TESE DE DOUTORADO...bifásico, a extração líquido-líquido e a sublação por solvente, em termos...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

TESE DE DOUTORADO

RECUPERAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE

BIOMOLÉCULAS POR FLOTAÇÃO EM SISTEMAS

AQUOSOS BIFÁSICOS

Carlos Eduardo de Araújo Padilha

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos - DEQ/UFRN

Coorientador: Prof. Dr. Jackson Araújo de Oliveira - DEQ/UFRN

NATAL/RN

FEVEREIRO/2018

Carlos Eduardo de Araújo Padilha


BIOMOLÉCULAS POR FLOTAÇÃO EM SISTEMAS

AQUOSOS BIFÁSICOS

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Engenharia Química da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte,

como parte dos requisitos necessários para a

obtenção do grau de Doutor em Engenharia

Química, sob a orientação do Prof. Dr.

Everaldo Silvino dos Santos e coorientação do

Prof. Dr. Jackson Araújo de Oliveira.

NATAL/RN

FEVEREIRO/2018

Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN

Sistema de Bibliotecas – SISBI

Catalogação da Publicação na Fonte - Biblioteca Central Zila Mamede

Padilha, Carlos Eduardo de Araújo.

Recuperação e concentração de biomoléculas por flotação em sistemas aquosos bifásicos / Carlos

Eduardo de Araújo Padilha. - 2018.

141 f. : il.

Tese (doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Tecnologia, Programa

de Pós-Graduação em Engenharia Química. Natal, RN, 2018.

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos.

Coorientador: Prof. Dr. Jackson Araújo de Oliveira.

1. Extração - Tese. 2. Componentes fenólicos - Tese. 3. Ácido gálico - Tese. 4. 2-hidroxibifenil -

Tese. 5. Camu-camu - Tese. 6. Polietilenoglicol - Tese. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Oliveira,

Jackson Araújo de. III. Título.

RN/UF/BCZM CDU 577.1

Ana Cristina Cavalcanti Tinôco

CRB 15/262

PADILHA, Carlos Eduardo de Araújo – Recuperação e concentração de biomoléculas por

flotação em sistemas aquosos bifásicos. Tese de Doutorado, UFRN, Programa de Pós-

Graduação em Engenharia Química. Área de Concentração: Engenharia Química, Linha de

pesquisa: Processos químicos, catalíticos e biotecnológicos, Natal/RN, Brasil.

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos

Coorientador: Prof. Dr. Jackson Araújo de Oliveira

Resumo: A sublação por solvente (SS) é uma técnica baseada na adsorção de substâncias de

supercífie ativa em uma interface gás/líquido e tem se destacado, em relação à extração

líquido-líquido (ELL), por alguns benefícios como a simples operação, baixa dosagem de

solvente, altos índices de eficiência de separação e concentração do produto; embora, não seja

apropriado para tratar todas as biomoléculas. Advinda da sublação por solvente, a flotação em

sistemas aquosos bifásicos (FSAB) opera em um ambiente com elevado teor de água e tem

ganhado destaque nos últimos anos na recuperação de componentes fenólicos. Neste contexto,

a presente tese explora a FSAB como técnica de separação para recuperar moléculas de

diferentes fontes tais como de extrato vegetal: ácido gálico (AG) - a partir da infusão de

folhas de goiaba, e polifenóis como (+)-catequina e quercetina do resíduo despolpado de uma

fruta típica da região amazônica, o camu-camu. Além disso, o agente bactericida 2-

hidroxibifenil (2-HBF) produzido via biodessulfurização do 4-metil-dibenzotiofeno por

Rhodococcus rhodochrous foi recuperado por FSAB. Nesses estudos, sistemas aquosos

bifásicos foram formados a partir do polímero Polietilenogligol (PEG) e o sal sulfato de

amônio, sendo que a flotação foi favorecida pela injeção de ar comprimido para geração das

bolhas ascendentes. A coluna no sistema FSAB foi confeccionada em vidro com 2,64 cm de

diâmetro interno e capacidade de 180 mL. A coluna era equipada no fundo com um disco de

vidro sinterizado de porosidade G4. Uma ampliação de escala, com a proporção

altura:diâmetro (≈ 8,0) usado como critério, também foi efetuada (para FSAB-camu camu) em

uma coluna de vidro de dimensões 60,0 x 8,00 cm e volume útil de 2,5 L. Os resultados

mostraram que as condições operacionais ótimas para recuperação de ácido gálico por FSAB

foram: pH igual a 4,0, concentração de sulfato de amônio de 450 g/L, concentração de PEG

de 80% (m/m), concentração de ácido gálico de 500 μg/mL, tempo de flotação de 120 min,

vazão de ar igual a 37,5 mL/min e razão volumétrica de 0,1. Quando alimentada com extrato

de folhas de goiaba, a FSAB apresentou maiores índices de enriquecimento do ácido gálico do

que a extração em sistema aquoso bifásico convencional. No estudo de captura de polifenóis a

partir do resíduo de camu-camu, as condições experimentais ótimas foram: pH igual a 5,0,

concentração de sulfato de amônio de 450 g/L, vazão de ar igual a 37,5 mL/min, tempo de

flotação de 60 min e razão volumétrica de 0,1. Nesse caso, na condição ótima obteve-se uma

eficiência de separação de 81,02% e coeficiente de concentração duas vezes superior à

tradicional extração em sistema aquoso bifásico. Além disso, observou-se o aumento de

aproximadamente duas vezes no poder antioxidante na fase superior, resultado da migração de

alguns componentes fenólicos como ácido gálico, ácido siríngico, quercetina e (+)-catequina.

Destaca-se que a ampliação de escala foi bem sucedida, uma vez que o desempenho do

processo em escala semi-piloto foi similar àquele obtido em escala menor. Alternativamente,

uma metodologia multivariada foi usada para definir as melhores condições operacionais da

FSAB do 2-HBF. Após um planejamento experimental fracionário, apenas as variáveis vazão

de ar, tempo de flotação e volume da fase topo foram otimizadas pelo planejamento Box-

Behnken, no qual foi possível alcançar valores de eficiência de separação de 43,55-57,55% e

coeficientes de concentração de 3,84-5,88. Assim como nos processos com os componentes

bioativos, a FSAB aplicada à captura de 2-HBF superou a extração em sistema aquoso

bifásico, a extração líquido-líquido e a sublação por solvente, em termos de fatores de

enriquecimento. O processo de flotação também obteve êxito na recuperação e concentração

do 2-HBF a partir do caldo fermentado, embora a análise por CLAE indique a elevada

concentração de contaminantes na fase topo. Assim, os resultados mostraram que a FSAB é

uma técnica promissora para recuperar e, principalmente, concentrar componentes fenólicos

advindos de meios complexos como extratos naturais e caldos de fermentação.

Palavras-chave: Extração, componentes fenólicos, ácido gálico, 2-hidroxibifenil, camu-

camu, polietilenoglicol.

Recovery and concentration of biomolecules by aqueous

two-phase flotation

Abstract: Solvent sublation (SS) is a technique based on the adsorption of active superficial

substances at a gas / liquid interface and has been highlighted, in relation to liquid-liquid

extraction (LLE), by some benefits such as simple operation, low dosage high solvent

separation rates and product concentration; although, it is not suitable for treating all

biomolecules. Derived from solvent sublation, aqueous two-phase flotation (ATPF) operates

in an environment with high water content and has gained prominence in recent years in the

recovery of phenolic components. In this context, the present thesis explores ATPF as a

separation technique to recover molecules from different sources such as plant extract: gallic

acid (GA) - from infusion of guava leaves, and polyphenols like (+) - catechin and quercetin

of the depulped residue of a typical Amazonian fruit, camu-camu. In addition, the bactericidal

agent 2-hydroxybiphenyl (2-HBP) produced via biodesulfurization of 4-methyl-

dibenzothiophene by Rhodococcus rhodochrous was recovered by ATPF. In these studies,

aqueous biphasic systems were formed from the polymer Polyethyleneglycol (PEG) and

ammonium sulfate salt, and flotation was favored by the injection of compressed air to

generate the ascending bubbles. The column in the ATPF system was made of glass with a

2.64 cm internal diameter and a capacity of 180 mL. The column was fitted to the bottom with

a sintered glass disk of G4 porosity. A scale magnification, with the height: diameter ratio

used as a criterion, was also performed (for ATPF-camu camu) in a glass column of

dimensions 60.0 x 8.00 cm and a useful volume of 2.5 L. results showed that the optimal

operating conditions for recovery of gallic acid by ATPF were: pH equal to 4.0, ammonium

sulfate concentration of 450 g/L, PEG concentration of 80% (w/w), gallic acid concentration

of 500 μg/mL, flotation time of 120 min, air flow equal to 37.5 mL/min and volumetric ratio

of 0.1. When fed with guava leaf extract, the ATPF showed higher enrichment indexes and

gallic acid distribution ratios than extraction in a conventional biphasic aqueous system. In the

study with the camu-camu residue, the optimal experimental conditions were: pH equal to 5.0,

ammonium sulfate concentration of 450 g/L, air flow equal to 37.5 mL/min, flotation time of

60 minm and volumetric ratio of 0.1. In this case, in the optimum condition, a separation

efficiency of 81.02% and a concentration coefficient two times higher than the traditional

two-phase aqueous extraction were obtained. In addition, the increase in antioxidant power in

the upper phase was observed, resulting from the migration of some phenolic components

such as gallic acid, syringic acid, quercetin and (+) - catechin. It should be noted that the

scale-up was successful. Alternatively, a multivariate methodology was used to define the

best operating conditions of ATPF to recover 2-HBP. After a fractional experimental design,

only the variables of air flow, float time and volume of the top phase were optimized by the

Box-Behnken design, in which it was possible to reach separation efficiency values of 43.55-

57.55% and coefficients concentration of 3.84-5.88. As in the previous chapters, ATPF

surpassed the two-phase aqueous system extraction, liquid-liquid extraction and solvent

sublation in terms of enrichment factors. The flotation process was also successful in the

recovery and concentration of 2-HBP from the fermented broth, although analysis by HPLC

indicates the high concentration of contaminants in the top phase. Thus, the results showed

that ATPF is a promising technique to recover and, mainly, concentrate phenolic components

from complex media such as natural extracts and fermentation broths.

Key-words: Extraction, phenolic compounds, gallic acid, ortho-phenylphenol, camu-camu,

polyethylene glycol.

AGRADECIMENTOS

À minha família, meu pai José, minha mãe Raimunda, e meus irmãos Ana Maria e

Carlinhos, pelo amor incondicional e apoio ao longo de todos esses anos. Eu não seria nada

sem vocês.

À minha namorada Cleitiane, por todo carinho e paciência durante esta etapa.

Aos meus orientadores, Prof. Everaldo Silvino dos Santos, Prof. Jackson Araújo de

Oliveira, Profa. Gorete Ribeiro de Macedo e Prof. Domingos Fabiano de Santana Souza, pelas

contribuições no meu trabalho e por serem exemplos de profissionalismo.

Aos meus alunos de iniciação científica, Paulo e Hanna, pelo companherismo e por me

ajudarem na realização dos experimentos.

Aos técnicos do LEB, Waleska e Francisco (agora professor), pela gestão do

laboratório, sendo então, importantes para a execução da tese.

Aos colegas de trabalho do LEB, Ana Laura, Marcos, Sérgio, Alexandre, Ruthineia,

Cinthia, Naldo, Emylliany, Priscilla, Jaciara, Juliene, Vitor, Júlia e Luan, pela colaboração e

por me aturarem quase todos os dias.

Aos funcionários da UFRN pela disponibilidade e atenção nos atendimentos.

Por fim, agradeço ao PPGEQ e a CAPES pela bolsa concedida durante o doutorado.

Sumário

Lista de Figuras ........................................................................................................................... i

Lista de Tabelas ........................................................................................................................ iv

Lista de abreviaturas e siglas ...................................................................................................... v

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 19

2. RECUPERAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO GÁLICO DE FOLHAS DE

GOIABA POR FLOTAÇÃO EM SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS ...................... 23

2.1. Revisão bibliográfica ......................................................................................................... 23

2.1.1. Compostos fenólicos bioativos ........................................................................... 23

2.1.2. Ácido gálico ........................................................................................................ 26

2.1.3. Extração líquido-líquido ..................................................................................... 28

2.1.4. Extração em sistemas aquosos bifásicos (ESAB) ............................................... 29

2.1.4.1. Diagrama de fases ................................................................................ 31

2.1.4.2. Particionamento em ESAB. ................................................................ 33

2.1.5. Sublação por solvente (SS) ................................................................................. 37

2.1.5.1. Mecanismos de transferência de massa .............................................. 38

2.1.5.1.1. Transporte por adsorção em bolhas....................................... 39

2.1.5.1.2. Transporte por drenagem da fase aquosa .............................. 40

2.1.5.1.3. Difusão na interface líquido/líquido ...................................... 41

2.1.5.2. Aplicações da SS .................................................................................. 42

2.2. Objetivos ............................................................................................................................ 47

2.2.1. Objetivos específicos .......................................................................................... 47

2.3. Materiais e Métodos .......................................................................................................... 48

2.3.1. Reagentes e aparato experimental ...................................................................... 48

2.3.2. Preparação do extrato de follhas de goiaba ........................................................ 49

2.3.3. Otimização das condições operacionais ............................................................. 49

2.3.4. Experimentos de comparação ............................................................................ 51

2.3.5. Determinação do ácido gálico e análise por cromatografia líquida de alta

eficiência ................................................................................................................................... 51

2.4. Resultados e Discussões .................................................................................................... 52

2.4.1. Efeito do tipo de solvente orgânico .................................................................... 52

2.4.2. Efeito do pH na fase aquosa ............................................................................... 53

2.4.3. Efeito da concentração de sulfato de amônio .................................................... 55

2.4.4. Efeito do percentual de PEG na camada de topo ............................................... 56

2.4.5. Efeito da concentração inicial do sublado ......................................................... 57

2.4.6. Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação ..................................................... 58

2.4.7. Efeito do volume da fase orgânica ..................................................................... 59

2.4.8. Comparação entre FSAB e ESAB ..................................................................... 61

2.5. Conclusões ......................................................................................................................... 63

3. RECUPERAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE POLIFENÓIS DO RESÍDUO DE CAMU-

CAMU (Myrciaria dubia H.B.K. Vaugh) POR FLOTAÇÃO EM DUAS FASES AQUOSAS

.................................................................................................................................................. 65


3.1.1. Valorização de resíduos agroindustriais ............................................................. 65

3.1.2. Camu-camu ......................................................................................................... 66

3.1.2.1. Resíduo despolpado de camu-camu ..................................................... 67

3.2. Objetivos ............................................................................................................................ 69


3.3. Materiais e Métodos ......................................................................................................... 70

3.3.1. Reagentes e aparato experimental ..................................................................... 70

3.3.2. Preparação do extrato do resíduo de camu-camu .............................................. 70

3.3.3. Experimentos FSAB .......................................................................................... 70

3.3.4. Ampliação de escala da FSAB ........................................................................... 71

3.3.5. Determinação da concentração de polifenóis totais ............................................ 71

3.3.6. Determinação da atividade antioxidante ............................................................. 72

3.3.7. Análise de polifenóis por CLAE ......................................................................... 72

3.4. Resultados e Discussões ................................................................................................... 73

3.4.1. Recuperação de polifenóis por FSAB ................................................................. 73

3.4.1.1. Efeito do tipo de solvente .................................................................... 73

3.4.1.2. Efeito do pH da fase fundo .................................................................. 74

3.4.1.3. Efeito da concentração sulfato de amônio na fase fundo .................... 75

3.4.1.4. Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação ..................................... 77

3.4.1.5. Efeito da razão volumétrica ................................................................ 78

3.4.2. Experimentos comparativos e aumento de escala .............................................. 80

3.4.3. Cromatogramas de CLAE ................................................................................... 81

3.5. Conclusões ......................................................................................................................... 83

4. RECUPERAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DO 2-HIDROXIBIFENIL A PARTIR DE

CALDO FERMENTADO POR FLOTAÇÃO EM DUAS FASES AQUOSAS .................... 86


4.1.1. Biodessulfurização e 2-hidróxibifenil ................................................................. 86

4.1.2. Técnicas de enriquecimento para amostras orgânicas ........................................ 88

4.2. Objetivos ............................................................................................................................ 92


4.3. Materiais e Métodos ......................................................................................................... 93

4.3.1. Reagentes e aparato experimental ..................................................................... 93

4.3.2. Microrganismos e biodessulfurização ............................................................... 93

4.3.3. Experimentos FSAB .......................................................................................... 94

4.3.4. Comparação entre as técnicas de separação ....................................................... 95

4.3.5. Determinação do 2-HBF e análise por CLAE ................................................... 95

4.4. Resultados e Discussões ................................................................................................... 97

4.4.1. Triagem das variáveis FSAB .............................................................................. 97

4.4.2. Planejamento Box-Behnken ............................................................................ 100

4.4.3. Experimentos de comparação ........................................................................... 104

4.4.4. Recuperação e concentração de 2-HBF obtido da biodessulfurização do 4-

MDBT .................................................................................................................................... 104

4.5. Conclusões ....................................................................................................................... 106

CONCLUSÕES GERAIS ...................................................................................................... 108

Referências bibliográficas ...................................................................................................... 110

i

Lista de Figuras

Figura 2.1 – Esquema simplificado das rotas metabólicas das plantas para produção de

componentes fenólicos. ........................................................................................................... 24

Figura 2.2 – Estrutura química do AG e valores de lipofilicidade do AG e seus galatos de

alquila ....................................................................................................................................... 27

Figura 2.3 – Ilustração esquemática da separação de fases em SABs do tipo polímero/sal. ... 32

Figura 2.4 – Diagrama de fases genérico de um sistema formado pela mistura de PEG e sal . 33

Figura 2.5 – Esquema da classificação dos métodos de separação envolvendo adsorção na

interface gás/líquido. ................................................................................................................ 38

Figura 2.6 – Mecanismos de transferência de massa no processo de sublação por solvente. .. 42

Figura 2.7 – Ilustração do aparato usado na FSAB .................................................................. 48

Figura 2.8 – Efeito do pH no desempenho da FSAB. Os experimentos foram realizados nas

seguintes condições: [sulfato de amônio] = 450 g/L, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL,

vazão de ar = 25 mL/min, tf = 30 min, razão volumétrica = 0.1. ............................................ 54

Figura 2.9 – Efeito do sulfato de amônio no desempenho da FSAB. Os experimentos foram

realizados nas seguintes condições: pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão

de ar = 25 mL/min, tf = 30 min, razão volumétrica = 0,1. ..................................................... 55

Figura 2.10 – Efeito do percentual de PEG no desempenho da FSAB. Os experimentos foram

realizados nas seguintes condições: pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão

de ar = 25 mL/min, tf = 30 min, razão volumétrica = 0,1. ....................................................... 57

Figura 2.11 – Efeito da concentração do sublado no desempenho da FSAB. Os experimentos

foram realizados nas seguintes condições: [sulfato de amônio] = 450 g/L, pH = 4,0, %PEG

(m/m) = 80,0, vazão de ar = 25 mL/min , tf = 30 min, razão volumétrica = 0,1. .. .................. 58

Figura 2.12 – Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação na eficiência de separação usando

a FSAB. Os experimentos foram realizados nas seguintes condições: [sufato de amônio] =

450 g/L, pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, razão volumétrica = 0,1. ......... 59

ii

Figura 2.13 – Efeito do volume inicial da fase rica em PEG no desempenho da FSAB. Os

experimentos foram realizados nas seguintes condições: [sulfato de amônio] = 450 g/L, pH =

4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão de ar = 37,5 mL/min , tf = 120 min. ..... 60

Figura 2.14 – Cromatogramas de CLAE para a fase rica em sal antes da FSAB (A), fase rica

em sal depois da FSAB (B) e fase rica em PEG depois da FSAB (C). .................................... 61

Figura 2.15 – Cromatogramas CLAE para o extrato de folhas de goiaba anterior ao processo

de flotação (A), fase rica em sal após a FSAB (B) e fase rica em PEG após a FSAB (C). ...... 63

Figura 3.1 – Frutos de camu-camu.. ......................................................................................... 67

Figura 3.2 – Desempenho da FSAB com diferentes solventes orgânicos. As condições

experimentais usadas foram: pH = 3,8 (sem ajuste do pH); [(NH4)2SO4] = 450 g/L, vazão de

ar = 37,5 mL/min; tf = 30 min; razão volumétrica = 0,1. As letras minúsculas a, b e c foram

usadas para comparação de respostas; respostas com a mesma letra indicam que não há

diferença entre elas a 95% de confiança ................................................................................... 73

Figura 3.3 – Efeito do pH da fase rica em sal sobre a FSAB. As condições experimentais

usadas foram:% PEG (m/m) = 80,0; [(NH4)2SO4] = 450 g/L, vazão de ar = 37,5 mL/min; tf =

30 min; razão volumétrica = 0,1. As letras minúsculas a, b, c, d e e foram usadas para

comparação de respostas; respostas com a mesma letra indicam que não há diferença entre

elas a 95% de confiança. .......................................................................................................... 75

Figura 3.4 – Efeito da concentração de sulfato de amônio na fase rica em sal sobre a FSAB.

