doenças vasculares, uma vez que o alvo da TG é bastante específico. Agradecimento: Agradecemos ao Dr. José Dalmo de Araújo, pelo estímulo na revisão deste assunto e ao Dr. Hamilton Almeida Rollo pela revisão do texto e sugestões.

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TERAPIA GÊNICA NA REESTENOSE E NA ISQUEMIA CRíTICA DOS MEMBROS

REFERÊNCIASBIBUOGRÁRCAS

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