Terapia Gênica e Nanotecnologia - Marilanda Bellini | … aos cromossomos: inviabiliza expressão a...

Disciplina:

Fundamentos deGenética e Bio Mol

Turma:

Terapia Gênica e Nanotecnologia

Turma:

Fisioterapia

(1o Ano)

E-mail: [email protected]

Blog: http://marilandabellini.wordpress.com

Tratamento Doença Genética

↓

Paliativo

↙

Ameniza Sintoma ↘Ameniza Sintoma ↘

Não age na causa � gene

Estratégias Terapêuticas

Terapia Gênica

Novo conceito terapêutico

↓

Introdução de material genético para atuar na causa fundamental da doençacausa fundamental da doença

↓

gene, fragmento gênico ou oligonucleotídeos

Processo destinado a tratar ou aliviar doenças pela modificação genética das células do paciente.

• Terapia gênica

germinativa

Formas Potenciais de Terapia Gênica

• Terapia gênica

somática

Terapia Gênica em Células Somáticas

In Vivo

• as células são tratadas dentro do corpo.

Ex Vivo

Terapia Gênica em Células Somáticas

In Vivo

• as células são tratadas dentro do corpo.

Ex Vivo

• as células do paciente são retiradas e manipuladas fora do corpo.

Técnicas de Introdução Gênica em Mamíferos

Métodos Físicos ou Químicos

• Microinjeção

• Eletroporação (choque elétrico)

Vetores Biológicos

• Retrovírus

• Adenovírus

• Adenovírus associado-AAV• Biobalística (gene gun)

BAIXA EFICÁCIA

E TRANSITÓRIOS

• Adenovírus associado-AAV(parvovírus)

• Lentivírus (retrovírus → cels. não dividem)

• Herpes vírus (invadir neurônios)

• Cromossomo artificial



• Microinjeção



• Eletroporação (choque elétrico)

choque elétrico→poros (morte celular)



• Biobalística (gene gun)

Bombardeio partículas de ouro: bomba de hélio (morte celular)


Vetores Biológicos

• Retrovírus– vetores ideais para a

transferência de genes emcélulas humanascélulas humanas

– capazes de infectar quase100% das células-alvo emdivisão→ integra no genomahospedeiro

– Carregam fragmentosrelativamente grandes deDNA (8kb)

– Desvatagem: infectamsomente células em divisão


Vetores Biológicos

• Retrovírus– A inserção casual do DNA no

genoma das células genoma das células hospedeiras pode :

• inativar um gene importante: morte celular

• ativar um oncogene: alterar o padrão normal de controle e divisão celular

• causar mutação


Vetores Biológicos

• Adenovírus– Eficiente para células em

divisão e quiescentes;

– Até 30Kb de DNA;– Até 30Kb de DNA;

– Expressão transiente alta, mas decai em 2 semanas;

– Adequado para matar células;

– Quimidirigido por proteinas de superfície;

– Eficaz em hepatócitos;

– Causam Resposta Imune


Vetores Biológicos

• Adenovírus associado-AAV(parvovírus)– vantagem de integração – vantagem de integração

estável ao DNA;

– células em/ou não divisão;

– nenhuma associação conhecida com doença humana;

– Desvantagem: inserção de DNA de cerca de 5kb


Vetores Biológicos

• Herpes vírus– desativado: capacidade de

invadir neurônios.invadir neurônios.

– Desvantagem: não se integram aos cromossomos: inviabiliza expressão a longo prazo


Vetores Biológicos

• Cromossomo artificial– 5-10 Mb

– DNA telomérico humano

– DNA centromérico– DNA centromérico

– DNA genômico

– Introduzidos em células em cultivo.

• escolher a doença apropriada a ser tratada;

• identificar e clonar o gene e suas regiões reguladoras;

• assegurar que o gene inserido não tenha efeitos prejudiciais;

• determinar as células-alvo certas que tenham duração de vida

Pré-requisitos para Terapia Gênica

• determinar as células-alvo certas que tenham duração de vida

adequada;

• verificar se a técnica é segura e eficiente para a introdução do

gene nas células;

• restringir a transferência do gene às células alvo somáticas;

• documentar e divulgar os resultados obtidos.

Classes de Doenças Passíveis de Terapia Gênica

• Doenças Hereditárias (monogênicas);

• Neoplasias;

• Doenças infecciosas (AIDS);

• Outras Doenças: doença arterial coronária; • Outras Doenças: doença arterial coronária; artrite; doença renal, etc

• Cerca de 650 protocolos aprovados

Tentativas de Terapia Gênica

• Deficiência da Desaminase de Adenosina - (ADA) • Imunodeficiência rara• Enzima ADA: via purinas (tóxica)• linfócitos T (células-alvo) são muito acessÍveis• Grande variação no nível de expressão do gene ADA entre• Grande variação no nível de expressão do gene ADA entre

indivíduos normais

• 1990: Drs. Anderson e Blease(Ashanti De Silva)

o primeiro protocolo aprovado para terapia gênica foi para a correção da deficiência da ADA.


