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SISTEMA SEROTONÉRGICO: RELAÇÕES COM O SISTEMA DE

TEMPORIZAÇÃO CIRCADIANO.

Tese de Doutorado apresentada ao Instituto

de Ciências Biomédicas III, da

Universidade de São Paulo, para a

obtenção do Título de Doutor em Ciências

Morfofuncionais.

Orientador:

Dra. Maria Inês Nogueira, Prof.Associado

São Paulo

2007

RESUMO

Vários fenômenos fisiológicos e comportamentais de um organismo apresentam-se

como eventos temporais sucessivo, caracterizando os chamados ritmos biológicos. O sistema

que gera e mantém ritmos que ciclam em período aproximado de 24 horas é denominado

sistema de temporização circadiano. O oscilador dominante desse sistema em mamíferos é o

núcleo supraquiasmático (NSQ) cuja citoarquitetura, aspectos hodológicos e neuroquímicos,

aferências e eferências têm sido investigados em várias espécies de mamíferos,

particularmente em roedores. Dentre as aferências do NSQ, as mais importantes são o trato

retinohipotalâmico (TRH), o trato geniculohipotalâmico (TGH) e as terminações

serotonérgicas da rafe, sendo que a função da serotonina neste circuito seria a modulação de

estímulos fóticos no NSQ. As múltiplas células do NSQ possuem individualmente oscilação

circadiana autônoma baseada em alças de retro-alimentação de transcrição e translação que

resultam na expressão rítmica dos então chamados genes do relógio ou “clock genes”. Estes

incluem, entre outros, os genes Per, o Clock, os genes Cry e o Bmal1. Embora homólogos

destes genes tenham sido identificados em várias espécies incluindo humanos, pouco é

conhecido sobre seus padrões de expressão no NSQ de primatas. O presente estudo analisa as

concentrações de 5-HT, 5-HIAA e NA nos núcleos da rafe e NSQ de ratos em livre-curso e

mostra que dentre os núcleos analisados, somente os núcleos obscuro e linear apresentam

ritmos endógenos o que evidencia ação determinante do ciclo claro-escuro na determinação

do ritmo diário no conteúdo de 5-HT dos núcleos da rafe. Analisa comparativamente a

morfologia do NSQ, a organização citoarquitetural e o padrão de distribuição dos terminais 5-

HT-IR do NSQ de primatas e roedores e mostra que a distribuição das fibras 5-HT-IR e NPY-

IR no primata, não apresenta o padrão característico ventrolateral observado em roedores,

com pouca sobreposição aos terminais do TRH sugerindo diferentes funções para estas

aferências no NSQ de primatas. Na espécie Cebus apella, o NSQ apresenta organização

neuroquímica intrínseca caracterizada por diversos grupos celulares, dentre eles células

imunorreativas a vasopressina, calbidina e calretinina, com diferenças de localização em

comparação ao que já foi descrito em roedores. Além disso, o presente estudo demonstra o

padrão de expressão dos genes Per1, Per2, Cry1 e Bmal1 no NSQ ao longo do período de

atividade do primata Cebus apella. Observou-se que o padrão de expressão do gene Bmal1

apresenta diferença em relação ao de roedores com pico máximo no ZT 2. Não foi encontrada

expressão do gene Cry1 no NSQ nos horários analisados. O padrão de expressão do gene

Per1 apresentou pico de expressão no ZT 2 diferente de roedores onde o pico é ao redor do

ZT 8; o padrão de expressão do gene Per2 no NSQ do Cebus apresenta pico de expressão no

ZT 7, diferente de roedores noturnos onde o pico de expressão é ao redor do ZT 12.

Os dados suportam a idéia de que há importantes diferenças interespecíficas na

estrutura e características intrínsecas do NSQ. Generalizações feitas a respeito da localização

dos fenótipos celulares ou terminais aferentes ao NSQ em diferentes espécies podem

prejudicar o entendimento das relações entre estrutura e função do NSQ.

ABSTRACT

Essential component of the circadian timing system, the suprachiasmatic nucleus

(SCN) receives dense retinohypothalamic RHT, geniculohypothalamic tract GHT and

serotonergic innervation arriving from the raphe nuclei. SCN has pacemaker cells that

produce rhythmic expression of clock genes. This study investigates the levels of 5-HT in the

raphe nuclei and SCN in free running rats and shows endogenous rhythms in the obscurus and

linear raphe nuclei, which is regulated by the daily light: dark cycle rhythms. The comparative

analysis of the intrinsic structure of the SCN of primates and rodents shows a different

organizational pattern of serotonergic and GHT terminals and the RHT terminals, suggesting

different actions of serotonin and neuropeptide Y in the control of circadian rhythmicity in

primates. Moreover, the pattern of the clock genes SCN expression along the awaken period

in the primates show that BMAL1 and Per1 RNAm peaks of expression occur around ZT2 and

Per2 around ZT7. These data suggest that the neural organization of the circadian timing

system in the studied primate differ from those of the most commonly studied rodents.

1. INTRODUÇÃO

1.1 Atributos básicos dos ritmos circadianos

Os fenômenos fisiológicos e comportamentais de determinadas espécies apresentam-se

como eventos temporais sucessivos ou concomitantes. Alguns se repetem a intervalos mais ou

menos regulares e geralmente mantendo relação de fase constante com eventos periódicos do

meio exterior, constituindo assim os chamados ritmos biológicos (Marques, Menna-Barreto,

1997).

Como vivemos em um meio ambiente externo cíclico proporcionado pela rotação da

Terra, não é surpresa que mecanismos evolutivos de adaptação tenham desenvolvido ciclos

para atividades fisiológicas e comportamentais. Grande parte dos processos fisiológicos

contém algum componente cíclico, pois o organismo criou maneiras de coordenar sua

fisiologia de forma que diferentes funções ocorram em diferentes horários do dia (Dunlap et

al., 2004).

Os ritmos biológicos podem ser classificados de acordo com diversos critérios, o mais

comumente utilizado é a freqüência de repetição. O ritmo circadiano em humanos oscila entre

períodos de 20 a 28 horas. Os ritmos infradianos ou ritmos de baixa freqüência expressam

períodos maiores do que 28 horas, como por exemplo, o ciclo menstrual; enquanto que os

ritmos ultradianos ou oscilações de repetições rápidas têm períodos menores que 20 horas,

como por exemplo, a secreção de insulina e glucagon (Kern et al., 1996; Marques, Menna-

Barreto, 1997).

Os ritmos circadianos constituem característica de quase todos os organismos vivos.

Os de caráter comprovadamente endógeno, como os ritmos de atividade/repouso, temperatura

corpórea e ingestão de líquido expressam-se através de ação coordenada entre diversas

atividades fisiológicas e comportamentais de manutenção do meio interno (organização

temporal interna) e eventos ambientais externos, propiciando assim, adaptação individual e

populacional efetiva (Dunlap et al., 2004; Sehgal, 2004).

Em vertebrados, o período destes ritmos circadianos é mantido, de forma mais ou

menos constante em torno de 24 horas sincronizado pelo ciclo de claro/escuro ambiental,

considerado o mais importante agente temporizador “Zeitgeber” (Aschoff, 1978).

O termo “Zeitgeber” (“marcador de tempo” em alemão) denota um sinal ambiental

que sincroniza ou ajusta um ritmo circadiano. Como a maioria dos ritmos é sincronizada por

ciclos ambientais, cronobiologistas referem-se ao tempo definido por estes ciclos ambientais

como “zeitgeber time” (ZT). Quando um organismo é mantido em um ciclo de 24-horas (12

horas de claro seguidas por 12 horas de escuro), o “zeitgeber time” zero ou ZT0 corresponde

ao acender da luz ou início do claro, enquanto que o ZT12 ao apagar da luz ou início do

escuro. Desta maneira, todos os pontos de tempo entre ZT0 e ZT12 referem-se à fase de claro,

enquanto aqueles entre ZT12 e ZT24 (ou ZT0) referem-se à fase de escuro (Sehgal, 2004).

O tempo no qual um dos processos de um ritmo (ex. atividade ou repouso) ocorre é

definido como fase de um ritmo. Sendo assim, por exemplo, animais diurnos e noturnos

exibem fases opostas em seus ritmos de sono e vigília (Marques, Menna-Barreto, 1997;

Dunlap et al., 2004).

Uma mudança na medida de tempo do “Zeitgeber”, causada, por exemplo, por uma

viagem transcontinental, provoca alteração na fase do ritmo, resultando em um fenômeno

conhecido como “jet lag”. Durante o processo de ajuste ao novo ciclo, um ritmo demonstra

comportamento “transiente”, com fase e periodicidade incorretas (Marques, Menna-Barreto,

1997).

Em mamíferos, a enucleação ou a secção dos nervos ópticos e a concomitante

ausência de outros agentes sincronizadores (disponibilidade de alimentos em horários

controlados, injeção de fármacos ou sincronização social) promovem a expressão em livre

curso de alguns ritmos circadianos, sendo que, a natureza endógena de um ritmo e sua

periodicidade devem ser determinadas sob esta condição. O padrão de um ritmo em livre

curso na maioria das vezes é diferente daquele apresentado sob influência do ciclo claro-

escuro, pois organismos expostos ao escuro constante, demonstram sua periodicidade

endógena. Sob esta condição nós utilizamos para determinar o tempo o termo “tempo

circadiano” (circadian time) (CT), o qual representa o tempo interno do organismo, gerado

por seu oscilador interno. Tendo em vista que a periodicidade endógena é frequentemente um

pouco diferente de 24 horas, o CT na maioria das vezes não é o mesmo que ZT (Sehgal,

2004).