As condições experimentais usadas foram:% PEG (m/m) = 80,0; pH = 5,0, vazão de ar = 37,5

mL/min; tf = 30 min; razão volumétrica = 0,1. As letras minúsculas a, b e c foram usadas para


elas a 95% de confiança............................................................................................................ 76

Figura 3.5 – Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação sobre a FSAB. As condições

experimentais usadas foram:% PEG (m/m) = 80,0; pH = 5,0, [(NH4)2SO4] = 450 g/L; razão

volumétrica = 0,1. As letras maiúsculas A e B foram usadas para comparação de E% para as

diferentes vazões de ar para o mesmo tempo de flotação. As letras minúsculas a, b, c e d

foram usadas para comparação de E% de diferentes tempos de flotação em uma mesma vazão

de ar; respostas com a mesma letra indicam que não há diferença entre elas a 95% de

confiança ................................................................................................................................... 78

iii

Figura 3.6 – Efeito da razão volumétrica sobre a FSAB. As condições experimentais usadas

foram:% PEG (m/m) = 80,0, pH = 5,0, [(NH4)2SO4] = 450 g/L, vazão de ar = 37,5 mL/min, tf

= 30 min, razão volumétrica = 0,1. As letras minúsculas a, b e c foram usadas para


elas a 95% de confiança............................................................................................................ 79

Figura 3.7 – Aparato experimental em escala piloto antes (A) e depois do processo (B) ........ 82

Figura 3.8 – Cromatograma de CLAE da fase rica em PEG da FSAB sob condições ótimas a

280 nm. Os picos 1, 2, 3, 4, 5 e 6 correspondem ao ácido gálico, (+) catequina, ácido vanílico,

ácido siríngico, ácido elágico e quercetina. ............................................................................. 83

Figura 4.1 – Ilustração simplificada da rota metabólica 4S para biodessulfurização do DBT. 87

Figura 4.2 – Cromatogramas de CLAE 75 μg/L de 2-HBF (A) e curva de calibração (B).. .... 96

Figura 4.3 – Efeitos das variáveis FSAB no planejamento fatorial fracionário sobre o

percentual de eficiência de separação. ...................................................................................... 99

Figura 4.4 – Superfície de respota e gráficos de contorno para eficiência de separação (A),

coeficiente de concentração (B) e razão de distribuição (C) de 2-HBF sob efeitos de duas

variáveis FSAB. A outra variável foi mantida no nível codificado igual a zero .................... 102

Figura 4.5 – Comparação de desempenho de diferentes métodos de separação. FSAB, vo/vw

=1:8; ESAB, vo/vw =1:4; SS, vo/vw =1:8; ELL, vo/vw =1:4. As letras minúsculas a, b, c e d são

usados para comparação de desempenho entre FSAB, ESAB, SS e ELL; valores com a

mesma letra não são significativamente diferentes entre si (p < 0,05) .................................. 105

Figura 4.6 – Cromatogramas CLAE para o caldo fermentado anterior ao processo de flotação

(A), fase rica em sal após a FSAB (B) e fase rica em PEG após a FSAB (C) ...................... 106

iv

Lista de Tabelas

Tabela 2.1 - Classes de componentes fenólicos em plantas ..................................................... 26

Tabela 2.2 - Ordem de execução dos experimentos e as respectivas faixas de operação

estudadas ................................................................................................................................... 50

Tabela 2.3 - Desempenho da FSAB com diferentes solventes orgânicos. As condições

experimentais usadas foram: pH = 4,0, [sulfato de amônio] = 450 g/L,% solvente orgânico

(m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão de ar = 25 mL/min , tempo de flotação = 30 min,

razão volumétrica = 0,1 ............................................................................................................ 53

Tabela 2.4 - Comparação de desempenhos entre a ESAB (1:4) e FSAB (1:10) para a solução

modelo e o extrato de folhas de goiaba .................................................................................... 62

Tabela 3.1 - Comparação entre os métodos de separação na recuperação de polifenóis de

resíduo de camu-camu .............................................................................................................. 80

Tabela 3.2 - Valores médios de concentração de componentes fenólicos (definidos em mg/100

g do material seco) e poder antioxidante (μmol TE/g do material seco) no resíduo de camu-

camu e no produto da FSAB .................................................................................................... 81

Tabela 4.1 - Valores das variáveis FSAB e seus níveis no planejamento de meia fração ....... 94

Tabela 4.2 - Matriz do planejamento fatorial fracionário 26-1

com o percentual de eficiência de

separação como resposta .......................................................................................................... 98

Tabela 4.3 - Valores das variáveis FSAB e seus níveis no planejamento Box-Behnken ....... 100

Tabela 4.4 - Matriz do BBD com três fatores. O pH da fase aquosa, a concentração de sal e a

concentração inicial de sublado foram fixados em 4,0, 425 g/L e 75 mg/L, respectivamente

................................................................................................................................................ 101

v

Lista de abreviaturas e siglas

2-HBF - 2-Hidróxibifenil

AD2EHF - Ácido di- ácido di(2-etilhexil) fosfórico

AG - Ácido gálico

BB - Box-Behnken

C - Concentração volumétrica

C0 - Número de repetições no ponto central

Ca - Concentração de soluto na fase aquosa

Co - Concentração de soluto na fase orgânica

CPEG - Concentração do sublado na fase de fundo em um determinado tempo t

Cw - Concentração do sublado na fase de fundo em um determinado tempo t

Cwi - Concentração inicial do sublado na fase de fundo

CG - Cromatografia gasosa

CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência

CTAB - Brometo de cetrimônio

D - Razão de distribuição

D-TISB - D-tartarato de isobutila

DBT - Dibenzotiófeno

DPPH - 2,2 difenil-1-picrilhidrazil

DPR - Desvio padrão relativo

EAA - Espectrometria de absorção atômica

EAG - Equivalentes a ácido gálico

ELL - Extração líquido-líquido

EM - Espectrometria de massa

EOPO - Etileno óxido/propileno óxido

EPN - Extração por ponto de nuvem

vi

ESAB - Extração em sistema aquoso bifásico

ESL - Extração sólido-líquido

E% - Percentual de eficiência de separação

FCE - Flotação/Complexação/Extração

FSAB - Flotação em sistema aquoso bifásico

HDS - Hidrodessulfurização

HDT - hexadeciltrimetilamõnio

HTMAB - Brometo de hexadeciltrimetilamônio

k - Número de fatores

K - Coeficiente de partição

L-ADBT - Ácido dibezoil-L-tartárico

LSS - Lauril sulfato de sódio

N - Número de ensaios no planejamento Box-Behnken

P - Lipofilicidade relativa

PCP - Ftacianina de cobre

PEG - Polietileno glicol

SAB - Sistema aquoso bifásico

SS - Sublação por solvente

Xi - Fatores codificados do planejamento fracionário 26-1

Xi ‘- Fatores codificados do planejamento Box-Behnken

W - Concentração mássica

α - Coeficiente de concentração

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO

Introdução 19

Carlos Eduardo de Araújo Padilha Tese de Doutorado

1. Introdução

Os surgimentos recentes de novos fármacos e outros produtos de natureza

biotecnológica tornaram urgentes inovações nas técnicas downstream processing (VICENTE

Os surgimentos recentes de novos fármacos e outros produtos de natureza

biotecnológica tornaram urgentes inovações nas técnicas downstream processing (VICENTE

et al., 2014). Estas técnicas correspondem às operações unitárias usadas para separar materiais

insolúveis, recuperar e purificar produtos de uma conversão enzimática ou de um processo de

produção microbiológica. A extração líquido-líquido (ELL) é uma operação unitária própria

da Engenharia Química, embora tenha sido incluída há tempos em esquemas de recuperação e

purificação de biomoléculas. A separação por ELL convencional se baseia na diferença entre

os coeficientes de partição dos componentes de sistemas formados por água e solventes

orgânicos (WEI et al., 2002). Contudo, algumas restrições são conhecidas quanto ao uso de

solventes orgânicos bem como às condições operacionais ríspidas da ELL, os quais podem

causar a degradação dos produtos (DUTRA-MOLINO et al., 2014). SALCES et al. (2001)

afirmaram que extrações realizadas sob temperaturas superiores a 60 oC provocam a

degradação de componentes fenólicos, atribuídas à hidrólise, reações de redução e

polimerização do analito. Segundo PESSOA JR. & KILIKIAN (2005), componentes como

hexano, diclorometano e benzeno não são apropriados para purificar proteínas, devido ao

comprometimento da estrutura terciária e, consequentemente, à perda da atividade biológica.

Tratando-se especificamente destas biomoléculas, o alto conteúdo de água nas fases (entre 80-

90% m/m) é fundamental para sua estabilidade (ASENJO & ANDREWS, 2012; DUTRA-

MOLINO et al., 2014).

Neste sentido, a extração líquido-líquido em sistemas aquosos bifásicos (SABs) tem se

provado uma valiosa técnica para separar, concentrar e purificar materiais biológicos como

proteínas, enzimas, ácidos nucléicos, componentes fenólicos, células de plantas e animais

(WEI et al., 2002; RAJA et al., 2011; KARKAŞ & ÖNAL, 2012). Os SABs são empregados,

na maioria dos casos, na forma de uma mistura de polietilenoglicol (PEG) e sal (fosfato,

sulfato, citrato, etc.) devido a sua baixa tensão interfacial, rápida segregação das fases e baixo

custo (BABU et al., 2008; SHAHRIARI et al., 2010; KARKAŞ & ÖNAL, 2012; ALMEIDA

et al., 2014; FERREIRA et al., 2014). Apesar das vantagens supracitadas, a extração líquido-

líquido por SABs pode não ser a técnica mais indicada em estudos de detecção por

cromatografia, seja pelos níveis inadequados de enriquecimento, seja pela necessidade de

Introdução 20


múltiplos estágios. Além disto, observou-se que o desempenho de separação muitas vezes é

limitado pela natureza do PEG, já que o polímero pode sofrer apenas mudanças na massa

molecular e nos grupos álcool por substituição de ligantes (SILVA et al., 1999; BARBOSA et

al., 2010; ALMEIDA et al., 2014). Para superar estes obstáculos, trabalhos recentes têm

combinado a sublação com solvente e a extração em SABs resultando em uma técnica

chamada flotação em sistemas aquosos bifásicos (FSAB). A FSAB se baseia na transferência

de componentes de superfície-ativa de uma fase rica em sal para uma fase rica em solvente

orgânico hidrofílico promovida, principalmente, pela adsorção do soluto nas bolhas (BI et al.,

2009a). Por conta deste mecanismo, o processo alcança elevados índices de enriquecimento e

recuperação, ainda que uma baixa dosagem de solvente seja usada (BI et al., 2010a). Devido a

estes benefícios, vários sistemas FSAB foram empregados com sucesso na recuperação de

enzimas (SHOW et al., 2011; PAKHALE et al., 2013; SHOW et al., 2013; TAN et al., 2014;

LIN et al., 2015; MATHIAZAKAN et al., 2016), antibióticos (BI et al., 2009a; HAN et al.,

2014), componentes bioativos (CHANG et al., 2014), éster ftalatos (CHANG et al., 2015),

clorofilina sódica (XIA et al., 2016), etc.

Alternativamente, é possível acompanhar o aumento do número de pesquisas de

prospecção resíduos agroindustriais como fontes de conponentes bioativos (MARTINS et al.,

2011). Por beneficiar a saúde humana devido às suas propriedades anticarcinogênicas, há um

profundo interesse do mercado no sentido de obtenção de preparados de componentes

fenólicos com características específicas bem como em modos de melhorar suas análises

(KAMMERER et al., 2010). Ao mesmo tempo, a consolidação das metas de redução de

emissões de poluentes depende da inclusão de etapas de remoção de substâncias derivadas de

enxofre. Algumas dessas substâncias, como é o caso do dibenzotiófeno (DBT), são bastante

recalcitrantes durante os tratamentos convencionais de dessulfurização. Portanto, os

tratamentos biológicos surgem como rotas alternativas de conversão de componentes

derivados do DBT para metabólitos menos danosos e de maior valor agregado. Logo, em

ambos os casos vê-se que a valorização de correntes residuárias é um passo fundamental para

minimizar o impacto ambiental devido ao lançamento equivocado de descartes.

Assim, a presente tese aborda a aplicação da FSAB na recuperação e concentração de

biomoléculas. Os experimentos FSAB foram realizados no Laboratório de Engenharia

Bioquímica (LEB), onde foram desenvolvidos diversos trabalhos na área de downstream

processing, tais como captura de biomoléculas via cromatografia de adsorção (ARAÚJO et al.

2016a, 2016b, SOUSA JÚNIOR et al. 2015, 2016; PADILHA et al., 2015, 2016a, 2016b,

Introdução 21


2017e) e métodos de extração em sistemas aquosos bifásicos (PADILHA et al., 2017c,

2017d). O documento está dividido em quatro capítulos, apresentados da seguinte forma: o

capítulo 1 consiste da introdução do trabalho. No capítulo 2 é apresentado o estudo da

recuperação e concentração de ácido gálico obtido da infusão de folhas de goiaba através da

FSAB. Nesta seção, em particular, a descrição da técnica de flotação foi mais bem detalhada

em relação aos demais capítulos. O capítulo 3 trata do estudo de recuperação e concentração

de polifenóis do resíduo despolpado de Myrciaria dubia pelo processo de flotação,

juntamente com sua ampliação de escala. Já no capítulo 4, uma abordagem multivariada foi

usada para otimizar as condições operacionais da FSAB na recuperação do 2-hidróxibifenil a

partir de soluções modelo, seguidos de ensaios usando caldo de fermentação de Rhodococcus

rhodochrous. Finalmente, considerações finais e perspectivas futuras da técnica de separação

são retratadas no capítulo final.

CAPÍTULO 2


ÁCIDO GÁLICO DE FOLHAS DE GOIABA

POR FLOTAÇÃO EM SISTEMA DE DUAS

FASES AQUOSAS

Recuperação e concentração de ácido gálico de folhas de boiaba 23


2. Recuperação e concentração de ácido gálico de

folhas de goiaba por flotação em sistema de duas

fases aquosas

Neste capítulo são apresentados os resultados da aplicação da flotação em sistemas de

duas fases aquosas na recuperação e concentração de ácido gálico. Primeiramente, de maneira

a realizar a triagem das condições operacionais favoráveis à captura deste componente

fenólico, uma solução modelo de ácido gálico foi usada nos estudos iniciais. Definidas as

condições ótimas, a infusão de folhas de goiaba foi usada como fonte de ácido gálico e o

desempenho da flotação foi comparado àquele obtido da extração em sistemas bifásicos

aquosos. Esses resultados foram organizados na forma do artigo entitulado “Optimization of

Separation of Bioactive Compounds in Daily Foods by Aqueous Two-´Phase Flotation

Coupled With HPLC-DAD”, o qual foi publicado no periódico International .Journal of

Chromatography and Separation Techniques.

2.1. Revisão bibliográfica

2.1.1. Compostos fenólicos bioativos

É notório que os hábitos alimentares podem ser os mais diversos; logo, o que

poderíamos inferir se as dietas de cidadãos de países como o Brasil e a China, de culturas

totalmente distintas, fossem alvo de comparações? Obviamente, claras diferenças podem ser

observadas nos itens das refeições, contudo, ainda é possível perceber um ponto de

confluência entre elas. Independentemente da localidade, a ingestão de frutas e vegetais bem

como cacau, café, vinhos e chás tornou-se comum no dia a dia (OVASKAINEN et al., 2008).

Estudos epidemiológicos apontam que o consumo desses alimentos está associado à redução

da ocorrência de diferentes tipos de câncer e doenças cardiovasculares (KHAN et al., 2014).

Como resultado, há um grande interesse em avaliar o papel de componentes bioativos

advindos de alimentos na redução do risco de doenças crônicas e degenerativas. Esses

componentes bioativos representam um grupo de constuintes extra-nutricionais que ocorrem

apenas em pequenas quantidades em plantas e produtos alimentícios; muitos desses, gerados a

partir do metabolismo secundário como, por exemplo, antibióticos, micotoxinas, alcalóides e

componentes fenólicos (ETHERTON et al., 2002; MARTINS et al., 2011 ; HUERTA et al.,



2015). Assim como as outras substâncias, os componentes fenólicos ou polifenóis são

produzidos como mecanismo de defesa das plantas contra vários tipos de estresse bióticos e

abióticos (TSAO, 2010). Os compostos fenólicos são caracterizados pela presença de um ou

mais anéis aromáticos substituídos por grupos hidroxilas, que compreendem de simples

moléculas fenólicas a componentes altamente polimerizados (BRAVO, 1998;

BALASUNDRAM et al., 2006). Biogeneticamente, todos os componentes fenólicos são

gerados a partir de um intermediário comum, a fenilalanina, ou um precursor mais próximo,

como o ácido chiquímico. Esta conclusão também se estende para os flavonóides, classe mais

abundante dos componentes fenólicos, que são expressos pela combinação de rotas

metabólicas (PANDEY & RIZVI, 2009). Uma descrição simplificada da expressão dos

componentes fenólicos é mostrada na Figura 2.1.

Figura 2.1. Esquema simplificado das rotas metabólicas das plantas para produção de componentes fenólicos.

Fonte: Adaptação de EWANÉ et al. (2012).

A abundância de componentes fenólicos existentes está fortemente ligada à

diversidade de plantas e funções biológicas desempenhadas por estas substâncias em



organismos (TSAO, 2010). Quanto às fontes naturais, MITIĆ et al. (2011) evidenciaram que

frutas vermelhas podem ter diferentes componentes fenólicos predominantes. Os autores

observaram que a cereja ácida possuia até 83% de cianidina-3-glicosil-rutinosídeo, enquanto

que a groselha negra continha aproximadamente 45% de malvidina-3-glicosídeo. Por sua vez,

FATEMEH et al. (2012) mostraram diferenças nas concentrações de componentes fenólicos

entre as variedades de bananas Cavendish e Dream, o que refletiu em diferentes atividades

antioxidantes observadas. Alguns estudos também indicaram que as condições climáticas,

modos de cultivo e características do solo tem impacto sobre o conteúdo de componentes

fenólicos em plantas. Por exemplo, MORI et al. (2007) mostraram que a concentração de

antocianinas em uvas pode reduzir pela metade caso o dia de colheita seja quente.

BORGUINI et al. (2013) observaram que tomates orgânicos apresentaram maior capacidade

antioxidante em testes do sequestro do radical 2,2 difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) em relação

à tomates cultivadas de modo convencional. No que diz respeito às funções, as lignanas

podem atuar como fitoestrogênio, uma vez que possuem uma estrutura semelhante ao 17β-

estradiol, um importante hormônio sexual feminino (SUNITA & PATTANAYAK, 2011). Por

outro lado, uma planta com alta percentagem de lignina (um polímero altamente ramificado

de grupos fenilpropanóides, assim como as lignanas) possui maior resistência a ataques de

herbívoros e insetos, bem como consegue combater possíveis infecções e ferimentos

(BHUIYAN et al., 2009).

Contudo, um grande destaque dos componentes fenólicos é sua variedade de estruturas

químicas. Na Tabela 2.1 são apresentadas as principais classes de componentes fenólicos que,

muitas vezes, ocorrem na natureza associados a monossacarídeos ou polissacarídeos (SALAS

et al., 2010). Até mesmo a posição das ligações é fator interessante, uma vez que o tipo de

ligação entre os açúcares e os flavonóides (que juntos formam as antocianinas) é determinante

para o sabor e coloração de produtos alimentícios (SALAS et al., 2010; WU et al., 2014).

Ademais, também foram reportadas ligações de componentes fenólicos com ésteres e

proteínas (PANDEY & RIZVI, 2009).



Tabela 2.1 Classes de componentes fenólicos em plantas

Classe Fórmula química

Fenólicos simples e benzoquinonas C6

Ácidos hidroxibenzóicos C6-C1

Acetofenonas e ácidos fenilacéticos C6-C2

Ácidos hidroxicinâmicos e fenilpropanóides C6-C3

Naftoquinonas C6-C4

Xantonas C6-C1-C6

Estilbenos e antraquinonas C6-C2-C6

Flavonóides e isoflavonóides C6-C3-C6

Lignanas e neolignanas (C6-C3)2

Biflavonóides (C6-C3-C6)2

Ligninas (C6-C3)n

Taninos condensados (C6-C3-C6)n Fonte: Próprio autor.

2.1.2. Ácido gálico

O ácido gálico (AG), também chamado de ácido 3,4,5 trihidroxibenzóico, é um ácido

orgânico de composição C6H2(OH3)COOH, cuja fórmula química é dada pela Figura 2.2.

Encontrado de forma livre em folhas de chá, uvas e castanhas, sua obtenção também pode ser

via hidrólise ácida de taninos (GRUNDHÖFER et al., 2001). A alteração da estrutura do AG

e suas implicações nas atividades biológicas e farmacológicas também são bastante

investigadas (ASNAASHARI et al., 2014). Os derivados de alquila, ou galatos, são

sintetizados a partir da adição de carbonos na cadeia lateral do precursor, conferindo à

estrutura química uma menor solubilidade em meio aquoso (GOMES, 2015). A lipofilicidade

relativa é geralmente expressa em termos de um coeficiente P, conforme a Figura 2.2.

Por conta de suas propriedades físico-químicas, várias são as aplicações do AG e seus

derivados. Por exemplo, o AG é frequentemente usado em pesquisas como padrão para

quantificação de componentes fenólicos totais através do método de Folin-Ciocalteau, o qual

expressa seus resultados em equivalentes de ácido gálico ou EAG. Outra aplicação desse

ácido fenólico é no desenvolvimento de cores. Em 1910, Ehrmann citou que o AG forma um

complexo de coloração avermelhada quando em contato com 3-hidroxifenilamina, tornando-

se uma opção para a indústria de tinturas (ROSSO, 2005). Ademais, AOUF et al. (2013) e

HOU et al. (2016) mostraram que o AG pode ser multifuncionalizado para sintetizar

bioresinas epóxi de alto desempenho.



O AG e seus derivados também tem sido reportados como potentes agentes

antitumorais. Na literatura constam diversas pesquisas in vitro e in vivo que exploram os

efeitos do AG e seus derivados contra diferentes tipos de câncer em células do pulmão

(OHNO et al., 1999; OHNO et al., 2001), cólon (YOSHIOKA et al., 2000; HAMID et al.,

2011; YUMNAM et al., 2014), hepáticas (LI et al., 2014), próstata (CHEN et al., 2009;

RUSSELL et al., 2012; LIU et al., 2013), entre outros (LO et al., 2011; ZHEN et al., 2012).

SUBRAMANIAN et al. (2015) sugere que a atividade anticâncer da AG está associada a

diferentes mecanismos de apoptose como geração de espécies reativas de oxigênio, regulação

de proteínas promotoras de apoptose e não-apoptose, atuação sobre os oncogenes e inibição

de matrizes de metaloproteinases.

Figura 2.2. Estrutura química do AG e valores de lipofilicidade do AG e seus galatos de alquila.

Abreviação Galatos -R C log P

AG Ácido gálico -H 0,89

G1 Metil -CH3 0,92

G2 Etil -(CH2)-CH3 1,27

G3 Propil -(CH2)2-CH3 1,73

G4 Butil -(CH2)3-CH3 2,13

G5 Pentil -(CH2)4-CH3 2,53

G6 Hexil -(CH2)5-CH3 2,92

G7 Heptil -(CH2)6-CH3 3,32

G8 Octil -(CH2)7-CH3 3,72 Fonte: Próprio autor.

Desde a década de 70, as técnicas de recuperação e isolamento se aperfeiçoaram a

ponto do AG ser obtido a partir de plantas e microrganismos, bem como facilitaram a triagem

dos materiais com maior conteúdo do ácido fenólico (CACACE & MAZZA, 2003; ROSSO,

2005). Dentre elas, os métodos extrativos tem sido amplamente empregados nos protocolos de

purificação do AG, bem como de outros componentes fenólicos (SALAS et al., 2010).



2.1.3. Extração líquido-líquido (ELL)

A extração é geralmente usada como primeira etapa na análise do conteúdo de

polifenóis, a qual realiza a recuperação dos componentes para uma fase fluida a partir de

materiais vegetais. Portanto, o método torna-se essencial para a quantificação adequada e

determinação da atividade antioxidante relativa àquela fonte (BOEING et al., 2014). A

extração é dependente da estrutura química dos componentes fenólicos, método de extração,

tempo de contato, granulometria da amostra sólida e substâncias interferentes (AZEVÊDO,

2010; FAUSTINO et al., 2010; BOEING et al., 2014). Logo, não existe um procedimento

padrão que se aplique adequadamente para a extração de todos os componentes fenólicos.

Além desses efeitos citados, a polaridade dos solventes pode ditar a natureza e a quantidade

de componentes fenólicos que são transferidos para o extrato (SALAS et al., 2010;

KADJŽANOSKA et al., 2011; DENT et al., 2013; DO et al., 2014). SCHERER & GODOY

(2014) observaram que a composição da mistura de solventes é crucial na extração de

componentes fenólicos bem como na atividade antioxidante do extrato de Xanthium

strumarium L. Para a extração de componentes fenólicos do chá verde, a solução aquosa de

etanol foi mais eficiente do que as soluções aquosas de metanol e acetona, como foi reportado

por WANG & HELLIWLL (2001). Tradicionalmente, nos procedimentos de extração de

antocianinas, o solvente é formado pela mistura aquosa de etanol ou metanol e o processo é

realizado em ambiente levemente ácido sob temperatura ambiente (SALAS et al., 2010).

Temperaturas elevadas aumentam a difusão do soluto através da matriz sólida; entretanto,

alguns componentes fenólicos são sensíveis à degradação por aquecimento (SANTANA et al.,

2009).

A extração por solvente pode ser classificada de acordo com o tipo de amostra a ser

manipulada. Quando a matriz que contém o soluto é sólida, a técnica extrativa é chamada de

extração sólido-líquido (ESL) ou lixiviação; enquanto que o método usado para tratar

amostras líquidas é definido como extração líquido-líquido (ELL) (LLANO et al., 2015). A

ELL é uma técnica de separação que consiste na partição de um soluto entre duas fases

líquidas com base na afinidade. A separação é promovida pela adição de um terceiro

componente ao sistema, sendo requisitada quando a destilação não é adequada,

principalmente, por conta da termossensibilidade do soluto. A partição é expressa em termos

do coeficiente de partição (K), definida pela razão entre as concentrações de soluto na fase



orgânica (Co) e aquosa (Ca) no equilíbrio (PADILHA et al., 2017c), como mostrado na Eq.

2.1.

o

a

CK

C (2.1)

Como citado acima, a escolha do extratante pode determinar a seletividade do soluto;

todavia, deve-se atentar também à miscibilidade mútua entre o solvente e o dispersante da

alimentação. Em situações em que há miscibilidade razoável entre essas substâncias, o

processo sofrerá com a perda de extratante e terá possíveis dificuldades de recuperação do

soluto (GITIRANA, 2007).

