Tese de Doutorado Morfo-fisiologia da biodegradação de...
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GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA, E DESENVOLVIMENTO ECONÔMICO FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA – PPG Biotecnologia Industrial Tese de Doutorado Morfo-fisiologia da biodegradação de madeiras por Ceriporiopsis Subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas & Burds. (Fungi, Basidiomycetes) Priscila Brasil de Souza Cruz Lorena – SP – Brasil 2005
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GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA, E DESENVOLVIMENTO ECONÔMICO FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA – PPG Biotecnologia Industrial
Tese de Doutorado
Morfo-fisiologia da biodegradação de madeiras por Ceriporiopsis Subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia
tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas & Burds. (Fungi, Basidiomycetes)
Priscila Brasil de Souza Cruz
Lorena – SP – Brasil 2005
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
Morfo-fisiologia da biodegradação de madeiras por Ceriporiopsis Subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia
tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas & Burds. (Fungi, Basidiomycetes)
Tese de Doutorado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Doutora em Biotecnologia Industrial.
Banca Examinadora: Dr. André Luis Ferraz – DEBIQ/FAENQUIL
Dra. Adriane Maria Ferreira Milagres – DEBIQ/FAENQUIL
Dra. Maria Eleonora Andrade de Carvalho – DEBIQ/FAENQUIL
Dra. Elisa Esposito - UMC
Dra. Manuela da Silva – FIOCRUZ-RJ
Estudante: Priscila Brasil de Souza Cruz
Lorena - SP - Brasil 2005
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
Morfo-fisiologia da biodegradação de madeiras por Ceriporiopsis Subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia
tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas & Burds. (Fungi, Basidiomycetes)
Este exemplar corresponde à versão final da tese de doutorado aprovada pela banca examinadora.
Dr. André Ferraz Orientador e Presidente da Banca Examinadora
Lorena - SP - Brasil 2005
Ficha Catalográfica
Elaborada pela Biblioteca Universitária da FAENQUIL
Souza-Cruz, Priscila Brasil S89m Morfo-Fisiologia da Biodegradação de Madeiras por
Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. & Burds. (Fungi,Basidiomycetes) / Priscila Brasil de Souza-Cruz.-- Lorena, 2005.
91f.: il.
Tese (doutorado) - Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Departamento de Biotecnologia. Orientador: André Ferraz. Co-Orientador: Clarice Loguercio-Leite
1. Biotecnologia 2. Biodegradação de madeira 3. Biopolpação 4. Phlebia tremellosa 5. Ceriporiopsis subvermispora 6. Pinus taeda 7. Eucalyptus grandis I. Ferraz, André, orientador. II. Título.
CDU : 574.6
LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Modelo de uma estrutura de lignina de madeiras moles proposta por Adler
11
Figura 2 - Modelo de uma estrutura de lignina de madeira dura proposta por K. Nimz
11
Figura 3 – Vias de colonização da madeira 13
Figura 4 – Ciclo catalítico simplificado de lignina peroxidase (LiP). S representa um substrato aromático não fenólico
16
Figura 5 – Ciclo catalítico simplificado de peroxidase dependente de Manganês (MnP). PhOH representa um substrato fenólico
17
Figura 6 – Ciclo catalítico de lacase. PhOH representa um substrato fenólico. A estequeometria do ciclo envolve 4 Cu2+ (normalmente ligados a uma única proteína ou a 2 cadeias protéicas acopladas), 4 substratos fenólicos, 4 prótons e 1 molécula de O2
17
Figura 7 - Microscopia ótica mostrando o ataque progressivo (erosão) da parede celular de Picea abies por Heterobasidium annosum Note que a célula ao centro apresenta erosões irregulares na parede celular. A escala no canto superior esquerdo da foto indica a magnitude do aumento
18
Figura 8 - Microscopia eletrônica de transmissão mostrando o ataque não erosivo da parede celular de madeira. Notophagus dombeyi degradado por Ganoderma australe. Corte fixado com KMnO4 para contraste da lignina. (A) células intactas, (B) e (C) as setas indicam o avanço do ataque onde as áreas de menor contraste estão livres de lignina. (D) células completamente livres de lamela média.
19
Figura 9 – Hifa com clamidosporos (a) intercalar e (b) apical de Ceriporiopsis subvermispora SS3.
28
Figura 10 – Classificação visual da quantidade de clamidósporos em (a) muito (++++), (b) médio (+++), (c) pouco (++) e (d) pouquíssimo (+).
46
Figura 11 – Perdas de massa de E. grandis após 15 dias de biodegradação por C. subvermispora SS-3.
49
Figura 12 – Crescimento fúngico estimado a partir do teor de ergosterol detectado nas amostras de madeira biodegradada (P. taeda e E. grandis) por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa ao longo do período de incubação.
50
Figura 13 – Produção de MnP por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, na biodegradação de P. taeda e E. grandis ao longo do período de incubação.
52
Figura 14 – Produção de lacase por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, na biodegradação de P. taeda e E. grandis ao longo do período de incubação.
55
Figura 15 – Produção de endoglucanase por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, na biodegradação de P. taeda e E. grandis ao longo do período de incubação.
58
Figura 16 – Produção de xilanase por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, na biodegradação de P. taeda e E. grandis ao longo do período de incubação.
59
Figura 17 – pH do meio fermentado por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa ATCC 48745, na biodegradação de P. taeda e E. grandis ao longo do período de incubação.
61
Figura 18 – Perda de massa seca da madeira (P. taeda e E. grandis) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa ao longo do período de incubação.
63
Figura 19 – Perda de glucana da madeira (P. taeda e E. grandis) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P.
65
1
tremellosa ao longo do período de incubação. Figura 20 – Perda de polioses da madeira (P. taeda e E. grandis) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa ao longo do período de incubação.
66
Figura 21 – Perda de lignina da madeira (P. taeda e E. grandis) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa ao longo do período de incubação.
67
Figura 22 – Conteúdo de lignina residual nas polpas Kraft obtidas após polpação kraft de alto rendimento. A polpação foi realizada em amostras de madeira P. taeda após biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa por 28 dias.
69
Figura 23 – Conteúdo de lignina residual nas polpas Kraft obtidas após rampa de aquecimento de 30 minutos e determinados tempos de cozimento a temperatura máxima. A polpação foi realizada em amostras de madeira E.grandis após biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa por 28 dias.
70
Figura 24 – Rendimento de polpa não classificada em função do número kappa em polpas Kraft obtidas a partir da madeira de P. taeda biotratada durante 28 dias por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa.
70
Figura 25 – Hifas de C. subvermispora SS3 em células de (a) P. taeda - traqueídeos e (b) E. grandis – elementos de vaso.
74
Figura 26 – Curva de crescimento de C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa em meio líquido CB (Batata dextrose) tamponado com acetato de sódio 10 mM.
77
Figura 27 – Curva de crescimento de C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa em meio líquido MS (Milhocina - sacarose).
77
Figura 28 – Microscopia óptica de fragmentos de hifas com clamidósporos, após o micélio cultivado para inóculo ser batido por 10 ciclos de 15 segundos.
82
2
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição química das madeiras moles e duras 9 Tabela 2 - Atividade celulolítica total encontrada nos extratos obtidos a partir da biodegradação de P. taeda e E. grandis por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, ao longo do período de incubação.
57
Tabela 3 - Taxa de crescimento dos fungos C. subvermispora SS3 e CS1 e P. tremellosa em meio de cultura ágar-batata- dextrose com diferentes valores de pH inicial.
75
Tabela 4 - Taxa de crescimento dos fungos C. subvermispora SS3 e CS1 e P. tremellosa em meio de cultura ágar-milhocina com diferentes valores de pH inicial.
75
Tabela 5 – Quantidade de clamidósporos observadas em P. tremellosa e C. subvermispora SS3 e CS1 ao microscópio óptico ao longo do crescimento em meio de cultura líquido BD tamponado (pH 4)
79
Tabela 6 – Atividade enzimática de manganês peroxidase (MnP) encontrada nos extratos obtidos após 14 dias de cultivo de C. subvermispora SS3 sobre P. taeda e E. grandis, com os inóculos convencional e induzido para a produção de clamidósporos.
82
3
ABSTRACT Morpho-physiology of wood biodegradation by Ceriporiopsissubvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Sch rad.:Fr.)Nakas. & Burds. (Fungi, Basidiomycetes). Priscila Brasil de Souza Cruz. Tese de Doutorado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia. Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. André Luis Ferraz (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Co-orientador: Dra Clarice Loguercio-Leite (Departamento de botânica, UFSC, CP 476, CEP 88090-400). This work involves the study of enzymatic and morphological aspects related to the wood biodegradation by white rot fungi. Wood samples of Pinus taeda L. and Eucalyptus grandis W. Hill ex Maiden were inoculated with Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. (strains SS3 and CS1) and Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. & Burds. (strain ATCC 48745) in solid-state fermentation bioreactors for periods from 7 to 28 days. Enzymes of hydrolytic nature, such as total cellulases, endocelulases and xylanases, along with those of oxidative nature, such as lacase, peroxidase and cellobiose dehydrogenase, were studied in extracts recovered from the cultures. From the colonized wood chips, morphological aspects of the wood colonization were observed under optical microscopy. Biodegraded wood samples analysed for chemical composition and weight and component losses were determined. High-yield kraft pulping of biotreated wood samples was performed to evaluate the effect of different fungal preteatments on bio-kraft pulping. The growth ability of the fungi in low-cost culture media was evaluated aiming to increase growth rates. The capacity of these cultures to produce chlamydospores was also evaluated since these spores are suitable for storage and inoculation on a large scale. The two fungal species used in this study displayed extracellular metabolic activity. In the group of hydrolytic enzymes, xylanases were detected throughout the cultivation period, the maximum being observed after 14 days of biodegradation. In contrast, cellulase levels where very low. Most significant oxidative enzyme was MnP, which showed enzymatic activity in both fungal species, the maximal production being detected after 14 days in all culture conditions. LiP and CDH activities were not detected in any of the cultures evaluated, whilst lacase activity was detected only on initial stages of wood decay and in low quantities. Lignin losses were higher in E. grandis cultures than in P. taeda. The 3 fungal strains tested grew well in simple and low-cost media such as corn steep liquor-sucrose medium and produced chlamydospores without any induction, however osmotic shock was efficient to increase the contents of these spores.
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RESUMO
Morfo-fisiologia da biodegradação de madeiras por Ceriporiopsissubvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Sch rad.:Fr.)Nakas. & Burds. (Fungi, Basidiomyce tes). Priscila Brasil de Souza Cruz. Tese de Doutorado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia. Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. André Luis Ferraz (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Co-orientador: Dra Clarice Loguercio-Leite (Departamento de botânica, UFSC, CP 476, CEP 88090-400).
Este trabalho se propôs a estudar aspectos enzimáticos e morfológicos
envolvidos no processo de biodegradação de madeira por fungos causadores de podridão branca. As madeiras de Pinus taeda L. e Eucalyptus grandis W. Hill ex Maiden foram inoculadas com Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. (cepas SS3 e CS1) e Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. & Burds. (cepa ATCC 48745) em biorreatores de fermentação sólida durante períodos que variaram de 7 a 28 dias. A partir dos extratos obtidos das culturas foram investigadas as enzimas de natureza hidrolítica como celulases, endocelulases e xilanases, bem como as de natureza oxidativa, como lacases, peroxidases e celobiose desidrogenase. A partir dos cavacos colonizados foram analisados aspectos morfológicos da colonização da madeira por microscopia óptica. As madeiras biodegradadas também foram analisadas quanto à perda de massa e de componentes. Observaram-se as modificações que essas cepas provocaram na madeira e quais as conseqüências destas sobre a biopolpação. A comparação do crescimento dessas cepas em meios de cultura de baixo custo foi realizada com o intuito de aumentar a velocidade de crescimento e baratear o custo de produção do micélio, tal comportamento foi avaliado através de curvas de crescimento. Paralelamente também foi avaliada a capacidade dessas culturas produzirem clamidósporos, como possibilidade de serem utilizados para a estocagem e inoculação em escala ampliada. As duas espécies utilizadas neste trabalho apresentaram atividade metabólica extracelular. Dentro do grupo das enzimas hidrolíticas a atividade enzimática de xilanase foi detectada em todos os períodos de cultivo, sendo que o máximo de atividade encontrava-se aos 14 dias de cultivo, ao contrário de celulase da qual não foi detectada atividade significativa. No complexo oxidativo a enzima de destaque foi a MnP, que apresentou atividade enzimática em ambas espécies sendo que o máximo foi detectado aos 14 dias em todas as condições de cultivo. As atividades enzimáticas de LiP e CDH não foram detectadas em nenhum dos cultivos testados, já a atividade de lacase foi baixa em todos as condições avaliadas. Quanto à perda de lignina observou-se que, de forma geral, nos cultivos no qual o substrato era E. grandis a perda foi mais extensa do que nos cultivos em P. taeda. Os fungos testados crescem bem em meio simples como milhocina-sacarose que tem um custo baixo e as duas espécies de fungos utilizadas neste trabalho são capazes de produzir clamidósporos sem qualquer indução, mas pode-se aumentar a quantidade de clamidósporos produzidos através de indução por choque osmótico.
5
1. INTRODUÇÃO
O estudo da biodegradação de madeira apresenta grande
importância acadêmica e tecnológica. Do ponto de vista acadêmico,
estudar a processo biodegradativo significa contribuir com o
entendimento do ciclo natural do carbono que tem início na biossíntese
dos componentes da madeira a partir de CO2 atmosférico e termina com
a liberação do mesmo gás, após a mineralização desses componentes
em decorrência da decomposição induzida por fungos degradadores de
madeira. Do ponto de vista tecnológico, a biodegradação de madeira
pode ser utilizada no processo de biopolpação. Este processo consiste
em tratar a madeira sob condições controladas com fungos previamente
selecionados e posteriormente submeter a madeira biotratada a
processos convencionais de polpação destinados a produção de celulose
e papel.
A combinação de um pré-tratamento fúngico com a polpação
mecânica permite reduzir em até 40% o consumo de energia elétrica
durante o desfibramento/refinamento mecânico. Além disso, as
biopolpas apresentam maior resistência mecânica do que as polpas
convencionais. Este processo já vem sendo testado em escala ampliada
(degradação de 50 toneladas de cavacos – planta piloto na empresa
Melhoramentos Ltda., Caieras - SP) e sua implementação industrial
depende de otimizações oriundas dos estudos em escala piloto e do
licenciamento da tecnologia (AKHTAR et al., 1998). No caso do pré-
tratamento fúngico combinado com a polpação química, os resultados
mais promissores indicam reduções expressivas na demanda de álcali
ativo em processos de polpação kraft destinados à produção de polpas
de alto rendimento, usualmente utilizadas na fabricação de papéis de
recobrimento de caixas ou em papéis de embalagem (MENDONÇA et al.,
2002).
Apesar do processo de biopolpação já se encontrar em vias de
6
implementação industrial, pouco se sabe sobre os mecanismos químicos
e bioquímicos que poderiam explicar os benefícios observados para o
pré-tratamento da madeira com os fungos ligninolíticos. Os fungos
estudados atualmente foram selecionados com base na habilidade de
crescerem rapidamente, degradarem lignina seletivamente, reduzirem o
consumo de energia durante a polpação mecânica e melhorarem a
resistência das polpas produzidas a partir da madeira biotratada. Várias
espécies têm sido selecionadas por diferentes pesquisadores de forma
empírica, no entanto não se sabe exatamente o que difere as espécies
avaliadas em termos de metabólitos extracelulares responsáveis pelas
transformações que causam os benefícios da biopolpação.
Não há, até o momento, estudos sistematizados que verifiquem
os tipos de transformações, quais diferentes espécies e cepas de fungos
as causam e quais as conseqüências dessas transformações sobre a
eficiência da biopolpação. O presente trabalho contribuiu nesse sentido,
ao abordar o modo de ação de três cepas de duas espécies de
basidiomicetes agindo sobre a madeira de duas espécies arbóreas
(Pinus taeda e Eucalyptus grandis).
7
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA COMENTADA
A biodegradação da madeira é um processo natural de reciclagem
da matéria orgânica e ocorre em todos os ambientes naturais
(terrestres e aquáticos) quando as condições ambientais são favoráveis.
A madeira pode ser colonizada rapidamente por vários organismos, os
quais através do processo de biodegradação solubilizam os
componentes estruturais da madeira (polissacarídeos e lignina)
inicialmente a moléculas simples e finalmente a CO2 e água (DANIEL,
2003). Dentre os vários organismos que podem degradar a madeira, os
basidiomicetes causadores de podridão branca despertam grande
interesse uma vez que podem ser aplicados a processos biotecnológicos
como no caso da biopolpação. Entender melhor os mecanismos
biológicos responsáveis pela degradação da madeira e especialmente da
lignina é um importante pré-requisito para o desenvolvimento e
otimização dos processos de biopolpação (MESSNER, et al., 2003).
2.1. Composição química e ultraestrutura da madeira
A madeira é constituída por celulose, polioses, lignina, pequenas
quantidades de extrativos e sais minerais, e apresenta-se como um
material complexo que deve ser estudado considerando suas
propriedades químicas e morfológicas. Em geral, as madeiras podem
ser classificadas em duras "hardwood" ou moles "softwood". As
madeiras duras são provenientes de árvores produtoras de folhas e
frutos (angiospermas), como, por exemplo, eucalipto, ipê e peroba, já
as madeiras moles são extraídas de árvores não produtoras de flores e
frutos (gimnospermas), tais como, pinheiro e cipreste (FENGEL E
WEGENER, 1989). As características anatômicas e microestruturais da
madeira variam entre as diferentes espécies, sendo que as madeiras
8
moles tendem a ter uma estrutura mais simples quando comparadas às
madeiras duras (DANIEL, 2003). As madeiras duras e moles diferem
quanto à proporção de seus componentes, a estrutura química da
lignina e das polioses, ao arranjo e tipos de células e quanto à
susceptibilidade à biodegradação. Em termos ultraestruturais, as
madeiras moles se caracterizam por apresentar de 90 a 95% de
traqueídeos, 5 a 10% de células de raio e 0,5 a 1,0% de canais de
resina. Outra característica importante das madeiras moles, quando se
considera a produção do papel e celulose, é que elas possuem fibras
mais longas que as madeiras duras. Essa característica confere boa
qualidade aos papéis originados de madeiras moles, mesmo aqueles
produzidos com processos mecânicos ou termomecânicos. Já as
madeiras duras têm uma estrutura mais complexa que incluem, 36 a
70% de fibras, 20 a 55% de elementos de vaso, 6 a 20% de células de
raios e 2% de células parenquimáticas (BIERMANN, 1996; DANIEL,
2003).