A persistência de ritimicidade circadiana em livre curso (ausência de pistas

ambientais) evidencia a presença, de estruturas no sistema nervoso central (SNC) capazes de

gerar endogenamente um ritmo circadiano. O núcleo supraquiasmático (NSQ) (par de

pequenos núcleos localizados no hipotálamo ventral anterior, dorsal ao quiasma óptico e

ventrolateral ao III ventrículo) é considerado o principal oscilador endógeno em mamíferos,

também chamado de relógio biológico, oscilador central ou marcapasso circadiano (Rusak,

Morin, 1976; Moore, 1983). Demonstrou-se desde 1972 que tanto o ritmo de liberação da

corticosterona, como os ritmos circadianos relacionados à ingestão de água e a atividade dos

animais (ratos) eram suprimidos pela lesão nos NSQ (Moore, Eichler, 1972; Stephan, Zucker,

1972), Além disso, o transplante de células do NSQ de um doador para um animal lesionado

restabelece os ritmos circadianos que o animal havia perdido, sendo que, o período dos ritmos

do animal transplantado segue aquele do doador (Ralph et al., 1990).

O relógio biológico, também chamado de oscilador, é a parte do sistema de

temporização capaz de gerar oscilação pela qual o organismo mede o tempo, mesmo na

ausência de pistas ambientais. Em mamíferos o núcleo supraquiasmático gera a maioria dos

ritmos circadianos endógenos (Inoue, Kawamura, 1979; Green, Gillete, 1982; Newman,

Hospod, 1986; Lehman et al., 1987; Ralph et al., 1990) que podem ser sincronizados pelo

ciclo de luz ambiental e ou por estímulos não fóticos (Johnson et al., 1988).

Além da periodicidade ao redor de 24 horas e persistência em livre-curso, outra

característica fundamental dos ritmos circadianos é a de seus períodos não serem dependentes

da temperatura externa, ou seja, permanecem constantes sob uma ampla gama de temperatura.

Isso evidencia que as bases que regem os ritmos são mecanismos bioquímicos mais

complexos do que mudanças nas funções de proteínas sob diferentes temperaturas que

poderiam alterar a taxa da reação e consequentemente a periodicidade de um ritmo (Sehgal,

2004).

O mecanismo autônomo de oscilação circadiana de cada célula do NSQ baseia-se em

alças de retro-alimentação de transcrição e translação que resultam na expressão rítmica dos

então chamados “genes do relógio” (clock genes) (Reppert, Weaver, 2001).

Nesta alça de retro-alimentação, os produtos resultantes da oscilação de genes

específicos regulam sua própria expressão. Auto-regulação essa que consiste de proteínas

controlando negativamente a síntese de seus próprios RNAs mensageiros (RNAms). Cada

volta completa da alça leva aproximadamente 24 horas para se completar, resultando em

oscilações circadianas dos níveis de proteína e RNAm (Reppert, Weaver, 2001; Dunlap et al.,

2004).

1.2 Aferências e eferências do oscilador circadiano

Sistema de temporização circadiano simplificado

Figura 1 - Esquema extremamente simplificado do sistema circadiano contendo um oscilador

central, vias de entrada que transmitem sinais ambientais para o oscilador central, e vias de

saída que levam as informações deste e resultam na manifestação dos ritmos circadianos. Na

prática existem múltiplas vias de entrada e saída para cada oscilador, além disso, o sistema

não funciona de maneira linear, as saídas podem retro-alimentar o oscilador ou até mesmo as

entradas e o oscilador pode retro-alimentar as entradas. Modificado de Sehgal (2004).

Quanto às características neuroquímicas do oscilador central, utilizando-se técnicas

bioquímicas e imunocitoquímicas é possível detectar numerosos neuropeptídeos e

neurotransmissores intrínsecos, ou seja, produzidos por células do NSQ, ou extrínsecos ao

NSQ, ou seja, trazidos de outros grupamentos neuronais que aferentam o NSQ (Rusak,

Zucker, 1979; Van den Pol, Tsujimoto, 1985; Rusak, Bina, 1990; Klein et al., 1991; Rietveld,

1992).

sinal ambiental (ex.luz)

expressão de ritmos ex.ciclo sono-vigília

vias de entrada vias de saída

Assim, o oscilador central é apenas parte de um sistema maior e mais complexo que

inclui também componentes que trocam informações e influenciam o funcionamento do

oscilador. Se os ritmos são gerados por osciladores endógenos, então as propriedades destes

ritmos devem vir de características inerentes aos osciladores que os produzem. Segundo a

terminologia cronobiológica, o oscilador central é sincronizado por sinais ambientais externos

trazidos por estruturas e vias de entrada (Reppert, Weaver, 2001). Assim, apesar da maioria

dos osciladores, não terem contato direto com o meio externo, eles recebem informações do

meio ambiente por vias distintas. Como a luz é a principal pista ambiental para o oscilador

central (Reppert, Weaver, 2001), a identificação de fotorreceptores, bem como de suas vias de

entrada fótica, constitui importante área de pesquisa em organismos usados para estudos

cronobiológicos.

Os sinais gerados pelo oscilador e modulados pelas informações que lhe aferentam

devem ser transmitidos para outras partes do organismo, de forma a determinar a expressão

rítmica de processos fisiológicos e comportamentais. As vias e estruturas que transmitem os

sinais do relógio para outras partes do organismo são chamadas vias de saída e podem ser

originadas de diferentes osciladores dentro de um mesmo organismo (Reppert, Weaver, 2001;

Sehgal, 2004).

Juntos, os osciladores biológicos, suas estruturas e vias de entrada e saída formam o

que chamamos de sistema de temporização circadiano de um organismo.

Figura 2 - Esquema de um modelo simplificado do sistema de temporização circadiano. O

oscilador central, o principal marcapasso do sistema, está sob influência de fatores de entrada

como o ciclo claro-escuro e impõe a expressão de ritmos em vários aspectos fisiologicos via

estruturas e vias de saída “outputs” que podem representar conexões neurais diretas e/ou

fatores secretados. Adaptado de Sehgal (2004).

Em roedores, o NSQ recebe informações tanto do meio interno como externo através

de três principais vias (Figura 3). A via retinohipotalâmica, ou trato retinohipotalâmico (TRH)

principal via de sincronização fótica dos ritmos circadianos (Moore, Lenn, 1972), manda

informações provenientes da camada de células ganglionares da retina até o NSQ.

O principal neurotransmissor do TRH é o glutamato (GLU), porém alguns

experimentos envolvem também o GABA no processo de sincronização (Ralph, Menaker,

1989). Em roedores, os neurônios do folheto intergeniculado (FIG) recebem projeções

retinianas e dão origem a uma via que se dirige ao NSQ, o trato geniculohipotalâmico (TGH)

cujo principal neurotransmissor é o NPY, que está relacionado a modulação dos estímulos

fóticos e estímulos não fóticos. Deste modo, os neurônios do NSQ recebem informação, sobre

a iluminação ambiental, diretamente da retina e também indiretamente através do TGH. O

terceiro maior sistema aferente para o NSQ é formado pelas projeções serotonérgicas das

células da rafe (Azmitia, Segal, 1978; Van de Kar, Lorens, 1979; Moore, 1983) cuja função

embora não totalmente esclarecida parece ser a modulação dos efeitos da luz, além de

participar da modulação de estímulos não fóticos (Levine et al., 1986; Smale et al., 1990).

Figura 3. Esquema simplificado das vias de entrada fóticas para o NSQ. O ciclo claro-escuro

ambiental é detectado pelas células ganglionares da retina. Este sinal fótico é transmitido para

o NSQ por duas vias principais. A primeira via, direta, conecta a retina ao NSQ via trato

retinohipotalâmico (TRH). A segunda, indireta, conecta a retina ao folheto intergeniculado

(FIG), o qual por sua vez conecta-se ao NSQ via trato geniculohipotalâmico (TGH). Há ainda

uma terceira via, que conecta primeiramente a retina com a rafe (demonstrada em algumas

espécies), a qual por sua vez conecta-se ao FIG e ao NSQ. Adaptado de Sehgal (2004).

A anatomia das conexões serotonérgicas com as estruturas do sistema de temporização

circadiano assim como sua função na ritimicidade circadiana, continua a ser estudada nas

diferentes espécies. Sabe-se que em roedores as projeções do núcleo Mediano da rafe

terminam em um plexo denso no NSQ e mais esparsamente no hipotálamo adjacente (Moore

et al., 1978; Card, Moore, 1984; Morin et al., 1992). Alguns autores relatam ainda, projeções

do núcleo dorsal da rafe (DR) para o FIG, o qual é a origem do TGH (Mantyh, Kemp, 1983;

Morin et al., 1992).

1.3 Sincronização do oscilador à luz

A maioria dos relógios biológica expressa endogenamente periodicidades que não

representam necessariamente 24 horas, com diferenças intra e interespecíficas nestes valores e

na resposta a intensidades de luz. Animais diurnos apresentam aumento na freqüência

espontânea de um ritmo com crescentes intensidades de luz o que resulta em um

encurtamento do período nestas condições. Já animais noturnos, por outro lado, diminuem sua

freqüência espontânea com aumento na intensidade de luz, expressando assim períodos mais

longos sob estas condições.