Alguns procedimentos tradicionais de ELL na recuperação de fenólicos tem sido

reportados na literatura, principalmente, para preparação de amostras de águas. ANDRÉS et

al. (2000) usaram diclorometano como solvente na preconcentração de fenólicos poluentes

(clorofenóis, nitrofenóis, metilfenóis, etc.) em águas para detecção em CLAE. ALMEDA et

al. (2007) mostraram que o éter diexil é mais adequado para extração de clorofenóis a partir

de águas fluviais do que outros solventes polares como octanol, triclorometano e éter 2-

nitrofenil octílico. Por sua vez, DANESHFAR & KHEZELI (2009) propuseram um método

de separação baseado na emulsão de óleo-em-água, o qual é formado pela mistura de

tetracloreto de carbono e acetato de butila, para detecção de fenólicos por cromatografia

gasosa. Apesar desses trabalhos, a ELL apresenta algumas limitações significativas e

desvantagens ligadas ao custo excessivo, toxicidade e inflamabilidade dos solventes orgânicos

(SANTANA et al., 2009; EL-ABASSI et al., 2014). Além disso, muitos desses métodos não

se aplicam a alguns tipos de amostras como, por exemplo, a água residual da extração azeite

de oliva, devido a razões práticas e econômicas (EL-ABASSI et al., 2014). Desta forma,

inspiradas no conceito de química verde, alternativas à ELL tradicional foram desenvolvidas

de modo a eliminar os solventes orgânicos (XAVIER et al., 2015).

2.1.4. Extração em sistemas aquosos bifásicos (ESAB)

A extração em sistemas aquosos bifásicos (ESAB) é uma modalidade da ELL, na qual

a mistura de soluções de componentes hidrofílicos permite a separação de biomoléculas em

um ambiente ameno, sem danos acentuados à estrutura dos produtos (ASENJO &

ANDREWS, 2011; PADILHA et al., 2017d; ZENG et al., 2016). Por conta da variedade de

analitos, o número de trabalhos com ESAB ainda é crescente, embora suas origens sejam

datadas do final do século XIX. Em 1896, Beijerinck observou que, quando misturadas,



soluções aquosas de gelatina e ágar ou gelatina e amido solúvel poderiam formar duas

camadas de líquido (Beijerinck, 1896). Inspirado em tal fenômeno, CRAIG & CRAIG (1956)

aplicaram um sistema bifásico aquoso/orgânico para a purificação de proteínas usando

distribuição contracorrente. Entretanto, o pionerismo é muitas vezes atribuído a Albertsson,

que a partir de 1955 começou a usar sistemas aquosos bifásicos (SAB’s), formados por

soluções aquosas de polietilenoglicol/dextrana e polietilenoglicol/sal, para separação de

macromoléculas e partículas biológicas (ALBERTSSON, 1958). Igualmente, SACKS &

ALDERTON (1961) aplicaram um SAB constituído por polietilenoglicol 400 e fosfato de

potássio na partição de esporos de Bacillus e Clostridium. Além disso, tal método possibilitou

que os autores detectassem dois tipos de esporos no cultivo do Bacillus megaterium. Apesar

dos anos decorridos, os sistemas usados nesses trabalhos, polímero/polímero e polímero/sal,

continuam a ser empregados em protocolos de purificação (PÉREZ et al., 2015;

MOHAMMADI et al., 2015; PADILHA et al., 2017c; PADILHA et al., 2017d), inclusive

voltados para a recuperação de componentes fenólicos. Componentes fenólicos de madeira de

Eucalyptus globulus foram isolados pela ESAB de polietilenoglicol/fosfato e

polietilenoglicol/citrato em XAVIER et al. (2015) e XAVIER et al. (2016), respectivamente.

A partir da técnica foi possível detectar a presença de vários componentes fenólicos por

CLAE-FR-ESI-TOF como, por exemplo, ácido gálico, ácido elágico, monogaloil glicosídeo e

quercitina 3-o-ramnosídeo. REIS et al. (2015) alcançaram valores de K na ordem de 9,5 de

ácido gálico obtido de resíduos de Psidium guajava L em sistemas polietilenoglicol

8000/fosfato de potássio.

O polietilenoglicol (PEG) é um poliéter diol, de composição

HO(CH2CH2O)nCH2CH2OH, que é disponível no mercado em uma ampla variedade de

massas moleculares médias (ALMEIDA et al., 2014). Os PEGs com massa molecular

superior a 1000 Da se apresentam na forma de pós ou flocos, enquanto aqueles de massa

molecular inferior a este patamar são fornecidos na forma líquida (PESSOA JR, 2001). O

PEG é muito presente em trabalhos envolvendo ESAB como um dos componentes

formadores de fases, devido à sua eficiência na exclusão de outros polímeros e sais.

Geralmente, a exclusão estérica observada nas SABs é dependente da massa molecular do

PEG, uma vez que a concentração necessária para separação das fases diminui à medida que a

cadeia carbônica do polímero aumenta (JOHANSSON et al., 2011; WYSOCZANSKA &

MACEDO, 2016). Quando ele é acrescido em soluções salinas, os SABs formados oferecem

vantagens como baixa tensão interfacial, boa biocompatibilidade, baixa toxicidade, rápida



separação e baixo custo (BABU et al., 2008; SHAHRIARI et al., 2010; PEREIRA et al.,

2010; KARKAŞ & ÖNAL, 2012; ALMEIDA et al., 2014; FERREIRA et al., 2014). Contudo,

segundo KULA (1990), a presença dos sistemas PEG/sal em aplicações de escala industrial

foi assegurada somente após o surgimento de separadores comerciais adaptáveis, os quais

possibilitaram o particionamento mais acelerado de proteínas. Ademais, ainda em relação ao

PEG, a presença de grupos hidroxilas terminais confere certa versatilidade ao polímero, uma

vez que tal substância pode ser derivatizada. Uma variedade de grupos pode ser incorporada à

estrutura do PEG através de reações de alquilação tais como ácidos carboxílicos, anidridos e

líquidos iônicos (ROSA et al., 2007; WU et al., 2008a). Esse método mostrou sensível

aumento de afinidade do polímero para proteínas com cauda de histidina, conforme mostrado

em PLUNKETT & ARNOLD (1990), XU et al. (2003) e BARBOSA et al. (2010).

Obviamente, outros sistemas têm sido elaborados de modo a superar alguns

inconvenientes das combinações entre polímero/polímero e polímero/sal como a dificuldade

no reciclo de reagentes, corrosão em equipamentos e baixa seletividade (CARDOSO et al.,

2013; GOJA et al., 2013; AMID et al., 2015). Sistemas alternativos podem ser criados pelos

pares de álcool/sal (REIS et al., 2014; REIS et al., 2015), líquidos iônicos/sal (LI et al., 2016;

WU et al., 2016), líquidos iônicos/polímero (FREIRE et al., 2012; PEREIRA et al., 2013;

SONG et al., 2015), líquidos iônicos/carboidratos (WU et al., 2008b; FREIRE et al., 2011) e

acetonitrila/carboidratos (CARDOSO et al., 2013; AMID et al., 2015), os quais também

foram aplicados para recuperação de componentes fenólicos. A apigenina e a genisteína, dois

principais flavonóides presentes nas raízes de Cajanus cajan, foram extraídos e concentrados

por sistemas formados por etanol/fosfato de potássio em ZHANG et al. (2013). Em

CARDOSO et al. (2013), a partição de vanilina foi investigada em SAB’s criados por

misturas aquosas de acetonitrila e polióis. WU et al. (2014) propuseram SAB’s formados por

etanol/sulfato de amônio e etanol/fosfato de sódio para extração de antocianinas e remoção

simultânea de açúcares a partir do suco integral de uva.

2.1.4.1. Diagrama de fases

A formação do sistema bifásico ocorre após a sedimentação de grandes agregados

formados pelos dois componentes majoritários, como mostrado na Figura 2.3. Nessa

representação genérica, soluções estoques de um polímero e sal foram misturadas em uma

dada proporção para que houvesse a formação de duas fases aquosas e, consequentemente,

particionamento do soluto entre as fases.



A formação do sistema aquoso bifásico e, na maioria das vezes, o desempenho da

extração estão intimamente vinculados à composição do sistema. Logo, informações sobre o

equilíbrio de fases pode ser de grande valia para aplicações em potencial (MURARI et al.,

2015). A construção do diagrama pode ser realizada por alguns procedimentos, mas o método

de titulação turbidométrica é o mais comum deles. Nessa titulação, duas soluções estoques são

misturadas em várias proporções e gradualmente tituladas até o desaparecimento da interface.

Assim, a composição do sistema imediatamente anterior à formação da fase única é

considerada como um dos pontos da curva binodal (ATEFI et al., 2016). Logo, novas

proporções são sucessivamente testadas para que a curva obtenha sua extensão plena,

delimitada pelas condições de precipitação de um dos constituintes em meio aquoso

(RAYNER, 1969).

Figura 2.3. Ilustração esquemática da separação de fases em SABs do tipo polímero/sal.

Fonte: Próprio autor.

Na Figura 2.4 é apresentado um diagrama de fases de SAB, que mostra as regiões

monofásica e bifásica em função da concentração de PEG e sal, expressa em% m/m.

Geralmente, as curvas binodais em estudos com SAB são representados em triângulos

retângulos, onde as concentrações dos constituintes são definido nos eixos x e y, enquanto a

intersecção dos eixos é considerada como água pura (MC CABE et al., 2005). No gráfico da

Figura 2.4, é observado que uma mistura de composição A deixada em equilíbrio resultou em

um SAB, cujas fases topo (rica em PEG) e fundo (rica em sal) são representadas pelos pontos

T1 e F1. O segmento T1-A-F1 é chamado de linha de amarração (tie-line), a qual delimita a

composição final de quaisquer sistemas em equilíbrio dentro desta região. O ponto B,



pertencente à outra linha de amarração, é gerado a partir do ponto A através da adição de

água. Por consequência, a composição final do sistema diferirá do preparado anterior (agora

caracterizadas pelos pontos T2 e F2) bem como o comprimento da linha de amarração será

reduzido. A contínua adição de água deslocou o sistema para o ponto C, também conhecido

como ponto crítico. Nessa condição, a composição e o volume das fases do sistema são

praticamente iguais, assim como o particionamento do soluto (SCHINDLER &

NOTHWANG, 2006; ASENJO & ANDREWS, 2011; RAJA et al., 2011). Assim, as

condições de operação da ESAB devem estar acima do ponto crítico, além de levar em

consideração o comportamento de migração do soluto e a razão volumétrica obtida (KAUL,

2000).

Figura 2.4. Diagrama de fases genérico de um sistema formado pela mistura de PEG e sal.


2.1.4.2. Particionamento em ESAB

Os conceitos abordados no tópico 2.1.3 acerca da migração do soluto entre as fases,

assim como a expressão de partição do soluto, mostrada na Eq. 2.1, também são válidos aqui,

embora os mecanismos responsáveis pela partição na ESAB sejam mais complexos (KAUL,



2001). As relações entre as biomoléculas e as fases do sistema podem ser de diferentes

naturezas, como exemplo, forças de Van der Waals, pontes de hidrogênio, interação

hidrofóbica e forças eletrostáticas, o que dificulta a sua predição por modelos termodinâmicos

(ZHI et al., 2004; ASENJO & ANDREWS, 2011, PORFIRI et al., 2011; GRILO et al., 2016;

PADILHA et al., 2017c; PADILHA et al., 2017d). Para sistemas envolvendo proteínas,

ALBERTSSON (1986) propôs uma modificação sobre a expressão de coeficiente de partição,

tratando-a como o produto de contribuições ligadas às propriedades do soluto, conforme Eq.

2.2.

0el hfob biosp tam confK K K K K K K (2.2)

Enquanto que o termo K0 é adotado como referência, dependendo da solvatação

relativa do soluto e das condições do ambiente SAB, os demais termos são basicamente

associados à estrutura do produto (ALBERTSSON, 1986; ASENJO & ANDREWS, 2011;

GRILO et al., 2016). As abreviações el, hfob, biosp, tam, conf são referentes às propriedades

eletroquímicas, hidrofobicidade, bioespecificidade, tamanho e conformação da molécula-alvo.

Como tais fatores são praticamente inflexíveis quando um dado produto é selecionado, os

estudos tem como enfoque avaliar os efeitos das variáveis manipuláveis sobre o desempenho

de extração e razão volumétrica. Temperatura, pH, o tipo e a concentração dos constituintes

são alguns das variáveis frequentemente manipuladas em pesquisas com ESAB. A seguir, os

efeitos de cada um dos fatores sobre esse processo de extração são detalhados.

É amplamente difundido que o aquecimento proporciona maiores taxas de difusão e,

em alguns casos, o aumento da solubilidade de substâncias (JOKIĆ et al., 2010;

RADOJKOVIĆ et al., 2012). Contudo, mais especificamente nos SAB’s, é observado que a

temperatura tem um papel particular na construção dos diagramas de fases. Segundo

BARBOSA et al. (2016), a aplicação de temperaturas de equilíbrio elevadas em sistemas

polímero/sal é acompanhada da redução da inclinação das linhas de amarração bem como do

aumento de seu comprimento; resultado do deslocamento da água presente na fase topo para a

fase fundo. Logo, o comportamento de partição com a temperatura deve ser atribuído às

variações da composição do sistema (NAGARAJA & IYYASWAMI, 2015; XAVIER et al.,

2016;). TAN et al. (2011) observaram que a recuperação de antraquinonas de folhas de

Curacao aloe em PEG 6000/sulfato foi intensificada quando o SAB foi deixado em equilíbrio

a 40 oC, alcançando partição e rendimento máximos nos valores de 9,0 e 90,5%,



respectivamente. Em XAVIER et al. (2016), que investigaram o particionamento de fenólicos

totais do tronco de Eucalyptus globulus por sistema PEG/fosfato, o aumento da temperatura

de 25 oC para 65

oC reduziu sensivelmente os valores de K de 52,5 para 21,7. Por outro lado,

em sistemas formados por etanol/sal, o efeito da temperatura é pouco significativo sobre as

curvas binodais e linhas de amarração (LI et al., 2017). De acordo com os últimos trabalhos

da literatura, tal comportamento reflete diretamente sobre a migração do soluto, uma vez que

WU et al. (2014) não observaram variações expressivas na partição de antocianinas de suco

de uva, mesmo quando o sistema etanol/fosfato foi submetido a temperaturas na faixa de 15-

55 oC. Similarmente, a variação de temperatura de 10

oC a 30

oC no sistema etanol/fosfato não

afetou a partição de componentes fenólicos de Ficus carica L, permanecendo no patamar de

4,0, conforme foi apresentado em FENG et al. (2015).

A temperatura também exerce outro papel fundamental em uma das modalidades da

ESAB, denominada extração em sistema aquoso bifásico micelar ou extração por ponto de

nuvem (EPN). Quando soluções aquosas de surfactantes não-iônicos são submetidas a

aquecimento podem gerar espontaneamente duas camadas: a fase coacervato, rica em micelas;

e a fase diluída, pobre em micelas (MUKHERJEE et al., 2011). A primeira temperatura que

provoca a turbidez do sistema, um indicativo de formação de duas fases, é considerada

temperatura de ponto nuvem. Nessa técnica, a temperatura de equilíbrio é obviamente

superior a temperatura de ponto nuvem e seu efeito é convencionalmente investigado. WANG

et al. (2006) propuseram a extração de estrogênio usando Triton X-114 e o rendimento da

EPN mostrou-se diretamente proporcional à temperatura de equilíbrio. EL-ABASSI et al.

(2014) verificaram que a partição dos componentes fenólicos da água residual da produção de

azeite de oliva em EPN é intimamente ligada à temperatura. Neste trabalho, reportou-se que a

temperatura de 90 oC superou as demais temperaturas testadas (70 e 80

oC) em termos do

desempenho, permitindo que a recuperação por EPN se aproxime de 100%.

O valor de pH do sistema é um fator crítico para a partição em ESAB. A carga líquida

do soluto e a razão de moléculas eletricamente carregadas no sistema são afetadas por esse

fator, o que determina a transferência de analitos entre fases de caráteres distintos (MA et al.,

2012; RAJA et al., 2011). Na Figura 2.1 se observa que os componentes fenólicos biativos

dispõem, muitas vezes, de grupos carboxila e hidroxila em sua estrutura, os quais são

facilmente ionizáveis em ambientes alcalinos (REIS et al., 2015). Em tal estado, os

componentes fenólicos tendem a migrar para regiões mais hidrofílicas, o que provoca declínio

nos valores de partição. ŠALIĆ et al. (2011) avaliaram o efeito do pH dentro de uma análise



multivariada envolvendo a recuperação de polifenóis em sistema PEG 6000/sulfato. Como

esperado, os resultados do trabalho indicaram que o pH do sistema teve impacto negativo no

desempenho do processo. No mesmo sentido, ZHANG et al. (2015) observaram que o

acréscimo nos valores de pH, de 4,0 para 6,0, provocou a redução de 40% no valor de K

durante a purificação parcial do ácido oleanólico obtido de cascas de uva através do sistema

etanol/sulfato.

Como mencionado previamente, as concentrações dos constituintes determinam a

obtenção da região bifásica bem como afetam diretamente o comprimento da linha de

amarração. Embora ambas as fases das SAB’s sejam hidrofílicas, o aumento no comprimento

das linhas de amarração leva à redução do conteúdo de água disponível e intensificação das

interações hidrofóbicas, as quais são expressas pelos efeitos de exclusão de volume e salting-

out (SILVA & FRANCO, 2000; PADILHA et al., 2017d). Na recuperação de componentes

bioativos usando o sistema polímero/sal proposta por MARTÍNEZ et al. (2014), observou-se

que o incremento de PEG elevou a partição de iohexol, salicina, ácido clorogênico,

epicatequina e ácido gálico. HUA et al. (2013) observaram que o acréscimo no conteúdo de

sulfato de amônio no sistema aumentou sensivelmente a seletividade da fase topo por

polifenóis do resíduo de Vaccinium uliginosum Linn. Neste estudo, o incremento do sal de

16% para 20% (m/m) no sistema etanol/sulfato aumentou o valor de K em mais de 500%.

Alternativamente, a escolha do constituinte também pode ser decisiva para o sucesso da

técnica. Por exemplo, em LI et al. (2017), sulfato de amônio e sulfato de sódio foram usados

na extração de alicina e ambos alcançaram rendimento semelhante, na ordem de 80%; ao

mesmo tempo que o uso do fosfato de potássio dibásico rendeu pouco mais de 8% desta

resposta. Variações nos resultados por conta da mudança no tipo do sal também estão ligadas

ao efeito do salting-out, o qual pode ser explicado a partir das séries de Hofmeister. Essas

séries estratificam os íons catiônicos e aniônicos de acordo com a sua capacidade de

“ordenação da água”. Efetivamente, os íons caotrópicos reduzem a solubilidade de moléculas

não-polares devido à intensificação das interações hidrofóbicas, enquanto que a adição de íons

cosmotrópicos leva à situação oposta (HOFMEISTER, 1888; ZHANG & CREMER, 2006;

XAVIER et al., 2016). Em SAB’s envolvendo polímeros, é comum a variação da massa

molecular desse componente na busca por melhores desempenhos de extração. Da mesma

forma que em sua concentração, o uso de um polímero com massa molecular elevada provoca

a redução do volume livre devido a um maior comprimento da cadeia, resultando em menores

valores de partição. Por outro lado, sistemas formados por polímeros de massas moleculares



menores possuem baixa tensão superficial, o que facilita a migração do soluto entre as fases e,

por consequência, possibilita maiores valores de K (BABU et al., 2008; RAJA et al., 2011;

GOJA et al., 2013; CHETHANA et al., 2015).

2.1.5. Sublação por solvente (SS)

Apesar do detalhamento das bases da ELL e da ESAB nos tópicos anteriores, é

importante ressaltar a existência de outras formas de separação de produtos em meios

aquosos. Em algumas delas é explorada a diferença de natureza da surperfície ativa dos

componentes dispersos bem como sua capacidade de adsorver na interface gás/líquido

(VALSARAJ & THIBODEAUX, 1991; LU & ZHU, 2001). Na Figura 2.5 é apresentada uma

classificação básica de todas as técnicas envolvidas, as quais são agrupadas como métodos de

separação por bolhas, termo primeiramente introduzido por Lemlich (LEMLICH, 1968). A

principal divisão dos grupos é estabelecida quanto à presença de espuma durante a execução

do método; a maior e mais difundida categoria, a separação por espuma, é representada pela

flotação e fracionamento por espuma. Em ambas é observada a formação de uma coluna de

espuma na superfície do líquido devido à passagem do gás, todavia o tipo de material

recuperado após o colapso da espuma é distinto. Enquanto que a alimentação no

fracionamento por espuma é formada por misturas homogêneas, a flotação é responsável por

separar ou concentrar partículas em suspensão (PERNA, 2010). Por sua vez, a segunda

categoria compreende a sublação por solvente e o fracionamento por bolhas. Assim como as

demais, o soluto (ou sublado) é capturado pela interface gás/líquido e ascende até a superfície

do líquido, região onde ocorre o rompimento da bolha e liberação de seu conteúdo. Logo, a

diferença entre as técnicas sem formação de espuma é encontrada pela presença de uma

camada imiscível sobre o topo da coluna do líquido no processo de sublação. Essa

peculiaridade pode ser considerada como uma combinação do próprio fracionamento por

bolhas com a ELL, o que confere características singulares à técnica (SMITH et al., 1996).



Figura 2.5 Esquema da classificação dos métodos de separação envolvendo adsorção na interface gás/líquido.


Desenvolvido por SEBBA (1962), a sublação por solvente (SS) apresenta algumas

vantagens práticas e teóricas sobre a ELL e as demais técnicas de separação por bolhas. Na

ELL, a quantidade de soluto transferida é limitada pela constante de equilíbrio; já na SS, o

interior da fase líquida não atinge, em tese, o estado de equilíbrio, uma vez que a transferência

de massa é fortemente ligada à adsorção nas bolhas, possibilitando rendimentos próximos a

100% (BI et al., 2010a). Outro destaque da SS sobre a ELL está ligado ao tratamento de

grandes volumes de amostra usando pequenas quantidades de solvente orgânico, o que

assegura elevados índices de concentração do produto na camada de topo (BI et al., 2010a;

SHOHAIB et al., 2014). Soma-se aos benefícios da técnica, o fato de que espécies ionizáveis

com baixa superfície ativa para serem separados por fracionamento por espuma podem ser

tratadas na sublação por solvente (GRIEVES et al., 1974).

2.1.5.1. Mecanismos de transferência de massa

Na sublação por solvente, a migração de soluto entre a fase aquosa e fase orgânica

pode ocorrer de diferentes formas. A primeira teoria acerca dos mecanismos de separação foi

descrita por SEBBA (1962), na qual foi considerado que a captura do sublado ocorre

unicamente por adsorção nas bolhas de gás. Em contrapartida, SPARGO & PINFOLD (1970),

SHEIHAM & PINFOLD (1972) e KARGER et al. (1970) observaram que a transferência de

massa envolvida na SS é bem mais complexa. Além da adsorção na interface gás/líquido, o

transporte difusivo e a drenagem de água também foram sugeridos para explicar o

comportamento da remoção de poluentes pela SS. Desde então, a literatura tem sido

enriquecida com dados experimentais e modelos matemáticos de modo a auxiliar na

compreensão do processo de separação. A concepção recente dos mecanismos de



transferência de massa que atuam na SS é ilustrada na Figura 2.6 e abaixo são descritos mais

aspectos de cada um deles.

2.1.5.1.1. Transporte por adsorção em bolhas

O transporte por bolhas de ar é o principal mecanismo de captura do sublado na SS.

As bolhas ascendentes que percorrem a coluna arrastam ambas as substâncias voláteis e não-

voláteis em seus interiores e em suas superfícies. No tratamento de componentes hidrofóbicos

que apresentam baixa volatilidade (por exemplo, hidrocarbonetos poliaromáticos, pesticidas,

corantes, componentes fenólicos bioativos, etc.), a quantidade de soluto retida na superfície

das bolhas é majoritariamente superior àquela dispersa na fase gasosa. Já no caso de

componentes com elevada pressão de vapor, a lei de Henry deve ser considerada para uma

descrição adequada do processo devido aos efeitos da adsorção e do dessorção (SMITH et al.,

1996; BI et al., 2010a). Outras decisões ligadas à composição do sistema, condições

operacionais e projeto do flotador podem influenciar na efetividade desse mecanismo; e o

primeiro fator a ser comentado é o tamanho das bolhas.