A composição química das madeiras moles difere das madeiras
duras quando comparadas às proporções dos seus diferentes
componentes como demonstrado na tabela 1.
Tabela 1 - Composição química das madeiras moles e duras (BIERMANN, 1996).
Componentes Madeira dura (%) Madeira mole (%)
Celulose 40-50 45-50
Galactoglucomanana 2-5 20-25
Xilana 15-30 5-10
Lignina 18-25 25-35
Extrativos 1-5 3-8
A celulose é o principal polímero tanto em madeiras duras quanto
em madeiras moles. Trata-se de um polímero linear de anidro-glicose
ligado por ligações β-(1-4)-glicosídicas (FENGEL E WEGENER, 1989).
9
As polioses são uma classe de polímeros de açúcar incluindo as
hexoses (glicose, manose, galactose e ácido metilglucurônico) e as
pentoses (xilose e arabinose). As polioses apresentam-se na forma de
polímeros ramificados de menor massa molar que a celulose e podem
ser homopolímeros (exemplo: xilana, formada por xilose) que
tipicamente ocorrem em madeiras duras ou heteropolímeros (exemplo:
glucomanana, formada por glicose e manose), que predominam nas
madeiras moles. As polioses de madeira mole são compostas por
galactoglucomanana, glucomanana, arabinoglucuronoxilana e
arabinogalactana e as de madeira dura por glucuronoxilana e
glucomanana (HON e SHIRAISHI, 2001).
A lignina é uma macromolécula complexa com estrutura
tridimensional amorfa composta por unidades de fenilpropano (guaiacil,
siringil e ρ-hidroxifenil). Os diferentes tipos de acoplamento entre os
precursores dão origem a vários tipos de ligações entre as unidades
fenilpropano como β-O-4 e α-O-4 (50-65%), β-1 (9-15%), β-5 (6-15%),
5-5 (2-9%) e β-β (2-5%). A estrutura da lignina é diferente entre os
dois tipos de madeira, a lignina de madeiras moles é composta de 90%
de unidades guaiacil e a lignina de madeiras duras é composta de
quantidades aproximadamente iguais de siringil e guaiacil. A lignina tem
um papel significante na proteção natural da madeira, pois grandes
quantidades de lignina e a presença de lignina guaiacil promovem uma
maior proteção natural do que baixos níveis de lignina e lignina siringil
(DANIEL, 2003). Estruturas modelo para lignina de madeiras moles e
duras são mostradas nas figuras 1 e 2 (FENGEL E WEGENER, 1989,
BIERMANN, 1996).
10
2
5 - 5
- ββ
- 1
- 5
- O - 4β
β
β
3O C H
|
γ
βα
3O C H
H C O H2
_
H C O
12O H
11
|
||
|
|
2H C
O C H
10
H O 9
2H C O H
|
|
|
|
8
__
7
_________
_O C
6______3H C O
5
|
|
| |
|
|
| |
|
____
4
_
__
_ || |
|
|
|
|
|
|
| _
_ _
_
16
______
___
___
___
C HC H
15
14
___
H C
H C
H C
H C
H C
H C
3H C O
3
13|
|
|
|
|
|
|
| |
|
|
|
|
|
|
|
|
|______
______
______H C
___
2
___
2C H OHH C = O
1
|
||
|
|
|
|
| |
|
|
|
|
|
|
H O C H H O C H
H O C H
H C O H
H C O H
H C O H
H C O H
H C O H
H C O H
H C O H
2 2
2
2
H C O H2
H C O H
2
2
H C O H
H C O H
2H C O H
H C O H
2 O C H 3
O C H 3
O C H 3
3
3H C O
H C O
3
H C O
3H C O
3
H C O
3
H C O
3
33
H C O
O HO H
H C
H C
H C
H C
H C
C H
C H
C H
C H
C H
C H
C = O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
OO
H C O H
2H C O H
H C
C H
______
__
H O H2 C C C = O --|
|O
H
___
Figura 1 - Modelo de uma estrutura de lignina de madeiras moles proposta por Adler
(FENGEL e WEGENER, 1989).
0.1
OCH3O
H3CO
CCCOHH2
HH H
OHOCH3
C
H2 COHCH
0.5OOCH3H3CO
CH2
CC
CHCH2
CH2
O
O
OCH3
H2H
0.4H3COO
OOCH3
COCHCOHH2 CH
CHCOHH2
CH
C
H3CO
H OOCH3
COCCOHH2
H
COHH2
CH
H
OH
C
OCH3H3CO
COHH2
OCH3
O CH
H3COOCH CHOHOCH2
CHCOHH2
O
COC OH
CHCH
OCH3O
H2H
H
COHC
C
OCH3O
HOCH2 COCHO
OCH3
H2COH
CCHO
OCH3
H CCOH
H3OC OCH3
CHO
COHH2
COHH2
H
OCH3H3CO
CHC
OCH3
OCH3
O CH
OCH3O
CH O
OCH3H3CO
CCCOH
CH2
OH2
HH
COHH2
COHH2
CHH
OCH3H3COOH
C
O
H3CO
COCH
O
COHH2
COHH2CHCHO
C
OCH3
O CHCH2O
CH
H3COOCH CHOHOCH2
OH3CO OCH3
CCC
HH
H2
O
OCH2
CH
COHH2
CH
H2 COH
H2COHCHCO
OCH3H3COOH
OCH3OHC
CHOH3CO
CH
H3CO OCH3
O CHCH
OHOCH3H3CO
OCOHH2
nach Nimz, H. 1974.Angew. Chem. internat. Edit., 13, 313-321
Figura 2 - Modelo de uma estrutura de lignina de madeira dura proposta por K. Nimz
(FENGEL e WEGENER, 1989).
11
Existe ainda uma fração menor da madeira, formada basicamente
por compostos fenólicos e resinas, que comumente são chamados de
extrativos (solúveis em solventes orgânicos e água) e compreendem
cerca de 2 a 4% (HIGUCHI, 1985; FENGEL E WEGENER, 1989).
É interessante ressaltar que todos os constituintes da madeira
estão intimamente associados e/ou ligados quimicamente. A lignina
forma um complexo com as polioses encapsulando a celulose, reduzindo
a disponibilidade destes dois componentes na parede celular (READING
et al., 2003). Na parede celular, a lignina está associada às polioses
através de interações físicas e ligações covalentes. O fato de a lignina
envolver as células funcionando como uma “cola” dificulta a
biodegradação, protege a árvore contra o ataque de microrganismos e
confere coesão à estrutura interna além de resistência ao esforço
mecânico (FENGEL E WEGENER, 1989; HOFRICHTER, 2002; READING,
et al., 2003).
2.2. Biodegradação da madeira
Embora a madeira possa ser atacada por vários organismos, no
ecossistema terrestre os fungos são os principais decompositores. As
enzimas extracelulares produzidas pelos fungos degradadores de
madeira e o subseqüente processo de decomposição difere entre os
vários grupos de fungos, resultando em diferentes tipos de degradação
(AKHTAR, et al., 1997). Os fungos degradadores de madeira são
agrupados em três categorias. Os fungos de podridão branda ou “soft-
rot” (Ascomycetes e Deuteromycetes) causam a degradação da lignina
e carboidratos, porém em velocidades muito baixas. Já os causadores
de podridão castanha ou "brown-rot" (Basidiomycetes) degradam
principalmente polissacarídeos. No caso dos de podridão branca ou
"white-rot" (Ascomycetes – Xylariales e Basidiomycetes) todos os
componentes da madeira são degradados (HIGUCHI, 1985; FENGEL E
12
WEGENER, 1989; DEACON, 1997).
Os fungos causadores de podridão branca são os mais eficientes
degradadores de lignina, podendo degradá-la seletivamente ou
simultaneamente. Os fungos que pertencem a este grupo são de grande
interesse para a indústria de papel e celulose por sua capacidade de
degradar lignina, embora muitos destes fungos também possam
degradar celulose e polioses (BLANCHETTE, 1991; BLANCHETTE et al.,
1992; KIRK E CULLEN, 1998; AKHTAR et al., 1998). Os fungos que
degradam a lignina seletivamente podem ter diferentes aplicações
biotecnológicas, tais como a deslignificação de materiais
ligninocelulósicos (madeira, palha e outros resíduos agrícolas) para
processos de biopolpação, o biobranqueamento de polpas, a
biorremediação de poluentes aromáticos e a produção de ração animal
(BLANCHETTE, 1994; AKHTAR et al., 1998; MESSNER et al., 2003).
As primeiras vias de colonização da madeira por todos os tipos de
fungos são usualmente as células dos raios que são vias anatômicas de
mais fácil acesso e menor resistência (fig. 3). Através das células do
raio as hifas têm acesso aos nutrientes de reserva não estruturais de
fácil assimilação contidos nas células parenquimáticas (não lignificadas).
A partir das células parenquimáticas do raio as hifas se espalham pelo
lúmem das fibras e vasos e avançam através das pontoações (“pits”).
hifas
Figura 3 – Vias de colonização da madeira pelas hifas.
13
Por meio da ação do complexo enzimático produzido por essas
hifas dá-se o processo de decomposição da madeira (KIRK E CULLEN,
1998; MESSNER, et al., 2003; DANIEL, 2003). No entanto, a
acessibilidade das enzimas na madeira, e nas fibras é limitado, devido a
fatores como adsorção à superfície, baixa porosidade da fibra e pequeno
tamanho dos poros das fibras. Além do que, a organização molecular e
a associação dos diferentes componentes da parede celular da fibra
(celulose, polioses e lignina) formam uma matriz impenetrável que
também limita o acesso dos microorganismos e suas enzimas (KUHAD
et al., 1997; DANIEL, 2003).
Dessa forma, assume-se que o processo de biodegradação de um
substrato lignocelulósico, como a madeira, ocorre pela ação combinada
de uma variedade de sistemas enzimáticos e alguns agentes não
enzimáticos de baixa massa molar como o ácido oxálico, álcool
veratrílico, ácido antranílico, ácidos graxos insaturados e agentes
redutores de ferro, que são produzidos extracelularmente pelos fungos.
Através destes sistemas lignocelulolíticos, os fungos degradam os
componentes insolúveis da madeira, transformando-os em
componentes menores e solúveis, os quais podem ser incorporados ao
seu metabolismo (FENGEL E WEGENER, 1989; TUOR, et al., 1995;
SETHURAMAN et al., 1998; MESSNER et al., 2003).
A biodegradação da celulose é um tópico bem elucidado do ponto
de vista bioquímico. A degradação do polímero é feita pela ação das
celulases (endo-1,4-β-glicanases, exo-1,4-β-glicanases e 1,4-β-
glicosidases). As enzimas atuam de forma cooperativa, causando a
hidrólise completa da celulose até glicose (HIGUCHI, 1985; ERIKSSON
et al., 1990; EVANS et al., 1994).
A biodegradação das polioses requer um conjunto de enzimas
extracelulares mais complexo devido a sua estrutura de hetero-
polissacarídeo ramificado. As enzimas envolvidas na biodegradação das
polioses são hidrolases específicas que clivam determinados tipos de
ligações existentes no polímero. Assim, as xilanases rompem ligações
14
glicosídicas entre unidades de xilose; as mananases atuam sobre
ligações glicosídicas entre moléculas de manose e as glucuronidases
sobre ligações de ácidos urônicos com moléculas de açúcares. As
hemicelulases são divididas em endo-hemicelulases, exo-hemicelulases
e xilosidases e, como as celulases, atuam de forma cooperativa
provocando a hidrólise completa das hemiceluloses até seus
monomêros (HIGUCHI, 1985; ERIKSSON et al., 1990).
A biodegradação da lignina ainda não foi completamente
elucidada devido a sua maior complexidade estrutural, mas supõe-se
que um grupo amplo de enzimas esteja relacionado à sua
biodegradação. No entanto, existem ainda hoje, controvérsias sobre a
real participação de cada grupo de enzimas e a função que cada um
deles exerce no processo global de oxidação que leva a lignina até
dióxido de carbono e água. Essas enzimas podem ser agrupadas em
pelo menos duas classes distintas, as fenoloxidases e as enzimas que
produzem peróxido de hidrogênio (HIGUCHI, 1985; ERIKSSON et al.,
1990; BLANCHETTE, 1991; RUEL et al., 1994). As fenoloxidases podem
ser divididas em dois subgrupos. Um contém as peroxidases, enzimas
dependentes de peróxido, que estão envolvidas na biodegradação da
lignina como: lignina peroxidase (LiP, EC 1.11.1.14) e manganês
peroxidase (MnP, EC 1.11.1.13). O outro subgrupo contém as lacases
(EC 1.10.3.2, benzenediol:oxigênio oxidoredutase) que são enzimas
que não dependem de peróxido para atuarem (HAKALA, et al., 2005).
Essas enzimas oxidativas são comumente produzidas por fungos de
decomposição branca em diferentes combinações. Existem espécies
fúngicas que são eficientes degradadoras de lignina e produzem
somente um ou outro tipo de enzima. Cerca de 60% dos fungos
causadores de podridão branca estudados até agora secretam MnP e
lacase, como combinação mais comum (LI, 2003; HAKALA, et al.,
2005). As enzimas que produzem peróxido de hidrogênio são acessórias
às peroxidases, gerando peróxido de hidrogênio “in situ” e possibilitam
que as peroxidases atuem (KIRK E CULLEN, 1998).
15
A ação dessas enzimas sobre a lignina leva a reações de oxidação
que progressivamente decompõem a macromolécula até compostos de
baixa massa molar que podem ser susceptíveis ao metabolismo
intracelular do fungo. No caso da ação da LiP (fig. 4), a degradação de
lignina ocorre através da formação inicial de um radical catiônico nos
núcleos aromáticos. A formação do radical catiônico induz à ruptura de
ligações, principalmente entre os carbonos α e β e a conseqüente
degradação química (pela ação do oxigênio e da água) dos
intermediários formados (HIGUCHI, 1985, 1990; FERRAZ E DURÁN,
1995; RODRIGUEZ et al., 1997, KIRK e CULLEN, 1998). Já nos casos da
MnP e da lacase (fig. 5 e 6 respectivamente), sabe-se que as enzimas
possuem baixo potencial de oxidação e podem abstrair elétrons
somente de estruturas fenólicas, não atuando diretamente sobre anéis
aromáticos cujos oxigênios da posição 4 estão eterificados (estruturas
não fenólicas). Isso limitaria a ação dessas enzimas a uma pequena
fração da lignina, já que a macromolécula apresenta somente cerca de
10% dos oxigênios da posição 4 na forma de estruturas fenólicas livres.
Alguns resultados recentes (apresentados no item 2.4) mostram que,
ao menos a MnP, pode atuar sobre estruturas não fenólicas mediada
pela peroxidação de lipídeos insaturados.
C 0 C I
C II
S
S +•
S
S +•
H 2O 2
H 2O
Figura 4 – Ciclo catalítico simplificado de lignina peroxidase (LiP). S representa um substrato aromático não fenólico (FERRAZ, 2004).
16
H2O
C 0 CI
C II
H2O2
Mn3+ Mn2+
PhOH PhO.
Mn3+ Mn2+ ou
Figura 5 – Ciclo catalítico simplificado de peroxidase dependente de Manganês (MnP). PhOH representa um substrato fenólico (FERRAZ, 2004).
Lacase (Cu2+)
Lacase red. (Cu1+)
O2
H2O PhOH
PhO•
Figura 6 – Ciclo catalítico de lacase. PhOH representa um substrato fenólico. A estequeometria do ciclo envolve 4 Cu2+ (normalmente ligados a uma única proteína ou a 2 cadeias protéicas acopladas), 4 substratos fenólicos, 4 prótons e 1 molécula de O2 (FERRAZ, 2004).
A celobiose desidrogenase (CDH) é uma enzima que faz parte do
sistema enzimático extracelular dos fungos celulolíticos e degradadores
de madeira, sistema no qual a CDH pode estar envolvida tanto na
degradação de celulose como de lignina, apesar de ser uma enzima que
oxida a celobiose e a manobiose que são respectivamente produtos da
degradação de celulose e manana (HENRIKSSON, et al., 2000b;
BAMINGER, et al., 1999). O exato papel biológico da CDH não está
completamente entendido. Foi sugerido que esta enzima atua de
diversas formas: (i) prevenindo a inibição por produto durante a
degradação da celulose através da oxidação da celobiose; (ii)
produzindo radicais hidroxila através da reação do tipo Fenton que pode
ter um papel na degradação dos polissacarídeos e da lignina; (iii)
inibindo a polimerização de radicais aromáticos produzidos pela LiP; e
17
(iv) disponibilizando manganês (MnII) para MnP através da redução de
precipitados de óxido de manganês (MnO2) (HILDÉN, et al., 2000). Esta
enzima foi encontrada e purificada em vários basidiomicetes causadores
de podridão branca como Phanerochaete chrysosporium e Trametes
versicolor (L.:Fr.) Pil., e em alguns outros fungos causadores de
podridão mole e em bolores (HENRIKSSON, et al., 2000a).
Outro aspecto importante a ser considerado na biodegradação de
madeira é que apesar dos muitos estudos sobre as enzimas que
estariam envolvidas na biodegradação, ainda não se consegue explicar
muito bem como estas penetrariam na parede das células componentes
da madeira. Desde o ponto de vista microscópico pode-se diferenciar
dois modos principais de degradação da célula vegetal por fungos de
decomposição branca. O primeiro envolve uma “escamação”
progressiva da parede celular no sentido lúmen-lamela média, levando
à diminuição progressiva da espessura da parede celular. Outro modo
de degradação que tem sido observado em fungos seletivos para a
degradação de lignina, envolve a remoção de lignina e polioses sem a
simultânea erosão da parede celular vegetal. Nesses casos, a parede
celular, apesar de degradada, mantém sua forma original (AGOSIN et
al., 1990, BLANCHETTE et al., 1997, KIRK e CULLEN, 1998). Os
mecanismos distintos de degradação envolvidos em cada caso têm sido
objeto de muitos estudos e um aspecto a ser considerado é o modo de
ação das enzimas extracelulares sobre o complexo lignocelulósico.
Figura 7 - Microscopia ótica mostrando o ataque progressivo (erosão) da parede celular de Picea abies por Heterobasidium annosum Note que a célula ao centro apresenta erosões irregulares na parede celular. A escala no canto superior esquerdo da foto indica a magnitude do aumento (FERRAZ, 2004).
18
Figura 8 - Microscopia eletrônica de transmissão mostrando o ataque não erosivo da parede celular de madeira. Notophagus dombeyi degradado por Ganoderma australe. Corte fixado com KMnO4 para contraste da lignina. (A) células intactas, (B) e (C) as setas indicam o avanço do ataque onde as áreas de menor contraste estão livres de lignina. (D) células completamente livres de lamela média (FERRAZ, 2004).