A maioria destes ritmos endógenos de diversos organismos é sincronizada ao ciclo

ambiental de 24 horas (Repert, Weaver, 2001). Isto significa que todos os dias o relógio

biológico é ajustado, caso contrário a expressão de um período menor do que 24 horas

repetidamente faria com que esses organismos, em questão de poucos meses, invertessem a

fase de seus ritmos em relação ao meio ambiente, o mesmo acontecendo com um ritmo de

período endógeno maior que 24 horas.

Mesmo organismos que não possuem relógios biológicos funcionantes (por ex.

animais geneticamente modificados) expressam seus ritmos em 24 horas por influência do

ciclo ambiental, se colocados em condição de claro-escuro (12:12 h). Nestes organismos esses

ritmos desaparecem em situação de livre curso, além disso, o animal perde a capacidade de

antecipar as transições dos ciclos ambientais. Este efeito de pistas ambientais sobre ritmos

biológicos sem a participação dos osciladores é chamado de “mascaramento” (Marques,

Menna-Barreto, 1997).

Questão que tem intrigado os pesquisadores é: qual seria a molécula da célula

ganglionar da retina que agiria na detecção da luz e transmitiria esta informação ao relógio?

Ou seja, qual é o fotorreceptor circadiano? A molécula candidata é a melanopsina, um

fotopigmento encontrado em células da camada ganglionar da retina que enviam projeções e

fazem sinapse com neurônios do NSQ (Provencio et al., 2000; Repert, Weaver, 2001).

Como mencionado anteriormente, outras vias conectam indiretamente a retina ao

NSQ. Por ter estações intermediárias, estas vias certamente não transmitem apenas

informações fóticas, vias secundárias integram informações de outras partes do cérebro

transmitindo também sinais não fóticos para o NSQ. Este fenômeno ocorre principalmente nas

vias provenientes da rafe e do TGH. Por exemplo, atividade física forçada pode mudar a fase

de um ritmo circadiano do animal, e o FIG foi demonstrado como necessário para que ocorra

essa mudança induzida pela atividade.

Finalmente, outra importante via de entrada para o NSQ são hormônios, dos quais o

mais estudado é a melatonina. A melatonina é produzida ciclicamente pela pineal sob o

controle do NSQ e pode retro-alimentar o NSQ influenciando-o.

Baseados nas informações das conexões existentes entre as estruturas do sistema de

temporização circadiana e o sistema serotonérgico, já descritas em roedores, e da necessidade

de esclarecer as relações entre os mesmos, realizamos estudo temporal dos conteúdos de

serotonina, 5-HIAA e NA nos núcleos da rafe, glândula pineal e no NSQ em ratos (capítulo I).

Além disso, com o intuito de explorar as relações entre o sistema de temporização

circadiana e o sistema serotonérgico, também em animais diurnos, e avaliar as diferenças

interespecíficas dos mesmos realizamos: estudo comparativo entre primatas e roedores, dos

terminais serotonérgicos (5-HT-IR) (capítulo II), da morfometria do NSQ e de suas células

(capítulo II), a caracterização química do NSQ no primata Cebus apella (capítulo III) e o

padrão de expressão dos “genes relógio” no NSQ nesta espécie (capítulo IV).

2. CAPÍTULO I

ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO TEMPORAL DO CONTEÚDO DE SEROTONINA,

ÁCIDO 5-HIDROXINDOLACÉTICO E NORADRENALINA NOS NÚCLEOS DA

RAFE, NSQ E GLÂNDULA PINEAL, EM RATOS SUBMETIDOS A LIVRE-CURSO.

RESUMO

Sob ciclo claro-escuro ambiental, os núcleos da rafe, principal fonte de serotonina encefálica,

apresentam ritmo diário no conteúdo de serotonina (5-HT) sincronizado ao ciclo claro-escuro

ambiental, com os menores níveis as 17:00h e 5:00h e os maiores níveis as 13:00h e 21:00h,

sendo este último o horário de pico máximo. Para avaliarmos se estes ritmos representam

ritmos endógenos circadianos, estudamos a variação no conteúdo de 5-HT nos núcleos da rafe

em ratos em situação de livre curso (ausência de pistas ambientais). Além disso, com o intuito

de correlacionar a variação no conteúdo de 5-HT, nos grupamentos neuronais, com a variação

do mesmo conteúdo nas áreas de projeção destes núcleos, onde estão os terminais dos

neurônios serotonérgicos, verificamos a variação no conteúdo de 5-HT no NSQ, que

conhecidamente recebe densa projeção serotonérgica e, em mamíferos, é o principal oscilador

dos ritmos biológicos circadianos. Tão importante quanto conhecermos o padrão do ritmo

endógeno no conteúdo da 5-HT é sabermos se a atividade do sistema serotonérgico é expressa

ritmicamente nestas áreas, para isso, realizamos também a dosagem do metabólito da 5-HT o

ácido 5-hidroxindolacético (5HIAA), para determinarmos a taxa de metabolização da 5-HT

(5-HIAA/5-HT) ao longo do período circadiano. Este estudo também correlaciona a variação

no conteúdo de 5-HT e de noradrenalina (NA), duas substâncias envolvidas na modulação de

ritmos biológicos, nos núcleos da rafe, pineal e no NSQ, assim como a relação destes

conteúdos com as fases de atividade e repouso dos animais. Os resultados mostram que os

núcleos da rafe Obscuro (ROb) e Linear (Li) apresentam ritmo endógeno circadiano no

conteúdo de 5-HT e que este ritmo difere daquele previamente demonstrado em situação de

claro/escuro ambiental. Os demais núcleos da rafe apesar de não apresentarem ritmo

circadiano, apresentaram variações endógenas significativas nos conteúdos de 5-HT, 5-HIAA

e NA em determinados horários ao longo do período circadiano. Ao contrário do que ocorre

em animais que expressam ritmos sincronizados ao ciclo claro/escuro ambiental, em situação

de livre-curso os núcleo da rafe apresentam padrões individuais de variação no conteúdo de 5-

HT. Os resultados evidenciam a forte influência da luz na determinação de um ritmo diário no

conteúdo de serotonina dos núcleos da rafe. O NSQ não apresentou ritmo endógeno

circadiano nos conteúdos de 5-HT e 5HIAA em animais em livre-curso, porém apresenta

variações significativas no conteúdo de 5-HT com queda acentuada do inicio para o final da

fase de atividade. O NSQ também apresentou alta taxa de metabolização durante a fase de

atividade e baixa durante a fase de repouso dos animais, o que indica maior atividade

serotonérgica no NSQ na fase de atividade dos animais. A pineal apresentou as maiores

concentrações de 5-HT e NA no final da fase de repouso dos animais em livre curso.

2.1 INTRODUÇÃO

Os ritmos circadianos constituem característica de quase todos os organismos vivos.

Alguns possuem caráter comprovadamente endógeno, como o ritmo de ingestão de líquido,

gerado por osciladores internos e sincronizado por fatores fisiológicos internos (organização

temporal interna) e eventos ambientais externos (Marques, Menna-Barreto, 1997).

Em vertebrados, o período dos ritmos circadianos, como os de atividade/repouso e

ingestão de líquido, é mantido de forma mais ou menos constante em torno de 24 horas

sincronizados pelo ciclo claro/escuro ambiental (Marques, Menna-Barreto, 1997; Oishi,

2002).

A participação de mecanismos endógenos na sincronização dos ritmos biológicos foi

comprovada em estudos que demonstraram ritmos circadianos em organismos expostos ao

modelo de livre-curso, situação onde as oscilações externas são eliminadas, como por

exemplo, um ambiente em escuro constante, isolado acusticamente, sem contato social e

temperatura constante (Sehgal, 2004).

O núcleo supraquiasmático (NSQ) é considerado o principal oscilador endógeno do

sistema de temporização circadiano em mamíferos (Morin, 1992), podendo ser sincronizado

tanto pelo ciclo de luz ambiental quanto por estímulos não-fóticos (Johnson et al., 1988).

Dentre os neurotransmissores presentes no NSQ, atuantes no processo de

sincronização de ritmos está a serotonina (5-hidroxitriptamina ou 5-HT), cuja função, neste

sistema, embora ainda não totalmente esclarecida, parece ser mediar os efeitos da luz sobre a

temporização (Zatz, Herkenham, 1981) e também mediar estímulos não fóticos (Mistlberger

& Antle, 1998).

Também conhecida como 5-hidroxitriptamina, a 5-HT é um neuromediador no sistema

nervoso central, produzida pelos neurônios serotonérgicos, cujos corpos celulares localizam-

se principalmente ao longo da linha média do tronco encefálico, nos núcleos da rafe (Tork,

1985). Vários estudos imunohistoquímicos demonstraram a presença de diversos

neurotransmissores e substâncias neuroativas nestes núcleos. Indolaminas (serotonina),

catecolaminas (noradrenalina (NA) e dopamina), aminoácidos (ácido γ-aminobutírico

(GABA), glicina, glutamato, aspartato), neuropeptídeos ativos (substância P, hormônio

liberador de tirotrofina e encefalina) e óxido nítrico (Fort et al., 1990; Törk, 1990; Dun et al.,

1994; Milner et al., l996).

A síntese de 5-HT é feita a partir do aminoácido aromático L-triptofano que é

transportado para dentro da célula por um mecanismo carreador neutro para aminoácidos.

Esse aminoácido é hidrolisado pela ação da enzima triptofano-hidroxilase (Tr-OH) (Frazer,

Hensler, 1994) (Figura 4A).