As bolhas são geradas a partir da passagem forçada de uma corrente de gás (nitrogênio

ou ar comprimido) por um distribuidor com interstícios diminutos, por volta de 300 μm

(COWARD et al., 2015). Esses distribuidores podem ser confeccionados de cerâmica, aço

inoxidável, vidro sinterizado, borracha e tecido, sendo capazes de gerar tamanhos de bolhas

na faixa de 0,01-0,2 cm (LEMLICH, 1968; AHMAD, 1975; SMITH et al., 1996). Segundo

MUBADDEL (2010), bolhas de menor tamanho oferecem maior área interfacial e maior

tempo de contato com a fase aquosa, o que proporciona teoricamente melhores resultados de

eficiência. Simulações matemáticas desenvolvidas por SMITH et al. (1996), LU & ZHU

(2001), MUBADDEL (2010) ratificaram a importância do tamanho das bolhas na SS. Em

situações práticas, SHOW et al. (2013) mostraram que o desempenho da SS na recuperação

da lipase de Burkholderia cenopacia ST8 é levemente dependente do tamanho das bolhas.

Três distribuidores de vidro sinterizado foram testados nesse trabalho e foi verificado que as

placas G4 e G5 ofereceram os índices de rendimento e fator de purificação da enzima pouco

superiores aos experimentos com a placa G3 (aspersor com maior tamanho de poros).

A vazão de gás é uma importante variável da SS, uma vez que ela afeta a área da

interface gás-líquido por unidade de volume da fase aquosa por minuto (NAIMI-JAMAL et

al., 2009; SHOW et al., 2013). Dessa forma, espera-se que o aumento da vazão de gás seja



acompanhado da melhoria na eficiência do processo, mas relatos da literatura indicam que

esse fato não ocorre necessariamente. Independentemente do projeto da coluna de sublação, a

tendência geral é que o aumento da vazão de gás também acarreta aumento no tamanho de

bolhas e elevação da dispersão axial na fase aquosa (VALSARAJ et al., 1991; MUBADDEL,

2010; TIRUNEHE & NORDDAHL, 2016). Além disso, em experimentos com vazão de gás

muito elevada e aspersores inadequados, a integridade da fase orgânica é comprometida

devido ao regime heterogêneo da coluna, o que resulta no declínio da eficiência (BRYSON &

VALSARAJ, 2001; MUBADDEL, 2010; LOBACHEVA & BERLINSKII, 2016).

No que diz respeito à composição; a adição de surfactantes ao sistema, prática comum

no fracionamento por espuma, deve ser feita na SS apenas nos casos em que o sublado

apresenta baixa hidrofobicidade. Nesse caso, o surfactante se agrupa em camadas sobre a

superfície das bolhas e interage com o produto através da formação de complexos, atração

eletrostática ou ambas (SCHNEPF & GADEN, 1959; LEMLICH, 1968). Assim, o produto

que exibe baixa superfície ativa é chamado de coligante, enquanto que o surfactante

adicionado para elevar a eficiência do processo é chamado de coletor (Lemlich, 1968).

Obviamente, tais interações coligante/coletor e seus impactos na SS já foram alvo de

investigações na literatura. VALSARAJ & THIDODEAUX (1991) propuseram a remoção do

corante ftalocianina de cobre (PCP) através da complexação por brometo de

hexadeciltrimetilamônio (HTMAB). Em seus experimentos foi observado que a presença do

surfactante foi fundamental para a remoção do PCP, embora sua dosagem elevada provocasse

um declínio no desempenho da SS devido à extrema competição pelos sítios de adsorção nas

bolhas. Resultados similares foram relatados em LU et al. (2005a). Tal estudo avaliou o efeito

da razão molar entre coletor e coligante na remoção do corante índigo carmim com auxílio do

surfactante CTAB. A razão do surfactante 2:1 possibilitou a eficiência máxima de remoção do

corante, o que expõe a sua importância nesse processo, uma vez que a eficiência do processo

foi próxima a 0% quando o surfactante estava ausente. Por outro lado, o contínuo acréscimo

de CTAB no sistema aumentou a emulsificação do 2-octanol e muitos dos complexos

formados retornaram à fase aquosa, o que reduziu significativamente a eficiência da SS.

2.1.5.1.2. Transporte por drenagem da fase aquosa

Após a captura do sublado na fase aquosa, as bolhas de gás alcançam a interface

líquido/líquido; contudo, não conseguem superar essa resistência imediatamente e tendem a

coalescer para formar bolhas maiores (CABALLERO et al., 1990; SMITH et al., 1996). No



instante em que a força de empuxo supera a força de sentido inverso provocada pela tensão

interfacial, bolhas entram na fase orgânica e são recobertas por uma fina camada de fase

aquosa, como é mostrado na Figura 2.6. Com o decorrer do processo e o contínuo

rompimento das bolhas, certa quantidade de fase aquosa se acumula na superfície da fase

orgânica até retornar sob a forma de gotas (MA et al., 2007; LU & ZHU, 2002). Assim, a

água é drenada para cima, levando consigo o soluto, na mesma medida em que as gotas

descendentes esgotam a concentração do soluto na fase orgânica. Segundo VALSARAJ &

THIBODEAUX (1991), tal dinâmica eventualmente alcança o estado estacionário e não

ocorre mais ganho líquido de soluto na fase orgânica. Por outro lado, durante a formulação de

um modelo matemático para a SS, BI et al. (2008) assumiram que o sublado não dissolve

imediatamente na fase orgânica após o rompimento das bolhas e que também é transferido por

difusão enquanto cai novamente para a fase aquosa. Assim, os autores incorporaram um termo

ao balanço de massa devido à área média de transferência proporcionada pelas gotas de água,

tendo resultados bastante satisfatórios na descrição da sublação do complexo ditizona-Co (II).

2.1.5.1.3. Difusão na interface líquido/líquido

A interface líquido-líquido é o ponto focal de todo o transporte de massa envolvida no

SS. Como pode ser visto na Figura 2.6, a difusão molecular, o último mecanismo da SS,

ocorre exatamente nessa região e se baseia no gradiente de concentração entre as fases.

Diferentemente da extração líquido-líquido, no qual esse mecanismo é único; na SS, o

transporte de massa por difusão molecular é notoriamente inferior ao transporte convectivo

(SMITH et al., 1996). Em VALSARAJ & THIBODEAUX (1991) foi observado que o efeito

do coeficiente de partição é irrelevante quando a difusão molecular é pouco significativa para

o processo. Contudo, quando a difusão molecular é predominante, tal parâmetro define a

concentração final do sublado no topo, assim como na extração líquido-líquido. De modo

semelhante, LU & ZHU (2002) mostraram que sistemas com elevadas constantes de difusão

molecular obedecem à cinética de primeira ordem e atingem o estado de equilíbrio

rapidamente.



Figura 2.6. Mecanismos de transferência de massa no processo de sublação por solvente.

Fonte: Adaptação de Bi et al. (2010a).

2.1.5.2. Aplicações da SS

Por conta de sua origem na flotação de íons, os primeiros trabalhos ligados à SS

envolvem a separação e determinação de metais traços (LU & ZHU, 2001; LOBACHEVA,

2008; BI et al., 2010a). Em KOTSUJI et al. (1977), a SS foi usada para separar Fe (II) pelo

complexo 3-(2-piridil)-5,6-difenil-1,4-triazina e o surfactante lauril sulfato de sódio (LSS),

alcançando valores de eficiência de até 97% na amostra marinha. BERG & DOWNEY (1980)

averiguaram o potencial da SS na remoção dos metais de transição dos períodos 5 e 6. Na

separação foi explorada a interação entre clorocomplexos aniônicos e surfactantes

quaternários de amônio e a sequência de seletividade Au (III) > Pt (IV), Ir (IV), Pd (II) > Ir

(III) > Rh (III) foi observada. CERVERA et al. (1982) propuseram a remoção de Cu (II)

através da formação de ditizonatos e sua coleta pela ação do LSS. Em uma coluna de flotação

de escala semi-piloto, os autores conseguiram obter valores de eficiência próximos a 100%

usando a razão de LSS/Cu (II) e tempo de processo equivalentes a 20:1 e 20 min,

respectivamente. No que diz respeito à aplicação da SS no tratamento de amostras para



espectrometria de absorção atômica (EAA), as contribuições dadas por KIM et al. devem ser

ressaltadas. Através desses trabalhos, a SS se firmou como técnica de tratamento na detecção

de metais por EAA devido ao seu sucesso em um número expressivo de aplicações (KIM et

al., 1998a; KIM et al., 1998b; KIM et al., 1999; KIM et al., 2001a; KIM et al., 2001b; KIM et

al., 2001c; KIM et al., 2002; KIM et al., 2003). Outra colaboração feita por Kim e

colaboradores foi a descoberta de um solvente adequado para esse tipo de análise de metais, a

isobutil metilcetona (MIC). Comparado aos solventes tradicionalmente usados na SS (xileno,

hexano, n-butanol, n-octanol, etc.), a MIC apresentou o valor máximo de remoção e menor

efeito de interferência na análise via EAA. Nos últimos anos poucos trabalhos foram

desenvolvidos (TUREK et al., 2016; LOBACHEVA & BERLINSKII, 2016), não havendo

grandes inovações na linha de remoção de metais.

A remoção e recuperação de poluentes orgânicos (por exemplo, corantes, solventes

orgânicos tóxicos, lubrificantes, etc.) têm sido extensivamente realizadas através da SS

(SOBIANOWSKA et al., 2009). Em 1966, Caragay e Karger estudaram a seletividade da

sublação de dois corantes, alaranjado de metila e rodamina B, por meio da complexação com

o brometo de hexadeciltrimetilamônio (HDT). Mesmo com uma pequena dosagem de

surfactante e baixa vazão de nitrogênio (5 mL/min), o processo conseguiu razão de

concentrações rodamina B/ alaranjado de metila superior a 510, tendo como alimentação uma

solução diluída equimolar (CARAGAY & KARGER, 1966). Técnicas de separação por

adsorção em bolhas, a flotação por íons e a sublação por solvente, foram aplicadas em

HORNG & HUANG (1993) na remoção do corante azul direto 1 disperso em água residuária

sintética. Sob a vazão de gás de 150 mL/min e tempo de flotação de 5 min, a remoção de azul

direto 1 foi superior 98% na presença do surfactante HDT. LU e colaboradores mostraram

êxito da SS na remoção de diferentes corantes como o azul de bromofenol (LU et al., 2001),

violeta de metilo (LU et al., 2003), índigo carmim (LU et al., 2005a) e verde bromocresol

(LU et al., 2007). Um número expressivo de processos industriais produz resíduos contendo

substâncias carcinogênicas como, por exemplo, hidrocarbonetos aromáticos multinucleares.

Em virtude disso, HUANG et al. (1983) mostraram a viabilidade da SS na remoção de

naftaleno e fenantreno de uma água residuária sintética. Com o intuito de aproveitar a água

residuária advinda da gaseificação do carvão em torres de resfriamento, NOLAN III &

MCTERNAN (1988) propuseram a aplicação da SS na remoção simultânea de benzeno e

partículas diminutas. A eliminação desses constituintes foi considerada importante, uma vez

que compostos orgânicos solúveis e sólidos suspensos podem causar incrustações nas paredes



do aparato. A otimização das condições operacionais possibilitou que a configuração final do

processo alcançasse índices de eficiência de remoção iguais a 93% e 90% para o benzeno e os

sólidos suspensos, respectivamente (NOLAN III & MCTERNAN, 1988). O acetato de butila

é comumente usado na extração de penicilina G, embora leve à geração de uma água

residuária imprópria para o descarte imediato devido à elevada concentração do solvente (MA

et al. 2010). LIU et al. aplicaram a SS sobre águas residuárias de plantas de produção de

penicilina G e conseguiram remover 60-70% do acetato de butila da corrente fluida (SUN et

al., 2005a; SUN et al., 2005b; SUN et al., 2006; SHEN et al., 2006; MA et al. 2010). Em

relação a outros contaminantes de águas; LU et al. (2005b) reportaram o sucesso da SS na

remoção de ácidos húmicos da água usando um sistema com o solvente isopentanol e cloreto

de hexadecil piridinio como coletor.

A recuperação de compostos de superfície ativa advindas de extratos naturais pela SS

também já foi alvo de estudos na literatura. Entre os componentes abordados nesses trabalhos,

encontra-se a efedrina e pseudoefedrina (DONG & WANG, 2004), magnolol e honokiol

(DONG & LIU, 2008), baicalina (DONG et al., 2005), icarina (WANG et al., 2007),

andrografólido (TANG et al., 2009) e fitosterona (LI & DONG, 2007). Como todos eles

possuem partes polares em sua estrutura e dispõem de grupos hidrofóbicos do tipo fenil e/ou

alquil, a separação por métodos de adsorção em bolhas é viável, muito embora seu

desempenho não seja tão satisfatório quanto foi no tratamento de metais. Além disso, foi

observado que o uso de solventes tradicionais (por exemplo, n-butanol, 2-octanol, acetato de

etila, etc.) dificulta a operação da SS quando esta é alimentada por extratos naturais baeados

em álcool (BI et al., 2010a). Assim, alterações foram realizadas sobre a SS convencional, de

modo que a técnica pudesse obter maiores níveis de desempenho e que fosse usada com êxito

na biosseparação e bioengenharia (BI et al., 2010a). Recentemente, duas novas vertentes da

SS foram desenvolvidas: a flotação/complexação/extração; e a flotação em sistema aquoso

bifásico.

Os aminoácidos são encontrados amplamente em microorganismos, animais e plantas,

podendo ser aplicados em diferentes segmentos como fármacos, cosméticos e suplementos

(GAO et al., 2015). Geralmente, a cromatografia de troca iônica é empregada no tratamento

de aminoácidos presentes em um líquido de fermentação; todavia, o baixo desempenho, o

consumo de tempo e o investimento requerido são alguns empecilhos desta etapa de produção

(WU et al., 2009). Outro fator que dificulta a recuperação desse produto é sua elevada

polaridade, o que dificulta o uso eficaz da ELL e SS uma vez que ele não solubiliza em



qualquer solvente (BI et al., 2008; WU et al., 2009). Inspirado nos progressos da extração de

aminoácidos reportados em LIU et al. (1999) e LIU et al. (2000), BI et al. (2008) foram os

primeiros a incorporar na SS seletores de componentes polares, em um processo chamado de

flotação/complexação/extração (FCE). O ácido di(2-etilhexil) fosfórico (AD2EHF), ácido

dibezoil-L-tartárico (L-ADBT) e D-tartarato de isobutila (D-TISB) são os seletores mais

usados. Diferentemente dos experimentos realizados com metais, na FCE a substância

responsável pela complexação é dispersa na fase topo. Em BI et al. (2008), a FCE foi aplicada

para recuperar L-fenilalanina de um caldo de fermentação de E. coli. Após a otimização de

algumas condições operacionais, a FCE foi capaz de atingir valores de razão de concentrações

superiores a 25, com um produto de 98% de pureza. WU et al. (2009) destacaram o

desempenho da FCE na separação de L-lisina, usando AD2EHF como seletor, o ácido

dodecilbenzeno sulfônico como surfactante e n-heptano como solvente. A ação dos seletores

também mostrou eficácia na separação de misturas racêmicas, apresentando bons resultados

de rendimentos para ambos os enantiômeros, conforme mostrado em JIAO et al. (2012) e

CHEN et al. (2012).

Nos estudos de extração da penicilina G por ELL, várias tentativas frustradas foram

realizadas para intensificar a recuperação do antibiótico na fase orgânica, rica em acetato de

butila (BI et al., 2009b; BI et al., 2010a). Da mesma forma, a aplicação da SS nesse cenário

não levou a resultados animadores. Apesar de seus benefícios já assinalados sobre a ELL, a

SS obteve valores baixos de eficiência, da ordem de 48%, o que não atendia às demandas da

produção massiva na indústria (BI et al., 2010a). No sentido de superar esse gargalo, BI et al.

(2009a) propuseram alterações nos constituintes das fases; mais especificamente, foi proposto

um sistema que compreende uma fase de fundo rica em sulfato de amônio sobreposta por uma

fase rica em PEG (50-80% m/m). Tal processo que combina sistema aquoso bifásico com

sublação por solvente foi denominado de flotação em sistema aquoso bifásico (FSAB). Com

essa nova técnica, os autores conseguiram 95% de rendimento para a penicilina G obtida de

caldo de fermentação bem como melhores índices de concentração do que a ELL, ESAB e SS.

O grande potencial da FSAB é ligado à substituição de solventes tradicionais (como

tolueno, n-octanol, n-butanol, entre outros) pelo uso de PEGs com baixa massa molecular ou

líquidos iônicos. Além de sua atoxicidade e baixo custo, a elevada polaridade atribuída a esses

compostos assegura a solubilização de sublados com a mesma propriedade. CHANG et al.

(2014) destacaram que durante a FSAB com PEG como solvente orgânico, uma camada de

emulsificação é claramente observada na fase topo da coluna. Para os autores, este fenômeno



permite maior captura de componentes de superfície ativa do que nos experimentos com

álcoois como solvente. Logo, várias aplicações da FSAB têm sido reportadas na literatura nos

últimos anos, as quais abrangem diferentes tipos de bioprodutos. BI et al. (2013) relataram

que a FSAB é um método efetivo para a purificação de baicalina obtida do extrato de

Scutellaria Baicalensis Georgi. Por sua vez, XIA et al. (2015) estudaram a recuperação de

clorofilina sódica e remoção de açúcares realizadas simultaneamente por FSAB. O sistema

proposto foi formado por etanol/fosfato e um extrato saponificado de folhas de bambu foi

usado como alimentação. Por conta dos elevados índices de recuperação da clorofilina

(88,28%) e remoção de açúcares (95,84%), a FSAB pode alavancar a produção industrial de

clorofilina cúprica de sódio. Já em LIN et al. (2015) foi avaliado o potencial da FSAB na

purificação parcial da ciclodextrinaglicosiltransferase produzida por Bacillus cereus. Em

condições ótimas, observou-se que a FSAB obteve valores expressivos de fator de purificação

e rendimento iguais a 21,8 e 97,1%, respectivamente. Ainda na linha de recuperação de

enzimas, MATHIAZAKAN et al. (2016) tiveram sucesso no estabelecimento de uma planta

piloto da FSAB para tratar lipases produzidas por Burkholderia cepacia ST8. Os resultados

obtidos em uma escala superior foram muito parecidas com aqueles da escala de laboratório,

com eficiência de 93% e fator de purificação igual a 13. Entretanto, para o nosso

conhecimento nenhum trabalho usando a FSAB foi realizado para a separação de ácidos

fenólicos. Assim, o presente capítulo apresenta um estudo exploratório da FSAB bem como

sua comparação com o desempenho da ESAB na recuperação e concentração de ácido gálico

do extrato de folhas de goiaba.



2.2. Objetivos

Recuperar e concentrar ácido gálico obtido de folhas de goiaba através da FSAB.

2.2.1. Objetivos específicos

Selecionar o solvente hidrofílico apropriado na recuperação do ácido gálico;

Avaliar os efeitos do pH da fase aquosa, concentração de sulfato de amônio,

percentual de PEG na camada do topo, concentração inicial de sublado, tempo de

flotação, vazão de ar e volume inicial da fase rica em PEG no desempenho da FSAB a

partir de uma solução modelo de ácido gálico;

Comparar o desempenho da FSAB com a ESAB em termos de eficiência de

separação, coeficiente de concentração e razão de distribuição;

Observar a captura de ácido gálico pela ação da flotação através da cromatografia

líquida de alta eficiência.



2.3. Materiais e métodos

2.3.1. Reagentes e aparato experimental

Ácido gálico (97.5-102.5% titration) usado como sublado nos experimentos FSAB foi

adquirida na Sigma-Aldrich. Polietileno glicol (PEG) com diferentes massas moleculares

(400, 1500, 4000, 6000 Da), etanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol, sulfato de amônio

foram adquiridos da Synth (Diadema, São Paulo, Brasil). Todos os reagentes possuíam grau

analítico e, portanto, não necessitaram de purificação prévia. Água deionizada foi obtida a

partir de um sistema MiliQ e prontamente usada nos experimentos FSAB.

O aparato usado para realizar os experimentos FSAB (Figura 2.7) foi confeccionado a

partir de uma coluna de vidro de 2.64 cm de diâmetro interno e capacidade de 180 mL. A

coluna foi equipada no fundo com um disco de vidro sinterizado de porosidade G4 e ar

comprimido foi usado para gerar as bolhas ascendentes. A vazão de ar foi medida usando um

rotâmetro (Dwyer RMA-1-SSV, USA) acoplado ao compressor via regulador.

Figura 2.7. Ilustração do aparato usado na FSAB.




2.3.2. Preparação do extrato de folhas de goiaba

O extrato de folhas de goiaba (Psidium guajava) foi preparado de acordo com

KANDIL et al. (1994) e SEO et al. (2014). Primeiramente, folhas de goiaba foram coletadas

em áreas urbanas da cidade de Natal/Brasil, lavadas com água corrente para remoção de

detritos e secas em temperatura ambiente (25 ± 2 oC). Em seguida, a mistura de 100 g de

folhas de goiaba e 1,5 L de água destilada foi aquecida a ponto de fervura durante 4 h. O

sobrenadante foi obtido por filtração à vácuo e levado para concentrar em evaporador rotativo

(Buchi R215, Alemanha) a 60 oC até a redução de volume em 1,5 vezes. Por fim, o extrato

resultante foi usado nos experimentos comparativos entre FSAB e ESAB.

2.3.3. Operação da coluna e otimização das condições experimentais

De modo a avaliar o transporte em situação monocomponente, os experimentos de

FSAB foram executados usando soluções aquosas modelo de ácido gálico (AG) como

alimentação. Primeiramente, uma dada quantidade de AG foi solubilizada em solução salina

de sulfato de amônio em agitador magnético e o pH da mistura foi ajustado pela adição de

soluções de NaOH e HCl, ambas a 3 M. Por tratar-se de um método que evita a mistura entre

as fases, a base de cálculo para a concentração salina da fase de fundo foi massa:volume (C),

ao invés da convenção massa:massa (W). Assim, a seguinte equação foi usada para converter

as concentrações volumétricas para concentrações mássicas na solução de sulfato de amônio:

W = 0.0771C + 2.6067 (R2 = 0.9990), conforme reportado em BI et al. (2009a). Após isso,

100 mL de mistura salina foram colocadas na coluna de flotação e, em seguida, certo volume

de solvente orgânico foi adicionado gentilmente sobre a solução anterior. A admissão de ar ao

sistema bifásico foi então permitida e, após um determinado tempo de experimento (também

chamado de tempo de flotação), os volumes finais das fases topo e fundo foram registrados e

amostras de ambas as fases foram coletadas para análises posteriores.

Os estudos foram direcionados para investigar a influência das condições operacionais

da FSAB (tipo de solvente hidrofílico, pH da fase fundo, concentração de sulfato de amônio,

concentração do sublado, vazão de ar, tempo de flotação (tf) e volume da fase orgânica) na

recuperação e concentração do ácido gálico. A eficiência de separação (E%), a razão de

distribuição (D) e o coeficiente de concentração (α), descritos nas equações 2.3-2.5, foram

usados para avaliar o desempenho da FSAB:



% 1 100w

wi

CE

C

(2.3)

PEG

w

CD

C (2.4)

PEG

wi

C

C (2.5)

onde Cw é a concentração de ácido gálico na fase rica em sal no tempo t, Cwi é a concentração

inicial de ácido gálico na fase rica em sal e CPEG é a concentração de ácido gálico na fase PEG

no tempo t. As condições experimentais de partida foram selecionadas com base nos trabalhos

de Bi e colaboradores (BI et al. 2009a, 2010b, 2013), cujos valores foram: pH da fase fundo

igual a 4,0, concentração de sulfato de amônio igual a 450 g/L, %solvente orgânico (m/m)

igual a 80,0, concentração de AG igual a 500 μg/mL, vazão de ar igual a 25 mL/min, tempo

de flotação de 30 minutos e razão volumétrica de 0,1. A Tabela 2.2 apresenta a ordem de

execução dos experimentos.

Tabela 2.2 Ordem de execução dos experimentos e as respectivas faixas de operação estudadas.

Ordem de execução Tipo de variável Faixa de operação Unidades

1 Tipo de solvente

orgânico

Etanol, n-propanol,

isopropanol, n-

butanol, PEG 6000,

PEG 4000, PEG

1500 e PEG 400

N/A

2 pH da fase fundo 2,0-8,0 N/A

3 concentração de

sulfato de amônio 350-500 g/L

4 percentual de

solvente orgânico 50-100 %

5 concentração de AG 25-10000 μg/mL

6 Vazão de ar e tempo

de flotação 12,5-50 e 1-120

mL/min e min,

respectivamente

7 Volume da fase PEG 5,0-15,0 mL




Todos experimentos foram realizados em duplicata a temperatura ambiente. As análises

estatísticas foram realizadas usando teste de médias (teste de Tukey) no software Statistica 7.0

a um nível de significância de 5% (p < 0,05).