Vários trabalhos têm demonstrado que enzimas lignocelulolíticas
não penetram na parede celular intacta (GOODELL, et al., 1997;
FLOUNOY et al., 1993; SREBOTNIK et al., 1988). Com isso, a
degradação enzimática dos componentes da parede celular não poderia
justificar o modelo de ataque não erosivo que descrevemos
anteriormente. Ou seja, se as enzimas responsáveis pela decomposição
dos componentes da madeira não podem penetrar na parede celular
vegetal, somente um processo de “escamação” da parede celular pode
ser efetivo na biodegradação. No entanto, para os fungos de
decomposição branca que degradam lignina seletivamente, esse modelo
não é adequado. Em trabalho bastante esclarecedor, BLANCHETTE et al.
(1997) demonstraram que culturas de C. subvermispora (um dos
fungos mais seletivos já descritos para a degradação de lignina) causam
alterações estruturais significativas na lignina presente na parede
celular e na lamela média, mesmo antes da parede celular vegetal ser
permeável a proteínas do tamanho da insulina (5730 Da). Dessa forma,
vários trabalhos têm proposto que alguns compostos de baixa massa
molar poderiam atuar ao menos nos estágios iniciais de biodegradação
da lignina (KAPICH et al, 2005). Estes compostos deveriam apresentar
19
atividade degradativa, mas teriam que ser suficientemente pequenos
para penetrar no complexo celular vegetal, degradar os componentes aí
existentes e com isso desestruturar a parede celular a ponto de permitir
a penetração de enzimas oxidativas e hidrolíticas (EVANS et al, 1994).
2.3. Basidiomicetes causadores de podridão branca com
potencial para a biopolpação
Na biopolpação, a madeira é pré-tratada pelo fungo e
posteriormente submetida à polpação mecânica ou química. Os
benefícios do pré-tratamento biológico incluem a redução de energia
requerida para o desfibramento/refinamento da madeira (no caso de
polpas mecânicas) e a redução da demanda por produtos químicos no
caso das polpações químicas. Adicionalmente, as “biopolpas”
usualmente possuem melhores qualidades mecânicas que os
respectivos controles, o que permite a preparação de papéis de melhor
qualidade (AKHTAR et al., 1998).
Os fungos causadores de podridão branca que podem ser
aplicados na biopolpação foram inicialmente selecionados com base na
habilidade de crescerem rapidamente e degradarem lignina
seletivamente. Esta seletividade é estimada com base em análises
químicas do conteúdo de lignina e açúcares liberados pela hidrólise
ácida da madeira biotratada (AKHTAR et al., 1997). Baseado neste tipo
de seleção, várias espécies têm sido selecionadas por diferentes
pesquisadores, entre elas estão Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn.
& Ryv., Phanerochaete chrysosporium Burds., Phlebia brevispora
(Nakas.), Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. & Burds., Phlebia
subserialis (Bourd. & Galz.) Donk, Perenniporia medullapanis (Jacq.:Fr.)
Donk, Dichomitus squalens (Karst.) Reid, Phellinus pini (Thore.:Fr.) A
Ames, Phlebia radiata (Fr), Hyphodontia setulosa (Berkeley & M.A.
Curtis) Maas Geesteranus, e Physisporinus rivulosus (Berk. & M.A.
20
Curtis) Ryvarden. Dentre as várias espécies de fungos estudadas C.
subvermispora foi considerada como uma das mais apropriados para ser
utilizada no processo de biopolpação, visto que degrada lignina
seletivamente, reduz o consumo de energia durante o desfibramento e
melhora a resistência do papel obtido a partir das biopolpas (AKHTAR et
al., 1997 E 1998). Entretanto, essa seleção foi feita de forma empírica,
uma vez que, não se sabe exatamente no que diferem as espécies
indicadas, em termos de produção de metabólitos extracelulares
responsáveis pelas transformações químicas que tornam
industrialmente atrativo o processo de biopolpação.
Tais basidiomicetes importantes para a indústria, considerando o
número de espécies existentes na natureza, são estudados em número
reduzidíssimo, apesar do óbvio potencial em aplicações biotecnológicas.
Identificar e escolher as melhores espécies com tal finalidade, é um
problema crítico, que demandará muito tempo e investimento em
pesquisa. Através da taxonomia, que é a ciência que permite classificar
os organismos, via filogenética, pode-se determinar graus de
parentescos entre organismos, selecionando assim organismos
parentes, que podem apresentar habilidades similares em produzir
metabólitos úteis em processos biotecnológicos. Sabendo que uma
espécie de um gênero apresenta características interessantes, como,
por exemplo, produzir metabólitos secundários ou enzimas de interesse
biotecnológico, poder-se-ia supor que outras espécies do gênero ou de
gêneros próximos e relacionados também apresentariam as mesmas
características. Desse modo, quando uma característica desejada é
encontrada em uma espécie em particular, um procedimento
recomendável para encontrar espécies com características similares é
fazer uma seleção entre organismos de um mesmo gênero e/ou família
(BURDSALL, 1998). Com base nesta hipótese foram selecionadas para o
estudo aqui proposto duas cepas de Ceriporiopsis subvermispora (SS-3
e CS-1) e uma de Phlebia tremellosa que é considerada
filogeneticamente próxima a Ceriporiopsis (BURDSALL, 1998).
21
Ceriporiopsis Dom. é um gênero poróide que pertence à família
Coriolaceae ou Polyporaceae (BURDSALL, 1998). C. subvermispora é
uma espécie rara, encontrada em regiões temperadas, distribui-se no
sul do Canadá, no norte da América do Norte e na Europa Central
(GILBERTSON E RYVARDEN, 1986). Na natureza, coloniza basicamente
madeiras moles, i. e. gimnospermas (BLANCHETTE et al., 1992). Um
consórcio formado por indústrias do setor de celulose e papel, a
Universidade de Wisconsin e o “USDA - Forest Products Laboratory” em
Madison, EUA desenvolveu vários estudos que culminaram na seleção
de C. subvermispora (AKHTAR et al., 1998). Esta espécie se mostrou
excelente para uso em biopolpação, principalmente por degradar a
lignina seletivamente e por manter a celulose praticamente intacta,
após curtos períodos de degradação (AKHTAR et al., 1998). Resultados,
bastante animadores já foram reportados envolvendo a utilização de C.
subvermispora no pré-tratamento de madeira anterior a processos
mecânicos, termomecânicos (SETLIFF et al., 1992; AKHTAR et al.,
1992, 1993; MESSNER E SREBOTNIK, 1994) e de polpação sulfito,
organosolv, Kraft e sulfito/antraquinona (SCOTT et al., 1996, FERRAZ et
al., 1998, MENDONÇA, et al., 2002, MENDONÇA et al., 2004).
Por outro lado, Phlebia Fr. (emend Donk), um gênero da família
Meruliaceae (KIRK et al., 2001), tem certas espécies poróides, sendo
próximo a Phanerochaete Karsten segundo ERIKSSON e seus
colaboradores (1981). Estudos moleculares, que consideram o gênero
Phlebia na família Corticiaceae, o localizam dentro de um grupo
denominado clado poliporóide, i. e., aparentado tanto a Ceriporiopsis,
quanto a Phanerochaete (HIBBETT E THORN, 2001).
Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. et Burds. tem sido citada
como outra espécie promissora para biopolpação e pré-tratamento de
resíduos agrícolas para produção de ração animal, uma vez que degrada
lignina seletivamente (VARES et al.,1994). No entanto, existem poucos
trabalhos na área de biopolpação com esta espécie e pouco se conhece
sobre o seu perfil de produção de enzimas extracelulares. Alguns
22
autores caracterizam P. tremellosa como produtora de LiP e lacase
(VARES et al., 1994; TUOR et al., 1995). No entanto, HATAKKA (1994)
afirma que esta espécie produz todas as enzimas ligninolíticas (LiP, MnP
e lacase), o que demonstra que são necessários mais trabalhos para
avaliar completamente esta espécie.
2.3.1. Mecanismo de ação sobre a lignina
Apesar da crescente importância de C. subvermispora na
aplicação industrial, o sistema enzimático extracelular deste fungo ainda
não está completamente esclarecido. Um grande problema a ser
elucidado é o diferente comportamento do sistema enzimático frente a
cada tipo de substrato. Muitas publicações têm mostrado que o
crescimento fúngico em substrato sólido é diferente quando comparado
ao meio líquido, e conseqüentemente, os padrões de produção das
enzimas e das isoenzimas são diferentes (MACHUCA e FERRAZ, 2001;
VICUÑA et al., 1996; URZÚA et al., 1995). SETHURAMAN et al. (1998)
acrescentam, ainda, que o padrão de produção das enzimas é
extremamente dependente da fonte de carbono utilizada.
C. subvermispora degrada lignina de um substrato
ligninocelulósico através da ação de manganês peroxidase e lacase. A
não produção da lignina peroxidases (LiP) seria crítica, pois essas
enzimas apresentam a habilidade de atacar estruturas não fenólicas da
lignina (RUTTIMANN-JOHNSON,1993, ENOKI et al., 1999, CÓRDOVA,
1999). No entanto, vários estudos revelaram ser eficiente a degradação
de lignina por C. subvermispora mesmo sem a produção de LiP
(RUTTIMANN-JOHNSON, 1993; SETHURAMAN, 1998). A produção de LiP
não tem sido detectada em cultivos desse fungo mesmo em diversos
meios e formas de cultivo (LOBOS et al., 1994). Um fato intrigante
nesse aspecto é a não detecção de lacases em condições de cultivo
onde o único substrato orgânico é o próprio composto lignocelulósico
23
(FERRAZ et al., 2002, SOUZA-CRUZ, 2002). Com isso, a degradação de
lignina por esse fungo deveria, a princípio, ser atribuída principalmente
a ação de MnP. Outro dado intrigante no modo de ação desse
organismo é o fato de que a degradação de lignina ocorre notoriamente
em pontos distantes da hifa fúngica, ou seja, o modelo erosivo de
degradação da parece celular vegetal não se aplica.
Em uma série de trabalhos esclarecedores JENSEN et al.(1996);
SREBOTNIK et al. (1997) e KAPICH et al. (1999) demonstraram que o
mecanismo químico envolvido na decomposição de lignina por C.
subvermispora deve enquadrar-se necessariamente em um modelo
onde um elétron é retirado diretamente de estruturas não fenólicas. Ou
seja, a retirada do elétron é induzida por uma espécie ativa com
elevado potencial de oxidação. Isso tem sido demonstrado pela
verificação dos produtos de degradação de um composto modelo de
lignina, marcado com carbono 14, ligado a uma cadeia polimérica de
polietilenoglicol (PEG). Nesses estudos propõe-se que a degradação
estaria relacionada com a peroxidação de lipídeos iniciada por Mn3+
oriundo da ação de MnP. Essa hipótese poderia, inclusive, explicar a
degradação da lignina no interior da parede celular da madeira através
de um processo não erosivo, uma vez que este é baseado na ação de
um mediador de baixa massa molar. Recentemente, KAPICH et al.
(1999) demonstraram que os radicais peroxila oriundos da peroxidação
de ácido linoléico por MnP de C. subvermispora podem atuar em
modelos de lignina não fenólicos, abstraindo um elétron (e um próton)
do carbono alfa, levando a posterior degradação de um composto
modelo de lignina.
2.4. Aspectos fisiológicos e morfológicos que interferem no
crescimento e na competição dos fungos pelo substrato
Quando falamos em fungos, uma exata definição de crescimento
24
depende do método utilizado em sua determinação. A maioria dos
métodos determina, diretamente ou indiretamente, o aumento em
massa de um inóculo após um conhecido tempo de incubação em um
meio de cultura completo. O aumento em massa ou o número de
células pode dessa forma ser usado como uma definição funcional de
crescimento. Em trabalhos experimentais utilizam-se meios sólidos em
placas de Petri e/ou meios líquidos, em culturas agitadas ou estáticas
(GRIFFIN, 1994). Um meio de cultura completo para o crescimento do
fungo deve ter além de água, substâncias orgânicas apropriadas como
fonte de carbono (ex. glicose), fonte de nitrogênio (ex. aminoácidos),
certos íons inorgânicos (ex. K+, SO42-, PO4
3-, íons metálicos) em
quantidades necessárias, e certos fatores orgânicos de crescimento (ex.
vitaminas) em concentrações baixas. Além da composição do meio, um
outro fator que afeta extensamente o desenvolvimento dos fungos na
cultura é o pH. A investigação da relação entre pH e crescimento
apresenta dificuldades. O problema é que o pH não varia sem alterar
outras características do meio de cultura e raramente se mantém
constante durante o crescimento, mesmo se o meio de cultura for
tamponado (INGOLD E HUDSON, 1993). Há uma lacuna na informação
sobre o efeito do pH nos parâmetros de crescimento do fungo, já que
suas atividades metabólicas alteram o pH, aumentando-o através da
absorção de ânions ou produção de amônia a partir de compostos
nitrogenados; ou reduzindo-o pela formação de ácidos orgânicos ou
absorção de cátions. Um tampão efetivo é difícil de ser utilizado em
cultura, já que estes podem ser assimilados pelo fungo ou serem
tóxicos em quantidades necessárias para uma tamponação eficiente. A
concentração de íons hidrogênio pode afetar o crescimento tanto
indiretamente pelo efeito na disponibilidade de nutrientes como
diretamente pela ação nas superfícies celulares e sobre a
permeabilidade da membrana. Quando os nutrientes requeridos são
satisfatórios, a maioria dos fungos cresce bem sobre uma larga faixa de
pH entre 4 e 7. Alguns fungos que produzem ácidos orgânicos são
25
capazes de tolerar condições consideravelmente mais ácidas (CARLILE E
WATKINSON, 1996).
Os sapróbios pertencentes à classe Basidiomycetes são
morfologicamente e bioquimicamente adaptados a viver sobre
substratos lignocelulósicos. Uma hipótese de sucessão na madeira
iniciaria com os mitospóricos comuns (mofos) e com os de tingimento
(“staining fungi”), continuando com os causadores de podridão mole e
culminaria com a penetração de micélio dos basidiomicetes causadores
de podridão parda e/ou branca (RAYNER & TODD, 1982). A colonização
de um determinado substrato por uma espécie de fungo depende em
parte pela habilidade competitiva saprofítica intrínseca e em parte pelo
balanço entre o potencial do próprio inóculo e as espécies competidoras.
A habilidade competitiva do fungo é determinada pela velocidade de
germinação dos esporos e a taxa de crescimento da hifa jovem na
presença de nutrientes solúveis do substrato; na habilidade de produzir
enzimas necessárias a decomposição de componentes solúveis e
insolúveis da madeira; na capacidade de lançar substâncias antibióticas
capazes de inibir o crescimento de outro fungo e bactéria; e na
habilidade de tolerar substâncias fungistáticas lançadas pelos outros
organismos. Conhecendo a habilidade competitiva sapróbia do fungo no
substrato é importante ainda considerar a energia para o crescimento
que cada fungo tem quando começa a colonização, isto é chamado
potencial de inóculo. Este depende do nível da população de um fungo
contaminante (número de esporos e unidades de hifa), idade, presença
de nutrientes no substrato e das condições ambientais (EATON E HALE,
1993).
Os basidiomicetes, especialmente aqueles que utilizam a madeira
como substrato tem um comportamento conhecido por ocupar um nicho
“economicamente” e por muito tempo, ou seja, mantém uma população
constante por longos períodos em equilíbrio com seu ambiente, a fim de
não esgotar o substrato. Este tipo de comportamento faz com que
métodos de competição antagonísticos sejam melhores para repelir uma
26
invasão de um substrato que ele já ocupa, do que competir pela
colonização de novos substratos. No processo de competição, alguns
basidiomicetes produzem antibióticos tais como substâncias fenólicas
efetivas contra bactérias Gram + (p. ex Ganoderma australe) e fungos
do solo (p. ex. Armillaria mellea), além de substâncias que inibem o
crescimento de outros fungos (p. ex. Oudemansiella), porém as
pesquisas sobre produção de antibióticos são ainda muito recentes
(STAMETS, 2002). Outro tipo de inibição, a interferência hifal, é mais
freqüentemente estudada em basidiomicetes do que a antibiose. Esta
ocorre somente quando existe um contato físico entre as hifas.
(CARLILE E WATKINSON, 1996; GERBER et al., 2000).
O fungo que utiliza a madeira como única fonte de nutrientes
mostra consideráveis adaptações tanto na sua morfologia como na sua
bioquímica. A hifa de uma única espécie pode diferir consideravelmente
em diâmetro, dependendo das condições ambientais e da sua posição
na colônia. Existem também claras diferenças entre as espécies.
Durante um determinado período de tempo de vida de uma colônia de
basidiomicetes, há muitas vezes diferenças consideráveis entre as hifas.
Inicialmente estas diferenças são simples como a taxa de crescimento,
ângulos de ramificação e largura, mais tarde diferem em espessura e
composição da parede, septações, conteúdo, habilidade de se agregar e
fundir com outras, translocar nutrientes e água e em perceber e reagir
a estímulos como a luz e a gravidade (CARLILE E WATKINSON, 1996).
2.5. Produção de inóculo
A palavra esporo define usualmente uma estrutura de reprodução
microscópica com vários atributos e funções. As suas funções mais
importantes são dispersão e sobrevivência, no entanto um mesmo tipo
de esporo normalmente não concilia estas duas funções, geralmente os
esporos dos basidiomicetes (basidiósporos) formados por reprodução
27
sexuada são melhores adaptados à dispersão do que a sobrevivência.
Os esporos cuja função primária é a dispersão, apresentam paredes
celulares finas e são pequenos em tamanho, estas características
prejudicam a sobrevivência destes por longos períodos quando as
condições ambientais não são favoráveis para o desenvolvimento de
novas gerações. Já os esporos cuja função primária é garantir a
sobrevivência da espécie durante períodos desfavoráveis para o
crescimento, tendem a ser maiores em tamanho e possuir uma
considerável reserva nutricional. As paredes celulares deste tipo de
esporos são grossas e dependem geralmente de algum fator ambiental
externo favorável para quebrar a condição de dormência (KRAMER,
1982).
Ceriporiopsis subvermispora e Phlebia tremellosa não produzem
esporos (basidiósporos) na fase miceliana dicarióptica. No entanto, têm
a capacidade de produzir assexuadamente esporos de resistência
(parede celular espessa), chamados clamidósporos (figura 9), quando
crescem em condições de estresse ambiental e/ou nutricional. O fato
destes fungos não produzirem basidiósporos na fase miceliana
dicarióptica, apesar de interessante do ponto de vista da aplicação do
fungo em ambientes abertos, pois não criaria problemas no que diz
respeito à dispersão de esporos e conseqüente interferência no
ecossistema local, gera alguns problemas para as etapas de
preparação, estocagem e transporte do inóculo.
a b
Figura 9 – Hifa com clamidosporos (a) terminal e (b) intercalar de Ceriporiopsis subvermispora SS3.