Além de ser encontrada no citoplasma e terminais dos neurônios serotonérgicos (Kruk,

Pycock, 1991, Frazer, Hensler, 1994), essa enzima também está localizada em células da

glândula pineal, onde a 5-HT produzida vai ser convertida em melatonina (Figura 4B) (Frazer,

Hensler, 1994). O papel da Tr-OH na síntese de 5-HT é de fundamental importância, tendo

em vista que é a primeira enzima da cadeia de síntese e atua como uma etapa regulatória de

todo o processo, muito embora uma estimulação neural seja necessária (Kruk, Pycock, 1991).

A serotonina é metabolizada pela enzima monoamina-oxidase (MAO) (Kruk, Pycock,

1991). Isso ocorre tanto dentro do neurônio como fora dele, na fenda sináptica (McGeer et al.,

1987). O resultado desse metabolismo é um catabólito primário inativo, chamado de ácido 5-

hidroxindolacético (5HIAA) (Kruk, Pycock, 1991).

N

— CH2— C — COOH

NH2

HL-triptofano

triptofano-hidroxilase (Tr-OH)O2

BH 4

N

— CH2— C — COOH

NH2

H 5-hidroxitriptofano

L-aminoácido aromáticodecarboxilase (AADC)

HO —

N

— CH2— CH2 — NH2serotonina (5HT)

HO —

Figura 4A. Biossíntese da serotonina a partir do aminoácido L-triptofano e suas enzimas de

síntese.

N

— CH2— CH2 — NH2serotonina (5HT)

monoamina-oxidase (MAO)

HO —

N

— CH2— C — OHácido 5-hidroxindolacético

(5HIAA)

HO —

O

N

— CH2— CH2 — NH — C — CH3

N--Acetil serotonina

HO —

O

5HT N-acetil-transferase

N

— CH2— CH2 — NH — C — CH3

Melatonina

CH3 — O —

O

5-hidroxindol-O-metiltransferase

Pineal

Figura 4B. Os dois processos de metabolização da serotonina: um pode ser a formação do

5HIAA e o outro é a sua conversão enzimática para melatonina na glândula pineal.

Desde sua descoberta, essa indolamina é relacionada a um amplo leque de funções,

entre as quais está a modulação do ciclo sono/vigília (Jouvet, 1973). Essa modulação é o

resultado da interação de vários neurotransmissores, neurohormônios e neuropeptídeos em

diferentes sítios neuronais, compondo complexa rede anatômica (Portas et al., 1998). Estudos

eletrofisiológicos no ciclo sono vigília demonstram que os grupamentos monoaminérgicos do

tronco cerebral (5-HT e NA) apresentam atuação predominante na fase de alerta enquanto a

acetilcolina atuaria predominantemente no sono, estes três sistemas apresentam intensas

conexões recíprocas e projetam-se para áreas prosencefálicas (Hobson, 1999).

A função do sistema serotonérgico em relação ao ciclo sono/vigília foi estudada em

ratos e gatos. Em ambas espécies, a taxa de disparo dos neurônios serotonérgicos e os níveis

extracelulares de 5-HT no núcleo dorsal da rafe (DR) são altos durante a vigília, diminuem

progressivamente durante o sono de ondas lentas e praticamente desaparecem na fase REM do

sono (Jacobs, Fornal, 1991; Portas et al., 2000). Este mesmo padrão de mudanças na

concentração extracelular de 5-HT e na taxa de disparo dos neurônios serotonérgicos pode ser

observado em outras estruturas do tronco encefálico e em áreas prosencefálicas (Shouse et al.,

2000). Os mecanismos responsáveis pelas mudanças na concentração de 5-HT extracelular

nos núcleos da rafe durante o ciclo sono/vigília ainda não estão claros, no entanto há

evidências de que o declínio na transmissão serotonérgica durante o sono de ondas lentas é

mediado pela interação com outros neurotransmissores (Gervasoni et al., 2000).

Além da relação com o ciclo sono/vigília, o nível extracelular de 5-HT nos núcleos da

rafe também é associado com o estado comportamental e a atividade motora dos animais. Em

áreas prosencefálicas foi observado que a liberação da 5-HT resulta da ativação

comportamental e está relacionada ao estado de alerta (Rueter, Jacobs, 1996).

Uma das evidências da relação entre a 5-HT, núcleos da rafe e a modulação de ritmos

circadianos é o substrato anatômico nas conexões entre a retina e a rafe (Shen, Semba, 1994,

Frazão et al., 2007), e entre rafe e o NSQ (Morin, 1992; Morin, Meyer-Bernstein, 1999;

Kalsbeehk et al., 1993).

A via rafe-NSQ se origina no núcleo mediano da rafe (MnR), (Morin, 1999; Morin,

Meyer-Bernstein, 1999) e corresponde a terceira maior aferência ao NSQ (Azmitia, Segal,

1978; Van de Kar, Lorens, 1979). Neste circuito, a 5-HT exerce efeito inibitório, modulando

os efeitos da luz na ritimicidade circadiana (Rea et al., 1994; Shibata, Moore, 1998). Além de

participar nos mecanismos de sincronização da via rafe-NSQ, a 5-HT apresenta flutuações

circadianas de sua concentração NSQ (Faradji et al., 1983; Glass et al., 1992). Outros estudos

foram realizados em estruturas como: locus coeruleus (LC) (Kaehler et al., 2000; Ase et al.,

2000), amígdala (Viana et al., 1997), núcleo accumbens, medula espinal, bulbo olfatório,

substância negra (Ase et al., 2000) e núcleo vestibular medial (Cransac et al., 1996) para se

avaliar o conteúdo de 5-HT, com o intuito de se analisar mudanças nas concentrações e no

metabolismo da 5-HT em resposta a manipulações fisiológicas ou farmacológicas.

Quanto à noradrenalina, axônios de neurônios noradrenérgicos encontram-se

espalhados por todo o encéfalo, o locus coeruleus (LC), principal fonte deste

neurotransmissor, envia densas projeções para diversas estruturas do encéfalo (Curtis,

Valentino, 1994; Aston-Jones et al., 1999; Berridge, Waterhouse, 2003), em especial, áreas

relacionadas ao processamento da atenção, como o córtex parietal e colículo superior (Aston-

Jones et al., 1999; Berridge & Waterhouse, 2003). O LC recebe aferências de várias estruturas

encefálicas como o córtex pré-central, área hipotalâmica lateral e os núcleos

paragigantocelular, hipoglosso, central da amigdala e DR (Peyron et al., 1998; Van

Bockstaele et al., 1998; Berridge, Waterhouse, 2003).

A concentração de 5-HT dos núcleos da rafe de ratos apresenta variação rítmica ao

longo do dia. As concentrações mais altas estão na fase de escuro, período considerado como

de atividade dos animais, com nível máximo às 21:00h e mínimo às 5:00h, sendo que, as

19:00h, imediatamente antes do apagar das luzes, há aumento significante do nível de 5-HT

(Pinato et al., 2004).

Para verificarmos se as flutuações rítmicas da concentração de 5-HT nos núcleos da

rafe ao longo do dia representam ritmos circadianos endógenos o presente trabalho analisou a

variação no conteúdo da 5-HT nos núcleos da rafe ao longo do período circadiano dos animais

mantidos em livre-curso (na ausência de pistas ambientais).

Além disso, para verificar a relação deste ritmo com a variação endógena no conteúdo

da NA nas mesmas áreas e em áreas de projeção dos núcleos da rafe e em estruturas

envolvidas na geração e modulação dos ritmos biológicos avaliamos também os conteúdos de

5-HIAA e NA nos núcleos da rafe, NSQ e glândula pineal de animais em livre-curso.

Os resultados são discutidos quanto à relação entre as variações nos conteúdos das

substâncias analisadas e o ritmo de atividade/repouso dos animais.

2.6 CONCLUSÕES

• Os núcleos da rafe Obscuro (ROb) e Linear (Li) apresentam ritmo endógeno

circadiano no conteúdo de 5-HT que difere daquele previamente demonstrado em situação de

claro/escuro ambiental, sugerindo que a luz imposta aos animais é importante na

sincronização dos ritmos endógenos de 5-HT.

• Os demais núcleos da rafe não apresentam ritmo endógeno circadiano no conteúdo

de 5-HT, demonstrando que o ciclo claro/escuro é fator determinante na expressão do ritmo

diário que estes núcleos expressam.

• Embora os núcleos analisados não tenham apresentado ritmos endógenos circadianos

nos conteúdos de 5-HIAA e NA, as variações encontradas entre as fases de repouso e de

atividade dos animais sugerem que a atividade dos sistemas serotonérgico e noradrenérgico

seja modulada pela transição do ciclo de atividade e repouso, ou ainda que estes dois sistemas

estejam envolvidos na modulação desta transição.

• O NSQ não apresenta ritmo endógeno circadiano nos conteúdos de 5-HT e 5HIAA

em animais em livre-curso, sendo que, a atividade serotonérgica, neste núcleo, é maior na fase

de atividade dos animais.

• Quantificações em somente um ponto do dia ou comparações entre experimentos

realizados em horários diferentes do dia tanto para 5-HT como para a NA podem levar a

informações errôneas dependendo em qual horário o estudo foi realizado.

3. CAPÍTULO II

CITOARQUITETURA E AFERÊNCIAS SEROTONÉRGICAS NO NÚCLEO

SUPRAQUIASMÁTICO: ESTUDO COMPARATIVO EM PRIMATAS (Cebus apella e

Callithrix jacchus) E ROEDORES Rattus norvegicus (WISTAR E LONG EVANS).