2.3.4. Experimentos de comparação

Finalizada a etapa de otimização, o sistema FSAB foi comparado com a ESAB. No

experimento da FSAB, 100 mL da solução aquosa (mistura entre AG ou infusão de folhas,

água e sulfato de amônio) foram extraídos por 10,0 mL da solução PEG 400 usando vazão de

ar de 37,5 mL/min durante 120 min. No experimento da ESAB, 8,0 mL de solução aquosa foi

agitada com 2,0 mL de solução de PEG 400 em um tubo de centrífuga de 15,0 mL e a

separação de fases foi acelerada por centrifugação a 2100 x g por 10 minutos. Não foi

possível realizar a ESAB sob a razão volumétrica de 0,1, uma vez que não ocorreu a formação

de duas fases. Em ambos os experimentos, a concentração de sulfato de amônio na fase

aquosa foi 450 g/L, o pH da fase aquosa foi 4,0, o percentual mássico de PEG na fase

orgânica foi 80% (m/m) e a concentração inicial de ácido gálico na fase aquosa foi 500 μg/mL

.

2.3.5. Determinação do ácido gálico e análise por cromatografia líquida de alta

eficiência

A quantificação de ácido gálico em experimentos FSAB e ESAB com solução modelo

foi realizada por espectroscopia UV, no comprimento de onda de 262 nm a partir de uma

curva de calibração com o mesmo analito. Outras curvas de calibração também foram

realizadas considerando os efeitos da concentração de sal, concentração de solvente orgânico

e pH.

A concentração de ácido gálico em meios complexos foi determinada em um sistema

de cromatografia líquida de alta-eficiência (CLAE) modelo Accela (Thermo Scientific, USA),

provido de detector por arranjo de diodo (operado em 278 nm) e amostrador automático. O

método analítico foi adaptado de KIM et al. (2013) usando a coluna Hypersil GOLD RP- C18

com dimensões de 50 x 2,1 mm (Thermo Scientific, USA) e uma solução contendo 5,0% de

metanol e 0,1% de ácido acético como fase móvel, sob fluxo de 0,9 mL/min. Todas as

amostras foram filtradas com membrana 0,22 µm e analisadas em três replicatas. A curva de

calibração para o AG foi realizada na faixa de 0,005-0,5 mg/mL. A equação da regressão



[AG] (mg/mL) = 4,7192 x 10-8

x Área do pico (mAu) x (R2

= 0,9938) foi usada para avaliar

quantitativamente esse componente fenólico nos experimentos envolvendo o extrato de folhas

de goiaba.

2.4. Resultados e Discussões

2.4.1. Efeito do tipo de solvente orgânico

Na ESAB, a escolha do solvente orgânico é fundamental na formação de um sistema

bifásico e afeta o comportamento de partição da molécula-alvo (HAN et al., 2014). Desta

forma, uma investigação preliminar foi realizada para avaliar o efeito do tipo de solvente

orgânico na recuperação e concentração do ácido gálico por FSAB usando como fase orgânica

soluções aquosas de PEG (PEG 6000, PEG 4000, PEG 1500 e PEG 400) e de álcoois (etanol,

n-propanol, isopropanol e n-butanol). Os experimentos com PEG 6000, PEG 4000 e PEG

1500 não puderam ser convenientemente monitorados devido à elevada viscosidade da fase

orgânica e ao acúmulo de espuma no topo da coluna, enquanto que nos experimentos usando

PEG 400 nenhum problema foi registrado. Em alguns estudos, polímeros com elevada massa

molecular foram usados como solvente e, aparentemente, nenhum problema com a espuma foi

observado. Esse é o caso de LI & DONG (2011), que usaram PEG 1000, PEG 2000 e PEG

4000 na recuperação da lincomicina; SHOW et al. (2011), na recuperação de lipase de

Burkholderia cepacia por intermédio de polímeros Etileno óxido-Propileno óxido (EOPO)

com massas moleculares de até 12000; LIN et al. (2015) usaram como solvente PEG 4000,

PEG 6000, PEG 8000, PEG 10000 e PEG 20000 na recuperação de ciclodextrina

glicosiltransferase; entre outros. Provavelmente, isso só foi possível devido à prática de

misturar a solução salina e o solvente hidrofílico conforme as metodologias apresentadas, que

são conflitantes às bases desta técnica de separação.

De acordo com a Tabela 2.3, os valores de eficiência de separação, assim como do

coeficiente de concentração e razão de distribuição para o ácido gálico foram superiores com

PEG do que com álcoois de baixo peso molecular. A grande disponibilidade de grupos éter

concede ao PEG forte polaridade, permitindo a dissolução mais fácil de sublados com

estruturas polares na fase orgânica e, consequentemente, maior desempenho da FSAB (BI et

al., 2009a; BI et al., 2010b; CHANG et al., 2014). Além disso, notou-se que o aumento da



cadeia carbônica nos álcoois desfavoreceu a migração do ácido gálico para a camada de topo,

o que refletiu no decréscimo dos valores de E%, a e D. Dessa forma, o solvente orgânico que

apresentou melhor desempenho foi o PEG 400.

Tabela 2.3 Desempenho da FSAB com diferentes solventes orgânicos. As condições experimentais usadas

foram: pH = 4,0, [sulfato de amônio] = 450 g/L,% solvente orgânico (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão de

ar = 25 mL/min , tf = 30 min, razão volumétrica = 0,1.

Tipo de solvente hidrofílico Eficiência de

separação (E%)

Coeficiente de

concentração (α) Razão de distribuição (D)

PEG 400 49,68 ± 1,57a 2,70 ± 0,09

a 5,18 ± 0,34

a

etanol 17,41 ± 1,77b 1,78 ± 0,17

bc 2,15 ± 0,15

c

isopropanol 19,61 ± 1,00b 1,88 ± 0,00

b 2,30 ± 0,01

b

n-propanol 18,90 ± 0,15b 1,55 ± 0,05

c 1,91 ± 0,06

d

n-butanol 13,55 ± 1,86c 1,35 ± 0,04

d 1,53 ± 0,05

e

As letras minúsculas a, b, c, d e e foram usadas para comparação de desempenho entre os solventes orgânicos;

valores com a mesma letra em uma coluna indica que não há diferença significativa entre eles a 5% de

significância (p < 0,05). Fonte: Próprio autor.

2.4.2. Efeito do pH na fase aquosa

O uso de níveis adequados de pH na FSAB conduz à redução da estabilidade do

sublado na fase aquosa bem como o aumento de sua solubilidade na fase orgânica (LU &

ZHU, 2001; BI et al., 2010a; BI et al., 2013; CHANG et al., 2014; CHANG et al., 2015).

Neste estudo, o efeito do pH da solução aquosa na FSAB foi avaliado na faixa 2 a 8 pela

adição de soluções de ácido clorídrico e hidróxido de sódio. Em concordância com BI et al.

(2013), foi observado que o sistema PEG/sulfato de amônio apresenta fase única quando o pH

da solução aquosa é menor do que 2,0. Por outro lado, em níveis de pH superiores a 7,0

ocorre a liberação de um forte odor de amônia, indicativo da decomposição do cátion NH4+

em NH3.H2O. Conforme a Figura 2.8, a eficiência de separação, coeficiente de concentração e

razão de distribuição mantêm-se constantes na faixa de pH 2-4 e decaem com o aumento do

pH.



A estrutura do ácido gálico, mostrado na Figura 2.2, dispõe de quatro grupos

hidroxilas potencialmente ionizáveis com diferentes valores de pKa (4,0, 8,7, 11,4 e >13,0)

(REIS et al., 2015). Possivelmente, nos experimentos com pH ≤ 4,0 a maior parte das

moléculas de ácido gálico se encontra no estado não-acidificado e, portanto, mais susceptíveis

à adsorção por bolhas. Por outro lado, o aumento do pH levou ao ganho de cargas de elétricas

no ácido gálico, tornando-o mais afim à fase rica em sal. Como o preparo da solução rica em

sal apresenta pH próximo a 4,0 sem qualquer adição de ácido ou base, este valor de pH foi

usado nas etapas seguintes.

Figura 2.8 Efeito do pH no desempenho da FSAB. Os experimentos foram realizados nas seguintes condições:

[sulfato de amônio] = 450 g/L, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão de ar = 25 mL/min, tf = 30 min,

razão volumétrica = 0,1.


Embora sistemas FSAB convencionais corroborem os resultados obtidos neste

capítulo quanto ao efeito do pH (Ver tópico 2.1.4.1), a tendência oposta também foi reportada

na literatura. LI & DONG (2010) mostraram que a razão de distribuição da lincomicina é

afetada positivamente pelo aumento do pH da fase rica em sal durante a FSAB. Os autores

argumentaram que as moléculas do antibiótico podem interagir entre si quando o pH se



encontra superior a 10, permitindo o seu transporte para a fase topo. Por sua vez, CHANG et

al. (2014) observaram que o aumento de pH na faixa de 2,0-7,0 melhorou o desempenho da

FSAB na recuperação de liquiritina e ácido glicirrízico de Glycyrrhiza uralensis. Neste

trabalho, a justificativa dada para tais resultados foi a manifestação mais intensa da camada de

emulsão em pHs mais álcalis, o que afetou a recuperação total dos componentes.

2.4.3. Efeito da concentração de sulfato de amônio

Para assegurar altos níveis de concentração do sublado na fase orgânica durante

processo FSAB, é recomendado que o volume da fase aquosa deva ser muito superior ao

volume da fase orgânica (PAKHALE et al., 2013). Assim, a concentração do sal na fase

aquosa torna-se chave para a existência de duas fases imiscíveis no sistema PEG/sulfato de

amônio (BI et al., 2009a, BI et al., 2010b; BI et al., 2013; CHANG et al., 2014). Com base

nessa informação, investigou-se a influência da concentração de sulfato de amônio na FSAB

na faixa de 350 g/L a 500 g/L e os resultados dos experimentos são mostrados na Figura 2.9.

Figura 2.9 Efeito do sulfato de amônio no desempenho da FSAB. Os experimentos foram realizados nas

seguintes condições: pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão de ar = 25 mL/min, tf = 30 min,





Como esperado, os valores de eficiência de separação, coeficiente de separação e

razão de distribuição foram mais altos nos experimentos com concentrações elevadas de

sulfato de amônio. Em contrapartida ao efeito do pH, o acréscimo de sal na fase aquosa leva à

redução da solubilidade do ácido gálico e ao aumento da adsorção do sublado nas bolhas. Nos

experimentos com concentração de sulfato de amônio igual a 325 g/L foi registrada uma

mistura vigorosa na interface fase aquosa-fase orgânica, o que levou a perda de volume da

fase orgânica e, consequentemente, altos níveis de coeficiente de concentração (4,70) e razão

de distribuição (7,96) foram obtidos. Esse comportamento também foi observado nos

trabalhos de BI et al. (2009a), BI et al. (2010a) e LI & DONG (2010). Quando a concentração

de sulfato de amônio foi superior a 500 g/L, observou-se o aumento marginal do desempenho

da FSAB devido à precipitação do ácido gálico. Perante tais resultados e buscando minimizar

os gastos com sal, a concentração de sulfato de amônio igual a 450 g/L foi mantida para os

experimentos seguintes.

2.4.4. Efeito do percentual de PEG na camada de topo

Assim como a concentração salina, o percentual do solvente hidrofílico na camada do

topo exerce um papel importante para o estabelecimento de um sistema bifásico (SHOW et al.

2013). Além disso, como o PEG 400 é um líquido com elevada viscosidade, o aumento de seu

percentual na camada de topo também afeta a dinâmica das bolhas ascendentes, que pode

refletir sobre o desempenho do processo. Isso ocorre quando há uma alta tensão interfacial

entre as fases aquosa e orgânica, impedindo a livre passagem das bolhas e favorecendo a

coalescência delas para superar tal resistência física (BI et al., 2007). Contudo, no que se

observa nos valores de E%, α e D expressos na Figura 2.10, esse fenômeno não foi decisivo

na faixa estudada de 50-100% PEG (m/m). À exceção dos experimentos a 50% (m/m), o

aumento de PEG possibilitou maiores índices de desempenho, alcançando seu máximo em

100% (m/m). Entretanto, nos experimentos usando a maior concentração bem como a 90%

(m/m) do polímero, foi observada a formação de grânulos de sal à medida que o processo

transcorria. Sendo uma característica indesejável de operação, ainda que o processo obtenha

bom desempenho, tais percentuais de PEG foram descartados e o nível imediatamente inferior

(80% m/m) foi selecionado. Nesta condição, o experimento realizado alcançou valores de E%,

α e D iguais a 49,68, 2,78 e 5,18, respectivamente.

O percentual de solvente no processo de flotação já foi alvo de investigação em outros

trabalhos. SHOW et al. (2013) observaram que a adição de 2-propanol na FSAB aumentou o



rendimento na recuperação de lipases de Burkholderia cepacia ST8, independentemente da

razão volumétrica usada. SHOW et al. (2011) também observaram uma correlação positiva

entre a adição de EOPO e o rendimento da flotação durante a recuperação e purificação da

mesma enzima. De maneira contrária, PAKHALE et al. (2013) registraram que o acréscimo

de PEG na camada de topo de 12% (m/m) para 18% (m/m) reduziu a eficiência da FSAB na

captura da bromelina de 86% para 81%. Os autores atribuíram essa tendência ao fenômeno de

exclusão de tamanho, no qual o espaço disponível para dissolução da enzima na camada de

topo fora gradativamente ocupada pela presença do polímero.

Figura 2.10 Efeito do percentual de PEG no desempenho da FSAB. Os experimentos foram realizados nas

seguintes condições: pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500 μg/mL, vazão de ar = 25 mL/min, tf = 30 min,



2.4.5. Efeito da concentração inicial do sublado

Usualmente, as técnicas de separação por adsorção em bolhas mostram excelentes

resultados na recuperação de componentes de superfície-ativa em soluções diluídas

(LEMLICH, 1968). Com o objetivo de estudar a influência da concentração inicial de sublado

no desempenho da FSAB, a concentração de ácido gálico foi variada na faixa de 25 μg/mL a

10 mg/mL (limite de solubilidade) e os resultados experimentais são mostrados na Figura



2.11. Em baixas concentrações iniciais de sublado na fase aquosa foram observados menores

taxas de recuperação e o desempenho máximo da FSAB (em termos de E% e D) foi obtido no

experimento com concentração de sublado igual a 500 μg/mL. Quando a concentração inicial

de ácido gálico foi superior a 500 μg/mL, foi observado o declínio dos valores de E%, α e D,

que pode ser atribuído à saturação do sublado na interface gás-líquido.

Figura 2.11. Efeito da concentração do sublado no desempenho da FSAB. Os experimentos foram realizados

nas seguintes condições: [sulfato de amônio] = 450 g/L, pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, vazão de ar = 25

mL/min , tf = 30 min, razão volumétrica = 0,1.


2.4.6. Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação

Neste ponto, ambos os efeitos da vazão de ar e do tempo de flotação sobre a eficiência

de separação da FSAB foram investigados e seus resultados são mostrados na Figura 2.12.

Neste estudo, a faixa da vazão de ar foi de 12,5 mL/min a 50 mL/min e os valores de

eficiência de separação foram estimados a partir de 1 min até 120 min. Obviamente, a

eficiência de separação do ácido gálico foi superior em maiores níveis de vazão de ar e tempo

de flotação. Além disso, nota-se que existe um padrão em todas as curvas cinéticas, dividido



em dois momentos: um aumento abrupto nos primeiros 5-10 min e um aumento gradativo até

os 120 min, devido à baixa interação entre o analito restante e a interface gás-líquido. Ainda

que permitam o equilíbrio mais rápido do sistema, elevadas vazões de gás (≥ 50 mL/min)

devem ser evitadas porque provocam a mistura turbulenta na interface fase aquosa-fase

orgânica e o acúmulo de bolhas no topo da coluna, como reportado em DONG et al. (2008),

BI et al. (2010b), CHANG et al. (2014). Portanto, a vazão de ar de 37,5 mL/min e o tempo de

flotação de 120 min foram selecionados para a etapa seguinte.

Figura 2.12. Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação na eficiência de separação usando a FSAB. Os

experimentos foram realizados nas seguintes condições: [sufato de amônio] = 450 g/L, pH = 4,0, %PEG (m/m) =

80,0, [AG] = 500 μg/mL, razão volumétrica = 0,1.


2.4.7. Efeito do volume da fase orgânica

Segundo SEBBA (1962), em um sistema de remoção de íons por complexação com

surfactante, o desempenho da sublação por solvente mostrou-se independente da razão

volumétrica usada. Em concordância, CABALLERO (1990) concluiu que o efeito do volume

da fase orgânica sobre o desempenho da sublação é insignificante até a saturação da fase pelo



sublado. Apesar disto, trabalhos recentes (BI et al., 2009a; MA et al., 2010; LIN et al., 2015)

têm apontado que o aumento da altura da camada topo possibilita a maior solvatação do

sublado e, consequentemente, maior eficiência de separação. Portanto, para esclarecer o efeito

desta variável, experimentos foram realizados pela variação do volume da fase orgânica de

5,0 mL a 15,0 mL. De acordo com a Figura 2.13, baixos volumes da fase PEG levaram a

menores valores de E% e altos valores de α e D, enquanto que o uso de maiores volumes de

fase PEG resultou em altos índices de E% e baixos valores de α e D. De modo a garantir

simultaneamente boa separação e concentração do ácido gálico, o volume inicial de solução

PEG de 10,0 mL foi selecionado para as etapas seguintes.

Figura 2.13. Efeito do volume inicial da fase rica em PEG no desempenho da FSAB. Os experimentos foram

realizados nas seguintes condições: [sulfato de amônio] = 450 g/L, pH = 4,0, %PEG (m/m) = 80,0, [AG] = 500

μg/mL, vazão de ar = 37,5 mL/min , tf = 120 min.


Baseado nos resultados acima, as condições ótimas da FSAB foram resumidas em:

PEG 400 como solvente orgânico, pH da fase aquosa de 4,0, concentração de sulfato de

amônio na fase aquosa de 450 g/L, concentração de ácido gálico de 500 μg/mL, vazão de ar

de 37,5 mL/min, tempo de flotação de 120 min e volume inicial de fase orgânica de 10 mL.

Sob condições ótimas, o ácido gálico pode ser efetivamente separado e concentrado da fase



aquosa para a fase orgânica como pode ser observado nos cromatogramas de CLAE (Figura

2.14). A redução na intensidade dos picos constatada pela comparação das Figuras 2.14A e

2.14B indica a migração de ácido gálico da fase rica em sal para a fase rica em PEG.

Figura 2.14. Cromatogramas de CLAE para a fase rica em sal antes da FSAB (A), fase rica em sal depois da

FSAB (B) e fase rica em PEG depois da FSAB (C).


2.4.8. Comparação entre FSAB e ESAB

Nesta seção comparamos a FSAB com a tradicional ESAB em relação à separação e

concentração de AG a partir da solução modelo. Para assegurar a formação de duas fases, a

razão volumétrica do sistema ESAB foi fixada em 1:3 (volume da fase orgânica/volume da

fase rica em sal), enquanto que foi usada a razão volumétrica na FSAB de 1:10. Quando a

solução modelo de ácido gálico foi usada, como pode ser observado na Tabela 2.4, os valores

para eficiência de separação e razão de distribuição foram inferiores a FSAB (E% = 81,62 ±

1,07; D = 26,94 ± 1,34) frente ao desempenho mostrado na ESAB (E% = 96,21 ; D = 54,81).

Entretanto, o coeficiente de concentração na FSAB (α = 2,53) foi 1,8 vezes superior àquele

mostrado na ESAB (α = 2,53). Por outro lado, a FSAB (D = 27,92; α = 5,72) mostrou maior



desempenho para ambos os coeficiente de concentração e razão de distribuição que a ESAB

(D = 22,08; α = 2,63) quando o extrato de folhas de goiaba foi usado, de concentração de

ácido gálico igual a 37,36 μg/mL. Além disso, a eficiência de separação foi levemente inferior

na FSAB (E% = 80,28) do que na ESAB (E% = 88,73).

Tabela 2.4 - Comparação de desempenhos entre a ESAB (1:4) e FSAB (1:10) para a solução modelo e o extrato

de folhas de goiaba

Respostas Solução modelo

Extrato de folhas de

goiaba

ESAB (1:4) FSAB (1:10) ESAB (1:4) FSAB (1:10)

Eficiência de separação (E%) 96,21 ± 0,39a

81,62 ± 1,07b

88,73 ± 1,20a

80,28 ± 0,05b

Coeficiente de concentração (α) 2,53 ± 0,01b

4,76 ± 0,15a

2,63 ± 0,24b

5,72 ± 0,39a

Razão de distribuição (D) 54,81 ± 5,41a

26,94 ± 1,34b

22,08 ± 3,45b

27,92 ± 1,83a

As letras minúsculas a e b são usados para comparação dos desempenhos entre ESAB e FSAB; valores com a

mesma letra em uma linha indica que não há diferença significativa entre eles a 5% de significância (p < 0,05).

Portanto, os resultados mostraram que a FSAB pode ser usada de modo eficaz na

recuperação e concentração de componentes fenólicos de extratos reais, não se restringindo à

captura do ácido gálico, como pode ser observado na Figura 2.15. Além do ácido gálico,

componentes fenólicos como taninos e flavonóides também são abundantes no extrato de

folhas de goiaba (SEO et al., 2014). Assim, a diminuição dos picos nos cromatogramas de

CLAE indica que provavelmente a maior parte dos componentes fenólicos migrou para a

camada de topo. Comparado a outras técnicas de separação, a FSAB mostrou algumas

vantagens como a simples operação, baixo custo e necessidade de pequenas quantidades de

solvente.



Figura 2.15 – Cromatogramas CLAE para o extrato de folhas de goiaba anterior ao processo de flotação (A), fase

rica em sal após a FSAB (B) e fase rica em PEG após a FSAB (C).


2.5. Conclusões

Neste trabalho, o sistema PEG/sulfato de amônio proposto obteve sucesso na

recuperação e concentração de ácido gálico através da FSAB. Usando a solução modelo de

ácido gálico como alimentação, o melhor desempenho da FSAB foi alcançado sob as

seguintes condições: PEG 400 como solvente orgânico, pH da fase inferior de 4,0,

concentração de sulfato de amônio de 450 g/L, concentração de sublado de 500 μg/mL, vazão

de ar de 37,5 mL/min, tempo de flotação de 120 min e volume de fase orgânica de 10 mL.

Sob condições ótimas e extrato de folhas de goiaba como alimentação, a FSAB alcançou

eficiência de separação igual a 80,28% e coeficiente de concentração de 5,72. Além disso, os

experimentos comparativos apontaram que não houve impacto da complexidade do extrato

sobre o desempenho da FSAB e que a técnica de flotação atingiu valores de coeficiente de

concentração ao menos duas vezes superior àqueles obtidos pela ESAB. Finalmente, a FSAB

mostrou ser uma técnica em potencial para separação e concentração do ácido gálico, o que

sugere sua aplicação para moléculas de superfície-ativa de extratos naturais.

CAPÍTULO 3


POLIFENÓIS DO RESÍDUO DE CAMU-

CAMU (Myrciaria dubia H.B.K. McVaugh)

POR FLOTAÇÃO EM SISTEMA AQUOSO

BIFÁSICO

Recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu... 65


3. Recuperação e concentração de polifenóis de

camu-camu (Myrciaria dubia H.B.K. McVaugh) por

flotação em sistema aquoso bifásico

Neste capítulo, polifenóis obtidos do resíduo despolpado de camu-camu foram

recuperados via FSAB usando o par de agentes de separação de fases PEG/sulfato de amônio.