• Deficiência da Desaminase de Adenosina - (ADA)

• expressão do gene ADA detectada por 12 anos nos linfócitos periféricos

• transferência do gene não foi eficiente: receberam PEG-ADA


• Deficiência da Desaminase de Adenosina - (ADA)• NOVA TÉCNICA:

• gene ADA transferido para células tronco: sangue do cordão umbilical;

• 10% dos linfócitos T circulantes carregavam o gene normal;• 10% dos linfócitos T circulantes carregavam o gene normal;

• tratamento com enzima ADA exógena (PEG-ADA) foi removida progressivamente;

• Células T expressando ADA � significantemente.


• Imunodeficiência Combinada Severa Ligada ao X –SCID– Devido mutação do gene IL2RG: codifica a cadeia γ do

receptor IL-2– Pacientes faltam células T e células B prejudicadas– França: 10 crianças selecionadas para terapia gênica: – França: 10 crianças selecionadas para terapia gênica:

células da medula óssea � retrovírus– 9/10 crianças apresentaram células T com o gene

transduzido

– Duas crianças desenvolveram leucemia de células T � ~ 3 anos após a terapia


• Fibrose Cística

Herança Autossômica Recessiva EXEMPLOS CLÍNICOS DE DOENÇAS MONOGÊNICASAUTOSSÔMICAS RECESSIVAS

� Albinismo � Fibrose Cística

� Doença pulmonar crônica.

� Doença de TAY-SACHS� Doença de TAY-SACHS

� Distúrbio neurológico degenerativo;

Homozigose recessiva � letalidade.

Aula 03


• Fibrose Cística

- vetor adenoviral: infecta os pulmões, penetra em célulasque não estão em divisão sem integrar no seu DNA,permitindo que estas expressem o DNA viral, introduzido pelonariz com um spray.nariz com um spray.

- desvantagem:

inflamação com ataque imune que neutraliza as células contendo gene adenoviral;

efeito da terapia de vida curta, cerca de 6 semanas.


• Hemofilia:• Mutação no gene do fator VIII (Hemofilia A) e fator IX

(Hemofilia B) de coagulação

• afeta 1:5000 homens (recessiva ligada ao X)• afeta 1:5000 homens (recessiva ligada ao X)

� Hemofilia AÉ um distúrbio da coagulação caracterizado por tempo de sangramento prolongado.

EXEMPLOS CLÍNICOS DE DOENÇAS MONOGÊNICAS

RECESSIVAS LIGADA AO X

Aula 03


• Hemofilia:• Mutação no gene do fator VIII Hemofilia A) e fator IX

(Hemofilia B) de coagulação

• afeta 1:5000 homens (recessiva ligada ao X)• afeta 1:5000 homens (recessiva ligada ao X)

• Sintomas: sangramento espontâneo nas articulações, nos tecidos moles e órgãos vitais

• Tratamento: injeções regulares de fator VIII ou IX


• Hemofilia (6 pacientes)– Procedimento:

• extração de células da pele (fibroblastos);• inserção do gene normal em plasmídeo (não provocam rejeição

pelo organismo);• clonagem dos fibroblastos• clonagem dos fibroblastos• pacientes receberam implantes dos fibroblastos no abdomem,

após pequenas incisões

• aumento de 1 a 4% do fator VIII (melhora qualidade de vida dos pacientes)

• benefícios foram temporários: apenas 10 meses


• Neuropatia óptica hereditária de Leber (LHON)

HERANÇA MATERNA DO DNA MITOCONDRIAL

� Neuropatia óptica hereditária de Leber (LHON)� Perda visual bilateral, subaguda e indolor;

� Adultos Jovens;

� Sexo Masculino Afetado;� Sexo Masculino Afetado;

Não transmite LHON para gerações subsequentes.

Aula 03


• Cegueira– Abril/2008: Universidade da Pennsylvania , Hospital da Philadelphia

(USA) e Universidade de Londres

– Inserção do gene RPE65 (injeção com vetor viral direto na retina): codifica a enzima que auxilia na conversão da vitamina A para rodopsina A (pigmento das células fotorreceptoras que absorvem luz).rodopsina A (pigmento das células fotorreceptoras que absorvem luz).

– Melhora na visão: maior sensibilidade a luz, detectaram movimentos manuais e leitura de linhas de um cartaz de exame oftalmológico

• Perspectiva: � terapia em retinoblastoma

Vítimas da Terapia Gênica

• Universidade de Pensilvania:– rapaz de 18 anos faleceu durante sua participação em uma triagem

de TERAPIA GÊNICA (4 dias após a terapia) ⇒⇒⇒⇒ falência múltipla de órgãosórgãos

• Julho/2007: – mulher de 36 anos com artrite reumatóide faleceu 22 dias após

receber a segunda dose de um gene terapêutico para artrite.