RESUMO

O Núcleo supraquiasmático (NSQ) é o componente essencial do sistema de temporização

circadiana envolvido na geração e modulação de ritmos neuroendócrinos e comportamentais

em mamíferos. Citoarquitetura, aspectos hodológicos e neuroquímicos foram investigados no

NSQ de várias espécies de mamíferos, particularmente em roedores. Na maioria das espécies,

estas características levam a duas subdivisões do NSQ, uma dorsomedial e outra ventrolateral,

as quais refletem especializações funcionais relacionadas à geração, controle e expressão da

ritimicidade circadiana. Estudos demonstram ainda, densa inervação de fibras serotonérgicas

(5-HT-IR) na área ventral do NSQ.

Neste estudo, o padrão de distribuição dos terminais 5-HT-IR e a organização citoarquitetural

do NSQ dos primatas Cebus apella e Callithrix jacchus e roedores Rattus norvegicus (Wistar

e Long Evans) foram investigados e comparados com os descritos para outras espécies. Os

resultados mostram o NSQ do Cebus apella como um grupamento celular de 0.118 ± 0.008

mm2 de área no plano de secção e mais de 1 mm de comprimento no eixo rostro-caudal. Seus

neurônios são menores e densamente agrupados em comparação com áreas adjacentes. A

análise quantitativa mostrou que terminais 5-HT-IR ocupam ao redor de 10 % da área do

núcleo, em contraste com os 25 % observados no Callithrix jacchus e em ratos (Long Evans

e Wistar). Além disso, a distribuição das fibras 5-HT-IR no Cebus apella, assim como no

Callithrix jacchus, não apresenta o padrão característico de organização ventrolateral

observado em roedores, sugerindo que a função das aferências serotonérgicas no NSQ nesta

espécie seja diferente da de roedores.

3.1 INTRODUÇÃO

Resultados de vários estudos suportam a função do núcleo supraquiasmático (NSQ)

como marcapasso central neural endógeno responsável pela geração e manutenção dos ritmos

circadianos (Moore, 1983; Turek, 1985; Rusak, 1989; Meijer, Rietveld, 1989; Klein et al.,

1991; Harrington et al., 1994). A sincronização da atividade endógena do NSQ ao fotoperíodo

ambiental é possível graças a projeções diretas das células ganglionares da retina via trato

retinohipotalâmico (TRH) (Moore, Lenn, 1972; Johnson et al., 1988, Morin, 1994) e por

projeções retinianas indiretas, tais como o trato geniculohipotalâmico (TGH) e a via rafe-NSQ

(Card, Moore, 1982; Hay-Schmidt et al., 2003). As projeções do TRH são formadas

principalmente por axônios glutamatérgicos (De Vries et al., 1993) enquanto o TGH utiliza

axônios contendo neuropeptídeo Y (NPY), e a via rafe é constituída por axônios contendo

serotonina (5-HT) (Albers, Ferris, 1984; Biello et al., 1994; Meyer-Bernstein, Morin, 1996;

Marchant et al., 1997).

Em roedores noturnos, espécie mais utilizada em pesquisa circadiana, o NSQ é

descrito como um grupamento de células densamente agrupadas no hipotálamo anterior,

organizado em duas subdivisões funcionais e anatômicas: (1) O cerne, adjacente ao quiasma

óptico, que contém predominantemente neurônios contendo polipeptídio intestinal vasoativo

(VIP) ou peptídeo liberador de gastrina (GRP) co-localizados com ácido gama aminobutírico

(GABA) e, (2) A concha, externa ao cerne, caracterizada por uma grande população de

neurônios contendo arginina vasopressina (AVP) em sua porção dorsomedial e também co-

localizado com GABA. O cerne, ou porção ventrolateral recebe fibras aferentes visuais e da

rafe; enquanto que, as projeções para a concha, ou porção dorsomedial provêm de regiões

subcorticais e corticais (Moga, Moore, 1997; Moore et al., 2002). As subdivisões cerne e

concha refletem especialidades funcionais relacionadas a geração, controle e expressão da

ritimicidade circadiana (Moore et al., 2002).

A 5-HT é encontrada em fibras e terminais no NSQ em roedores e em várias outras

espécies já estudadas. Em ratos, essas fibras formam um denso plexo na sua porção ventral

sobrepondo o campo dos terminais do TRH (Moore et al., 1978; Steinbusch, 1981; Ueda et

al., 1983; Van den Pol, Tsujimoto, 1985). Em hamsters, camundongos e gatos, estas fibras

também formam um plexo na região ventral com expansão para lateral e principalmente

medial nas porções média e caudal do NSQ (Ueda et al., 1983; Card, Moore, 1984;

Abrahamson, Moore, 2001). Em marsupiais, as terminações 5-HT–IR formam um plexo

periventricular esparso no NSQ e, em porquinhos da índia estas estão distribuídas por toda

extensão do núcleo (Cassone et al., 1988). No Octodon degus, as 5-HT-IR estão localizadas

ventralmente ao longo do trato óptico e dorsalmente ao longo da margem, entre o terceiro

ventrículo e o NSQ, nas porções rostral e média (Goel et al., 1999).

Alguns estudos também relatam imunoreatividade a 5-HT no NSQ em algumas

espécies de primatas. Por exemplo, no Callithrix jacchus, um denso plexo de fibras preenche

este núcleo, principalmente, nas áreas dorsal e central, sendo que, estas fibras são

praticamente ausentes na porção ventral (Costa et al., 1998; Cavalcante et al., 2002). Já no

macaco cynomolgus e em humanos estas fibras apresentam padrão de distribuição similar ao

descrito em roedores, formando um plexo ventral (Moore, Speh, 2004).

A organização citoarquitetural e o padrão de distribuição dos terminais serotonérgicos

no NSQ do primata diurno Cebus apella são descritos neste estudo, bem como, comparados

aos dados obtidos no também primata diurno Callithrix jacchus e em roedores noturnos

(ratos Wistar e Long Evans).

3.6 CONCLUSÕES

• O NSQ do Cebus apella possui forma e tamanho diferentes daqueles encontrados

para o Callithrix jacchus e roedores (Long Evans e Wistar).

• As células analisadas exibem freqüência de distribuição similar para todos os

parâmetros medidos entre os primatas, porém estes apresentam valores maiores do que

encontrados para roedores.

• No NSQ do Cebus apella, a área dos corpos celulares é cerca de 15 % maior do que

em Callithrix jacchus e cerca de 38 % maior do que em roedores. A mesma tendência é

observada nos diâmetros celulares mínimo, médio e máximo destas linhagens.

• O NSQ do Cebus apella apresenta baixa densidade das fibras aferentes 5-HT-IR em

comparação ao Callithrix jacchus e roedores.

• O padrão de distribuição das fibras serotonérgicas não coincide com a parte ventral

do núcleo, sugerindo diversidade na função da 5-HT na modulação de ritmos biológicos em

diferentes espécies.

4. CAPÍTULO III

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO DO

PRIMATA Cebus apella

RESUMO

O núcleo supraquiasmático (NSQ), principal relógio biológico circadiano em mamíferos,

contém uma variedade de neurônios de diferentes características neuroquímicas, os quais

tendem a formar grupos organizados dentro do núcleo. O padrão de distribuição dos

grupamentos neuronais determinou, em roedores, a subdivisão do NSQ em duas porções, uma

ventrolateral, também chamada cerne e outra dorsomedial também chamada concha. Esta

organização intrínseca pode apresentar diferenças interespecíficas, sendo que, até o momento,

a maioria dos estudos de caracterização neuroquímica deste núcleo foi realizada em roedores

e pouco se sabe sobre a organização neural do NSQ em primatas. O presente estudo avalia a

distribuição de diferentes grupos neuronais do NSQ no primata Cebus apella e os relacionam

com as distribuições das três principais aferências para este núcleo, o trato retinohipotalâmico

(TRH), as terminações neuropeptidérgicas e as terminações serotonérgicas. Os resultados

demonstram que, nesta espécie, o NSQ apresenta organização complexa caracterizada por

diversos grupos celulares (vasopressina, polipeptídeo intestinal vasoativo, calbindina,

calretinina e substância P, entre outros que ainda não foram identificados) que na maioria dos

casos se sobrepõem e apresentam diferenças de localização em comparação ao descrito em

roedores. A análise dos terminais retinianos mostrou que o TRH projeta-se bilateralmente

para o NSQ, sendo que, a projeção contralateral é predominante. Além disso, há sobreposição

de poucos terminais do TRH com terminais neuropeptidérgicos e/ou terminais serotonérgicos,

diferentemente de roedores, onde há grande sobreposição destes terminais. Os dados suportam

a idéia de que há importantes diferenças interespecíficas na estrutura e características

intrínsecas do NSQ e que, em primatas, a organização do NSQ é mais complexa do que a

organização classicamente dividida em “cerne” e “concha”. Generalizações feitas a respeito

da localização dos fenótipos celulares ou terminais aferentes ao NSQ em diferentes espécies

podem prejudicar o entendimento das relações entre estrutura e função do NSQ.