Inicialmente, investigações foram realizadas de modo univariado na FSAB para maximizar a

captura de polifenóis na fase rica em polímero. Em seguida, os desempenhos das técnicas

foram comparados em termos do percentual de recuperação bem como dos índices de

enriquecimento. Enfim, os componentes fenólicos presentes em cada uma das fases foram

identificados por CLAE-DAD e a FSAB foi realizada em escala semi-piloto. Esses resultados

foram organizados na forma do artigo entitulado “Enhancing the recovery and concentration

of polyphenols from camu-camu (Myrciaria dubia H.B.K. McVaugh) by aqueous two-phase

flotation and scale-up process”, o qual foi publicado no periódico Separation and Science

Technology.


3.1.1. Valorização de resíduos agroindustriais

Atualmente, por conta da brutal atividade humana sobre a natureza, faz-se urgente o

estabelecimento de tecnologias sustentáveis; ao mesmo tempo, em que o crescimento

populacional impulsiona a atividade da agroindústria para processamento de alimentos. Por

exemplo, em países como o Brasil, cujo agronegócio tem forte impacto sobre a economia

nacional, a gestão de resíduos vem se tornando cada vez mais importante nas empresas

(SHARMA et al., 2016). Não apenas para se enquadrar no rigor das leis ambientais, a

preocupação com o ambiente melhora a imagem da empresa com os consumidores, além de

possibilitar o aumento na margem de lucro pela valorização de subprodutos (CARVALHO et

al., 2011). No que diz respeito à indústria de processamento de alimentos, os resíduos gerados

são na forma de cascas, sementes, folhas, palhas, refugo, bagaço, etc. A compreensão da



estrutura química e das funções biológicas dos constituintes destes resíduos é fundamental

para o seu direcionamento eficiente e seguro (SOUSA et al., 2011).

3.1.2. Camu-camu

O camu-camu (Myrciaria dubia H. B. K. Vaugh), também conhecido como caçari ou

araçá-d’água, é um fruto de origem amazônica pertencente à família Myrtaceae. Tal fruto é do

tipo globuloso, com diâmetro médio de 20 mm, cuja coloração varia de verde a vermelho ou

roxo escuro, no último estágio de maturação (conforme a Figura 3.1). A polpa do camu-camu

é macia e suculenta; contudo, por sua elevada acidez e adstringência, dificilmente é feito o

consumo do fruto na forma natural. Isso se deve ao seu alto teor de ácido ascórbico, por volta

de 2606 mg/100 g de fruto; o qual é significativamente superior aos níveis encontrados em

frutas consideradas ricas nesta vitamina como acerola, laranja e limão (ZANATTA et al.,

2005). Além disso, na polpa da fruta são detectadas concentrações significativas de alguns

ácidos fenólicos (ácido gálico, ácido siríngico, ácido elágico), flavonóides (catequina,

quercetina, kaempferol, naringenina e eriodctiol), antocianinas (cianidina-3-glicosídeo e

delfinidina-3-glicosídeo) e taninos (elagitaninos) (AKTER et al., 2011; FRACASSETTI et

al., 2013). Por conta disto, estudos foram realizados para explorar os possíveis benefícios

atribuídos ao consumo do fruto. A pesquisa desenvolvida por INOUE et al. (2008) sugerem

que o suco de camu-camu oferece propriedades antioxidativos e antiinflamatórios superiores à

vitamina C comercial, ainda que estejam na mesma dosagem da vitamina. AKACHI et al.

(2010) destacaram o potencial hepatoprotetor do suco de camu-camu em ratos, quando estes

foram submetidos a lesões induzidas por D-galactosamina. NASCIMENTO et al. (2013)

reportaram a atividade antiobesidade da polpa de camu-camu quando inserida na alimentação

de ratos. Esses resultados estimularam o interesse da indústria alimentícia e farmacêutica pelo

fruto, o que levou ao aumento de sua exploração. Os principais países para exportação do

camu-camu são Japão e Estados Unidos, os quais consideram o fruto como alimento

funcional, mas também o consomem na forma processada como sucos, sorvetes, picolés,

geléias, licores e sobremesas (MAEDA & ANDRADE, 2003).



Figura 3.1 Frutos de camu-camu.

Fonte: Imagens da internet.

3.1.2.1. Resíduo despolpado de camu-camu

Ainda que o camu-camu seja sazonal, a demanda pelo fruto exigiu a implementação de

tecnologias de produção. Seleções de plantas e técnicas de clonagem proporcionaram

colheitas com alta produtividade (10 a 23 kg/planta/safra) e elevado teor de ácido ascórbico

nos frutos. Os dados sobre a exploração do camu-camu ainda são escassos, embora se indica

que ela seja majoritariamente realizada no Peru, com aproximadamente 800 toneladas de

polpa produzidas, enquanto que a produção no Brasil não ultrapassa 20 toneladas de polpa

(YUYAMA, 2011).

Equivalendo a 40% da massa do fruto, o resíduo despolpado gerado pode ser

alavancado com o crescente processamento do camu-camu, o que pode agravar a poluição

ambiental. Assim, com vistas às propriedades biológicas observadas na polpa, algumas

pesquisas também foram realizadas com o resíduo despolpado, conforme reportado em

MYODA et al. (2010). Neste trabalho, os autores observaram elevada atividade antioxidante

em extratos metanólicos do resíduo bem como quantidades significativas de constituintes

lipolíticos, os quais oferecem atividade antimicrobiana. FRACASSETTI et al. (2013)

mostraram que a concentração de componentes fenólicos bem como a capacidade

antioxidante da farinha do resíduo despolpado de camu-camu (4007,95 mg/100 g and 752,3

μmol Trolox/g) foram superiores aos resultados obtidos a partir da polpa (48,54 mg/100 g and

167,5 μmol Trolox/g). Por sua vez, o extrato aquoso deste resíduo exibiu atividade

neuroprotetor em C. elegans in vivo, conforme apresentado em AZEVÊDO et al. (2014).



Assim, o uso de métodos de separação permitirá a elaboração de preparações com

propriedades específicas bem como possibilita identificar outros constituintes do resíduo após

concentração de extratos. Em nosso estudo, a técnica flotação em sistema bifásico aquoso foi

escolhida para a captura de componentes fenólicos do extrato aquoso do resíduo de camu-

camu.



3.2. Objetivos

Recuperar e concentrar polifenóis do resíduo despolpado de camu-camu por FSAB.


Investigar os efeitos do tipo de solvente orgânico, pH da fase aquosa, concentração de

sulfato de amônio, tempo de flotação, vazão de ar e volume inicial de topo no

desempenho da FSAB;

Comparar os métodos baseados em extração líquido-líquido em termos de eficiência

de separação, coeficiente de concentração e razão de distribuição;

Realizar ensaios de FSAB em escala ampliada;

Identificar os componentes fenólicos dispersos em cada fase após o método extrativo;



3.3. Materiais e métodos

3.3.1. Reagentes

O resíduo despolpado de camu-camu (Myrciaria dubia H.B.K. Vaugh), formado

principalmente de sementes e cascas, foi cedido pela Cupuaçu do Amazonas Comércio e

Indústria Ltda (Amazonas, Brazil). Os reagentes Folin-Ciocalteau e Triton X-114 bem como

os padrões (+)-catequina, ácido elágico, eugenol, ácido gálico, quercetina, ácido siríngico,

vanilina e ácido vanílico foram adquiridos pela Sigma-Aldrich (USA). Polietilenoglicol

(PEG) 400, 1500, 4000 e 6000, etanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol, sulfato de amônio

e cloreto de sódio foram adquiridos da Synth (Diadema, São Paulo/Brazil). Todos os

reagentes usados possuíam grau analítico e, portanto, não necessitaram de purificação prévia.

Água deionizada obtida do sistema MiliQ EasyPure RF (ThermoFisher Scientific, USA) foi

usada nos experimentos FSAB.

3.3.2. Preparação do extrato do resíduo de camu-camu

A secagem do resíduo de camu-camu foi realizada em equipamento de freeze dryer

Liobras modelo L101 (Campinas, Brazil) sob temperatura de -40 oC e pressão de vácuo de 13

Pa. Finalizada a etapa, o resíduo seco foi armazenado em freezer a -20 oC e envolto em lona

para isolamento da luz. No preparo do extrato, as amostras secas foram trituradas e extraídas

em água deionizada na proporção 1:100 (m/v), para a EPN, e 1:200 (m/v), para a FSAB e

ESAB. Após 30 min de incubação a temperatura ambiente, os extratos foram finalmente

levados para centrifugação a 2100 x g e os sobrenadantes foram recolhidos.

3.3.3. Experimentos de FSAB, ESAB e EPN

A partir dos extratos do resíduo de camu-camu, os passos para execução dos

experimentos de FSAB foram semelhantes aos descritos no Tópico 2.3.3. De modo a

maximizar o desempenho do processo, os efeitos de algumas variáveis da FSAB foram

investigados usando uma coluna com dimensões de 30,0 x 2,64 cm, a qual dispunha de placa

porosa de vidro sinterizado G4. A ordem de otimização das variáveis da FSAB seguiu a

modificação do tipo de solvente hidrofílico (álcoois e PEG 400), pH da fase fundo (3,0-7,0),

concentração de sulfato de amônio da fase fundo (350-500 g/L), vazão de ar (12,5-50



mL/min), tempo de flotação (1-120 min) e volume da fase orgânica (2,5-12,5 mL). Para

avaliar o desempenho do processo, a eficiência de separação (E%), o coeficiente de

distribuição (D) e o coeficiente de concentração (α) são calculados através das equações 2.3-

2.5. Nestes experimentos, as condições operacionais iniciais foram selecionadas com base em

PADILHA et al. (2017b). Além disso, o volume da fase fundo e o percentual de PEG na

camada de topo foram fixados em 100 mL e 80% (m/m), respectivamente; Ar comprimido foi

usado como gás passante e todos os experimentos FSAB foram realizados em duplicata a

temperatura ambiente (25 ± 2 oC).

Para confrontar com os resultados da FSAB, experimentos ESAB e EPN também

foram realizados. Na ESAB, tubos cônicos com 8 mL de extrato modificado de camu-camu,

já acrescido de 450 g/L de sulfato de amônio e pH 5,0, foram agitados vigorosamente em

vórtex com 2 mL de solução aquosa de PEG 400 a 80% (m/m). Em seguida, os tubos

contendo a mistura foram centrifugados a 2100 x g e as fases resultantes foram analisadas.

Por sua vez, o sistema aquoso micelar foi preparado em tubos de centrífuga a partir da mistura

de 80% extrato de camu-camu (m/m), 7% Triton X-114 (m/m) e água deionizada em um total

de 5 g. Os tubos foram agitados em vórtex, prontamente levados em banho termostático a 30

oC por 3 h e a fase diluída foi coletada para determinação da concentração de polifenóis.

Todos os resultados de particionamento de polifenóis passaram por testes de médias (teste de

Tukey), no software Statistica 7.0 (Statsoft/USA), usando o nível de confiança de 95% (p <

0,05).

3.3.4. Ampliação de escala da FSAB

De modo a avaliar o aumento de escala da técnica proposta, um aparato FSAB semi-

piloto foi confeccionado. Uma coluna de vidro de dimensões 60,0 x 8,00 cm foi acoplada a

um funil de Buchner com placa porosa G4 por meio de conectores de poliamida 6.6

(Technyl®). Com um volume útil de 2,5 L, o experimento de FSAB em escala maior foi

realizado com as condições ótimas da menor escala, usando a razão altura:diâmetro de 8.0

(critério de ampliação de escala).

3.3.5. Determinação da concentração de polifenóis totais

A quantificação de polifenóis nos experimentos EPN, ESAB e FSAB foi realizada

usando o método Folin-Ciocalteau, conforme mostrado em FUJITA et al. (2013). Alíquotas



de 0,5 mL da amostra foram reagidas com 2,5 mL do reagente Folin (0,2 M) a 50 oC durante 5

min, em seguida a mistura foi acrescida de 2,0 mL da solução de carbonato de sódio a 75 g/L.

Os tubos foram deixados em repouso por 20 min a 25 oC e suas absorbâncias foram medidas

em espectrofotômetro (ThermoSpectronic Genesys 10 UV/Vis) a 760 nm. Amostras foram

coletadas das fases de topo e de fundo na ESAB e FSAB, enquanto que na EPN a

concentração de polifenóis foi determinada apenas para a fase diluída. Nessa última técnica, a

concentração da fase topo foi estimada através de um balanço de massa, uma vez que a

presença do Triton X-114 poderia interferir na leitura (RAYCHAUDHURI &

CHATTERJEE, 1985). Ácido gálico foi usado nas curvas de calibração e os efeitos do sal,

PEG e pH sobre os métodos foram considerados no cálculo da concentração do produto.

3.3.6. Determinação da atividade antioxidante

A atividade antioxidante é frequentemente usada como um indicativo da degeneração

dos componentes fenólicos durante um método de extração (BOI et al., 2017). A captura do

radical DPPH foi determinada de acordo com DO et al. (2014) usando misturas metanólicas

de PEG e sulfato de amônio como controle da fase de topo e fundo, respectivamente. Os

resultados foram expressos como concentração de equivalentes a Trolox (μmol TE/g do

material seco).

3.3.7. Análise de polifenóis por CLAE

Os polifenóis presentes no extrato e da fase diluída foram identificados em um sistema

de cromatografia líquida de alta-eficiência (CLAE) modelo Accela (ThermoFisher Scientific,

USA). Este equipamento é provido de detector por arranjo de diodo (operado em 278 nm) e

coluna Shimadzu Shim-pack C18 (Thermo Scientific, USA) de dimensões 250 x 4,6 mm. Sob

vazão de 1000 μL/min e temperatura de 30 oC, a eluição das amostras foi inspirada em KIM

et al. (2013), através da mistura de 1% ácido acético (v/v) (A) e acetonitrila (B) nas seguintes

proporções: 100% A como condição inicial, 70% A e 30% B até 10 min, 30% A e 70% B até

15 min, 100% B até 25 min. Por fim, a eluição foi mantida sob a máxima dosagem de

acetonitrila por mais 5 min. As amostras analisadas foram previamente filtradas com

membrana 0,22 µm e seus resultados foram obtidos após três replicatas.



3.4. Resultados e discussões

3.4.1. Recuperação de polifenóis por FSAB

3.4.1.1. Efeito do tipo de solvente

A escolha dos componentes formadores de fases é o primeiro passo no

desenvolvimento de um processo FSAB, uma vez que afeta fortemente a solubilidade do

sublado no topo bem como a tensão interfacial entre as fases (OLIVEIRA et al., 2012; SHOW

et al., 2013). Neste estudo, diferentes soluções aquosas de álcoois e PEG 400 foram usadas

como fase de topo e seus respectivos desempenhos foram expressos em termos de E%, a e D,

como mostrado na Figura 3.2. Algumas tentativas foram realizadas com PEG’s de massa

molecular maiores, porém a formação excessiva de espuma foi decisiva para declinar desses

polímeros.

Figura 3.2 Desempenho da FSAB com diferentes solventes orgânicos. As condições experimentais usadas foram:

pH = 3,8 (sem ajuste do pH); [(NH4)2SO4] = 450 g/L, vazão de ar = 37,5 mL/min; tf = 30 min; razão volumétrica

= 0,1. As letras minúsculas a, b e c foram usadas para comparação de respostas; respostas com a mesma letra

indicam que não há diferença entre elas a 95% de confiança.




Na Figura 3.2, observa-se que os valores das três respostas no experimento com PEG

400 foram bem superiores em relação aos valores encontrados nos demais experimentos.

Enquanto que nos experimentos com n-propanol o valor obtido de E% foi apenas 7,33%, o

uso do PEG 400 permitiu que tal resposta alcançasse um valor oito vezes maior. Este

comportamento pode ser explicado pela grande disponibilidade de grupos éter na estrutura do

polímero, o que confere maior capacidade de dissolução de sublados polares na fase topo (BI

et al. 2009, 2010; PADILHA et al., 2017b). Além disso, não foi possível estabelecer

correlações entre o aumento da cadeia carbônica dos álcoois e quaisquer respostas da FSAB.

Portanto, a solução polimérica de PEG 400 a 80% (m/m) foi usada nos experimentos

seguintes.

3.4.1.2. Efeito do pH da fase fundo

Estudos anteriores reportaram o impacto do estado ionizável de componentes fenólicos

sobre sua solubilidade e estabilidade em meios aquosos. CLÁUDIO et al. (2012) e REIS et al.

(2015) sugeriram que a partição do ácido gálico para a fase orgânica reduz com a elevação do

pH devido ao aumento da interação eletrostática do componente fenólico com sais durante

extração em duas fases aquosas. FRIEDMAN & JÜRGENS (2000) relataram que algumas

espécies de componentes fenólicos são facilmente degradadas quando expostas a valores de

pH superiores a 7,0.

Desta forma, experimentos foram realizados para investigar o efeito do pH da fase

fundo, na faixa de 3,0 a 7,0, pela adição de HCl e NaOH. Entretanto, como pode ser

observado pela Figura 3.3, a eficiência de separação, o coeficiente de concentração e o

coeficiente de distribuição não se comportam exatamente conforme explicado acima. O

experimento sem ajuste de pH (pH = 3,8) bem como os outros experimentos da faixa de 3,0-

4,5 alcançaram aproximadamente os valores iguais a 60%, 4,3 e 10 para eficiência de

separação, coeficiente de concentração e coeficiente de distribuição, respectivamente. A partir

desse limite, a adição de NaOH possibilitou o aumento abrupto do desempenho da FSAB,

principalmente sobre os valores de E% e D.



Figura 3.3 Efeito do pH da fase rica em sal sobre a FSAB. As condições experimentais usadas foram:% PEG

(m/m) = 80,0; [(NH4)2SO4] = 450 g/L, vazão de ar = 37,5 mL/min; tf = 30 min; razão volumétrica = 0,1. As

letras minúsculas a, b, c, d e e foram usadas para comparação de respostas; respostas com a mesma letra indicam

que não há diferença entre elas a 95% de confiança.


Esse comportamento inesperado pode ser atribuído à complexidade do extrato de

camu-camu, uma vez que cada componente fenólico dispõe de diferentes grupos orgânicos

com diferentes valores de pKa. Por sua vez, CHANG et al. (2014) afirmam que em ambientes

alcalinos a fase rica em PEG adquire maior efeito emulsificante e, portanto, aumenta a

recuperação do sublado. Particularmente, nos experimentos com pH 5,0, foi possível alcançar

elevados valores de E% (76,26 ± 0,73) e α (5,33 ± 0,23) bem como o maior valor de D (22,55

± 0,18; p < 0,05), logo essa condição foi escolhida para as etapas seguintes.

3.4.1.3. Efeito da concentração sulfato de amônio na fase fundo

A baixa razão volumétrica é uma das características marcantes da sublação com

solvente, o que permite alcançar altos índices de coeficiente concentração do produto na fase

de topo. Especialmente em sistemas PEG/sal, a concentração salina determina a

incompatibilidade das fases e, consequentemente, pode evitar a turbulência na interface



(PADILHA et al., 2017c). Assim, para que o processo proposto pudesse operar com apenas

10,0 mL de fase orgânica, elevadas dosagens de sulfato de amônio foram requeridas (350-500

g/L) e seus resultados são mostrados na Figura 3.4.

Figura 3.4 Efeito da concentração de sulfato de amônio na fase rica em sal sobre a FSAB. As condições

experimentais usadas foram:% PEG (m/m) = 80,0; pH = 5,0, vazão de ar = 37,5 mL/min; tf = 30 min; razão

volumétrica = 0,1. As letras minúsculas a, b e c foram usadas para comparação de respostas; respostas com a

mesma letra indicam que não há diferença entre elas a 95% de confiança.


Como esperado, o efeito de salting-out possibilitou maiores valores de E%, α e D nos

experimentos com concentrações do sal mais elevadas. À exceção dos valores de E%, o

acréscimo de sal a partir da concentração de 425 g/L possibilitou outro aumento repentino do

desempenho da FSAB. Em termos de coeficiente de concentração, o crescimento foi de 3,37

para 5,33; enquanto que para o coeficiente de distribuição, o aumento do conteúdo salino

provocou o crescimento de 12,05 para 22,55. Uma vez que os experimentos realizados na

faixa 450-500 g/L obtiveram respostas similares (p > 0,05), optou-se por manter a condição

com menor concentração salina (450 g/L).



3.4.1.4. Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação

Em contrapartida às variáveis avaliadas anteriormente, a vazão de gás passante atua

basicamente no mecanismo de transferência de massa. Tal condição afeta a área interfacial

gás-líquido por unidade de volume e tempo, ou seja, acelera a migração do sublado da fase

fundo para fase topo (LIN et al., 2015). Entretanto, autores sugerem que a vazão de gás em

níveis mais elevados provoca a mistura das fases, o que descaracteriza a FSAB. Logo, para

investigar o efeito da vazão sobre a técnica proposta, os valores de eficiência de separação

foram determinados sob diferentes vazões de ar (12,5-50,0 mL/min) durante 120 min.

Obviamente, o tempo de flotação favoreceu a maior recuperação dos componentes fenólicos,

embora a migração do sublado tenha ocorrido principalmente nos primeiros instantes do

processo conforme a Figura 3.5.

Por exemplo, na condição de 12,5 mL/min, o valor de E% alcançou 69,67 já no

primeiro minuto e alcançou apenas o valor de 80,75 a 120 min. Por sua vez, nos experimentos

com maiores vazões de ar foram obtidos elevados valores médios de E%, porém na análise

estatística não foram observadas diferenças significativas de desempenho ao longo da

cinética. De modo a combinar desempenho de recuperação e produtividade, a vazão de ar

igual a 37,5 mL/min e o tempo de flotação de 60 min foram escolhidos.



Figura 3.5 Efeito da vazão de ar e do tempo de flotação sobre a FSAB. As condições experimentais usadas

foram:% PEG (m/m) = 80,0; pH = 5,0, [(NH4)2SO4] = 450 g/L; razão volumétrica = 0,1. As letras maiúsculas A

e B foram usadas para comparação de E% para as diferentes vazões de ar para o mesmo tempo de flotação. As

letras minúsculas a, b, c e d foram usadas para comparação de E% de diferentes tempos de flotação em uma

mesma vazão de ar; respostas com a mesma letra indicam que não há diferença entre elas a 95% de confiança.


3.4.1.5. Efeito da razão volumétrica

Por fim, os impactos de mudanças na razão volumétrica sobre o desempenho da FSAB

foram investigados e os resultados, expressos em termos de E%, α e D, são mostrados na

Figura 3.6. A elevada concentração salina definida anteriormente (450 g/L) permitiu a

execução do processo em baixa razões volumétricas, como por exemplo 0,025. Em tal

condição, apenas 2,5 mL da solução de PEG foram depositadas sobre 100 mL da fase fundo.

Os valores de α reduziram com a elevação da razão volumétrica, provavelmente devido ao

efeito da diluição, todavia as outras duas respostas seguem comportamentos diferentes.

Diferentemente do que foi relatado nos trabalhos de SEBBA (1962) e CABALLERO et al.



(1990), no presente estudo os valores de E% foram afetados pela razão volumétrica, ainda que

o limite de saturação na camada de topo estivesse distante. Enquanto que na razão

volumétrica de 0,025 foi alcançado E% no valor de 63,17 ± 1,22, na razão volumétrica de 0,1

foi obtido o valor máximo de eficiência de separação (82,37 ± 0,81). Além disso, observou-se

que o coeficiente de distribuição sofreu menor efeito da diluição e, portanto, não reduziu com

o aumento da razão volumétrica. Um comportamento anômalo foi observado no experimento

com razão volumétrica de 0,125, uma vez que não foi possível conseguir um valor elevado de

E%. Usando como critério de escolha a eficiência de separação, a razão volumétrica de 0,1

superou as demais condições operacionais e também forneceu alto coeficiente de distribuição

(27,56 ± 1,33), o qual não possui diferença estatística do valor obtido no experimento com

menor dosagem de PEG (p = 0,16).

Figura 3.6 Efeito da razão volumétrica sobre a FSAB. As condições experimentais usadas foram:% PEG (m/m)

= 80,0; pH = 5,0, vazão de ar = 37,5 mL/min; tf = 60 min; razão volumétrica = 0,1. As letras minúsculas a, b e c

foram usadas para comparação de respostas; respostas com a mesma letra indicam que não há diferença entre

elas a 95% de confiança.