28
A capacidade de o fungo produzir clamidósporos, através de
indução (provocando estresse ao fungo), pode minimizar problemas na
produção de inóculo e estocagem como demonstrado por SAXENA e
seus colaboradores (2001), onde os clamidósporos foram separados do
micélio, estocados por longos períodos como um pó seco, à temperatura
ambiente, mantendo-se viáveis. Os clamidósporos se desenvolvem de
um único compartimento hifal, podendo ser intercalares ou terminais e
são bastante resistentes a condições severas do ambiente.
(ALEXOPOULOS et al., 1996).
SAXENA e seus colaboradores (2001) induziram a formação de
clamidósporos em C. subvermispora, através da manipulação de
diferentes parâmetros como estresse nutricional e osmótico. Dentre os
diferentes meios de estresse testados o mais eficiente (CaCl2 1%)
produziu cerca de 308 x 104 esporos/ml em 60 horas. Os clamidósporos
foram separados do micélio por tratamento enzimático, liofilizados e
estocados por até 6 meses à temperatura ambiente depois de
empacotados.
29
3. OBJETIVOS
O objetivo deste trabalho foi estudar o metabolismo extracelular
de Ceriporiopsis subvermispora (Pilát) Gilbn. e Ryv. e Phlebia tremellosa
(Fr.) Nakasone e Burdsall) evolutivamente aparentadas agindo sobre
duas espécies vegetais Pinus taeda L. e Eucalyptus grandis W. Hill ex
Maiden representantes de tipos diferentes de madeira para verificar se
as madeiras biotratadas apresentam respostas diferenciadas frente ao
processo de biopolpação. As espécies fúngicas em estudo foram, ainda,
comparadas quanto a capacidade para crescer em meios de culturas
simples e produzir clamidósporos, com o intuito de facilitar a produção
e armazenamento de inóculo em larga escala.
3.1 Objetivos específicos:
Definir padrões de degradação provocados pelas duas espécies
fúngicas sobre madeira das duas espécies vegetais selecionadas, em
três períodos de tempo pré-definidos, com adição ou não de co-
substrato.
Extrair e determinar as atividades enzimáticas extracelulares
hidrolíticas e oxidativas produzidas durante o processo de
biodegradação.
Caracterizar quimicamente a madeira biodegradada e verificar a
resposta desta à polpação Kraft de alto rendimento.
Avaliar o crescimento das espécies estudadas em meios de cultura
simples e em pH diferentes.
Induzir a produção de clamidósporos nas espécies estudadas e testar
a viabilidade e eficiência na colonização das espécies vegetais.
Analisar morfologicamente a colonização da madeira através de
microscopia óptica
Identificar o gênero dos contaminantes mais freqüentes presentes
nas pilhas de cavacos processados em uma planta piloto de
biopolpação.
Realização de ensaios in vitro de competição antagonística entre
Ceriporiopsis subvermispora e Phlebia e os fungos contaminantes
isolados.
30
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Fungos utilizados e manutenção das culturas
Duas espécies foram utilizadas correspondendo a 3 cepas, duas
delas de Ceriporiopsis subvermispora, uma delas (CS1) cedida pela
Universidad de la República, Montevideo, UY (Prof. M. Speranza), a
outra (SS3) enviada por Forest Products Laboratory, Madison, USA (Dr.
Masood Akhtar). A terceira cepa (ATCC 48745), refere-se a Phlebia
tremellosa e foi adquirida da American Type Culture Colection
As cepas foram mantidas a 4±2ºC, sem iluminação, em tubos de
ensaio com meio ágar extrato de malte (2% de extrato de malte, 0,7%
de extrato de levedura e 2% de ágar). Todo o processo de repicagem e
inoculação foi realizado em câmara de fluxo laminar.
4.2. Meios de cultura
Foram utilizados os seguintes meios de cultura, os quais foram
previamente esterilizados a 121oC por 15 minutos.
Sólidos ou agarizados;
AEML - Ágar extrato de malte (2% de extrato de malte, 0,7% de
extrato de levedura e 2% de ágar).
ABDL - Ágar batata (2,4% de extrato de batata dextrose, 0,7% de
extrato de levedura e 2% de ágar).
AM – ágar-milhocina (3% ágar e 4% milhocina)
Líquidos
CBL - Caldo batata (2,4% de extrato de batata dextrose e 0,7% de
extrato de levedura).
MS - milhocina (3,2%) e sacarose (2%).
31
Solução de milhocina (5 g em base seca suspensa em 100 mL de
água)
4.3. Preparação das madeiras para a biodegradação
As madeiras tiveram diferente origem, a de Pinus taeda proveio
de uma única tora oriunda do Parque Estadual de Campos do Jordão
(Campos do Jordão, SP) com aproximadamente 28 anos. Por outro
lado, árvores de cerca de 7-8 anos de Eucalyptus grandis, fornecidas
pela empresa Melhoramentos Ltda. (Caieiras – SP), foram as fontes
desta madeira.
Cavacos dessas madeiras medindo cerca de 3,0 X 1,2 X 0,2 cm
foram secos ao ar e estocados em condições isentas de umidade.
Previamente aos experimentos de biodegradação, os cavacos foram
imersos em água por um período de 16 horas O excesso de água foi
então drenado e os cavacos foram esterilizados no interior de
Erlenmeyers de 2L a 1 atm de pressão, 121oC por 15 minutos.
4.4. Preparação dos inóculos
Em placas de Petri (10 cm de diâmetro) foram adicionados cerca
de 15 mL de meio ABD. Estas placas foram inoculadas com pequenos
fragmentos provenientes de cultivos estoque e incubadas a 27±2oC. O
crescimento do micélio foi monitorado diariamente até que este
atingisse a borda da placa (de 7 a 10 dias), de onde foram extraídos
discos de ±8 mm de diâmetro. Em 200 mL de meio CB foram
introduzidos 20 discos obtidos do cultivo do micélio em meio sólido. Os
frascos permaneceram em incubação estática por 10 dias em estufa a
27±2oC. O micélio que foi obtido do cultivo em meio líquido (CB) foi
filtrado em funil de Buchner estéril e lavado com 300 mL de água
32
esterilizada. Em um liquidificador com copo de alumínio (estéril) de 500
mL foram batidos 3 vezes, por 15 segundos (com intervalos para evitar
o aquecimento), 100 mL de água destilada e a massa miceliana obtida
após a filtração. Uma alíquota desta suspensão foi utilizada para
inocular os cavacos nos Erlenmeyers. Para calcular a quantidade de
micélio na suspensão, foi feita a determinação da massa seca de fungo
presente numa alíquota dessa suspensão. Para determinar a massa
seca, 25 mL da suspensão foi filtrada, em papel filtro previamente seco
e tarado. O material retido no filtro, juntamente com o papel, foram
secos, inicialmente a 60°C e posteriormente a 105°C, até atingir massa
constante. Este procedimento foi realizado para cada cepa utilizada.
4.5. Experimentos de biodegradação de madeira
Cada espécie de madeira foi inoculada com os inóculos fúngicos e
cada experimento de biodegradação foi monitorado em três diferentes
períodos de tempo (7, 14 e 28 dias). Para cada cepa o experimento foi
realizado com a ausência ou presença de milhocina (0,5 g de
milhocina/100 g de madeira, ambos em base seca). A carga de inóculo
variou de acordo com a presença ou ausência de milhocina. Para
Eucalyptus grandis foi utilizado 5 mg de micélio/kg de madeira na
presença de milhocina, e 500 mg/kg na ausência do co-substrato; já
para Pinus taeda a carga de inóculo foi de 5 mg/kg na presença de
milhocina e 100 mg/kg na ausência do co-substrato (SOUZA-CRUZ,
2002; FERRAZ e AKHTAR, 1998 - dados não publicados).
Erlenmeyers de 2L foram carregados com 50 g de cavacos (base
seca) e inoculados com uma suspensão de micélio em razões pré-
definidas conforme descrito anteriormente. Nos cultivos onde houve a
adição de milhocina, um volume de 5 mL de solução de milhocina (5 g
em base seca suspensa em 100 mL de água) foi adicionado em cada
frasco. Nos cultivos sem a adição de milhocina, cada Erlenmeyer
33
recebeu 5 mL de água. Os cultivos amostrados no 7º dia foram
mantidos em sala termostatizada a 27±2oC. Os cultivos que foram
incubados por períodos superiores a 7 dias ficaram acondicionados em
câmaras de crescimento (27±2oC) com saturação de umidade do ar para
prevenir a perda de água da madeira. Os ensaios foram feitos com 6
repetições que foram amostradas da seguinte maneira: 3 cultivos para
extração e determinação de enzimas (SOUZA-CRUZ, 2002); 2 cultivos
para determinação de biomassa fúngica e 1 cultivo para determinação
do pH.
4.6. Determinação de Ph
Para cada condição e tempo de cultivo, 1 Erlenmeyer foi
reservado para a determinação do pH. O pH da madeira biodegradada
foi medido na água resultante da imersão das 50 g de cavacos em 300
mL de água bidestilada (pH 7,0) por 48 horas a uma temperatura média
de 25°C. O controle para a verificação da alteração do pH após a
biodegradação, foi feito com 50 g de madeira que passaram pelo
mesmo processo de imersão em água e esterilização anterior, mas não
sofreram o processo de inoculação do fungo e posterior biodegradação
(BROWNING,1967).
4.7. Extração das enzimas
A extração das enzimas foi conduzida com tampão acetato de
sódio 50 mM, pH 5,5, adicionado de 0,01% de Tween 60 (MACHUCA E
FERRAZ, 2001; SOUZA-CRUZ, 2002).
Ao término de cada período de incubação foram adicionados 200
mL de solução de extração aos Erlenmeyers. Foi realizada uma extração
de 5 horas, sob agitação (120 rpm) a 14±1oC. Foi utilizado o período de
34
5 horas de extração com base no estudo realizado por SOUZA-CRUZ e
colaboradores (2004) que demonstraram que cerca de 50% da
atividade enzimática de manganês-peroxidase contida no cultivo é
extraída nesse período. Os extratos enzimáticos foram recuperados por
filtração através de filtros de vidro sinterizado, de porosidade no 4,
seguida de uma segunda filtração a vácuo utilizando um filtro de
acetato de celulose, com poros de 0,47 μm, para que o extrato ficasse
totalmente translúcido.
As atividades enzimáticas relacionadas à degradação dos
principais componentes da madeira (celulose, hemicelulose e lignina)
foram determinadas em cada extrato enzimático e expressas como
unidades internacionais (UI) por quilograma de madeira inicial.
Atividades enzimáticas relacionadas à degradação de
celulose.
a) Celulase total: a atividade celulolítica total do extrato enzimático foi
determinada utilizando-se papel de filtro Whatman No 1 como substrato,
seguindo o método padrão descrito por MANDELS et al. (1976). Foram
incubados em um tubo de ensaio, 0,5 mL de extrato enzimático, 1,0 mL
de tampão citrato de sódio 50 mM (pH 4,8) e uma tira de papel filtro
correspondente a aproximadamente 50 mg. A mistura foi incubada a
50ºC por 1 hora. Os açúcares redutores liberados do papel de filtro pela
ação do complexo celulolítico, foram determinados pelo método do
ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) segundo MILLER (1959) e expressos
como μmoles de glicose, com base em uma curva de calibração feita
com o mesmo açúcar. Para isso, à solução anterior, foram adicionados 3
mL de reagente DNS e a mistura foi mantida por 5 minutos em banho-
maria a 100°C. Após resfriamento, foi feita a leitura da absorbância em
540 nm em um aparelho de UV-visível (GBC-CINTRA 20). Um controle
foi obtido pela incubação do papel de filtro em tampão citrato de sódio
35
50 mM (pH 4,8), substituindo os 0,5 mL de extrato enzimático por
água. Um segundo controle foi obtido para contabilizar os açúcares
redutores presentes no caldo de cultivo. Nesse caso se omitiu o
substrato do meio reacional.
b) endoglucanase: esta atividade foi determinada pela liberação de
açúcares redutores a partir de carboximetilcelulose (CMC) seguindo o
método padrão descrito por TANAKA et al. (1981). Os açúcares
redutores liberados foram determinados pelo método do DNS e
expressos como μmoles de glicose, com base em uma curva de
calibração feita com o mesmo açúcar. Para este ensaio foi utilizado
como substrato uma solução de CMC 0,44 % (p/v) dissolvida em
tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,5. Em um tubo de ensaio foram
adicionados, 0,1 mL de extrato enzimático e 0,9 mL de solução de CMC.
A mistura foi incubada a 50ºC por 60 min. Após esse período, foram
adicionados 1,5 mL de DNS ao tubo de ensaio e este foi mantido em
banho-maria a 100 °C por 5 minutos. Após o resfriamento, a leitura da
absorbância foi feita no comprimento de onda de 540 nm. A reação
controle dessa determinação foi realizada substituindo os 0,1 mL de
extrato enzimático por água. Um segundo controle foi preparado
substituindo-se o substrato do meio reacional por água.
4.9. Atividades enzimáticas relacionadas à degradação de
hemicelulose
Xilanase total: esta atividade foi determinada pela liberação de
açúcares redutores a partir de xilana de bétula seguindo o método
padrão descrito por BAILEY et al. (1992). Os açúcares redutores
liberados foram determinados pelo método do DNS e expressos como
μmoles de xilose, com base em uma curva de calibração feita com o
mesmo açúcar. Para este ensaio foi utilizado como substrato uma
36
solução de xilana 1% (p/v) (“birchwood xylan” - SIGMA X-0502)
dissolvida em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,5. Em um tubo de
ensaio, foram colocados 0,1 mL de extrato enzimático e 0,9 mL de
solução de xilana. A mistura foi incubada a 50ºC por 5 min. Após esse
período, foram adicionados 1,5 mL de DNS ao tubo de ensaio e este foi
mantido em banho-maria a 100 °C por 5 min. Após o resfriamento, a
leitura da absorbância foi feita no comprimento de onda de 540 nm. A
reação controle dessa determinação foi realizada substituindo os 0,1 mL
de extrato enzimático por água. Um segundo controle foi preparado
substituindo-se o substrato do meio reacional por água.
4.10. Atividades enzimáticas relacionadas à degradação de
lignina
a) Lacase: a atividade foi determinada utilizando-se como substrato
solução etanólica de siringaldazina em concentração de 1 mM. A reação
de oxidação foi conduzida pela mistura de 0,3 mL de tampão citrato-
fosfato 50 mM (pH 5,0), 0,1 mL de água, 0,5 mL de extrato e 0,1 mL
solução de siringaldazina 1 mM. A reação foi monitorada entre 10 s e 5
min através da leitura da absorbância em 525 nm. A atividade
enzimática foi calculada com base na absortividade molar da
siringaldazina oxidada (ε525 = 65.000 M-1.cm-1) segundo SZKLARZ et al.
(1989). Também foi utilizado como substrato para determinar a
atividade de lacase uma solução de ABTS 1mM (2,2'-azinobis (3-
ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), utilizando as mesmas condições
de reação descritas anteriormente para siringaldazina. As reações foram
monitoradas em 420 nm para o produto de oxidação do ABTS (ε420 =
36.000 M-1.cm-1). Nesse caso, um controle foi obtido para descontar a
absorção do extrato enzimático em 420 nm. O controle foi feito
substituindo-se o substrato por água.
37
b) Mn-peroxidase (MnP): foi determinada pela oxidação de vermelho
de fenol 0,1% (a dissolução do vermelho de fenol em água foi feita pelo
ajuste continuado do pH em 7,4). A reação foi conduzida em tubos de
ensaio que continham 1,5 mL de tampão succinato de sódio 20mM (pH
4,5), 1,5 mL de lactato de sódio 50 mM, 0,5 mL de extrato, 0,5 mL de
vermelho de fenol 0,1%, 0,5 mL de MnSO4 1 mM, 0,25 mL de albumina
bovina 2 mM e 0,25 mL de peróxido de hidrogênio 2 mM (LUNDELL et
al.,1990). Em intervalos de tempo definidos entre 1 e 10 minutos, 1 mL
da solução contida no tubo de ensaio foi removida e a esse volume
foram adicionados 30 μL de hidróxido de sódio 6,5 M para interromper a
reação e realizar a leitura no espectrofotômetro. A cinética da reação foi
avaliada medindo-se a absorbância do produto de reação em 610 nm. A
atividade de MnP foi calculada com base na absortividade molar do
vermelho de fenol oxidado (22.000 M-1.cm-1) (KHINDARIA et al., 1994).
c) Lignina peroxidase (LiP): a atividade foi determinada pela
oxidação de Azure B. A reação foi feita com 0,25 mL de Azure B 320
μM, 1,25 mL de tampão tartarato de sódio 50 mM (pH 4,5), 0,5 mL de
extrato e 0,5 mL de H2O2 2 mM. A leitura da absorbância foi feita em
651 nm, onde um extrato ativo induz ao decréscimo de absorção nesse
comprimento de onda (ARCHIBALD, 1992). O controle dessa reação
continha substrato e substituição do extrato enzimático por água. Como
o controle da reação apresenta absorbância em 651 nm, o
espectrofotômetro é zerado com água destilada.
4. 11. Atividade enzimática relacionada à degradação de
celulose e lignina
Celobiose desidrogenase (CDH): a atividade foi determinada
espectrofotometricamente pela diminuição da absorbância do
diclorofenol-indofenol (DCPIP) a 520 nm (ε520 = 6800 M-1 cm-1), pH 4,0
38
e 37oC. A mistura reacional continha 0,2 mL de DCPIP 3 mM, 0,2 mL de
lactose 300 mM, 0,2 mL de fluoreto de sódio 40 mM, 0,4 mL de extrato
enzimático e 1 mL de tampão acetato de sódio 100 mM (pH 4,0)
(BAMINGER et al., 1999).
4.12. Determinação da biomassa fúngica através da
quantificação de ergosterol
Amostras de madeiras biodegradadas por 28 dias foram secas e
moídas para a determinação do teor de ergosterol de acordo com
metodologia descrita por MONTGOMERY et al. (2000).
Em tubos de ensaio foram adicionados 250 mg de madeira moída,
2 mL de metanol e 1 mL de NaOH 1 M. Os tubos foram vedados e
colocados dentro de um forno de microondas doméstico operando a
2450 MHz e 900 W. O forno foi ligado em potência média e o material
foi irradiado por 18 s. Após o resfriamento (aproximadamente 15 min),
o material foi novamente irradiado por mais 17 s em potência média.