4.1 INTRODUÇÃO

Diversos estudos utilizando métodos in vivo e in vitro demonstram que o principal

oscilador circadiano de mamíferos reside no núcleo supraquiasmático (NSQ) (Stephan,

Zucker, 1972; Moore, Lenn, 1972; Hendrickson et al., 1972; Ralph et al., 1990; Silver et al.,

1996a). Resultados mais recentes demonstram que o NSQ não é um grupo homogêneo de

células capazes de gerar ritmos de maneira uniforme. Ao invés disto, diferentes tipos de

células, expressam comportamentos diferentes dentro do NSQ dependendo do seu fenótipo

e/ou localização (Schaap et al., 2001; Saeb-Parsy, Dyball, 2003; Quintero et al., 2003;

Hamada et al., 2004). Isso aumenta a ênfase no conhecimento da organização intrínseca do

NSQ devido às implicações que tal organização pode ter na regulação funcional do sistema de

temporização circadiano.

O estudo da organização do NSQ em primatas é especialmente importante se levarmos

em consideração a extensão a qual ela varia entre espécies já estudadas. Por exemplo,

hamsters têm um subnúcleo central dentro do NSQ caracterizado pela presença de células

imunoreativas a substância P (SP), peptídeo liberador de gastrina (GRP), calbidina (CalB) e

calretinina (CalR) (Morin et al., 1992; Miller et al., 1996; Silver et al., 1996b; LeSauter et al.,

2002). Contrariamente, não existe tal subnúcleo ou equivalente presente no NSQ de ratos e do

esquilo golden-mantled, no qual a mesma região é caracterizada por células contendo

encefalina (ENC) (Smale et al., 1991).

Apesar da existência de diferenças interespecíficas, há algumas similaridades na

morfologia do NSQ compartilhada por roedores. As mais evidentes são as populações de

neurônios contendo vasopressina (VP) geralmente localizados na porção dorsomedial e de

peptídeo intestinal vasoativo (VIP) geralmente localizados na porção ventral do NSQ (Moore

et al., 2002; Morin, Alen, 2006). Outros tipos celulares, tais como colecistoquinina ou

somatostatina, também foram demonstrados no NSQ de algumas espécies (Silver et al., 1999;

LeSauter et al., 2002; Moore et al., 2002). Em adição, células imunoreativas ao ácido gama

aminobutírico (GABA) caracterizam a maioria dos neurônios do NSQ em roedores (Moore,

Speh, 1993; Morin, Blanchard, 2001).

Além dos vários fenótipos celulares intrínsecos ao NSQ, esse núcleo também pode ser

caracterizado pela localização de seus terminais aferentes. Destes, os três principais são: o

trato retinohipotalâmico (TRH), o trato geniculohipotalâmico (GHT) e as projeções

serotonérgicas da rafe (Morin, Alen, 2006). Cada uma destas projeções tem distribuição

específica dentro do núcleo, muitas vezes apresentando sobreposição entre elas. Em roedores,

ambos, TRH e TGH projetam-se para os núcleos NSQ, onde há grande sobreposição de seus

terminais na região ventral do NSQ (Muscat et al., 2003; Morin et al., 2003, Morin, Alen,

2006).

A origem do TGH, em roedores, seria uma população de neurônios imunoreativos ao

NPY (NPY-IR) no folheto intergeniculado (FIG), estrutura esta que divide o núcleo

geniculado lateral (NGL) em regiões dorsal e ventral (Allen et al., 1983) e se projeta para o

NSQ (Morin, Alen, 2006).

O TGH, o qual utiliza o NPY como principal neurotransmissor, atua na modulação da

informação fótica para o NSQ (Lall, Biello, 2002), além de estar envolvido no processo de

sincronização não-fótica dos ritmos endógenos gerados pelo NSQ (Biello et al., 1994).

A informação fótica, principal pista ambiental que sincroniza os ritmos biológicos ao

meio ambiente, chega diretamente ao NSQ através de terminais do TRH, que se originam de

células ganglionares da retina e utilizam como principal neurotransmissor o glutamato

(Ebling, 1996).

De importância comprovada na modulação do sistema circadiano em roedores

(Gamble et al., 2006; Yannielli et al., 2004), alguns autores sugerem que o TGH está ausente

em humanos (Moore, 1989; Pelletier et al., 1984) e em alguns primatas não-humanos

(Chevassus-au-Louis, Cooper, 1998; Ueda et al., 1986). Entretanto, Cavalcante et al. (2002)

descrevem que em sagüis a distribuição de terminais NPY-IR no NSQ é similar a descrita em

roedores.

Os resultados descritos na literatura e no capítulo II do presente estudo (Pinato et al.,

2007) sugerem diferenças morfológicas em estruturas envolvidas na regulação de ritmos

circadianos em diferentes espécies. Tal fator motiva a investigação da presença e da

distribuição dos terminais retinianos e NPY-IR, utilizando métodos de traçador e

imunoistoquímica, no NSQ do primata (Cebus apella), e assim colaborar no entendimento da

participação do sistema peptidérgico no sistema de temporização circadiana, e do mecanismo

de sincronização fótica e não fótica em espécies diurnas.

4.6 CONCLUSÕES

• O presente estudo de análise dos tipos celulares presentes e sua distribuição no NSQ

do primata Cebus apella demonstra uma complexidade organizacional que vai além das duas

subdivisões propostas em roedores e evidencia importantes diferenças nas relações entre

terminais e grupos celulares nesta espécie.

• Além disso, os resultados indicam que, nesta espécie de primata diurno, a 5-HT e o

NPY devem estar envolvidos na modulação dos estímulos não fóticos que sincronizam o NSQ

e conseqüentemente os ritmos biológicos gerados pelo mesmo.

• Estes resultados demonstram que a extrapolação dos conhecimentos adquiridos em

roedores para primatas e humanos deve ser feita com cautela, pois podem, além de confundir

a localização de tipos celulares, inferir falsas funções aos grupamentos neuronais do NSQ.

• A importância de se continuar investigando estas características se torna ainda maior

levando-se em conta que como tem sido relatado na literatura pode haver mudanças dinâmicas

nessa aparente organização, já que, substâncias neuroativas podem apresentar um padrão de

expressão circadiano.

• Este estudo revela a importância da investigação e o conhecimento de cada vez mais

detalhes da distribuição dos vários tipos celulares, suas relações sinápticas e a anatomia das

projeções que chegam de áreas que influenciam a função do relógio circadiano,

principalmente retina, folheto intergeniculado e rafe.

5. CAPÍTULO IV

EXPRESSÃO DOS “GENES DO RELÓGIO” NO NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO

DO PRIMATA Cebus apella

RESUMO

Os mecanismos moleculares que fundamentam o funcionamento de um oscilador circadiano

parecem ser governados por princípios similares em todos os organismos já estudados. Não

importa o quão complexo seja o organismo, oscilações circadianas são geradas em cada uma

das células do oscilador, porém podem existir diferenças interespecíficas nos detalhes

moleculares de como as alças oscilatórias operam. Em mamíferos, o principal oscilador

biológico circadiano está localizado no núcleo supraquiasmático (NSQ). Composto de

múltiplas células que funcionam individualmente como osciladores autônomos; as vias

químicas e moleculares que constituem o mecanismo oscilatório intracelular começam a ser

compreendidas através da análise de mutações, homologias na seqüência de genes, e

interações proteína-proteína que identificam moléculas regulatórias e processos bioquímicos.

A oscilação circadiana autônoma baseia-se em alças de retro-alimentação de transcrição e

translação que resultam na expressão rítmica dos chamados “genes relógio”. Estes incluem,

três genes da família Period (Per): Per1, Per2 e Per3, o gene Clock, os genes “cryptochrome”

Cry1 e Cry2 e o BMAL1. Embora homólogos destes genes tenham sido identificados em

primatas incluindo humanos, pouco é conhecido sobre seus padrões de expressão no NSQ.

Com a análise da expressão do RNAm dos genes mPer1, mPer2, mCry1 e mBMAL1 no NSQ

do primata Cebus apella ao longo de alguns horários da fase de atividade dos animais,

observou-se que há densidade moderada na expressão dos genes, mPer1, mPer2 e mBMAL1 e

não foi encontrada expressão do gene Cry1. O padrão de expressão do gene Per1 e do gene

BMAL1 apresentou pico de expressão no ZT 2; o padrão de expressão do gene Per2 apresenta

pico de expressão no ZT 7, diferente dos horários onde foram encontrados os picos de

expressão destes genes no NSQ de roedores. Os dados suportam a idéia de que deve haver

importantes diferenças interespecíficas na estrutura, características intrínsecas e

conseqüentemente nos mecanismos do NSQ, entre animais diurnos e noturnos.

5.1 INTRODUÇÃO

Sabendo que os ritmos circadianos constituem característica de quase todos os

organismos vivos, a questão então é “como estes ritmos são gerados?” A primeira indicação

de que poderiam ser gerados dentro do próprio organismo, ao invés de serem criados pelo

meio ambiente cíclico, veio das observações de De Mairan em 1729, que notou que havia

periodicidade de 24 horas nos movimentos que as folhas de uma determinada planta faziam,

mesmo em situação de escuro constante. Entretanto, somente muito tempo depois a natureza

endógena deste ritmo foi aceita (Sehgal, 2004).

Em humanos, processos rítmicos incluem, entre outros, ciclo sono-vigília, liberação de

vários hormônios, regulação da temperatura corpórea, pressão sangüínea, ingestão de líquido,

produção de urina, metabolismo de colesterol e função respiratória. Enquanto alguns destes

ritmos estão sob controle do oscilador endógeno circadiano, outros são dependentes de

diferentes fatores, tais como estado comportamental. Por exemplo, a liberação de alguns

hormônios aparenta ser rítmica por ser influenciada pelo sono, o qual normalmente ocorre de

forma cíclica, e não pela função do relógio (Dunlap et al., 2004).