3.4.2. Experimentos comparativos e aumento de escala

Nesta seção, as técnicas FSAB (menor escala), ESAB e EPN foram aplicadas para a

recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu e o comparativo dos

resultados foi expresso na Tabela 3.1. Ainda que sob condições ótimas, a FSAB obteve

valores de E% inferiores a ESAB e EPN, nessa última técnica foi alcançada a maior eficiência

de separação. A extração com soluções aquosas de Triton X-114 é um método tradicional de

tratamento de componentes fenólicos a partir de resíduos agroindustriais. Em nossos

experimentos, foi registrada uma forte interação entre os polifenóis do resíduo de camu-camu

e as micelas do surfactante, mesmo em ambientes com pH superior a 10,0 (dados não

mostrados). Por outro lado, devido à diminuta razão volumétrica adotada na FSAB, seu valor

de α foi duas vezes maior que a ESAB e quatro vezes maior que a EPN. Em termos do

coeficiente de distribuição, a FSAB (27,56 ± 1,32) foi levemente superior a ESAB (23,06 ±

1,43) e três vezes maior que a EPN (8,92 ± 0,08).

Baseado no sucesso do aumento de escala da FSAB na recuperação de lipases (Show

et al., 2013; Mathiazakan et al., 2016), o protótipo semi-piloto da coluna FSAB foi usado para

separação e concentração dos polifenóis do resíduo de camu-camu. As respostas mostradas na

Tabela 3.1 foram similares àquelas obtidas pela escala menor, principalmente em termos de

E%. Quanto aos índices ligados à concentração do sublado na fase topo, notou-se um leve

declínio nos valores médios de α e D de 5,21 e 27,56 para 4,32 e 22,64, respectivamente. O

bom desempenho da escala maior também é confirmado pela mudança de coloração das fases

após o processo FSAB, conforme a Figura 3.7. Comparado a outras técnicas de separação, a

aplicação da FSAB mostrou vantagens como simples operação, baixo custo, fácil aumento de

escala e alto poder de concentração das moléculas-alvo.

Tabela 3.1. Comparação de desempenho entre os métodos de separação na recuperação de

polifenóis do resíduo de camu-camu

Técnicas de separação E% α D

Extração por ponto de nuvem 95,75 ± 0,22a

1,25 ± 0,02d

8,92 ± 0,08c

Extração em sistema aquoso

bifásico 90,52 ± 0,16

b 2,18 ± 0,16

c 23,06 ± 1,43

b

Flotação em sistema aquoso

bifásico (menor escala) 81,02 ± 1,12

c 5,21 ± 0,06

a 27,56 ± 1,32

a

Flotação em sistema aquoso

bifásico (maior escala) 80,91 ± 0,49

c 4,32 ± 0,02

b 22,64 ± 0,08

b



3.4.3. Cromatogramas de CLAE

A otimização do processo de flotação possibilitou a elevada concentração de

polifenóis na fase rica em PEG (≈ 350 μg GAE/mL), portanto a análise de CLAE foi usada

para detectar os compostos no produto da FSAB. O perfil cromatográfico apresentado na

Figura 3.8 revela a presença de diversas espécies de polifenóis na fase rica em PEG. Não foi

possível determinar quais eram os compostos principais do produto, cujos tempos de retenção

foram 6,79 e 7,71 min. Contudo, pela comparação de tempos de retenção, foram identificados

alguns compostos minoritários como o ácido gálico (t = 6,09 min), (+)-catequina (t = 9,67

min), ácido vanílico (t = 10,73 min), ácido siríngico (t = 10,87 min), ácido elágico (t = 12,57

min) e quercetina (t = 15,44 min). Considerando o conteúdo de polifenóis na camada de topo

pela massa de resíduo usada no extrato, a produtividade estimada de ácido gálico, catequina,

ácido vanílico, ácido siríngico, ácido elágico e quercetina seria 93,21, 40,93, 7,48, 56,31,

10,79 e 26,23 mg/100 g do material seco conforme mostrado na Tabela 3.2.

Tabela 3.2. Valores médios de concentração de componentes fenólicos (definidos em mg/100

g do material seco) e poder antioxidante (μmol TE/g do material seco) no resíduo de camu-

camu e no produto da FSAB.

Referências

(+)

Catequina

Ácido

elágico

Ácido

gálico

Quercetina

Ácido

siríngico

Ácido

vanílico

Atividade

antioxidante

AZEVÊDO et

al. (2014)

1,6 9,6 - 0.4 4,1 - 32,40

Presente

trabalho

40,93 10,79 93,21 26,23 56,31 7,48 70,33




Figura 3.7 Aparato experimental em escala piloto antes (A) e depois do processo (B).


Quando comparados com os resultados de AZÊVEDO et al. (2014) usando o extrato

aquoso do resíduo de camu-camu, verifica-se uma intensa concentração dos componentes

fenólicos citados durante a FSAB. Quanto ao poder antioxidante, a fase rica em PEG (70,33

μmol TE/g do material seco) possuiu maior atividade de eliminação do radical DPPH do que

o extrato aquoso original (32,40 μmol TE/g do material seco), embora esse aumento não tenha

acompanhado a diferença no teor de polifenóis das amostras.



Figura 3.8 Cromatograma de CLAE da fase rica em PEG da FSAB sob condições ótimas a

280 nm. Os picos 1, 2, 3, 4, 5 e 6 correspondem ao ácido gálico, (+) catequina, ácido vanílico,

ácido siríngico, ácido elágico e quercetina.

Fonte:

Próprio autor.

3.5. Conclusões

O presente trabalho mostrou o sucesso da extração por ponto de nuvem e da sublação

por solvente na recuperação e concentração de polifenóis do resíduo de camu-camu. Usando

polietilenoglicol e sulfato de amônio como compostos formadores de fases, as seguintes

condições operacionais da FSAB foram otimizadas via avaliação univariada: pH = 5,0,

[(NH4)2SO4] = 450 g/L, vazão de ar = 37,5 mL/min, tempo de flotação = 60 min e razão

volumétrica = 0,1. Em tais condições, foi obtido o desempenho máximo da FSAB em termos

de E% (81,02 ± 1,12) e a ampliação de escala de 110 mL para 2,5 L pouco afetou o valor

desta resposta. Em relação à ESAB e EPN, os processos de flotação, seja em pequena escala

ou escala semi-piloto, obtiveram coeficientes de concentração duas vezes superior. Observou-

se também que uma parcela do sublado que migrou para a fase rica em PEG é composta de



polifenóis com elevado poder antioxidante como ácido gálico, ácido siríngico, (+)-catequina e

quercetina. A FSAB é uma alternativa eficiente às outras técnicas de downstream processing

para recuperar e concentrar compostos fenólicos bioativos de extratos naturais.

CAPÍTULO 4

RECUPERAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DO

2-HIDROXIBIFENIL A PARTIR DE CALDO

FERMENTADO POR FLOTAÇÃO EM

DUAS FASES AQUOSAS

Recuperação e concentração de 2-hidroxibifenil a partir de caldo fermentado... 86


4. Recuperação e concentração do 2-hidroxibifenil a

partir de caldo fermentado por flotação em duas

fases aquosas

Aqui, a flotação em sistema de duas fases aquosas foi aplicada à recuperação e

concentração de um biocida, obtido a partir da biodessulfurização do dibenzotiófeno,

realizada por meio de uma metodologia multivariada usando uma solução modelo. Além

disso, a FSAB foi comparada com outras técnicas de separação como a extração líquido-

líquido, extração em sistemas bifásicos aquosos e sublação por solvente. Por fim, sob

condições ótimas, a flotação foi executada com caldo de fermentado como alimentação. Esses

resultados foram organizados na forma do artigo entitulado “Recovery and concentration of

ortho-phenylphenol from biodesulfurization of 4-methyl dibenzothiophene by aqueous two-

phase flotation”, o qual foi publicado no periódico Separation and Purification Technology.


4.1.1. Biodessulfurização e 2-hidróxibifenil

A queima de combustíveis com alto teor de enxofre tem sido considerada como a

principal causa dos eventos de poluição do ar devido às emissões de óxidos de enxofre e ácido

sulfídrico (NAKAYAMA et al., 2002; YU & WANG, 2013). O percentual mássico de

enxofre em óleos crus varia de 0,03 a 7,39% e ele é amplamente classificado como inorgânico

e orgânico (MEHRAN et al., 2007; JAVADLI & DE KLERK, 2012). O enxofre inorgânico

ocorre majoritariamente como pirita, enquanto que o enxofre orgânico é encontrado na forma

de tióis, tiofenos e sulfetos (SHEN et al., 2012). Com o objetivo de remover o enxofre dos

componentes organosulfurados, as indústrias petrolíferas comumente recorrem à

hidrodessulfurização (HDS). Esse método de dessulfurização é baseado na redução do

enxofre em ácido sulfídrico a partir de condições drásticas de temperatura e pressão (LI et al.,

2003). Contudo, em um cenário de leis ambientais mais restritivas, a HDS mostra-se pouco

efetiva sobre os tiofenos como o dibenzotiofeno (DBT) (FURUYA et al., 2003). Uma



estratégia para superar este gargalo é a associação da HDS com a dessulfurização microbiana

(VAN HAMME et al., 2003). Algumas cepas bacterianas como Rhodococcus sp. (DEL

OLMO et al., 2005; DERIKVAND & ETEMADIFAR, 2014; DINAMARCA et al., 2014),

Mycobacterium sp. (LI et al., 2003; FURUYA et al., 2003) and Pseudomonas sp.

recombinantes (GALLARDO et al., 1997; GUOBIN et al., 2005; MARTÍNEZ et al., 2015)

são capazes de consumir o DBT e seus derivados, convertendo-os em 2-hidroxibifenil (2-

HBF). Esta reação é obtida a partir da rota metabólica 4S, que compreende na atuação de um

sistema multienzimático, formado por monooxigenases e desulfinases, sobre a estrutura de

componentes tiofênicos (MOHAMED et al., 2015), como foi ilustrado na Figura 4.1.

Figura 4.1. Ilustração simplificada da rota metabólica 4S para biodessulfurização do DBT.


O 2-HBF é um popular biocida que extermina bactéria, fungos e leveduras, usado

principalmente como defensivo agrícola em lavouras de frutas cítricas e desinfetante em

hospitais e indústrias (GARCÍA et al., 2014). Embora o 2-HBF não exiba elevada toxicidade

em animais (BOMHARD et al., 2002), alguns estudos mostraram a formação de lesões no



DNA de células V79 (HENSCHKE et al., 2000) bem como a maior incidência de câncer de

bexiga em ratos machos quando expostos ao composto (HIRAGA & FUJII, 1984; APPEL,

2000). Isto é um motivo de preocupação, uma vez que baixas concentrações de 2-HBF podem

ser encontradas persistentemente em produtos agrícolas (NAKAZATO et al., 1995; SAAD et

al., 2004; KOLBE & ANDERSSON, 2006) e cerveja (COELHAN et al., 2006). Neste

sentido, a detecção de elementos traços por técnicas analíticas como cromatografia líquida de

alta eficiência (CLAE), espectrometria de massa, cromatografia gasosa (CG) acoplada com

espectrometria de massa (EM) requer procedimentos de enriquecimento de amostras

(GÖKMEN et al., 2009).

4.1.2. Técnicas de enriquecimento para amostras orgânicas

A determinação da concentração de compostos orgânicos nem sempre é uma tarefa

simples e inúmeras complicações podem ocorrer; de modo que o uso de pré-tratamentos de

amostras eficientes pode ser a chave para o sucesso de análises (QUEIROZ et al., 2001;

HYÖTYLÄINEN, 2007; CALDAS et al., 2011). Particularmente para vegetais e águas, onde

as concentrações de pesticidas são baixas (da ordem de pg.L-1

a μg.L-1

), a amostragem

adequada e as técnicas de enriquecimento de amostras são necessárias para que a substância

esteja na faixa de sensibilidade do instrumento analítico proposto (DEMEESTERE et al.,

2007). Quanto à determinação de drogas no plasma humano; além da concentração ínfima

(0,1-10 ng.mL-1

), problemas extras podem surgir como a adsorção do analito por proteínas

e/ou o volume limitado de amostra (PRABU & SURIYAPRAKASH, 2012). A

implementação dessas técnicas também é importante para a eliminação ou, ao menos, para a

redução dos efeitos de matriz sobre as análises. O efeito de matriz é definido como a alteração

direta e indireta ou interferência na resposta devido à presença de analitos indesejáveis na

amostra, o qual se aplica a diferentes análises (TAHBOUD, 2014). MENEZES et al. (2013)

reportaram a flutuações na determinação de concentrações de hemoglobina glicada por CLAE

devido a presença das variantes hemoglobina C e hemoglobina S. Os autores salientaram a

deficiência da metodologia analítica, uma vez que ela pode levar à interpretações equivocadas

do índice glicêmico de pacientes. TANG et al. (2013) observaram a co-eluição de metabólitos

interferentes na determinação de naftaleno hidroxilado em amostras de urina por CLAE-

EM/EM. Esse efeito é dependente das propriedades físico-químicas do analito de interesse

bem como das características dos componentes endógenos da matriz; por exemplo, tamanho



de moléculas, polaridade, estabilidade térmica, pressão de vapor, entre outros (PINHO et al,

2010). Em algumas situações, a escolha inapropriada das técnicas de preparação pode levar

intensificação da interferência devido à elevação da concentração dos interferentes juntamente

com o analito de interesse. Segundo HLADIK & MCWAYNE (2012), a presença persistente

de ácido húmico e/ou ácido fúlvico em amostras de água pode comprometer a análise de

inseticidas por CG. Tratando-se de determinações realizadas em CLAE, CG ou eletroforese

capilar (EC), os métodos de preparação asseguram a leitura correta das moléculas de interesse

bem como garante uma maior longevidade das colunas analíticas ou dos capilares (JARDIM,

2010).

Tradicionalmente, a preparação de amostras para análises é baseada na extração

líquido-líquido (ELL) e na extração sólido-líquido (ESL). A ELL, como já mencionado no

tópico 2.1.3, envolve a partição do analito entre as duas fases, sendo limitada apenas pela

solubilidade do soluto. Já a ESL é fundamentada no fenômeno de adsorção e dessorção do

analito em uma fase sólida. O procedimento geral dessa técnica compreende no contato dos

analitos com o adsorvente, lavagem dos componentes indesejáveis e fracionamento de

componentes-alvo por ação de um eluente (PADILHA et al., 2016a; PADILHA et al., 2016b;

PADILHA et al., 2017e).

Diferentemente da ELL, durante o tratamento da amostra na ESL a purificação parcial

pode ser realizada na carga e/ou na eluição (FERENC & BIZIUK, 2006). Os mecanismos de

retenção são variados (por exemplo, força de Van der Waals, força dipolo-dipolo, ligação de

hidrogênio, etc.) e cada adsorvente oferece uma combinação peculiar dessas propriedades,

possibilitando ao analista uma gama de opções para solucionar seu problema específico. No

entanto, VAS & VÉKEY (2004) e KONING et al. (2009) apontaram que as técnicas

tradicionais são bastante onerosas e consomem um tempo elevado bem como expuseram

algumas limitações quanto ao desempenho delas. Em uma situação ideal, o solvente usado na

ELL deve apresentar seletividade suficiente para eliminar potenciais substâncias interferentes

da amostra (RAIKOS et al., 2009). Entretanto, em um caso real, apenas uma parcela desses

interferentes é efetivamente removida em uma única etapa, necessitando de múltiplos passos

até a obtenção de um preparado ótimo. Obviamente, um número razoável de extrações

sucessivas também introduz contaminações e erros ao procedimento bem como acarreta na

perda de analito.



Na ESL é frequente a ocorrência de problemas ligados ao leito adsorvente como

coagulação, colmatação e canalização, o que pode refletir negativamente sobre o rendimento.

Embora o volume de solventes orgânicos usada na ESL seja bastante reduzido se comparado à

ELL, essa quantidade ainda é significante e pode causar complicações no seu descarte (VAS

& VÉKEY, 2004). Soma-se ainda o fato de que traços do solvente da ELL e do eluente da

ESL podem permanecer no preparado, a menos que etapas adicionais sejam realizadas

(DUROVIĆ et al., 2012). Nesse contexto, pesquisas recentes tem reportado a necessidade da

substituição das técnicas tradicionais por outras mais vantajosas.

A sublação por solvente (SS), uma classe de técnicas baseadas na adsorção por bolhas,

possui como um dos seus maiores trunfos sobre as técnicas extrativas a possibilidade de

alcançar fatores de enriquecimento superiores a 100:1. Embora isto não tenha sido

aprofundado no capítulo anterior, tal aspecto da SS a assegura como eficiente método de pré-

tratamento e enriquecimento de amostras para cromatografia líquida de alta eficiência e

cromatografia gasosa, principalmente para análises de pesticidas (BI et al., 2010a). LU &

HUANG (1992) propuseram a remoção de dois pesticidas organofosforados da água por meio

de três técnicas de separação por bolhas: stripping, sublação por solvente e flotação com

adsorção coloidal. A partir da leitura via CG, foi observado que a remoção de forato foi

superior a 97%; enquanto que nos experimentos com diclorvós, a SS conseguir eliminar

pouco mais de 50% do pesticida presente na fase de fundo. XI & DONG (2007) determinaram

a concentração de dimetoato, paratião metílico, malatião e clorpirifós (também pesticidas

organofosforados) em vegetais através da SS. Sob as condições ótimas, os valores de

recuperação variaram de 81,3 a 98,9% e o desvio padrão relativo (DPR) na análise de CC

oscilou de 0,46 a 4,83%. Por sua vez, DONG et al. (2008) usaram a SS para determinar a

concentração de pesticidas piretróides em vegetais. Assim como os trabalhos anteriores, os

valores de recuperação foram superiores a 85% para a fempropatina, deltametrina e bifentrina

em amostras reais. Para esse último pesticida, observou-se uma ligeira perturbação em seus

valores de recuperação, uma vez que esses ultrapassaram 100% nos preparados de alface e

repolho. Por fim, foram alcançados os valores de sensibilidade de 4,2 μg/kg para a

fempropatina, 2,4 μg/kg para a deltametrina e 1,4 μg/kg para a bifentrina, com DPR máximo

de 6,19% na análise por CLAE com SS acoplada.

Nos últimos anos, outras modalidades da SS também tem sido usadas como

ferramentas de enriquecimento de amostras para análises, especialmente a flotação em



sistema de aquoso bifásico (FSAB). Com um sistema formado por n-propanol/sulfato de

amônio, GE et al. (2011) avaliaram o potencial da FSAB na determinação da concentração do

antibiótico tilmicosina em amostras de água coletadas em Zhenjiang, na China. Os valores de

eficiência de separação e fator de enriquecimento da FSAB quando alimentada com uma

solução modelo de tilmicosina foram 84,7% e 16,8, respectivamente. Ainda que nenhum

resíduo de tilmicosina tenha sido encontrado em amostras de águas da área agrícola, a técnica

mostrou sucesso na recuperação do antibiótico quando esse foi prontamente adicionado às

amostras. Em HAN et al. (2014), a FSAB foi usada como etapa preliminar na determinação

da concentração do cloranfenicol em alimentos. Quando comparada com outros métodos de

preparação (ESAB, microextração líquido-líquido dispersiva e dispersão da matriz em fase

sólida), a FSAB possibilitou menores índices nos limites de detecção e quantificação do

antibiótico pela CLAE. Assim como o trabalho citado anteriormente, nenhum traço do

cloranfenicol foi detectado nas amostras de carne, leite integral e leite em pó; embora a

técnica tenha mostrado resultados de eficiência de separação de praticamente 100% quando o

antibiótico foi adicionado de maneira proposital. Nesta mesma linha de detecção de

antibióticos em alimentos, LU et al. (2016) estudaram a aplicação da FSAB na recuperação de

ciprofloxacina e lomefloxacina usando o polímero Etileno óxido-propileno óxido (EOPO)

como solvente da fase topo. Nos experimentos com solução modelo, o processo de flotação

conseguiu recuperar mais do que 95% de ambos os antibióticos, em pouco mais de 20 min de

execução. No tratamento de amostras de ovo, leite e carne de porco, observou-se que o

desempenho da FSAB se manteve no mesmo patamar (91,4-99,1%), apresentando baixos

índices de DPR (0,3-0,7%). Apesar deste enfoque em análises de antibióticos, não

observamos na literatura nenhum estudo usando a FSAB como método de preparação de

amostras de pesticidas. Assim, o presente capítulo propõe a otimização multivariada das

condições operacionais da FSAB na recuperação e concentração do 2-HBF bem como sua

aplicação em um meio complexo contendo o pesticida.



4.2. Objetivos

Recuperar e concentrar 2-hidroxibifenil do caldo de fermentação de Rhodococcus

rhodochrous através da FSAB.


Realizar a triagem das variáveis mais significativas ao processo de flotação por meio

de um planejamento fatorial de meia fração;

Avaliar os efeitos da vazão de ar, tempo de flotação e volume inicial da fase rica em

PEG (os fatores de maior impacto do planejamento anterior) no desempenho da FSAB

a partir de uma solução modelo de 2-hidroxibifenil;

Empregar o caldo de fermentação de Rhodococcus rhodochrous como fonte de 2-

hidroxibifenil para o processo de flotação e seu desempenho foi comparado com os

ensaios anteriores com solução modelo;

Observar a captura de 2-hidroxibifenil pela ação da flotação através de cromatogramas

de CLAE.



4.3. Materiais e Métodos

4.3.1. Reagentes e aparato experimental

Os reagentes 2-hidroxibifenil 99% e 4-metil dibenzotiófeno ≥96% foram obtidos pela

Sigma-Aldrich (Ohio, USA). Polietilenoglicol 400 (PEG 400), sulfato de amônio, triptona,

extrato de levedura, cloreto de sódio foram adquiridos pela Synth (Diadema, São

Paulo/Brazil). Água deionizada foi obtida a partir de um sistema MiliQ e foi usada nos

ensaios FSAB.

O aparato usado nos experimentos FSAB foi confeccionado a partir de uma coluna de

vidro de 2,64 cm de diâmetro interno e capacidade máxima de 180 mL. O fundo da coluna foi

equipado com um disco de vidro sinterizado (porosidade G4) para geração de bolhas com

tamanho uniforme. A vazão de ar foi medida usando um rotâmetro modelo RMA-1-SSV

(Dwyer, USA) acoplado ao compressor por meio do regulador.

4.3.2. Microrganismos e biodessulfurização

A cepa Rhodococcus rhodochrous (NRRL B - 2149) foi cedida pela National Center

for Agricultural Utilization Research (USA) e usada neste estudo. Para preparação do

inóculo, amostras de 1 mL do concentrado celular a 10% de glicerol (v/v) foram suspensas em

50 mL de meio Luria-Bertani (10 g/L triptona, 5 g/L de extrato de levedura e 10 g/L NaCl)

sob agitação de 120 rpm e 32 oC durante 24 h.

A produção do 2-hidroxibifenil foi realizada via dessulfurização usando o 4-MDBT

como fonte de carbono secundária. Como a solubilidade do 4-MDBT em água é baixa, foi

necessária a prévia dissolução de 100 mg do reagente em 10 mL de hexadecano para

finalmente ser homogeneizado com 990 mL da solução nutriente (20 g/L glicose, 4 g/L

NaH2PO4, 4 g/L K2HPO4, 2 g/L NH4Cl, 0,0245 g/L MgCl2, 0,001 g/L FeCl3, 0,001 g/L CaCl2,

8 mL glicerol). Alíquotas de 2.5 mL do inóculo foram transferidas para 47,5 mL do meio de

produção e incubados sob agitação de 120 rpm e 32 oC durante 72 h. A biomassa celular foi

removida por centrifugação e o sobrenadante acrescido de 0,05% de azida de sódio (m/v) foi

armazenado em freezer.



4.3.3. Estudo da FSAB por abordagem multivariada

A otimização das condições operacionais da FSAB na recuperação do 2-HBF foi

baseada nos métodos estatísticos multivariados. Primeiramente, com o objetivo de avaliar os

efeitos das variáveis independentes do processo a partir de um pequeno número de

experimentos, um planejamento fatorial de meia fração foi usado. A concentração de sulfato

de amônio, pH da fase aquosa, concentração inicial de 2-HBF, vazão de ar, tempo de flotação

e volume inicial da fase orgânica foram adotados como fatores e a eficiência de separação

(E%) como resposta. Na Tabela 4.1 são mostrados os valores reais e codificados das variáveis

independentes e o cálculo de E% foi realizado com a Equação 2.3.