Após resfriamento, os tubos foram abertos e a suspensão resultante foi
neutralizada com 1 mL de HCl 1 M e adicionada de mais 2 mL de
metanol. A suspensão foi então extraída com pentano em agitador
“Vortex” (3 extrações com 2 mL de pentano em cada uma). Os extratos
de pentano foram combinados, filtrados em filtro com membrana de
0,45 μm (Acrodisc Gelman) e evaporados sob fluxo de gás nitrogênio. O
resíduo foi diluído em 2 mL de metanol e analisado por cromatografia
líquida de alta eficiência.
A análise por cromatografia utilizou uma coluna de fase reversa
C18 eluída com metanol a um fluxo de 1 mL/min. Foi utilizado um
detector de UV operando em um comprimento de onda de 282 nm. A
concentração de ergosterol presente na amostra foi determinada
através de uma curva de calibração construída com solução padrão de
ergosterol em metanol.
39
4.13. Análise morfológica da colonização da madeira por
microscopia óptica.
As amostras de madeira foram cortadas manualmente nos
sentidos paralelo e transversal às fibras com o auxílio de uma lâmina de
barbear. Uma preparação, que requer duas colorações, foi utilizada para
corar os cortes de madeira dos ensaios de biodegradação facilitando as
observações ao microscópio óptico. Inicialmente foi utilizado o corante
verde malaquita (solução aquosa 0,5% (p/v)) no qual os cortes ficaram
embebidos por 5 minutos, em seguida os cortes foram imersos em água
para retirar o excesso de corante. Após este passo, os cortes ficaram
embebidos em floxina (solução aquosa 1% (p/v)) e posteriormente
foram posicionados entre lâmina e lamínula, para visualização. Os
cortes foram observados em aumentos que variaram de 40X a 1000X.
As microestruturas fúngicas encontradas foram medidas com o auxílio
de uma lente ocular com disco micrometrado. No procedimento de
coloração dos cortes utilizou-se o verde malaquita (coloração verde)
que tem afinidade por células de madeira e a floxina (coloração rosa)
que a apresenta com hifas do fungo, aumentando assim o contraste nas
observações (GILBERTSON E RYVARDEN, 1986). As amostras
analisadas representaram dois cavacos colonizados provenientes dos
mesmos cultivos utilizados para a determinação de ergosterol para os
diferentes períodos de cultivo.
4.14. Determinação da perda de massa seca da madeira
Após a extração dos cavacos com tampão acetato (extração de
enzimas), os mesmos foram lavados com água destilada e secos ao ar.
A umidade desses cavacos foi determinada em balança aquecida com
infravermelho (OHAUS) e a perda de massa foi calculada como massa
seca inicial menos massa seca final dividida pela massa seca inicial.
40
4.15. Determinação da composiç ão química em amostras de
madeira
Os cavacos foram previamente moídos em um moinho de facas
até passarem por uma malha com perfurações de 0,75 mm e extraídos
por 6 h em Soxhlet com etanol 95%.
O teor de componentes (glucana, polioses e lignina,) foi
determinado a partir da hidrólise do material com H2SO4 72% (FERRAZ
et al., 2000b). Cerca de 300 mg de amostra seca ao ar foram tratados
com 3 mL de H2SO4 72% (peso/peso) por uma hora a 30oC. Em
seguida, o conteúdo do tubo de ensaio foi transferido quantitativamente
para um Erlenmeyer de 250 mL com o auxílio de 79 mL de água. A
mistura foi autoclavada a 121oC/60 min, resfriada e filtrada em filtros
de vidro sinterizado de porosidade número 3, previamente secos a
105oC e pesados. O material retido foi lavado com 2 porções de 5 mL de
água e seco até massa constante. Esse resíduo corresponde à lignina
insolúvel em ácido (Klason). O filtrado foi avolumado a 100 ml e
analisado quanto aos teores de açúcares em um sistema de
cromatografia líquida. A análise cromatográfica foi feita em um
cromatógrafo líquido de alta eficiência utilizando uma coluna BIORAD
HPX-87H, aquecida a 45ºC e H2SO4 5 mM a 0,6 mL/min como eluente e
um detector de índice de refração (SHIMADZU).
A concentração de açúcares foi determinada através de curvas de
calibrações preparadas com padrões de grau analítico, secos sob sílica e
vácuo.
O teor de lignina solúvel em ácido foi determinado através da
leitura em 205 nm de uma diluição (usualmente 2:10) do hidrolisado,
tomando-se como padrão uma absortividade de 105 L/g.cm neste
comprimento de onda.
41
4. 16. Determinação da perda de componentes durante a
biodegradação
O cálculo da perda de componentes (glucana, polioses e lignina)
foi feito como segue:
Pc(%) = [(mci – mcf)/mci] x 100
Onde:
Pc : perda de componentes
mci : % de componente na madeira controle x massa de madeira inicial
mcf : % de componente na madeira biodegradada x massa de madeira final
4. 17. Verificação da resposta das amostras biodegradadas
frente à polpação Kraft de alto rendimento
Essa etapa avaliou o comportamento das amostras biotratadas
frente a um processo químico de polpação de alto rendimento.
As reações de polpação pelo processo Kraft foram feitas em
condições pré-otimizadas a fim de preparar polpas com números kappa
entre 40 e 120 (MENDONÇA et al., 2002). A reação foi realizada em
ampolas de aço inox 316 de 80 mL, as quais foram carregadas com 10
g de madeira (base seca) e 60 mL de licor contendo 22,5% de álcali
ativo (como NaOH) e 25% de sulfidez no caso de P. taeda (BIERMANN,
1993) e 17% de álcali ativo (como NaOH) e 25% de sulfidez no caso de
E. grandis. As ampolas foram seladas e imersas num banho de silicone,
que foi aquecido progressivamente, a fim de permitir um tempo de 30
min de aquecimento até atingir a temperatura de cozimento de 170º C
para P. taeda e 150°C para E. grandis. Para cada amostra biotratada
foram realizadas 4 ou 5 polpações simultâneas variando o tempo de
cozimento. Em P. taeda os tempos de cozimento foram 60, 80, 100 e
120 minutos, já em E. grandis os tempos de cozimento foram 40, 60,
80, 100 e 140 minutos. Após as reações, o material residual da digestão
42
(polpa mais rejeitos) foi lavado com água para eliminação de resíduos
de álcali e lignina solúvel. O material lavado foi seco a 105ºC até massa
constante. O rendimento de polpa não classificada foi determinado com
base nas massas iniciais e finais secas. Todo o material seco foi então
moído e submetido à caracterização química para determinar os teores
de lignina (item 3. 16).
4.18. Comportamento das cepas em meios agarizados ou não,
sem presença da madeira.
4.18.1. Avaliação do crescimento dos basidiomicetes em meio agarizado
com diferentes pHs.
Esta avaliação foi realizada com o intuito de verificar qual seria o
melhor pH para obter um crescimento mais rápido de cada
basidiomicete. O crescimento dos fungos foi monitorado em placas de
Petri contendo os meios de cultura ABD e AM com pH previamente
ajustados entre 3 e 6. O pH foi corrigido com HCl 1 M. As placas
inoculadas foram mantidas em estufa a 27oC e o diâmetro das colônias
foi monitorado diariamente até que chegasse à borda da placa de Petri.
4.18.2. Curva de crescimento dos basidiomicetes em meio líquido
O crescimento das 3 cepas estudadas foi avaliado em meios de
cultivo simples e de baixo custo, com a finalidade de verificar a
capacidade de cada cepa produzir inóculo em escala ampliada. Foram
determinadas as curvas de crescimento de cada cepa sobre meios de
cultura líquidos como CB e MS mantendo a mesma relação C/N do meio
anterior (16 eqC/ 1eqN). O meio líquido CB foi tamponado com acetato
de sódio 10 mM (2,4% de extrato de batata e 0,7% de extrato de
levedura, 0,048% (v/v) de ácido acético glacial, 0,0207% (p/v) de
acetato de sódio) e seu pH inicial foi corrigido para 4,0 com HCl 1 M.
Em Erlenmeyers de 250 mL com 20 mL de meio de cultura, foram
43
introduzidos 2 discos de inóculo, obtidos em placas com meio de cultura
CB. Os frascos permaneceram em incubação estática a 27±1oC por
períodos definidos entre 2 e 22 dias. O micélio obtido do cultivo em
meio líquido foi filtrado em papel de filtro (previamente seco e tarado).
Do micélio retido no papel filtro foi retirada uma pequena amostra para
observação em microscópio óptico. Em seguida a massa seca de fungo
foi determinada secando-a inicialmente a 60°C e posteriormente a
105°C até atingir massa constante. O consumo de açúcares redutores
totais durante o crescimento do fungo foi monitorado pelo método do
DNS (item 3.9).
4.19. Análise morfol ógica do micélio por microscopia óptica.
Para as culturas em meio líquido ou sólido, um fragmento do
micélio retirado do cultivo foi colocado sobre um preparado que
continha uma gota de solução aquosa de hidróxido de sódio 5% (p/v) e
uma gota de solução aquosa de floxina 1% (p/v) segundo GILBERTSON
E RYVARDEN (1986). Outro fragmento do micélio foi colocado sobre
uma gota de reagente de Melzer (SINGER, 1975). Os fragmentos foram
observados em aumentos que variaram de 40X a 1000X.
4.20. Isolamento de espécies contaminantes
Fungos contaminantes encontrados sobre os cavacos oriundos de
uma planta piloto de biopolpação localizada na empresa Melhoramentos
Ltda.,Caieiras – SP, foram isolados e identificados. O isolamento iniciou-
se com a retirada de um pouco de micélio do contaminante existente no
cavaco e foi seguido pela inoculação deste em placas de Petri com meio
AEM. As placas inoculadas foram mantidas em estufa a 27±2oC e o
crescimento do micélio foi monitorado diariamente até que este
44
atingisse a borda da placa (de 7 a 10 dias). Após o período de
crescimento, as placas que não apresentaram mais de uma cultura
tiveram seu micélio repicado novamente e essas culturas foram
observadas ao microscópio para identificação, através de características
morfológicas do micélio, tais como as estruturas de reprodução.
4.21. Confronto de espécies
Os isolados de contaminantes descritos no item 3.20 foram
confrontados com C. subvermispora (cepas SS3 e CS1) e P. tremellosa
(ATCC 48745). Este confronto foi realizado em placa de Petri em meio
de cultura CB. Em placas de Petri colocaram -se, em bordas opostas,
um inóculo de cada contaminante e um inóculo de cada uma das três
cepas (SS3, CS1 e ATCC 48745). As placas inoculadas foram mantidas
em estufa a 27±2oC, sem iluminação, sendo o crescimento dos micélios
monitorado diariamente até que houvesse o encontro de cada par de
micélios confrontado.
4.22. Indução à formação de clamidósporos nas espécies
estudadas
C. subvermispora (SS3 e CS1) e P. tremellosa (ATCC 48745)
foram inicialmente cultivados por 12 dias em CB. Após este período, foi
adicionado ao meio CaCl2 1% (p/v) (concentração final) estéril, para
provocar estresse osmótico e induzir a formação de clamidósporos no
micélio. Este foi analisado em microscópio óptico a cada 24 horas para
verificação de presença de clamidósporos. A observação foi realizada
em lâminas preparadas com soluções aquosas de hidróxido de sódio 5%
e de floxina 1% (GILBERTSON e RYVARDEN, 1986). Uma estimativa da
45
quantidade de clamidósporos formados foi feita pela classificação visual
(figura 10) entre muito (++++), médio (+++), pouco (++),
pouquíssimo (+) e ausência (-).
a b
c d
Figura 10 – Classificação visual da quantidade de clamidósporos em (a) muito (++++), (b) médio (+++), (c) pouco (++) e (d) pouquíssimo (+).
4.23. Viabilidade dos clamidósporos na colonização da madeira.
Com os cultivos em que houve a indução da formação de
clamidósporos, foi realizado um teste onde o micélio foi batido em
liquidificador em ciclos subseqüentes de 15 segundos, a fim de verificar
se as hifas presentes no micélio seriam danificadas e os clamidósporos
permaneceriam intactos. Após cada ciclo de 15 segundos, o micélio foi
observado ao microscópio óptico para estabelecer quantos ciclos não
interfeririam na morfologia, mantendo os clamidósporos intactos, i. e.,
visualmente sem rompimentos ou quebras. O padrão estabelecido foi de
46
10 ciclos de 15s. Com o micélio batido no padrão estabelecido acima foi
realizado um novo experimento de biodegradação de madeira (em
triplicata) para cada uma das espécies. Os cultivos foram de 14 dias de
incubação e não continham milhocina. As cargas de inóculo utilizadas
foram 500 mg de fungo /kg de madeira para Eucalyptus grandis e de
100 mg de fungo /kg de madeira para Pinus taeda. A atividade
enzimática de MnP, produzida nesses cultivos foi determinada como
descrito no item 4.10.
47
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. ENSAIOS DE BIODEGRADAÇÃO DE MADEIRA
Foram realizados ensaios de biodegradação de madeira utilizando
as cepas de fungo de podridão branca, C. subvermispora (SS3 e CS1) e
P. tremellosa (ATCC 48745). Em cada ensaio foram utilizadas duas
espécies de madeira: P. taeda (Gimnosperma – madeira dura) e E.
grandis (Angiosperma - madeira mole) e para cada uma avaliaram-se
as condições de cultivo onde houve ou não a adição de co-substrato
(milhocina). A milhocina minimiza a demanda por uma elevada carga
inicial de inóculo permitindo um expressivo crescimento de micélio
fúngico a partir da sua metabolização inicial, já que este co-substrato é
de fácil assimilação (AKHTAR et al., 1998). No caso dos ensaios de
biodegradação com adição de milhocina, a carga de inóculo foi de 5 mg
de fungo/ Kg de madeira para ambas as espécies de madeira, enquanto
que nos ensaios sem adição de co-substrato as cargas de inóculo
utilizadas em cada cultivo foram de 100 mg de fungo/ Kg de madeira
para P.taeda (20 vezes maior) e de 500 mg de fungo/ Kg de madeira
para E. grandis (100 vezes maior), independente da cepa de fungo
utilizada.
Está amplamente descrito na literatura que cada espécie de
vegetal apresenta uma resistência própria à biodegradação. De forma
geral, diferenças anatômicas e estruturais dos componentes da madeira
são a causa dessa variabilidade (KIRK E CULLEN, 1998). Outro aspecto
relevante é a presença de compostos inibidores do metabolismo fúngico
em algumas espécies de madeira que a tornam mais resistente à
biodegradação e, com isso, um certo grau de degradação somente pode
ser atingido a partir de determinada carga de inóculo fúngico inicial. Em
estudos prévios foi demosntrado que C. subvermispora é capaz de
degradar P. taeda eficientemente a partir de uma carga de inóculo de
48
100 mg/Kg de madeira (ambos em base seca) (SOUZA-CRUZ, 2002).
No caso de E. grandis essa carga é maior, situando-se entre 400 e 500
mg de fungo/Kg de madeira (André Ferraz, dados não publicados,
Figura 11).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 250 500 750 1000
Carga de inóculo (mg/kg de madeira)
Per
da d
e pe
so (%
)
Figura 11 – Perdas de massa de E. grandis após 15 dias de biodegradação por C. subvermispora SS-3.
O crescimento fúngico foi avaliado com base no teor de ergosterol
encontrado nas amostras de madeira biodegradada nas diferentes
condições de cultivo, já que o ergosterol está diretamente
correlacionado com a membrana fúngica (MONTGOMERY et al., 2000).
Utilizando este parâmetro avaliou-se a possibilidade de reduzir as
cargas de inóculo nos experimentos de biodegradação de madeira
através da adição de milhocina como co-substrato.
Na figura 12 estão apresentados os teores de ergosterol
encontrado em função do tempo de cultivo na madeira biodegradada.
49
Pt/SM
0
1 0
20
30
40
0 7 14 21 28
Pt/CM
0
10
20
30
40
0 7 14 21 28
Eg/SM
0
10
20
30
40
0 7 14 21 28
Eg/CM
0
10
20
30
40
0 7 14 21 28
Erg
ost
ero
l (m
g/
Kg
de m
ad
eir
a)
Período de experimentação da biodegradação (dias)
Figura 12 – Crescimento fúngico estimado a partir do teor de ergosterol detectado nas amostras de madeira biodegradada (P. taeda – Pt e E. grandis - Eg) por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) ao longo do período de incubação. Como inóculo utilizou-se 5 mg de fungo/Kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/Kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios).
Comparando os teores de ergosterol obtidos nos cultivos sem e
com a adição de milhocina na figura 12, pode-se afirmar que a adição
de milhocina efetivamente permite um crescimento eficiente mesmo
com cargas de inóculo tão baixas quanto 5 mg/kg de madeira e que nos
cultivos onde a milhocina não foi adicionada como co-substrato, as
cargas de inóculo requeridas foram expressivamente maiores como 100
mg/Kg de madeira (20 vezes) e 500 mg/Kg (100 vezes) de madeira,
quando os substratos eram P. taeda e E. grandis, respectivamente.
Estes dados confirmam que em ensaios de biopolpação pode-se reduzir
a carga de inóculo adicionando um co-substrato de fácil assimilação,
como demonstraram AKTHAR et al. (1998), mantendo a eficiência na
biopolpação semelhante tanto para cargas de inóculo de 3 g de
micélio/Kg de madeira sem adição de co-substrato quanto para 5 mg de
50
micélio/Kg de madeira com adição de 0,5% de milhocina.
5.1.1. Produção de enzimas extracelulares e compostos de
baixa massa molar
Nesse trabalho, as atividades de enzimas oxidativas e hidrolíticas
vinculadas à decomposição de lignina, bem como a de celobiose
desidrogenase (CDH) relacionada tanto com a degradação de celulose
como de lignina, apresentaram padrões diferentes entre as espécies
estudadas. Cada uma delas será abordada e discutida nos itens a
seguir, comparando os dados obtidos.
5.1.1.1. Atividade enzimática de manganês peroxidase
Na figura 13 estão apresentadas as atividades enzimáticas de
manganês peroxidase detectadas nos extratos obtidos a partir dos
ensaios de biodegradação utilizando C. subvermispora SS3, CS1 e P.
tremellosa (ATCC 48745) e as madeiras de P. taeda e E. grandis, em
cultivos com e sem a adição de milhocina.