Atualmente acredita-se que a maioria dos organismos multicelulares possui mais que

um oscilador biológico, sendo estes, específicos para diferentes sistemas, tecidos ou órgãos. O

“oscilador central” estaria localizado no encéfalo. Osciladores localizados em outras partes do

corpo são denominados osciladores periféricos e seu grau de autonomia varia de oscilador

para oscilador e também entre espécies (Dunlap et al., 2004).

Em mamíferos, existe um oscilador central dominante, localizado no hipotálamo, o

NSQ (Klein et al., 1991). Este núcleo pode manter a atividade marcapasso por extenso

período de tempo em cultura de células. Sendo o único oscilador conhecido, do corpo de

mamíferos, com exceção do olho, que recebe informação fótica (Dunlap, 1999; Reppert,

Weaver, 2001).

Embora osciladores periféricos em mamíferos não percebam a luz, eles podem ser

sincronizados por outros estímulos fisiológicos, sendo os mais importantes: ciclos hormonais,

os quais podem ser controlados pelo NSQ ou agir independentemente nos osciladores

periféricos, e restrições alimentares que podem sincronizar o oscilador do fígado sem afetar o

NSQ.

Welsh et al., (1995) demonstraram que o NSQ apresenta ritmo circadiano na taxa de

disparo neuronal. A partir disto, outros estudos estabeleceram que a base para a geração de

ritmos biológicos está no acúmulo de ritmos intracelulares de neurônios individuais do NSQ,

sendo estas células autônomas na geração deste ritmo (Liu et al., 1997; Herzog et al., 1998;

Dunlap, 1999; Liu, Reppert, 2000). As células do NSQ expressam, em cultura, muitas

propriedades encontradas no NSQ intacto e são capazes de restabelecer a ritimicidade quando

transplantadas em animais com o NSQ lesado e, portanto, arrítmicos (Welsh et al., 1995).

Fica claro que a linhagem de células do NSQ tem a capacidade de regular o ritmo de outras

células via fatores secretados (Dunlap et al., 2004).

A organização do sistema circadiano em termos do oscilador central e dos periféricos,

as interações entre seus diferentes componentes e os mecanismos que os sincronizam são

importantes aspectos da fisiologia que só recentemente começaram a ser desvendados.

Desde a aceitação da idéia de que existem osciladores biológicos endógenos surgiu a

questão sobre qual seria o mecanismo pelo qual estes osciladores atuam? Vários modelos

matemáticos tentam explicar este fato com um aspecto em comum: a presença de uma alça de

retro-alimentação ou ciclo endógeno que poderia manter oscilações indefinidamente na

ausência de pistas ambientais (Dunlap, 1999; Jin et al., 1999; Reppert, Weaver, 2001).

Esse mecanismo básico dos osciladores (alça oscilatória) acontece intracelularmente

(Herzog et al., 1998; Liu, Reppert, 2000). Isto não quer dizer que um marcapasso é formado

por uma única célula, mas sim por um grupo de células, cada qual contendo uma alça que

oscila em sincronia com as alças das células vizinhas (Herzog et al., 1998). O NSQ é assim,

um grupamento celular que gera sinais rítmicos que vão determinar ritmos fisiológicos ou

comportamentais (Jin et al., 1999; Reppert, Weaver, 2001).

A existência de ritmos circadianos foi demonstrada em vários filos, e pelo que foi

descrito, imagina-se que os osciladores mantiveram a base de seu mecanismo durante a

evolução (Darlington et al., 1998; Jin et al., 1999; Kume et al., 1999; Dunlap et al., 2004;

Sehgal, 2004).

Na alça de retro-alimentação, que forma o mecanismo básico do oscilador, produtos

de oscilações de genes específicos regulam sua própria expressão. Estes genes são chamados

“genes do relógio” e sua auto-regulação consiste de proteínas regulando negativamente a

síntese de seus próprios RNA mensageiros (RNAms) (Sangoram et al., 1998; Shearman et al.,

1999; Reppert, Weaver, 2001).

Cada volta completa da alça leva aproximadamente 24 horas para se completar

resultando em oscilações circadianas dos níveis de proteína e RNAm. A expressão rítmica

destas proteínas garante que a retro-alimentação negativa na transcrição também seja rítmica,

a qual por sua vez garante a expressão rítmica do RNAm (Darlington et al., 1998; Jin et al.,

1999; Kume et al., 1999; Shearman et al., 2000). Embora certas características estruturais

sejam conservadas desde cyanobacteria a mamíferos, as moléculas envolvidas neste

mecanismo podem diferir de uma espécie para outra, (Todo et al., 1996; Shearman et al.,

1999; Cermakian et al., 2000; Dunlap et al., 2004; Sehgal, 2004).

Figura 24. Desenho esquemático simplificado dentro de um oscilador de 24h. Este modelo é

baseado em estudo de diversas espécies e consiste de uma alça regulatória de retro-

alimentação na qual um gene do relógio é transcrito de forma cíclica, oscilando seu RNA e

proteína que por sua vez regula negativamente a síntese de seu próprio RNAm. A alça leva

aproximadamente 24h para se completar. Adaptado de Sehgal (2004).

O número e também a natureza dos genes expressos de forma rítmica varia não

somente de espécie para espécie, mas também de um órgão ou tecido para outro dentro de um

mesmo organismo. Um gene expresso ritmicamente em um tecido, pode não ser expresso

ritmicamente em outro, talvez por servir para uma diferente função ou por que o processo no

qual está envolvido não se apresente ritmicamente neste outro tecido (Oishi et al., 1998;

Hastings et al., 1999).

Resumidamente a expressão rítmica dos “genes do relógio” dá origem a ritmos de

função e de expressão de proteínas que por sua vez dão origem a ritmos na fisiologia e

comportamento.

Gene

RNA

Proteína

Retro-alimentação negativa

Estudos genéticos e moleculares em uma variedade de organismos (cyanobacteria,

Drosophila ou camundongos) têm fornecido informações relevantes para o entendimento das

bases moleculares dos ritmos circadianos e dos mecanismos intrínsecos que estão por trás da

função circadiana. Estes estudos identificaram genes envolvidos em cada aspecto do sistema

circadiano (Honma et al., 1998; Zheng et al., 1999; Takumi et al., 1999).

Os métodos que têm sido utilizados para isolar os genes do relógio envolvem a análise

genética de animais mutantes e variam de espécie para espécie. Depois de isolado, o gene é

analisado através de uma série padronizada de procedimentos começando pelo seu

seqüenciamento (Sehgal, 2004).

Atualmente, como o genoma completo de muitos organismos já foi seqüenciado, os

resultados de uma pequena seqüência podem ser comparados com dados de base existentes

para extrair a seqüência completa do gene, o que possibilita que pesquisadores rapidamente

comecem experimentos baseados nesta informação.

A clonagem do DNA pode ser usada para expressar proteínas em bactérias ou cultura

de células, assim grandes quantidades de proteínas podem ser isoladas e usadas para estudos

bioquímicos.

A partir dos clones do DNA podemos obter sondas para análise do RNAm, enquanto

que os anticorpos podem ser usados para identificar proteínas. Usando anticorpos e sondas a

partir de genes clonados, podemos responder quando e onde os genes são expressos, e como

as funções dos múltiplos genes do relógio interagem para produzir ritmos circadianos (Dunlap

et al., 2004).

A análise temporal da expressão de muitos genes do relógio e genes controlados pelo

relógio pode ser feita pela quantificação dos níveis de RNA por técnicas como de Northen

Blot ou pela quantificação dos níveis de proteína por Western blot em tecidos coletados em

diferentes horários do dia. Já a análise espacial, ou seja, o padrão de expressão dos genes

relógio em certo local pode ser determinado por experimentos in situ.

Em experimentos in situ o RNAm e/ou a proteína são detectados em secções do

tecido, ou no tecido como um todo, de espécimes biológicos, de tal forma que o gene pode ser

visualizado na estrutura celular e subcelular. Desta forma este tipo de experimento nos diz não

somente se e quando um gene é expresso, mas precisamente onde ele é expresso. Se um gene

é expresso nas células do oscilador, ele torna-se um candidato a gene relógio, embora ele

possa num próximo passo ser identificado como componente das entradas ou saídas do

oscilador e não necessariamente ser um gene relógio. Ao contrário, se ele não é expresso em

células do oscilador, então é quase certeza que ele não é um gene relógio (Sehgal, 2004;

Dunlap et al., 2004).

A utilização da genética de insetos para o estudo do sistema circadiano tem sido bem

sucedida. Embora aparentemente (isto ainda não foi completamente provado) haja grande

conservação nas bases moleculares dos ritmos circadianos entre as espécies, o estudo destas

bases em mamíferos se justifica pela complexidade das vias e estruturas de saída, exclusivas

destes animais, que determinam a maior complexidade de sua fisiologia e comportamentos.

5.1.1 Alça de retro-alimentação do oscilador central

Dois genes, Period (Per) e Cryptochrome (Cry), são ciclicamente transcritos no curso

de 24 horas; em roedores, o pico dos níveis transcritos ocorre no meio do dia e o menor valor

no meio da noite. A translação está interligada a transcrição. Como os níveis de transcritos

aumentam durante o dia, mais e mais proteínas são produzidas. Com os níveis dessas

proteínas aumentando na célula, elas heterodimerizam e translocam para o núcleo. No núcleo

o heterodímero PER:CRY bloqueia a atividade de dois fatores de transcrição, CLOCK e

BMAL1, inibindo a transcrição de Per e Cry (Gekakis et al., 1998; Hogenesch et al., 1998;

Takahata et al., 1998).