– Após investigação pela FDA (Food and Drug Administration) não foi possível atribuir a morte da paciente a terapia

Vítimas da Terapia Gênica

Terapia Gênica do Câncer

• Cerca de 420 protocolos:• 2/3 dos protocolos de terapia gênica em estudo envolvem

cânceres não herdados• introdução de genes supressores de tumor para restaurar a

função perdida.

• Ex.: inserção do gene – TP53 normal em

tumores de pulmão ⇒bloquear a progressão tumoral e apoptose

Dificuldades da Terapia Gênica

• Obtenção da alta eficiência na transferência gênica

• Dificuldades de atingir o tecido alvo. Ex. neurônios (distúrbios

do SNC)

• Expressão adequada do gene transferido: expressão• Expressão adequada do gene transferido: expressão

transitória e de baixo nível (<1%)

• Necessidade de regulação precisa da atividade gênica. Ex.

Talassemia

• Resposta imune e inflamatória

• Ocorrência de inserção casual no genoma da célula

hospedeira

Terapia Gênica no Brasil

- Em 2004 foi criada a Rede de

Terapia Gênica

- 14 grupos de pesquisa dos estados do Rio de Janeiro, São Paulo e Rio Grande do Sul, financiados pelo Grande do Sul, financiados pelo Institutos do Milênio do CNPq/MCT.

- Pesquisas: introdução de genes com efeito terapêutico

Qual o alvo do Brasil?- terapia gênica em câncer- doenças graves do metabolismo- doenças degenerativas e cardiovasculares- vacinas de DNA profiláticas para doenças infecciosas e vacinas de DNA terapêuticas para HPV

Nanotecnologia

Nanotecnologia

• Tamanho: 10-100nm (um bilionésimo de metro)

- minúsculas partículas: variadas formas →→→→ tubos, conchas, espirais

• Composição: moléculas funcionais como: drogas, peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos

• materiais: polímeros, dendrímeros, nanotubos de carbono, e metais • materiais: polímeros, dendrímeros, nanotubos de carbono, e metais (ouro e óxido de ferro)

• Polímeros: avaliar a toxicidade (ativação do complemento, imunogenicidade, carcinogenicidade, teratogenicidade) →→→→ devem ser não tóxicos e biodegradáveis →→→→ evitar acúmulo no organismo (fígado, baço e medula óssea)

-partículas esféricas (25nm-10um),

membrana bicamada fosfolipídica

-limitações: curto tempo de

circulação sangue→→→→ rápido

clearance pelos macrófagos

-2a. geração de lipossomos: tempo

de circulação sangue maior (3 dias)

Nanopartícula - Polímero

Nanotecnolgia

Formação: duas partes

-núcleo hidrofóbico →→→→ recipiente p/droga

-Concha hidrofílica →→→→ estabilização em ambiente aquoso

Nanotecnologia

• Nanoconchas - esferas microscópicas �– núcleo de sílica, recoberto com uma finíssima camada de ouro

– destroem células tumorais quando aquecidas com a luz de um raio laser � interagem com a luz de forma específica �"configuradas" para destruir sob a ação de comprimentos de �"configuradas" para destruir sob a ação de comprimentos de onda específicos

• Nanoconchas e câncer de cólon de ratos– Nanoconchas na corrente sangüínea de camundongos � se

acumulam preferencialmente nos tumores �irradiação dos tumores com fonte de laser

� 82% dos camundongos sobreviveram

Nanotecnologia no Câncer

• Nanopartícula multifuncional

– a entrega da droga, eficácia do tratamento e toxicidade podem ser monitoradas usando agentes de imagem.

Annu Rev Biomed Eng, 2007

agentes de imagem.

NANOTECNOLOGIA

Nanotubos de carbono: de parede única com anticorpos

monoclonais adsorvidos → detectam células do câncer de

mama

•Os anticorpos eram específicos para os receptores do fator

crescimento 1 (IGF1R) → comuns em células cancerosas.crescimento 1 (IGF1R) → comuns em células cancerosas.

•A técnica poderá ser utilizada para detecção de células

tumorais recorrentes ou micrometástases remanescentes de

um tumor já tratado

•estudos em animais, analisando a sensibilidade do sistema

anticorpo-nanotubo na detecção de células cancerosas no

sangue e para detectar tipos específicos de células

cancerosas lançadas na corrente sangüínea pelos tumores

Referências

• NUSSBAUM, RL; MCINNES, RR; WILLARD, HF. Thompson e Thompson - Genética Médica. 7ª ed. Elsevier, 2008.

• WEINBERG, RA. A Biologia do Câncer. Porto Alegre, Artmed Editora, 2007.

• LEWIS, B. Genes VII. 7a ed. Artmed Editora, 2001.

• SNUSTAD, P.; SIMMONS, M.J. Fundamentos de Genética. 2ª ed., Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2001.

• ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. 3a. ed., Porto Alegre, Artmed Editora, 1997.

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