51
Pt/SM
0200400600800
1000120014 0 01 6 0 01800
4 1 8
Pt/CM
0200400600800
100012001400160001800
0 7 1 2 2 0 7 1 2 2 4 1 8
Eg/SM
0200400600800
10001200140016001800
0 7 1 2 2
Eg/CM
0200400600800
10001200140016001800
4 1 8 0 7 1 2 2 4 1 8
Ati
vid
ad
e e
nzi
máti
ca U
I/K
g
Período de experimentação da biodegradação (dias)
Figura 13 – Produção de MnP por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -), na biodegradação de P. taeda (Pt) e E. grandis (Eg) ao longo do período de incubação. A carga de inóculo usada foi de 5 mg de fungo/Kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/Kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios).
As atividades de MnP apresentaram um pico de atividade
enzimática aos 14 dias de cultivo em ambas as espécies de madeira na
maioria das cepas fúngicas estudadas (fig. 13). No cultivo com a adição
de milhocina sobre E. grandis, C. subvermispora CS1 foi à única cepa a
apresentar uma atividade crescente após 14 dias de cultivo. Quando
comparamos as atividades de MnP entre os cultivos com e sem a adição
de milhocina, nota-se claramente que, para as três cepas, a adição de
milhocina provocou um aumento expressivo e significativo da
quantidade de enzima detectada no meio. Nos cultivos onde não houve
adição de co-substrato, a produção de MnP seguiu a seguinte
seqüência: C. subvermispora SS3 > C. subvermispora CS1 e P.
tremellosa em ambas as espécies de madeira estudadas, sendo que em
E. grandis a quantidade de enzima produzida pelas diferentes cepas foi
maior do que em P. taeda. C. subvermispora CS1 e P. tremellosa
52
produziram níveis de atividade de MnP semelhantes entre si tanto nos
cultivos em E. grandis como em P. taeda sem adição de milhocina. Nos
cultivos com adição de milhocina, a produção de MnP foi maior e
diferenciada entre as cepas. C. subvermispora SS3 aparece como a
produtora dos maiores níveis de enzima nos cultivos em ambas
madeiras. No cultivo sobre P. taeda, C. subvermispora CS1 apresentou
maior atividade enzimática que P. tremellosa, o mesmo ocorreu no
cultivo sobre E. grandis, com exceção da atividade de MnP encontrada
aos 14 dias de cultivo, onde Phlebia tremellosa produziu mais enzima
que C. subvermispora CS1.
5.1.1.2. Atividade enzimática de lignina peroxidase
A atividade de LiP foi ensaiada, utilizando como substrato “Azure
B” (ARCHIBALD, 1992), em todos os extratos enzimáticos obtidos a
partir de todas as condições de biodegradação. Esse substrato revela
atividade da enzima pela diminuição da absorção do corante na região
do espectro visível, ficando livre das interferências causadas pelos
compostos que absorvem na região do ultravioleta como os fenóis e as
quinonas. O método “Azure B”, pode ser mais vantajoso para detectar
LiP em fermentação em meio de sólido de compostos lignocelulósicos
onde os extratos enzimáticos são escuros (ARORA E GILL, 2001).
Mesmo utilizando este substrato (“Azure B”), em nenhum extrato
produzido pelas cepas estudadas, sob nenhuma condição de
experimentação, foi detectada atividade de LiP. SOUZA-CRUZ e
colaboradores (2004) também não detectaram atividade de LiP em
cultivos de C. subvermispora sobre P. taeda, por períodos de até 90
dias de incubação. Segundo LOBOS et al. (1994), LiP não tem sido
detectada em culturas de C. subvermispora e isso, provavelmente
ocorre porque esta enzima realmente não é produzida ou sua detecção
é dificultada pela forte adsorção ao substrato ou ainda pela presença de
53
substâncias interferentes nos extratos enzimáticos (principalmente em
substratos como a madeira). A possibilidade de que a LiP seja produzida
em pequenas quantidades e/ou seja de difícil detecção existe, uma vez
que, segundo RAJAKUMAR et al. (1996), C. subvermispora possui genes
semelhantes aos responsáveis pela expressão de LiP em outros fungos
ligninolíticos.
Existem artigos que apresentam diferentes espécies de Phlebia (P.
radiata, P. brevispora, P. tremellosa) como produtoras de LiP e outros
que afirmam que estas mesmas espécies não produzem esta enzima. As
condições de cultivo descritas nesses trabalhos são bastante distintas,
os métodos de determinação da atividade enzimática são variáveis e
utilizam diferentes substratos de reação, isso dificulta a comparação
entre os resultados obtidos (VARES et al., 1994; TUOR et al., 1995).
HATAKKA (1994) afirma que P. tremellosa tem a capacidade de produzir
LiP (álcool veratrílico como substrato da reação) em culturas submersas
sob agitação em biorreatores. Nessas condições foram encontradas
várias isoenzimas de LiP produzidas por diferentes cepas de P.
tremellosa (VARES et al., 1994).
No presente trabalho, no entanto, pudemos demonstrar que
durante a experimentação de biodegradação com P. taeda e E. grandis,
com e sem adição de milhocina, P. tremellosa não produziu quantidades
detectáveis de LiP.
Outras espécies de Phlebia também apresentam divergências no
que diz respeito à detecção de atividade enzimática de LiP. Em um
trabalho recente, KAPICH e colaboradores (2005) não detectaram
atividade de LiP (com álcool veratrílico como substrato da reação) em P.
radiata quando cultivada em meio contendo palha de trigo. No entanto,
ARORA e colaboradores (2002) afirmam que várias espécies de Phlebia
(P. fascicularia, P. floridensis e P. radiata) produziram LiP em cultivos
que também continham palha de trigo. Neste último trabalho, os
ensaios enzimáticos foram realizados usando Azure B como substrato.
Aparentemente a produção de LiP é característica das espécies de
54
Phlebia e as dificuldades de detecção da atividade são provavelmente
relacionadas às diferenças nas condições de cultivo e aos diferentes
substratos utilizados para quantificar esta enzima.
5.1.1.3. Atividade enzimática de lacase
As atividades enzimáticas de lacase detectadas (figura 14)
apresentam-se relativamente baixas em todos os cultivos avaliados.
Enquanto os níveis de MnP chegaram a 1556 UI/Kg de madeira, os
níveis de lacase não ultrapassaram 55 UI/Kg de madeira.
Pt/SM
0
10
20
30
40
50
60
0 7 14 21 28
Pt/CM
0
10
20
30
40
50
60
0 7 14 21 28
Eg/SM
0
10
20
30
40
50
60
0 7 14 21 28
Eg/CM
0
10
20
30
40
50
60
70
0 7 14 21 28
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Período de experimentação de biodegradação (dias)
Figura 14 – Produção de lacase por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -), na biodegradação de P. taeda (Pt) e E. grandis (Eg) ao longo do período de incubação. A carga de inóculo usada foi de 5 mg de fungo/Kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/Kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios).
Na figura 14 nota-se que o pico de atividade enzimática de lacase,
ocorre no 7O dia. Os níveis de atividade de lacase detectados para as
três cepas quando o substrato utilizado no ensaio de biodegradação era
55
P. taeda, foram semelhantes não ultrapassando 20 UI/kg de madeira.
Já nos ensaios com E. grandis, P. tremellosa destacou-se como maior
produtora de lacase principalmente no 7O dia de cultivo, enquanto que
as duas cepas de C. subvermispora produziram níveis de lacase
parecidos entre sí, além de 3 a 4 vezes menores do que os detectados
para P. tremellosa. Nos cultivos com adição de milhocina, as atividades
de lacase praticamente dobraram quando comparadas às atividades
encontradas nos cultivos sem a adição de co-substrato. ENOKI et al.
(1999) e HAKALA et al.(2005) afirmam que C. subvermispora produz
está enzima nos estágios iniciais de biodegradação da madeira e
geralmente isso ocorre quando o cultivo recebe adição de um co-
substrato como a milhocina ou glicose. VARES e colaboradores (1994)
também observaram que em várias espécies do gênero Phlebia o pico
de atividade da lacase aparece nos períodos iniciais de biodegradação e
diminui rapidamente.
Com base nos dados das atividades enzimáticas oxidativas
detectadas nos extratos obtidos a partir de cada condição de cultivo,
pode-se concluir que dentro do complexo enzimático degradador de
lignina, as MnP, são claramente as principais enzimas produzidas pelas
três cepas em estudo.
5.1.1.4. Atividades enzimáticas de celulases totais
Dentro do complexo hidrolítico foram determinadas às atividades
de celulase total, endoglucanase e xilanase total, utilizando como
substratos papel de filtro (Whatman no 1), carboximetilcelulose e xilana
de bétula, respectivamente (MANDELS, et al., 1976; TANAKA et
al.,1981; BAILEY, et al, 1992). A atividade celulolítica total foi pouco
expressiva em todas as condições de cultivo, pois baixas concentrações
de açúcares redutores foram detectadas a partir do tratamento de papel
56
de filtro com os extratos enzimáticos (Tabela 2).
Tabela 2 - Atividade celulolítica total (UI/Kg de madeira) encontrada nos extratos obtidos a partir da biodegradação de P. taeda (Pt) e E. grandis (Eg) por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, ao longo do período de incubação. A carga de inóculo usada foi de 5 mg de fungo/Kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM) e 100 mg de fungo/Kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM).
Condição de cultivo Tempo biodegradação C. subvermispora CS1 C. subvermispora SS3 P. tremellosa
7 11,8±0,3 15±4 57±5
Pt/Sm 14 16±2 28±6 57±6
28 41±3 31±2 42±4
7 23±2 19±5 71±7
Pt/Cm 14 19±5 45±3 66±5
28 33±4 35±1 47±4
7 20±3 21±2 30±3
Eg/Sm 14 36±3 40±4 55±3
28 47±5 36±4 42±2
7 21±3 26±3 35±7
Eg/Cm 14 33±9 54±8 67±4
28 48±7 48±2 42±3
WOOD E BHAT (1984) reportaram que a atividade celulolítica total
medida a partir da hidrólise de papel de filtro representa a ação do
complexo celulolítico completo somente quando a conversão do
substrato atinge níveis de no mínimo 4%. A partir desse nível de
hidrólise, não somente a celulose amorfa, mas também parte
significante da celulose cristalina já sofreu degradação enzimática. As
atividades enzimáticas encontradas em nosso estudo foram inferiores a
2% de conversão do substrato em todas as condições de cultivo
estudadas. Sabendo-se que C. subvermispora produz pequenas
quantidades de exoglucanases e quantidades mais expressivas de
endoglucanases (SETHURAMAN et al., 1998), optou-se então por
determinar a atividade de endoglucanase dos extratos produzidos pelos
basidiomicetes aqui estudados.
57
5.1.1.5. Atividade enzimá tica de endoglucanase
As atividades de endoglucanase, detectadas nos extratos obtidos
a partir dos cultivos em estudo, estão apresentadas na figura 15.
Pt/SM
0
50100150200
250300
350
4000
0 7 1 2 2 4 1 8
Pt/CM
0
5010 015 0200
250300
350
400
0 7 14 21 28
Eg/SM
0
50100150200
250300
350
400
0 7 1 2 2 4 1 8
Eg/CM
0
5010 015 0200
250300
350
400
0 7 14 21 28
Ati
vid
ad
e e
nzi
máti
ca U
I/K
g
Período de experimentação de biodegradação (dias) Figura 15 – Produção de endoglucanase por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -), na biodegradação de P. taeda (Pt) e E. grandis (Eg) ao longo do período de incubação. A carga de inóculo usada foi de 5 mg de fungo/Kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/Kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios).
A figura 15 mostra que as diferentes cepas utilizadas neste estudo
apresentaram um comportamento parecido apesar das diferentes
condições de cultivo. Nos cultivos onde não houve adição de co-
substrato, as atividades de endoglucanases permaneceram
praticamente no mesmo nível desde o 7o até o 28o dia de cultivo,
exceção feita a C. subvermispora SS3, que aos 28 dias de cultivo sobre
E. grandis apresentou um decréscimo acentuado, quando comparado ao
7o dia, nos níveis de endoglucanases. Nos ensaios com adição de
58
milhocina notou-se um aumento na atividade de endoglucanase,
principalmente em C. subvermispora SS3; já C. subvermispora CS1 e P.
tremellosa mantiveram os níveis de produção semelhantes aos
encontrados nos cultivos sem à adição do co-substrato. Independente
das diferentes condições de cultivo, a produção de endoglucanase
obedeceu a seguinte seqüência: C. subvermispora SS3 > C.
subvermispora CS1 > P. tremellosa.
5.1.1.6. Atividade enzimática de xilanase
As atividades de xilanase detectadas nos extratos obtidos a partir
dos cultivos em estudo estão apresentadas na figura 16.
Pt/SM
0
10 0 020003000
4000500060007000
8000
0 7 14 21 28
Pt/CM
0
10 0 020003000
4000500060007000
8000
0 7 1 2 2 4 1 8
Eg/SM
010 0 0200030004000
500060007000
8000
0 7 14 21 28
Eg/CM
010 0 0200030004000
500060007000
8000
0 7 1 2 2 4 1 8
Ati
vid
ad
e e
nzi
máti
ca U
I/K
g
Período de experimentação de biodegradação (dias)
Figura 16 – Produção de xilanase por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -), na biodegradação de P. taeda (Pt) e E. grandis (Eg) ao longo do período de incubação. A carga de inóculo usada foi de 5 mg de fungo/Kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/Kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios).
59
Observando a figura 16 pode-se notar que C. subvermispora SS3
e CS1 produziram níveis parecidos de xilanase total em todas as
condições de cultivo, não ultrapassando 2000 UI/Kg de madeira. Já P.
tremellosa produziu os maiores níveis de xilanases com um pico de
produção aos 14 dias de cultivo em todas as condições de cultivo. Para
todas as cepas em estudo, a produção desta enzima praticamente
duplicou na presença de co-substrato quando comparada aos níveis
enzimáticos detectados nos cultivos sem adição de milhocina.
A atividade enzimática de xilanase foi muito mais expressiva do
que a de endoglucanase em todas as condições de cultivo (10 a 20
vezes maior). Pode-se afirmar que há uma efetiva diferença na
capacidade dessas cepas produzirem cada tipo de enzima e fica claro
que dentro do complexo hidrolítico predominam as xilanases.
5.1.1.7. Atividades enzimática s de celobiose desidrogenase
(CDH)
A celobiose desidrogenase é uma enzima extracelular envolvida
na biodegradação de lignina e celulose (BAMINGER et al., 1999). P.
tremellosa e P. radiata foram reportadas como possíveis produtoras de
CDH (HENRIKSSON et al., 2000; CAMERON E AUST, 2001), no entanto,
neste estudo não foi detectada atividade de CDH em nenhum dos
ensaios de biodegradação onde P. tremellosa (ATCC 48745) era o
agente degradador. C. subvermispora (CS1 e SS3) também não
apresentou nenhuma atividade enzimática de CDH, sob as diferentes
condições de cultivo estudadas nesta tese.
60
5.1.2. pH da madeira biodegradada
O pH das culturas (madeira biodegradada + micélio fúngico)
estudadas está mostrado na figura 17.
Pt/SM
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
0 7 14 21 28
Pt/CM
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
0 7 14 21 28
Eg/SM
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
0 7 14 21 28
Eg/CM
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
0 7 14 21 28
pH
Período de experimentação de biodegradação (dias)
Figura 17 – pH do meio fermentado por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa ATCC 48745 (- -), na biodegradação de P. taeda (Pt) e E. grandis (Eg) ao longo do período de incubação. A carga de inóculo usada foi de 5 mg de fungo/Kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/Kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios).
As três cepas aqui estudadas apresentam atividade metabólica
diferenciada quanto à produção de ácidos orgânicos. A acidificação do
meio (madeira impregnada com água) é mais rápida nos cultivos com
C. subvermispora SS3 e P. tremellosa ATCC 48745 do que nos cultivos
com C. subvermispora CS1, tanto em E. grandis como em P. taeda. Por
outro lado, no 280 dia de cultivo o pH praticamente se iguala em todas
as condições de cultivo nas três cepas. A adição de milhocina aos
cultivos não afetou o pH dos meios ao longo dos períodos de cultivo.
61
5.1.3. Conclusão parcial dos ensaios de biodegradação
Com base em ensaios de biodegradação descritos anteriormente
foi possível avaliar o crescimento fúngico através do teor de ergosterol
e a produção de enzimas extracelulares.
Sobre madeira de P. taeda, o crescimento miceliano foi
semelhante quando se compara as três cepas estudadas, enquanto que
em E. grandis, P. tremellosa se destacou ao produzir mais biomassa
que as outras cepas. Nos cultivos com adição de milhocina a biomassa
encontrada para cada cepa foi maior que a encontrada nos ensaios sem
a adição de co-substrato. Fica claro que a adição de milhocina
efetivamente permite um crescimento eficiente mesmo com cargas de
inóculo tão baixas quanto 5 mg/kg de madeira.
As três cepas estudadas apresentaram um mesmo perfil
enzimático produzindo MnP, lacase, endoglucanases e xilanases. Dentro
do complexo oxidativo, a enzima que apresentou os maiores níveis de
atividade enzimática foi a manganês peroxidase. O pico de atividade
desta enzima foi aos 14 dias constatando-se que nos cultivos com
adição de milhocina, a atividade encontrada foi maior do que aquela dos
cultivos sem adição do co-substrato. Em todas as condições de cultivo
C. subvermispora SS3 apresentou maior atividade enzimática que as
demais espécies. Apesar disto à atividade de lacase foi
comparativamente baixa e apresentou um pico aos 7 dias de cultivo. As
atividades enzimáticas encontradas para as duas espécies de fungos
nos ensaios sobre P. taeda foram semelhantes, enquanto que com E.
grandis, P. tremellosa foi a que apresentou maior atividade enzimática.
Nenhuma espécie estudada produziu lignina peroxidase e celobiose
desidrogenase em níveis detectáveis nas variadas condições de ensaio
testadas. A xilanase foi a principal enzima detectada dentro do
complexo hidrolítico. P. tremellosa apresentou maior atividade
enzimática de xilanase que as demais espécies em todas as condições
62
de cultivo. O pico de atividade desta enzima foi aos 14 dias de cultivo e
a atividade enzimática encontrada nos ensaios com adição de milhocina
foi maior do que naqueles sem adição.
5.2. CARACTERIZAÇÃO DA MADEIRA BIODEGRADADA
5.2.1. Perda de massa seca da madeira
A extensão da degradação da madeira pode ser medida como
perda de massa seca. A perda de massa da madeira representa a
mineralização completa (até dióxido de carbono e água) dos seus
componentes, ou a conversão desses componentes a produtos solúveis
em água.
Na figura 18 estão apresentadas as perdas de massa da madeira
(P. taeda e E. grandis) causadas pela ação biodegradativa de C.
subvermispora SS3 e CS1 e P. tremellosa ATCC 48745 nos cultivos,
com e sem a adição de milhocina.