Na ausência de PER e CRY, CLOCK e BMAL1 formam um heterodímero que ativa a

transcrição dos genes Per e Cry (Gekakis et al., 1998; Hogenesch et al., 1998; Takahata et al.,

1998). Em outras palavras quando os níveis de PER e CRY são altos, a transcrição de Per e

Cry é bloqueada. Quando os níveis de PER e CRY diminuem na célula pela degradação

destas proteínas a transcrição é liberada e o ciclo recomeça (Jin et al., 1999; Kume et al.,

1999) (Figura 25).

Figura 25. Desenho esquemático de uma alça de retroalimentação em mamífero. A alça de

retroalimentação consiste de 4 componentes principais: PERIOD (PER), CRYPTOCHROME

(CRY), CLOCK, e BMAL1. CLOCK, e BMAL1 estão agindo positivamente como fatores de

transcrição. Eles heterodimerizam e ativam a transcrição dos genes Per e Cry, com suas

isoformas. Os PERs formam tanto homodímeros como heterodímeros e também

heterodimerizam com os CRYs. Na dimerização, PER: CRY translocam para o núcleo e

inibem a atividade do heterodímero CLOCK: BMAL1. Evidências sugerem que o CRY é o

repressor dominante. A supressão da atividade do CLOCK: BMAL1 causa a inibição da

transcrição dos genes Per e Cry. A alça de retroalimentação não fica permanentemente

interrompida, graças à degradação das proteínas PER e CRY. O sinal para que elas se tornem

alvo da degradação provavelmente é o processo de fosforilação. Com a degradação de PER e

CRY, a repressão transcricional é liberada e o ciclo recomeça. O resultado final dessa alça de

retroalimentação é a oscilação diária dos níveis de ambos RNAm e proteína dos componentes

do relógio. A única exceção é o CLOCK, que não apresenta variação na sua expressão ao

longo das 24h. Adaptado de Sehgal (2004).

Em mamíferos são reconhecidos atualmente três homólogos de Per: Per1, Per2 e

Per3; e dois homólogos de Cry: Cry1 e Cry2. As razões para se ter múltiplos homólogos

ainda não são completamente esclarecidas. Expressões cíclicas de Bmal1, Per e Cry são

encontradas no NSQ e também em órgãos tais como fígado e rins. Já a expressão do gene

Clock é constante tanto em órgãos periféricos como no encéfalo (Gekakis et al., 1998;

Hogenesch et al., 1998; Takahata et al., 1998). O gene Clock foi o primeiro dos genes do

relógio a ser clonado em mamíferos (Takahashi et al., 1994; King et al., 1997).

Em roedores, o pico de expressão do Bmal1 ocorre durante o final da noite em

oposição de fase com o Per1 e Per2, tal fato consistente com a idéia de que BMAL1 se liga

ao CLOCK e juntos estes ativam a transcrição destes dois genes (Gekakis et al., 1998;

Hogenesch et al., 1998; Takahata et al., 1998). Além disso, o próprio BMAL1 funciona como

uma alça de retro-alimentação dele mesmo onde a proteína regula os níveis do seu RNAm

(Dunlap,1999; Reppert, Weaver, 2001).

Animais “Knockout” para o BMAL1 além de se tornarem arrítmicos em livre-curso

perdem a expressão rítmica de Per1 e Per2 no NSQ e em órgãos periféricos. Além disso,

esses animais têm dificuldades em responder a luz, o que sugere que BMAL1 têm função na

sincronização fótica. O mesmo acontecendo com a regulação das vias de saída do NSQ já que

esses animais apresentam disfunções metabólicas e comportamentais.

Os homólogos Per1, Per2 e Per3 apresentam similaridades e diferenças. Os níveis dos

três genes ciclam no NSQ, sendo o valor mais alto durante o dia, com valores mínimos à

noite. Uma primeira diferença entre esses genes envolve a resposta à luz. A expressão de Per1

e Per2 é induzida com a exposição à luz, entretanto, a indução de Per1 é muito mais forte e

mais rápida do que para o Per2. Camundongos que não possuem o Per1 não apresentam

avanço de fase no ritmo de atividade e repouso em resposta a um pulso de luz dado no

começo da noite. Ao contrário, camundongos que não possuem o Per2 não apresentam atraso

de fase no ritmo locomotor em resposta a um pulso de luz aplicado no final da noite. Já o gene

Per3 não é induzido pela luz, o que sugere que ele não desempenha função na via de entrada

fótica do relógio circadiano (Shearman et al., 2000).

Outra diferença chave entre essas proteínas são seus padrões de expressão em vários

tecidos. Na verdade existe até mesmo, diferença na expressão dos três homólogos dentro do

próprio NSQ (Reppert, Weaver, 2001). No hamster, uma região do NSQ expressa Per1, Per2

e Per3 de maneira rítmica. Outra região apresenta expressão constante de Per3 e expressão de

Per2 e Per1 induzida pela luz. Este resultado também sugere diferenças funcionais entre os

homólogos. Além disso, existem diferenças de expressão entre tecidos não neurais. Cada um

dos homólogos é expresso em tecidos periféricos específicos e em diferentes níveis destes

tecidos. A razão para estas diferenças de expressão ainda não é conhecida, mas sugere-se que

os três homólogos de Per tenham funções específicas em cada tecido (Shearman et al., 2000).

Decifrar estas funções individuais seria um grande avanço no entendimento das funções dos

osciladores.

Em mamíferos há dois homólogos de CRY: CRY1 e CRY2. Em camundongos, os dois

genes Cry são comprovadamente importantes para a manutenção dos ritmos circadianos (Jin

et al., 1999; Kume et al., 1999). A expressão dos genes Cry1 e Cry 2 apresenta ritimicidade

no NSQ sendo os maiores níveis de RNAm no final do dia, apresentando assim um atraso em

relação aos picos de expressão dos genes Per. A expressão das proteínas CRY1 e CRY2

também cicla no NSQ, sendo o pico aproximadamente 3 horas após o pico do RNAm. Dados

em animais “knockout” mostram que os genes Cry não são totalmente necessários para a

fotorrecepção ou para o controle da ritimicidade pela luz em mamíferos, porém são

necessários para a geração dos ritmos endógenos circadianos (Kume et al., 1999; Okamura et

al., 1999), sendo que, CRY1 e CRY2 têm efeitos opostos no tempo do oscilador. Por

exemplo, animais “knockout” para Cry2 apresentam períodos mais longos em escuro

constante (Thresher et al., 1998; Van der Horst et al., 1999); já animais “knockout” para Cry1

apresentam períodos mais curtos em escuro constante (Van der Horst et al., 1999; Vitaterna et

al., 1999).

Quanto à ação destes genes na alça de retro-alimentação, ambos bloqueiam a

transcrição de Per1 pelo heterodímero CLOCK: BMAL1 através da interação direta do CRY

com o BMAL1 (Okamura et al., 1999; Vitaterna et al., 1999). Estes genes também podem

interagir com os três homólogos do Per formando heterodímeros que também acabam por

bloquear a atividade de CLOCK e BMAL1 (Kume et al., 1999; Okamura et al., 1999).

O grau de comunicação entre diferentes osciladores dentro de um sistema circadiano

depende da posição filogenética do organismo. A evolução parece ter partido de osciladores

autônomos independentes uns dos outros e sincronizados pelo ciclo claro-escuro (plantas e

insetos), para um menos autônomo e mais acoplado sistema de osciladores (mamíferos) onde

os osciladores periféricos não são sincronizados por entradas fóticas, mas sim por outros

sinais neurais e por fatores humorais advindos principalmente do NSQ (Reppert, Weaver,

2001).

As ligações entre osciladores e seus componentes de saída que resultam em oscilações

fisiológicas incluem vários passos intermediários partindo dos genes do relógio via outros

fatores de transcrição para genes efetores que estão envolvidos na fisiologia celular. Alguns

passos deste mecanismo são conhecidos em osciladores central e periféricos, mas ainda não

compreendemos todos os detalhes da cascata de eventos desde os genes relógio a fisiologia do

organismo.

Futuros estudos da expressão dos genes relógio e dos genes controlados pelo relógio

deverão ajudar a revelar como o sistema de temporização garante a otimização do

funcionamento diário do corpo, assim como a adaptabilidade ao meio ambiente externo.

Embora homólogos destes genes do relógio tenham sido identificados em espécies de

primatas incluindo humanos (Piggins, 2002), pouco é conhecido sobre seus padrões de

expressão no NSQ de primatas. O objetivo deste trabalho foi estudar o padrão de expressão

dos genes Per1, Per2, Cry1 e BMAL1 no NSQ do macaco Cebus apella.

• O presente estudo, embora não tenha avaliado o padrão de expressão dos genes

relógio ao longo de todo o período circadiano, mostrou algumas diferenças no padrão diurno

de expressão dos genes Per1 e Per2, os quais podem ser possíveis alvos de investigação da

função fisiológica destes genes em diferentes espécies.

• O padrão de expressão dos genes Bmal 1, Per1 e Per2 apresenta pico de expressão

em horários diferentes daqueles encontrados no NSQ de roedores.

• Os dados suportam a idéia de que deve haver importantes diferenças interespecíficas

na estrutura, características intrínsecas e conseqüentemente nos mecanismos do NSQ, entre

animais diurnos e noturnos.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

5.6 CONCLUSÕES

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