Tabela 4.1 - Valores das variáveis FSAB e seus níveis no planejamento de meia fração

Variáveis Variável

codificada

Níveis codificadas

-1 0 +1

pH X1 4,0 5,0 6,0

[(NH4)2SO4] (g/L) X2 425,0 450,0 475,0

[2-HBF] (mg/L) X3 37,50 56,25 75,00

Vazão de ar (mL/min) X4 12,5 25,0 37,5

Tempo de flotação (min) X5 30 60 90

Volume inicial da fase rica

em PEG (mL) X6 5,0 7,5 10,0

Finalizada a etapa anterior, o comportamento da FSAB foi avaliado novamente através

de um planejamento Box-Behnken (BBD). O BBD é uma classe de planejamentos rotacionais

(ou quase rotacional) baseado em planejamentos de três níveis incompletos (FERREIRA et

al., 2007), que combina pontos centrais de uma variável com níveis inferior (-1) e superior

(+1) de outras variáveis. O número de experimentos (N) requeridos para o BBD completo é

representado na Eq. 3.1,

02 1N k k C (3.1)

onde k é o número de fatores e C0 é o número de repetições no ponto central. Assim, as três

variáveis mais relevantes do planejamento fatorial de meia fração foram selecionadas como

fatores, enquanto que as demais variáveis foram mantidas em níveis favoráveis ao



desempenho do processo. Também, assim como na primeira triagem, uma solução modelo foi

usada. Nesta etapa, além dos valores de E%, as respostas dos ensaios foram expressas em

termos do coeficiente de concentração (α) (Eq. 2.4) e razão de distribuição (D) (Eq. 2.5).

Obviamente, para efetuação dos cálculos de α e D foi necessário obter a concentração de 2-

HBF na fase rica em PEG (CPEG). Os procedimentos necessários para a execução de cada

experimento são similares àqueles descritos no Tópico 2.3.3 e as condições iniciais da Tabela

4.1 foram definidas com base no trabalho de PADILHA et al. (2017a). As análises dos

planejamentos experimentais, a análise de regressão bem como os gráficos de superfície de

resposta foram realizados usando STATISTICA 7.0 (Statsoft, USA).

4.3.4. Comparação entre as técnicas de separação

Neste estudo o sistema FSAB foi comparado com a ESAB, SS e ELL. Nos

experimentos FSAB e SS, 100 mL da solução salina contendo 2-HBF foram extraídos por

12,5 mL da solução PEG 400 e 12,5 mL da mistura de n-butanol e acetato de etila 1:1 (v/v),

respectivamente. Nestes experimentos, a vazão de ar foi fixada em 37,5 mL/min, enquanto

que o tempo de flotação foi de 120 min. Por sua vez, os experimentos ESAB e SS, 8,0 mL da

solução salina de 2-HBF foram adicionados em tubos de centífuga contendo 2,0 mL da

solução de PEG 400 e 2,0 mL da mistura de n-butanol e acetato de etila 1:1 (v/v),

respectivamente. Os tubos foram agitados em vórtex, centrifugados a 2100 x g e as fases

foram coletadas. Em todos os ensaios a concentração de sulfato de amônio foi 425 g/L, o pH

inicial da fase aquosa foi 4,0 e a concentração inicial de 2-HBF na fase aquosa foi 75 μg/mL.

Particularmente, o percentual de PEG na fase orgânica foi fixado em 80,0% (m/m) nos

ensaios FSAB e ESAB.

4.3.5. Determinação do 2-HBF e análise por CLAE

A quantificação de 2-HBF nos ensaios com soluções modelo foi realizada por leitura

direta por meio da espectroscopia UV (comprimento de onda igual a 252 nm). De modo a

reduzir os efeitos do pH, sal e PEG na análise, diluições foram preparadas com tampão fosfato

20 mM (pH 7,0) e as concentrações foram obtidas através de uma curva de calibração.

Nos ensaios FSAB com caldo fermentado obtido da dessulfurização, a concentração

de 2-HBF foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) modelo

Accela (Thermo Scientific, USA) provido de detector por arranjo de diodo (operado em 278



nm) e amostrador automático. Foi utilizada a coluna Hypersil GOLD RP-C18 com dimensões

de 50 x 2,1 mm (Thermo Scientific, USA), e uma solução contendo 50% de acetonitrila e

50% água deionizada como fase móvel, sob fluxo de 0,9 mL/min a 25 oC. Todas as amostras

foram filtradas com membrana 0,22 µm e analisadas em três replicatas. A seguir são

apresentados o cromatograma de CLAE a 75 μg/L de 2-HBF (Figura 4.2A) e sua curva de

calibração (Figura 4.2B) para determinar a concentração do biocida no caldo de fermentação.

Figura 4.2. Cromatogramas de CLAE 75 μg/L de 2-HBF (A) e curva de calibração (B).




4.4. Resultados e discussões

4.4.1. Triagem das variáveis FSAB

Em virtude do elevado número de fatores que afetam a FSAB, a identificação das

variáveis mais significativas é fundamental na busca pelo desempenho ótimo do processo de

separação. Desta forma, um planejamento fracionário 26-1

com adição de quatro repetições no

ponto central foi usado para a triagem das variáveis FSAB sobre os valores de eficiência de

separação (E%). Os fatores deste planejamento foram: pH da fase aquosa, concentração de

sulfato de amônio, concentração inicial de 2-HBF, vazão de ar, tempo de flotação e volume

inicial da fase PEG. Os limites superiores e inferiores das variáveis FSAB foram definidos de

acordo com estudos prévios da literatura (BI et al., 2009a; BI et al., 2010b; LI & DONG,

2010; PADILHA et al., 2017). Na Tabela 4.2 são mostrados os 36 ensaios do planejamento

meia fração com três níveis de cada variável independente e os correspondentes valores de

E%. Como pode ser observado, a combinação dos fatores afetou fortemente o desempenho do

processo, com valores de E% que compreendem de 27,48% (Ensaio 4) até 54,83% (Ensaio

29).

Considerando o nível de confiança de 95% (p < 0,05), as variáveis da FSAB que mais

impactaram os valores de E% foram: X5 (tempo de flotação), X4 (vazão de ar), X6 (volume

inicial da fase orgânica), X3 (concentração inicial de 2-HBF) e X1 (pH da fase aquosa), como

ilustrado na Figura 4.3. Neste diagrama de Pareto é observado que os efeitos dos quatro

primeiros fatores foram positivos, enquanto que o efeito do último fator foi negativo. Por

outro lado, o efeito da variável X2 (concentração de sulfato de amônio) não foi significativo

sobre o desempenho da FSAB usando o critério estatístico proposto. Algumas justificativas

para tais efeitos são reportadas na literatura, sendo detalhadas a seguir.

O uso mais prolongado da flotação assegura o contato entre o sublado e as bolhas

ascendentes, o que possibilitou alcançar maiores valores de E% (HAN et al., 2014). Também

favoráveis ao desempenho da FSAB são os aumentos na vazão de ar e no volume inicial da

fase orgânica, já que permitem respectivamente a intensificação da adsorção do sublado nas

bolhas e sua maior solvatação na camada topo (BI et al., 2009a; MA et al., 2010; LIN et al.,

2015). No que diz respeito à concentração inicial de sublado, LEMLICH (1968) sugeriu o uso

de soluções muito diluídas em técnicas de separação baseadas em adsorção em bolhas.



Tabela 4.2 - Matriz do planejamento fatorial fracionário 26-1

com o percentual de eficiência de

separação como resposta.

Ensaio

no. X1 X2 X3 X4 X5 X6 E%

1 (34) -1 -1 -1 -1 -1 -1 30,26

2 (21) 1 -1 -1 -1 -1 1 35,98

3 (33) -1 1 -1 -1 -1 1 39,91

4 (26) 1 1 -1 -1 -1 -1 27,48

5 (11) -1 -1 1 -1 -1 1 35,59

6 (36) 1 -1 1 -1 -1 -1 28,25

7 (35) -1 1 1 -1 -1 -1 36,40

8 (1) 1 1 1 -1 -1 1 38,27

9 (15) -1 -1 -1 1 -1 1 42,30

10 (10) 1 -1 -1 1 -1 -1 34,05

11 (20) -1 1 -1 1 -1 -1 38,73

12 (19) 1 1 -1 1 -1 1 40,49

13 (4) -1 -1 1 1 -1 -1 39,73

14 (9) 1 -1 1 1 -1 1 38,70

15 (18) -1 1 1 1 -1 1 44,98

16 (32) 1 1 1 1 -1 -1 36,70

17 (27) -1 -1 -1 -1 1 1 39,83

18 (8) 1 -1 -1 -1 1 -1 31,89

19 (12) -1 1 -1 -1 1 -1 40,94

20 (29) 1 1 -1 -1 1 1 40,35

21 (3) -1 -1 1 -1 1 -1 45,70

22 (16) 1 -1 1 -1 1 1 48,77

23 (30) -1 1 1 -1 1 1 43,73

24 (17) 1 1 1 -1 1 -1 39,87

25 (28) -1 -1 -1 1 1 -1 40,94

26 (7) 1 -1 -1 1 1 1 44,55

27 (25) -1 1 -1 1 1 1 45,12

28 (6) 1 1 -1 1 1 -1 42,09

29 (13) -1 -1 1 1 1 1 54,83

30 (24) 1 -1 1 1 1 -1 46,17

31 (5) -1 1 1 1 1 -1 48,39

32 (23) 1 1 1 1 1 1 47,87

33 (31) 0 0 0 0 0 0 40,99

34 (2) 0 0 0 0 0 0 42,92

35 (14) 0 0 0 0 0 0 41,36

36 (22) 0 0 0 0 0 0 40,62

Fonte: Próprio autor



No capítulo 2 foi reportado que o efeito da concentração de ácido gálico (sublado) não

obedeceu necessariamente às observações dos trabalhos anteriores. Neste estudo, os melhores

resultados de E% foram obtidos no maior nível de concentração de 2-HBF (75 mg/L).

O pH tem um papel fundamental no desempenho da FSAB, uma vez que atua na

solubilidade do sublado na fase aquosa (LU & ZHU, 2001; BI et al., 2010a; BI et al., 2013;

CHANG et al., 2014; CHANG et al., 2015). O 2-HBF é um componente de superfície ativa

que possui um grupamento hidroxila, o qual pode ser ionizável em ambientes álcalis,

tornando-o menos susceptível ao transporte para a fase orgânica. Por fim, a concentração de

sal na fase aquosa afeta a estabilidade do sublado devido ao efeito salting-out (MA et al.,

2010; ZHAO et al., 2011; BI et al., 2013). Contudo, na faixa de concentração de sulfato de

amônio usada neste trabalho (425-475 g/L), não foi possível observar qualquer influência do

sal sobre o processo.

Figura 4.3. Efeitos das variáveis FSAB no planejamento fatorial fracionário sobre o

percentual de eficiência de separação.




4.4.2. Planejamento Box-Behnken

Como resultado, outra investigação foi realizada usando as três variáveis mais

relevantes (vazão de ar, tempo de flotação e volume inicial da fase orgânica) a partir do

planejamento Box-Behnken. Nesta etapa, as variáveis antes codificadas por X4, X5 e X6 foram

chamadas de X1’, X2’ e X3’. Além disso, devido aos efeitos positivos provocados por estas

variáveis no planejamento de meia-fração, novos níveis de estudo foram definidos no BBD,

como pode ser observado na Tabela 4.3. As demais variáveis da FSAB foram fixadas também

com base no planejamento anterior. Assim, o pH da fase aquosa e a concentração inicial de

sublado foram mantidos em 4,0 e 75 mg/L, respectivamente. Por não apresentar efeito

significativo e visando reduzir o gasto excessivo com sal no processo, a concentração de

sulfato de amônio de 425 g/L foi usada nos experimentos seguintes.

Tabela 4.3 - Valores das variáveis FSAB e seus níveis no planejamento Box-Behnken

Variáveis Variáveis

codificadas

Níveis codificados

-1 0 +1

Vazão de ar (mL/min) X1’ 25,0 37,5 50,0

Tempo de flotação

(min) X2’ 60 90 120,0

Volume inicial da fase

rica PEG (mL) X3’ 7,5 10,0 12,5

Na Tabela 4.4 são mostrados os 15 ensaios do BBD com três níveis de cada variável

independente e suas correspondentes respostas. A análise de variância (ANOVA) foi realizada

na matriz BBD e expressões polinomiais de segundo grau foram geradas para descrever E%

(Eq. 5), α (Eq. 6) e D (Eq. 7), com base nas variáveis codificadas.

' '2 ' '2 '1 1 2 2 3% 0,556 0,08850,520 1,476 1,862 3,822E X X X X X

(5)

'2 ' ' ' ' ' '3 1 2 1 3 2 30,175 0,180 0,4591,491X X X X X X X

' '2 ' '2 '1 1 2 2 30,014,897 0,153 0,042 0,179 0,784X X X X X

(6)

'2 ' ' ' ' ' '3 1 2 1 3 2 30,002 0,037 0,0040,038X X X X X X X



' '2 ' '2 '1 1 2 2 30,0439,788 0,219 0,213 0,731 0,801D X X X X X

(7)

'2 ' ' ' ' ' '3 1 2 1 3 2 30,056 0,007 0,1060,413X X X X X X X

A ANOVA mostrou a significância estatística dos modelos de regressão a 95% de

confiança (p < 0,05), com valores de Fcal/Ftab iguais a 10,12 (for E%) e 8,03 (for D). No caso

de α, a probabilidade de erro é inferior a 0,01%, uma vez que o valor de Fcal foi 456,09.

Apesar disto, foi observado que a falta de ajuste não foi significativa em relação ao erro puro

apenas nos modelos de E% e α, enquanto que em D o valor de Fcal/Ftab foi superior a 1,0 (falta

de ajuste p = 0,048). Isto não confere ao modelo de D a característica preditiva, embora não

elimine sua importância, que também pode ser mostrada através dos coeficientes de

determinação (R2). Os valores de R

2, como medida de ajuste do modelo, indicaram que

98,8%, 99,1% e 98,5% das variâncias totais podem ser explicadas pelos modelos de regressão

de E%, α e D, respectivamente.

Tabela 4.4 - Matriz do planejamento Box-Behnken com três fatores. O pH da fase aquosa, a

concentração de sal e a concentração inicial de sublado foram fixados em 4,0, 425 g/L e 75

mg/L, respectivamente.

Run no. X1’ X2’ X3’ E% α D

1 (15) -1 -1 0 50,15 4,64 9,21

2 (6) 1 -1 0 49,75 4,97 9,90

3 (13) -1 1 0 53,53 4,96 10,55

4 (14) 1 1 0 52,43 5,30 11,01

5 (9) -1 0 -1 45,38 5,53 10,02

6 (12) 1 0 -1 43,55 5,88 10,31

7 (3) -1 0 1 53,41 4,02 8,53

8 (5) 1 0 1 52,30 4,22 8,85

9 (8) 0 -1 -1 46,24 5,38 9,89

10 (10) 0 1 -1 49,74 5,78 11,38

11 (11) 0 -1 1 52,22 3,84 7,95

12 (7) 0 1 1 57,55 4,23 9,86

13 (2) 0 0 0 54,60 4,92 10,72

14 (4) 0 0 0 54,83 4,90 10,71

15 (1) 0 0 0 54,35 4,90 10,62



Gráficos de superfície de resposta e de contorno (Fig. 4.4) foram construídos para

estudar as interações entre dois fatores e determinar os níveis ótimos para cada uma das

respostas. Em concordância com os valores de R2, observa-se que os dados experimentais

estão próximos das curvas de superfície para as três respostas. No que diz respeito aos efeitos

das variáveis independentes, é exibido na Fig. 4.4A que o aumento combinado do volume

inicial da fase PEG e do tempo de flotação contribui para maiores índices de E%. Na Fig.

4.4B é mostrado o comportamento de α como função do volume inicial de PEG e da vazão de

ar.

Figura 4.4. Superfície de respota e gráficos de contorno para eficiência de separação (A),

coeficiente de concentração (B) e razão de distribuição (C) de 2-HBF sob efeitos de duas

variáveis FSAB. A outra variável foi mantida no nível codificado igual a zero.




Assim como na seção anterior, a adição do solvente hidrofílico favoreceu a captura do

2-HBF, mas provocou a redução severa da concentração do sublado. Alternativamente, a

aplicação de vazões de ar baixas como 25 mL/min não favoreceu o aumento da concentração



de 2-HBF na camada topo. Além disso, não foram observadas diferenças nos valores de α

obtidos no nível superior (50 mL/min) e no ponto central (37,5 mL/min). Similarmente a α, os

valores de D decrescem com o aumento do volume inicial de PEG. O valor máximo de D

(11,38) é obtido no nível inferior do volume de PEG e no nível superior no tempo de flotação

como ilustrado na Fig. 4.4C. Usando como critério apenas os valores de E%, na etapa

seguinte foram mantidos a vazão de ar, tempo de flotação e volume inicial de PEG em 37,5

mL/min, 120 min e 12,5 mL, respectivamente (Ensaio 12 da Tabela 3.4).

4.4.3. Experimentos de comparação

Sob condições ótimas, a FSAB foi comparada com a ESAB, SS e ELL para

recuperação e concentração de 2-HBF a partir de uma solução modelo. Na Figura 4.5 é

mostrado que a eficiência de separação da FSAB (E% = 57,55 ± 0,65) foi sensivelmente

superior a ESAB (E% = 42,66 ± 2,37), ELL (E% = 33,69 ± 1,63) e SS (29,56 ± 1,27). Este é

um resultado surpreendente, uma vez que em trabalhos prévios com componentes fenólicos

(BI et al., 2009a; BI et al., 2010b; BI et al., 2013; PADILHA et al., 2017b) é mostrado que a

ESAB sempre supera a FSAB em termos de E%. Isto indica que a intensificação do processo

promovida pela adsorção nas bolhas é fundamental para o bom desempenho da FSAB na

recuperação do 2-HBF. Obviamente, a baixa razão volumétrica (vPEG/vw) usada na FSAB

possibilitou valores de coeficiente de concentração e distribuição (α = 4,23 ± 0,00; D = 9,86 ±

0,26) expressivamente maiores do que outras técnicas (ESAB: α = 1,60 ± 0,12; D = 2,88 ±

0,33; SS: α = 3,60 ± 0,15; D = 5,12 ± 0,31; ELL: α = 1,26 ± 0,06; D = 1,96 ± 0,12).

4.4.4. Recuperação e concentração de 2-HBF obtido da biodessulfurização do 4-

MDBT

De modo a avaliar a viabilidade da recuperação do 2-HBF pela FSAB envolvendo

uma solução complexa, um caldo de fermentação obtido da biodessulfurização do 4-MDBT

foi usado. A exceção da concentração inicial do sublado, as condições operacionais usadas

foram as mesmas definidas pela metodologia multivariada. Segundo a análise por CLAE, a

concentração de 2-HBF no caldo de fermentação foi de 87,29 mg/L.

Após a flotação, foram obtidos os valores de E%, α e D equivalentes a 49,62 ± 0,29,

3,39 ± 0,00 e 6,29 ± 0,01. Esta redução do desempenho da FSAB em relação aos



experimentos com solução modelo pode ser atribuída à maior polaridade dos contaminantes, o

que interferiu na transferência de massa do 2-HBF. Como pode ser observado na Figura 4.6,

dois picos são registrados nos cromatogramas de CLAE, sendo o primeiro e de maior

intensidade pertencente aos contaminantes e o último pico pertencente ao 2-HBF. Baseado

nas escalas de absorbância dos gráficos, conclui-se que uma grande quantidade de

contaminantes migrou para a fase topo juntamente com o sublado desejado (Figura 4.6C).

Atentamos-nos que na literatura ligada a essa técnica de separação, a aplicação da FSAB

formada por PEG/sulfato de amônio também permitiu a captura de contaminantes advindos

do extrato como em BI et al. (2010b) e CHANG et al. (2014). Apesar disto, não houve

alteração expressiva do tempo de residência do pesticida em relação ao padrão (Figura 4.2A)

bem como o DPR da análise por CLAE foi diminuto, no valor de 2,57%. Mesmo com a baixa

seletividade do sistema proposto, nós consideramos que a FSAB mostrou-se uma técnica em

potencial para recuperação e concentração de 2-HBF a partir de misturas reais.

Figura 4.5. Comparação de desempenho de diferentes métodos de separação. FSAB, vo/vw

=1:8; ESAB, vo/vw =1:4; SS, vo/vw =1:8; ELL, vo/vw =1:4. As letras minúsculas a, b, c e d são

usados para comparação de desempenho entre FSAB, ESAB, SS e ELL; valores com a

mesma letra não são significativamente diferentes entre si (p < 0,05).




Figura 4.6. Cromatogramas CLAE para o caldo de fermentação anterior ao processo de

flotação (A), fase rica em sal após a FSAB (B) e fase rica em PEG após a FSAB (C).


4.5. Conclusões

Neste trabalho o sistema PEG/sulfato de amônio foi usado no estudo da FSAB para

recuperação e concentração de 2-HBF. A partir da metodologia multivariada, as condições

ótimas da FSAB foram: pH da fase aquosa igual a 4,0, concentração de sulfato de amônio

igual a 425 g/L, concentração inicial de sublado igual a 75 mg/mL, vazão de ar igual a 37,5

mL/min, tempo de flotação de 120 min e volume inicial da fase PEG igual a 12,5 mL. Além

disso, a FSAB mostrou maior desempenho em termos de E%, α e D do que ESAB, SS e ELL.

Usando o caldo de fermentação, o processo conseguiu bons índices na captura do 2-HBF,

embora uma quantidade significativa de contaminantes também tenha migrado para a fase rica

em PEG. De forma geral, a FSAB é uma técnica simples e de baixo custo com resultados

satisfatórios no contexto da análise e detecção do 2-HBF.


CONCLUSÕES GERAIS

Concluisões gerais 108


Conclusões gerais

A renovação da sublação por solvente pela incorporação do sistema aquoso bifásico

tem garantido à técnica um maior leque de aplicações em potencial. Nos experimentos da

FSAB com ácido gálico e polifenóis do resíduo de camu-camu buscou-se maximizar as

respostas através da manipulação univariada das condições experimentais bem como

estabelecer os limites de operação da técnica. Em contraste, uma metodologia multivariada foi

aplicada para realizar a triagem das variáveis mais significativas e otimizar a FSAB para

recuperação e concentração do 2-HBF. Sob condições ótimas, os valores de E%, e D da

FSAB com ácido gálico foram 81,62, 4,76 e 26,94, respectivamente; enquanto que os valores

de E%, e D da FSAB com polifenóis do resíduo de camu-camu foram obtidos na seguinte

ordem: 81,02, 5,21 e 27,56. Por outro lado, os experimentos conduzidos com 2-HBF foi

possível alcançar apenas os valores de eficiência de separação de 57,55%, coeficiente de

concentração de 4,23 e coeficiente de distribuição de 9,86. Tal disparidade de desempenho

entre os experimentos pode ser atribuída à baixa polaridade do 2-HBF, ocasionando em uma

baixa solubilidade do pesticida na solução aquosa de PEG. Quando a FSAB foi comparada

com outros métodos extrativos, a referida técnica apresentou resultados surpreendentes para

ambos sublados não apenas em termos de enriquecimento, mas também em eficiência de

separação. Apesar dos benefícios apresentados, a seletividade reduzida do sistema

PEG/sulfato de amônio foi vista como ponto negativo. Como pode ser observado nos

cromatogramas para ambas as aplicações, contaminantes dos meios complexos migraram

intensamente da fase fundo para a fase topo. O caso mais grave foi para a biodessulfurização

do 4-MDBT, uma vez que a concentração do contaminante foi bem superior à concentração

do 2-HBF, o produto-alvo. De forma a superar esse obstáculo, em trabalhos futuros

buscaremos inserir seletores na fase topo e/ou substituir o sistema de aquoso bifásico

convencional por outros tipos mais vantajosos. Outra atrativa vertente para a técnica é sua

integração com processos fermentativos. A baixa miscibilidade entre as fases e a passagem de

gás pelo sistema abrem a possibilidade de se obter produtos microbianos via sublação com

solvente, contanto que as células e produtos tenham preferência por fases diferentes. Ainda

assim, consideramos que o presente trabalho contribuiu para a pesquisa voltada ao

downstream processing e que a FSAB é uma alternativa promissora na recuperação e

concentração de componentes fenólicos provenientes de extratos naturais e caldos de

fermentação.

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Referências bibliográficas 110


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