Pt/SM
0,0
3,0
6,0
9,0
12 , 0
15 , 0
0 7 1 2 2 4 1 8
Eg/SM
0,0
3,0
6,0
9,0
12 , 0
15 , 0
0 7 1 2 2 4 1 8
Pt/CM
0,0
3,0
6,0
9,0
12 , 0
15 , 0
0 7 14 21 28
Eg/CM
0,0
3,0
6,0
9,0
12 , 0
15 , 0
0 7 14 21 28
Perd
a d
e m
ass
a s
eca
(%
)
Período de experimentação biodegradação (dias)
Figura 18 – Perda de massa seca da madeira (P. taeda – Pt e E. grandis - Eg) devido
63
a biodegradação por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) ao longo do período de incubação. Como inóculo utilizou-se 5 mg de fungo/Kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/Kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios).
Comparando os cultivos, com e sem adição de milhocina, na
mesma espécie de madeira, pode-se notar que o comportamento em
relação à perda de massa foi semelhante até os 14 dias de cultivo,
sendo que aos 28 dias de biodegradação nos ensaios com adição de
milhocina, a perda de massa seca foi ligeiramente maior do que nos
cultivos onde o co-substrato não foi adicionado.
Comparando as perdas de massa provocadas pelas diferentes
cepas agindo sobre P. taeda e E. grandis, pode-se afirmar que a maior
perda de massa ocorreu em E. grandis. Essas perdas de massa parecem
estar relacionadas ao crescimento fúngico, pois comparando as figuras
12 e 18 nota-se um comportamento semelhante entre esses dois
parâmetros, como por exemplo, nos cultivos de biodegradação usando
E. grandis como substrato, C. subvermispora CS1 apresentou um
crescimento fúngico menor e também uma perda de massa menor que
as demais espécies de fungo estudadas. A comparação entre as perdas
de massa mostra ainda que P. tremellosa e as duas cepas de C.
subvermispora se equivalem em termos de crescimento fúngico e
extensão de degradação da madeira de P. taeda. Já no caso da madeira
de E. grandis, a cepa CS1 de C. subvermispora claramente se mostra
menos efetiva em crescer e promover a perda de massa. Do ponto de
vista da aplicação tecnológica, nota-se que a cepa CS1 é menos
adequada já que apresenta uma maior especificidade por substrato e
seria mais apropriada somente para o tratamento de madeiras moles
como Pinus.
5.2.2. Perda de componentes
A degradação dos componentes da madeira se dá inicialmente
64
através da atuação dos complexos enzimáticos e de outros metabólitos
de baixa massa molar que promovem a despolimerização de glucanas,
polioses e lignina, sendo que os produtos desta despolimerização são
posteriormente mineralizados.
Na figura 19 estão apresentadas às perdas de glucana observadas
nos experimentos de biodegradação desta tese.
As perdas de glucana foram baixas, porém crescentes ao longo do
período de cultivo avaliado. P. tremellosa foi a espécie que promoveu
uma maior perda desse componente, principalmente nos cultivos com a
adição de milhocina, em ambas as espécies de madeira. Em geral, a
perda de glucana foi maior nos cultivos com a adição de milhocina. A
menor perda de glucana foi promovida pela cepa CS1 de C.
subvermispora que praticamente não causou perdas até 14 dias para
todas as condições de cultivo, com exceção do ensaio sobre E. grandis
com a adição de milhocina (3% e 6% de perda aos 14 dias e 28 dias de
cultivo, respectivamente).
Pt/SM
0
5
10
15
20
25
30
0 7 14 21 28
Pt/CM
0
5
10
15
20
25
30
0 7 14 21 28
Eg/SM
0
5
10
15
20
25
30
0 7 14 21 28
Eg/CM
0
5
10
15
20
25
30
0 7 14 21 28
Perd
a d
e g
luca
na (
%)
Período de experimentação biodegradação (dias)
Figura 19 – Perda de glucana da madeira (P. taeda – Pt e E. grandis - Eg) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) ao longo do período de incubação. Como inóculo utilizou-se 5 mg de
65
fungo/Kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/Kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios).
Na figura 20 estão apresentadas as perdas de polioses observadas
nos mesmos experimentos.
Pt/SM
0
5
10
15
20
25
0 7 14 21 28
Pt/CM
0
5
10
15
20
25
0 7 14 21 28
Eg/SM
0
5
10
15
20
25
0 7 14 21 28
Eg/CM
0
5
10
15
20
25
0 7 14 21 28
Perd
a d
e p
oli
ose
s (%
)
Período de experimentação de biodegradação (dias)
Figura 20 – Perda de polioses da madeira (P. taeda – Pt e E. grandis - Eg) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) ao longo do período de incubação. Como inóculo utilizou-se 5 mg de fungo/Kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/Kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios).
As perdas de polioses provocadas pelas duas cepas de C.
subvermispora (SS3 e CS1) foram baixas até o 140 dia de cultivo,
aumentando (em torno de 10%) no 280 dia em todas as condições de
cultivo. Em todas as condições estudadas, P. tremellosa provocou as
maiores perdas de polioses e glucana.
A figura 21 apresenta as perdas de lignina causadas pela ação de
C. subvermispora SS3 e CS1 e P. tremellosa ATCC 48745 sobre P. taeda
e E. grandis. Quando comparamos os cultivos sobre P. taeda, nota-se
que perda de lignina produzida pelas cepas em estudo foi muito
66
semelhante tanto nos cultivos com a adição de milhocina como nos
cultivos sem o co-substrato.
Nos ensaios com E. grandis, nota-se que as perdas de lignina
foram, de modo geral, maior que as perdas encontradas em P. taeda, o
que é amplamente conhecido na literatura, visto que as madeiras moles
são menos susceptíveis à biodegradação devido as características
anatômicas da madeira e as características estruturais da lignina (KIRK
E CULLEN, 1998). Vale ressaltar que nos cultivos onde E. grandis era o
substrato, as atividades enzimáticas de MnP detectadas foram maiores.
Pt/SM
0
5
101520
25
30
35
40
0 7 1 2 2 4 1 8
Pt/CM
0
5
101520
25
30
35
40
0 7 1 2 2 4 1 8
Eg/SM
0
5
101520
25
30
35
40
0 7 1 2 2 4 1 8
Eg/CM
0
5
101520
25
30
35
40
0 7 1 2 2 4 1 8
Perd
a d
e lig
nin
a (
%)
Período de experimentação de biodegradação (dias)
Figura 21 – Perda de lignina da madeira (P. taeda – Pt e E. grandis - Eg) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) ao longo do período de incubação. Como inóculo utilizou-se 5 mg de fungo/Kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/Kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios).
Ainda comparando os cultivos sobre E. grandis, nota-se que C.
subvermispora SS3 e P. tremellosa ATCC 48745 provocaram perdas de
lignina maiores que C. subvermispora CS1. Sendo assim pode-se
afirmar que há uma relação entre o pico de atividade de MnP aos 14
67
dias e a conseqüente maior degradação de lignina, isto é, mineralização
ou mesmo formação de produtos solúveis em água. Apesar de os níveis
de MnP diminuírem após 14 dias de cultivo, as perdas de lignina
permaneceram crescentes. Isto ocorre porque a degradação de lignina
parece ser precedida por um máximo na produção de enzima que a
partir daquele momento inicia as reações de despolimerização que
culminarão na mineralização da lignina após a absorção e
metabolização intracelular dos fragmentos gerados pela MnP (MACHUCA
E FERRAZ, 2000; SOUZA-CRUZ et al, 2004; KIRK E CULLEN, 1998;
GUERRA et al, 2002; GUERRA et al, 2004).
5.2.3. Resposta à polpação Kraft das madeiras biotratadas
A polpação Kraft foi realizada com o intuito de avaliar o
comportamento das amostras biotratadas frente a um processo químico
de polpação de alto rendimento. As amostras controle e biotratadas em
ensaios com e sem adição de milhocina, após 28 dias de cultivo foram
selecionadas para este estudo.
Quando se comparam as amostras biotratadas com seus
respectivos controles esterilizados (fig. 22 e 23), pode-se observar que,
um menor número Kappa é obtido nas amostras biotratadas num tempo
fixo de polpação ou ainda que um menor tempo de reação é necessário
para preparar polpas com um determinado número Kappa. Esses dois
benefícios oriundos do biotratamento da madeira confirmam dados da
literatura obtidos a partir de processos de polpação iguais (Kraft) ao
usados em nosso trabalho (MENDONÇA et al., 2002), bem como de
outros processos químicos de polpação como o sulfito-
alcalino/antraquinona (MENDONÇA et al., 2004).
Na figura 22 a comparação das curvas obtidas para a polpação de
P. taeda biodegradado pelas diferentes cepas mostra que as duas
espécies proporcionaram benefícios bastante semelhantes, inclusive
68
entre os cultivos com e sem a adição de milhocina. Em geral, para se
obter um número Kappa de 80 levou-se cerca 80 minutos de cozimento
das amostras biotratadas, contra um tempo aproximado de 110
minutos para o controle autoclavado.
28Pt/Sm
30
40
50
60
70
80
90
10 011012 013 014 0
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 1406
8
10
12
14
16
18
20 28 Pt/Cm
30
40
50
60
70
80
90
10 011012 013 014 0
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 1406
8
10
12
14
16
18
20
Lig
nin
a (
%)
Kap
pa
Tempo de cozimento a temperatura máxima (min)
Figura 22 – Conteúdo de lignina residual nas polpas Kraft obtidas após polpação kraft de alto rendimento. A polpação foi realizada em amostras de madeira P. taeda (Pt) após biodegradação por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) por 28 dias. (-*-) Madeira controle. A carga de inóculo foi de 5 mg de fungo/Kg de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/Kg de madeira na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). Condições de cozimento: tempo de aquecimento até temperatura máxima = 30 min, temperatura máxima =170oC, 25% de sulfidez e 22,5% de álcali ativo (expressos como NaOH em g/100 g de madeira, base seca).
A figura 23 compara as curvas obtidas para a polpação de E.
grandis biotratado pelas diferentes cepas estudadas neste trabalho. A
polpação de E. grandis biodegradado por C. subvermispora SS3 e P.
tremellosa ATCC 48745 apresentou benefícios bastante semelhantes
entre os cultivos com e sem a adição de milhocina, já a polpação da
amostra biodegradada por C. subvermispora CS1 com adição de
milhocina apresentou um benefício maior frente à polpação do que a
amostra biodegradada por esta mesma cepa sem adição de milhocina.
Na condição de ensaio sem milhocina, após 100 minutos de cozimento a
temperatura máxima, apenas a amostra biodegradada por P. tremellosa
se aproximou de um número kappa 100 e na condição com adição de
milhocina as amostras biotratadas por P. tremellosa e C. subvermispora
CS1 levaram cerca de 100 minutos de cozimento para alcançar número
69
kappa em torno de 90.
28Eg/Sm
8090
10 011012 013 014 015 016 017 018 019 0200
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 1406
8
10
12
14
16
18
20 28 Eg/Cm
8090
10 011012 013 014 015 016 017 018 01 90200
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 1406
8
10
12
14
16
18
20
Lig
nin
a (
%)
Kap
pa
Tempo de cozimento a temperatura máxima (min)
Figura 23 – Conteúdo de lignina residual nas polpas Kraft obtidas após rampa de aquecimento de 30 minutos e determinados tempos de cozimento a temperatura máxima. A polpação foi realizada em amostras de madeira E.grandis (Eg) após biodegradação por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) por 28 dias. (-*-) Madeira controle. A carga de inóculo foi de 5 mg de fungo/Kg de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 500 mg de fungo/Kg de madeira na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). Condições de cozimento: temperatura máxima =150oC, 25% de sulfidez e 17% de álcali ativo.
A figura 24 mostra a relação entre rendimento de polpação e o
número kappa das polpas Kraft de P. taeda. Esse tipo de gráfico
permite avaliar a seletividade do processo de polpação, sendo que
quanto mais elevada à curva nesse gráfico, maior a seletividade da
polpação.
28 Pt/SM
40
45
50
55
60
65
70
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
28 Pt/CM
40
45
50
55
60
65
70
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
Ren
dim
en
to (
%)
Kappa
Figura 24 – Rendimento de polpa não classificada em função do número kappa em polpas Kraft obtidas a partir da madeira de P. taeda (Pt) biotratada durante 28 dias por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -). (-
70
*-) Madeira controle. A carga de inóculo foi de 5 mg de fungo/Kg de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/Kg de madeira na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). Condições de cozimento: tempo de aquecimento até temperatura máxima = 30 min, temperatura máxima =170oC, 25% de sulfidez e 22,5% de álcali ativo (expressos como NaOH em g/100 g de madeira, base seca).
Na figura 24 pode-se observar que a seletividade no processo de
polpação de P. taeda foi semelhante para a amostra controle e as
amostras biodegradadas, com exceção da amostra biotratada por P.
tremellosa na presença de milhocina. Esse resultado é bastante
relevante, pois indica que o biotratamento com C. subvermispora
(ambas as cepas) proporciona o benefício de “amenizar” a polpação
Kraft posterior (no caso específico em estudo, permite reduzir o tempo
de polpação) sem resultar em perda significativa de rendimento de
polpa Kraft. No caso da biodegradação com P. tremellosa, a amostra
que proporcionou menores rendimentos de polpa foi exatamente aquela
que sofreu maior perda de celulose e polioses durante o biotratamento.
A maior perda de polissacarídeos durante o biotratamento deve ser um
reflexo da maior atividade hidrolítica das culturas de P. tremellosa e é
possível inferir que também os polissacarídeos residuais da madeira
biotratada apresentem menor grau de polimerização do que aquele
observado na madeira controle. Por outro lado, sabe-se que durante a
polpação kraft, a diminuição do rendimento reflete a solubilização de
polissacarídeos devido a reações de “peeling” e que essas reações são
mais extensivas quando o grau de polimerização dos polissacarídeos é
menor (BIERMANN, 1993). Dessa forma, pode-se concluir que a ação
hidrolítica extensiva de P. tremellosa aos 28 dias de cultivo (com
milhocina) gerou uma madeira biotratada menos adequada a um
processo de polpação kraft, visto que os rendimentos de polpa foram
mais baixos que os do controle para um mesmo grau de deslignificação
(mesmo número kappa).
71
5.2.4. Conclusões parciais sobre a caracterização da madeira
biodegradada
Para caracterizar a madeira biodegradada foram avaliadas as
perdas de massa seca, certos componentes (glucana, polioses e lignina)
e a resposta à polpação Kraft. As perdas de massa seca e componentes
foram crescentes ao longo do período de biodegradação apesar dos
picos de atividade enzimática de MnP e xilanase serem aos 14 dias. Isto
ocorre porque a perda efetiva de massa seca ou de um componente
está relacionada a mineralização e este fato ocorre após a ação da
enzima. A perda de massa seca provocada por C. subvermispora SS3 e
CS1 e P. tremellosa sobre P. taeda foi semelhante ao longo de todo o
período de biodegradação, sendo mais expressiva aos 28 dias. Na
madeira de E. grandis, C. subvermispora SS3 e P. tremellosa causaram
perdas de massa seca maiores do que C. subvermispora CS1. Dentre as
três cepas P. tremellosa foi a responsável por provocar a maior perda
de polissacarídeos em todas as condições de cultivo, já as perdas de
lignina foram semelhantes nas espécies para todas as condições de
cultivo, com exceção da condição sem adição de co-substrato sobre
madeira de E. grandis.
A polpação das amostras de P. taeda biotratadas pelas duas
espécies de fungos mostrou que as três cepas proporcionaram
benefícios bastante semelhantes, inclusive entre os cultivos com e sem
a adição de milhocina e a seletividade foi semelhante para as amostras
biotratadas e controle, com exceção da amostra biotratada por P.
tremellosa na presença de milhocina que apresentou rendimentos de
polpa menores. Em E. grandis as amostras biodegradadas por C.
subvermispora SS3 e P. tremellosa apresentaram benefícios
semelhantes nos cultivos com e sem adição de milhocina, no entanto,
no ensaio com adição de milhocina a polpação da amostra biodegradada
por C. subvermispora CS1 apresentou um benefício maior do que a
amostra biodegradada por esta mesma cepa sem adição de milhocina.
72
5.3. Estudos relacionados à colonização da madeira e
crescimento fúngico
5.3.1. Análise morfológica da colonização da madeira por
microscopia óptica
As observações ao microscópio óptico de cortes radiais da
madeira, mostraram que a colonização com todas as cepas utilizadas
seguem um mesmo padrão. Em P. taeda (fig 25a), foi possível
visualizar uma colonização crescente dos traqueídeos e raios da
madeira ao longo dos períodos de cultivo (7, 14 e 28 dias). Nos cultivos
em E. grandis visualizou-se uma colonização crescente nos elementos
de vaso durante os diferentes períodos de biodegradação (fig 25b), já
nas outras células como fibras e traqueídeos nota-se uma menor
colonização. A média de espessura das hifas ficou entre 0,1 e 0,2 μm
em todos os cultivos, nos diferentes substratos, com as diferentes
cepas em todos períodos de biodegradação. Em pouquíssimos cultivos
foi possível observar a presença de clamidósporos (cultivos em P. taeda
da cepa SS3, com e sem adição de milhocina, aos 7 e 14 dias de
incubação e na cepa CS1, sem adição de milhocina aos 28 dias de
biodegradação). Nos cultivos com P. tremellosa, não foram encontrados
clamidósporos nos cortes avaliados. Nos cultivos de 7 dias foi possível
observar a presença de gotas de óleo dentro das hifas em todas as
cepas. Essas gotas lipídicas têm função primária de armazenar gordura,
sendo particularmente apropriadas como reserva de energia, pois tem o
maior conteúdo calórico que qualquer outro constituinte fúngico
(GRIFFIN, 1994).
73
a b
Figura 25 – Hifas de C. subvermispora SS3 em células de (a) P. taeda - traqueídeos e (b) E. grandis – elementos de vaso. Aumento de 400X.
5.3.2. Cultivos em meio de cultura com diferentes pHs
Na produção de inóculo fúngico o pH pode ser um importante
parâmetro para acelerar o crescimento celular. O controle de pH é
provavelmente o parâmetro mais fácil de ser manipulado e controlado
em ampliações de escala (JONES, 1998). Foram realizados
experimentos com culturas em meios de sólido, com pHs definidos
inicialmente (pHs variaram entre 3.0 e 5.5), a fim de verificar se era
possível otimizar o tempo de crescimento das três cepas utilizadas em
placas de Petri sobre ágar batata e ágar-milhocina. É importante
otimizar esta variável já que todos os experimentos de biodegradação
dependem da produção de inóculo.
A tabela 3 apresenta as taxas de crescimento (diâmetro) em
milímetros/dia sobre meio de cultura ágar batata dextrose.
74
Tabela 3 - Taxa de crescimento (diâmetro das colônias) dos fungos C. subvermispora SS3 e CS1 e Phlebia tremellosa em meio de cultura ágar-batata- dextrose com diferentes valores de pH inicial.
Taxa de crescimento (mm/dia)
pH C. subvermispora SS3 C. subvermispora CS1 Phlebia tremellosa
3,0 17,6 ± 0,1 19,8 ± 1,3 14 ± 3
4,5 20,2 ± 0,3 22,5 ± 0,1 18,4 ± 0,4
4,0 20,3 ± 0,8 22,5 ± 0,1 16,6 ± 0,3
4,5 16 ± 3 22,5 ± 0,1 14 ± 3
5,0 19,5 ± 0,8 20,5 ± 0,9 16,8 ± 0,5
5,5 14,9 ± 0,1 16,8 ± 0,7 12,7 ± 0,5
Ceriporiopsis subvermispora SS3 apresentou a maior taxa de
crescimento nos pHs 3.5 e 4.0, enquanto a cepa CS1 cresceu mais
rapidamente entre os pHs entre 3.5 e 4.5. Phlebia tremellosa cresce
mais lentamente que C. subvermispora e os pHs em que se observou
um crescimento mais rápido foi 3.5.
Na tabela 4 estão mostradas as taxas de crescimento (diâmetro)
em milímetros/dia sobre meio de cultura ágar-milhocina.
Tabela 4 - Taxa de crescimento (diâmetro da colônia) dos fungos C. subvermispora SS3 e CS1 e Phlebia tremellosa em meio de cultura ágar milhocina com diferentes valores de pH inicial.
Taxa de crescimento (mm/dia)
pH C. subvermispora SS3 C. subvermispora CS1 Phlebia tremellosa
4 30±1 32,1±0,1 22±1
4,5 28±1 33±2 25,1±0,5
5 26,1±0,7 29±1 19,3±0,3
6 10±1 8±2 12,1±0,6
No meio ágar milhocina as maiores taxas de crescimento foram
encontradas entre os pHs 4 e 4,5 para as três cepas estudadas.
Comparando as taxas encontradas entre os dois meios de cultura
podemos afirmar que as 3 cepas cresceram mais rapidamente em meio
75
ágar-milhocina do que em ágar-batata. Este fato é interessante do
ponto de vista econômico, já que o custo do caldo de batata dextrose é
bastante elevado quando comparado ao da milhocina. Se levarmos em
consideração a ampliação de escala, este seria um item importante na
redução de custos na produção de inóculo.
Um fato bastante intrigante despertado neste estudo foi o de
avaliar se no caso da biopolpação o pH ótimo encontrado para o
crescimento em meio de cultura pode ser o mesmo utilizado para o
crescimento em madeira e se haveria um aumento na taxa de
crescimento nos cultivos em biorreatores com madeira com pH ajustado
para os valores mais adequados para o crescimento mais rápido em
meio de cultura.
5.3.3. Cultivos submersos
O crescimento das várias espécies estudadas foi avaliado em
diferentes meios de cultivo líquidos, com a finalidade de verificar a
capacidade de cada cepa produzir inóculo miceliano em escala
ampliada. Foram determinadas as curvas de crescimento de C.
subvermispora (SS3 e CS1) e P. tremellosa para cultivos em meios
como batata dextrose - CB tamponado com acetato de sódio 10 mM, e
sacarose - milhocina - MS (pH inicial 4,0).
Nas figuras 26 e 27 estão apresentadas as quantidades de
biomassa seca obtidas durante os cultivos de até 18 dias e as
concentrações de açúcares redutores restantes nos meios de cultura. O
pH inicial foi corrigido para 4, pois no estudo em placas com meio sólido
este foi o pH em que foi encontrada a maior taxa de crescimento.
76
Consumo de açúcar
0
5
10
15
20
25
30
0 3 6 9 12 15 18
M assa seca
0
30
60
90
12 0
15 0
18 0
0 3 6 9 12 15 18
Açú
car
red
uto
r (g
/L)
Mass
a s
eca
(m
g)
Período de cultivo (dias)
Figura 26 – Curva de crescimento de C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) em meio CB (Batata dextrose) tamponado com acetato de sódio 10 mM.
Consumo de açúcar
0
2
4
6
8
10
12
1416
18
20
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
M assa seca
0
20
40
60
80
10 0
12 0
14 016 0
18 0
200
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Açú
car
red
uto
r (g
/L)
Mass
a s
eca
(m
g)
Período de cultivo (dias)
Figura 27 – Curva de crescimento de C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) em meio líquido MS (Milhocina - sacarose).
O consumo de açúcares é crescente ao longo do tempo em ambos
os meios de cultura. No meio CB (fig. 20), P. tremellosa consumiu os
açúcares rapidamente até 9 dias; no entanto seu crescimento é
semelhante aos das outras cepas estudadas. C. subvermispora CS1
produziu mais massa seca do que C. subvermispora SS3 e P. tremellosa
ATCC 48745 em meio CB. Este mesmo comportamento foi observado
até 10 dias de cultivo no meio MS (fig. 27), porém, após esse período
C. subvermispora SS3 produziu mais massa do que C. subvermispora
CS1. A produção máxima de biomassa seca foi maior nos cultivos
realizados no meio MS quando comparado com o meio CB. Este fato é
interessante do ponto de vista econômico, pois o custo do meio MS
77
pode ser menor do que o de batata dextrose.
O micélio de cada período de cultivo das três cepas estudadas
neste item foram observados ao microscópio óptico, a largura das hifas
e dos clamidósporos foram medidos (μm) e a quantidade de
clamidósporos foi classificada em muito (++++), médio (+++), pouco
(++), pouquíssimo (+) e ausência (-). A tabela 5 apresenta a
quantidade de clamidósporos observadas em P. tremellosa e C.
subvermispora SS3 e CS1 ao microscópio óptico ao longo da curva de
crescimento em meio de cultura líquido tamponado (pH 4).
Neste estudo pode-se verificar que as hifas do micélio de C.
subvermispora SS3 e CS1 são um pouco mais largas que as hifas de P.
tremellosa em todos os períodos de cultivo. Ao longo dos cultivos as
hifas de C. subvermispora CS1 e SS3 e P. tremellosa ficaram um pouco
mais finas. Inicialmente as hifas de C. subvermispora tinham uma
espessura ao redor de 0,38μm e aos 18 dias chegaram à cerca de
0,25μm, o mesmo ocorreu em P. tremellosa: a largura inicial era de
0,31 μm e chegou após 18 dias de cultivo a 0,24 μm. Aos 3 dias de
cultivo, clamidósporos foram encontrados em pouquíssima quantidade
nas culturas de P. tremellosa e ao longo do período de cultivo as
culturas apresentaram poucos clamidósporos em seu micélio (tabela 5).
C. subvermispora CS1 apresentou clamidósporos também aos 3 dias de
cultivo, no entanto, a quantidade destes ao longo do período de
incubação foi maior do que a encontrada em P. tremellosa. Em C.
subvermispora SS3 os clamidósporos foram encontrados após 6 dias de
cultivo já em média quantidade e após 9 dias haviam muitos destes
esporos de resistência na cultura até o final dos 18 dias de cultivo.
Dentre as três culturas, C. subvermispora SS3 foi quem produziu mais
clamidósporos nestas condições de estudo.
78
Tabela 5 – Produção de clamidósporos observadas em P. tremellosa e C. subvermispora SS3 e CS1 ao microscópio óptico ao longo do crescimento em meio de cultura líquido BD tamponado (pH 4)
Espécies
Período de cultivo (dias) C. subvermispora SS3 C. subvermispora CS1 P. tremellosa
3 - + +
6 ++ + +
9 +++ ++ +
12 ++++ +++ ++
17 ++++ +++ ++
Em P. tremellosa os clamidósporos formados tinham em média
um menor tamanho (0,96 μm no início) do que os encontrados em C.
subvermispora SS3 e CS1 (1,45 μm no início). Nos períodos iniciais de
cultivo os clamidósporos são menores e ao longo do tempo se tornam
maiores com paredes mais espessas.
5.3.4. Isolamento de espécies contaminantes e confronto com os
basidiomicetes em estudo
Os contaminantes isolados a partir de cavacos da planta piloto
pertencem aos fungos anamórficos e foram identificados como
Aspergillus spp. e Penicillium spp., através da visualização em
microscópio dos conidióforos (estruturas de reprodução assexuada).
Estas duas espécies de contaminantes foram confrontados com C.
subvermispora CS1 e SS3 e P. tremellosa ATCC 48745 em meio de
cultura sólido ABD. Em extremidades opostas de uma placa de Petri
foram inoculadas uma espécie de fungo degradador de madeira e um
dos contaminantes. Todas as combinações foram avaliadas. Em todos
os casos não houve antibiose, ou seja, os dois fungos cresceram e
entraram em contato. Inicialmente os fungos causadores de podridão
branca cresciam mais lentamente e o contaminante dominava a placa,
no entanto, mantendo o cultivo em estufa, pode-se observar que após
79
algum tempo os basidiomicetes reagiam à colonização do contaminante
e ocupavam a placa, crescendo inclusive sobre o contaminante. O
mesmo fato ocorre em biorreatores com madeira nos experimentos de
biodegradação; inicialmente os contaminantes crescem mais
rapidamente, porém ao longo do período de cultivo os basidiomicetes
aqui estudados voltam a ser os principais colonizadores do substrato.
Estes organismos (“Deuteromicetes = anamorfos/mitospóricos) tem
uma ‘estratégia’ que consta de instalação e crescimento rápidos em um
dado substrato, com produção imediata de conídios (DIX & WEBSTER,
1995). Acredita-se que nos casos dos biorreatores, a colonização rápida
dos contaminantes está relacionada aos nutrientes de fácil assimilação
que estão disponíveis no inicio dos experimentos (adição de co-
substrato) e que assim que estes são consumidos, os contaminantes
não têm mais capacidade de manter o crescimento.
5.3.5. Conclusões parciais sobre os estudos relacionados à
colonização da madeira e crescimento fúngico
A colonização da madeira observada em todas as condições de
cultivo para as duas espécies foi crescente e mais visível dentro dos
traqueídeos em madeiras moles e nos elementos de vaso em madeiras
duras. Poucos clamidósporos foram encontrados nos cortes de madeira
observados nas diferentes condições e períodos de cultivo.
No crescimento em pH diferentes, pode-se verificar que o pH do
meio ABD que é por volta de 5,5 não foi o melhor pH de crescimento
para as três cepas testadas. A melhor faixa de crescimento para todas
cepas ficou ente 3,5 e 4,5 para os meios ágar-milhocina e ABD. Em
meio ABD, C. subvermispora (SS3 e CS1), e P. tremellosa (ATCC
48745) mostraram-se eficientes na competição contra os contaminantes
Aspergillus e Penicillium, após uma fase inicial de crescimento.
80
5.4. Indução à formação de clamidósporos em C. subvermispora
CS1 e SS3 e P. tremellosa ATCC 48745
C. subvermispora CS1 e SS3 e P. tremellosa ATCC 48745
produzem clamidósporos sem indução em cultivos em laboratório.
Apesar deste fato foi realizada a indução para verificar se poderíamos
reduzir o tempo de cultivo e aumentar a quantidade de clamidósporos
produzidos. Para provocar a produção destes esporos de resistência foi
utilizado como fator de indução estresse osmótico (SAXENA et
al.,2001). Após cultivar o micélio por 12 dias em meio de cultura BD a
formação de clamidósporos foi induzida pela adição de CaCl2 1%
(concentração final). Pode-se observar que a produção de
clamidósporos no micélio era crescente a cada 24 horas e que após 72
horas de indução a quantidade de clamidósporos encontrado nas
culturas já não variava muito. Sendo assim, estabeleceu-se como
padrão 72 horas de indução. Apesar das cepas de C. subvermispora não
apresentarem grande variação na produção de clamidósporos após 72
horas, a cepa CS1 apresentava um pouco menos de clamidósporos do
que SS3. Já a produção de clamidósporos em P. tremellosa foi bastante
menor do que a encontrada em C. subvermispora.
5.5. Teste de viabilidade do inóculo para produção de
clamidósporos em C. subvermispora CS1 e SS3 e P. tremellosa
ATCC 48745
O teste de viabilidade foi realizado utilizando como inóculo o
micélio/clamidósporos batido por 10 ciclos de 15 segundos (maioria das
hifas destruídas – fig. 28).
81
Figura 28 – Microscopia óptica de fragmentos de hifas com clamidósporos, após o micélio cultivado para inóculo ser batido por 10 ciclos de 15 segundos. Hifa (seta vermelha) e clamidósporos (seta preta). Aumento 400X.
Como parâmetro para comparar a eficiência do inóculo utilizou-se
a atividade enzimática de MnP, pois além de apresentar o pico de
atividade enzimática aos 14 dias foi a principal enzima oxidativa
produzida pelas três espécies de fungos estudadas.
Na tabela 6 estão apresentadas as atividades de MnP encontradas
nos extratos obtidos após 14 dias de cultivo com o dois tipos de inóculo,
o induzido (micélio cultivado por 12 dias, induzido a produzir
clamidósporos, batido por 10 ciclos de 15 s) e o convencional utilizado
nos experimentos de biodegradação anteriores (micélio cultivado por 10
dias e batido por 3 ciclos de 15 s) (item 4.23).
Tabela 6 – Atividade enzimática de manganês peroxidase (MnP) encontrada nos extratos obtidos após 14 dias de cultivo de C. subvermispora SS3 sobre P. taeda e E. grandis, com os inóculos convencional e induzido para a produção de clamidósporos. Tipo de inóculo
Substrato Tradicional* Induzido**
P. taeda 564±180 530±21
E. grandis 1050±46 204±14
*Convencional= micélio cultivado por 10 dias e batido por 3 ciclos de 15 s. **Induzido= micélio cultivado por 12 dias, induzido a produzir clamidósporos, batido por 10 ciclos de 15 s.
Nos extratos dos cultivos com micélio induzido de C.
subvermispora CS1 e P. tremellosa não houve detecção de MnP. Isto
provavelmente ocorreu porque a quantidade de clamidósporos
82
produzidos por estas cepas foram menores do que para SS3 ou apesar
da aparente (controle óptico ao MO) ação não danosa do batido, a
germinação destes clamidósporos foi afetada, logo não cresceu micélio
suficiente (no tempo testado) para produzir MnP. A atividade enzimática
de MnP encontrada no extrato obtido a partir da biodegradação de P.
taeda por C. subvermispora SS3 foi semelhante para os dois tipos de
inóculo. No entanto, no cultivo sobre E. grandis a atividade enzimática
encontrada no extrato obtido após incubação com o inóculo induzido foi
5 vezes menor que com o inóculo convencional. Através deste ensaio foi
possível verificar que é possível utilizar como inóculo os clamidósporos,
no entanto é necessário que seja aperfeiçoada a técnica de separação
destes das hifas e que novos experimentos testando a carga de inóculo
(clamidósporos) sejam realizados. As vantagens da utilização de
clamidósporos como inóculo estão relacionadas ao fato destes esporos
poderem ser liofilizados e estocados como mostraram Saxena e seus
colaboradores (2001). Em escala industrial estas características
facilitariam o processo de inoculação.
5.6. Comparativo entre os basidiomicetes versus ação
biodegradativa da madeira e eficiência no biokraft.
As três cepas estudadas neste trabalho apresentaram um perfil de
atividade metabólica semelhante, em termos gerais. Dentro dos
complexos oxidativo e hidrolítico as enzimas de destaques foram a MnP
e a xilanase, respectivamente. A cepa que produziu maior quantidade
de MnP foi C. subvermispora SS3 nos diferentes tipos de tratamento. A
cepa CS1 de C. subvermispora provocou menor perda de lignina e de
glucana do que a cepa SS3. No entanto, frente à polpação biokraft
estas diferenças na atividade enzimática e na perda de componentes
não provocaram expressivas alterações no rendimento nas diferentes
condições de biodegradação (P. taeda sem e com adição de milhocina).
83
Dentre as três cepas estudadas, P. tremellosa foi quem proporcionou a
maior perda de glucana e polioses enquanto que a perda de lignina foi
semelhante à provocada por C. subvermispora SS3. Este fato
provavelmente ocorre porque P. tremellosa apresentou maior atividade
de xilanase e endocelulase que as outras cepas e isto propiciou uma
maior degradação dos polissacarídeos. Esta espécie também é eficiente
na degradação de lignina, mas como provoca maiores perdas de
polissacarídeos durante o biotratamento, o rendimento na polpação
Kraft é menor do que o encontrado para C. subvermispora, isto faz com
que P. tremellosa seja menos adequada ao pré-tratamento na polpação
kraft. Ainda com relação à polpação biokraft foi possível verificar que
não há necessidade que o fungo degrade muita lignina para que o
tempo de cozimento ou kappa sejam reduzidos, pois os resultados
quanto ao kappa são parecidos, mesmo havendo diferenças em termos
de perda de lignina no biotratamento.
No que diz respeito ao crescimento em meio de cultura sólido
(ABD e AM) e submerso (BD), C. subvermispora CS1 cresce mais
rapidamente que C. subvermispora SS3 e P. tremellosa. No entanto, C.
subvermispora SS3, após indução, produz mais clamidósporos que CS1
e esta característica é muito importante se considerada a possibilidade
de produção destes como inóculo para escala industrial. No meio líquido
milhocina-sacarose após 12 dias de cultivo, C. subvermispora SS3
apresentou crescimento maior que a cepa CS1, sendo que podemos
afirmar, que em termos de crescimento e produção de clamidósporos,
C. subvermispora SS3 é mais adequada que as demais cepas.
No estudo de competição em placas de Petri com meio de cultura
sólido, as três cepas estudadas não apresentaram diferença em relação
à resposta encontrada frente aos contaminantes Aspergillus sp e
Penicillium sp. . Após a fase inicial de crescimento, que é mais lenta que
a do contaminante, as três cepas foram capazes de competir nos meios
e tempos testados.
84
6. CONCLUSÕES FINAIS
As três cepas estudadas neste trabalho apresentaram um perfil de
atividade metabólica semelhante. Dentro dos complexos oxidativo e
hidrolítico as enzimas de destaques foram a MnP e a xilanase,
respectivamente.
A perda de lignina e de glucana provocada por C. subvermispora
CS1 foi menor do que a causada pela cepa SS3. No entanto as
variações encontradas em relação ao nível de atividade enzimática e a
perda de componentes não provocaram expressivas diferenças no
rendimento nas diferentes condições de biodegradação frente à
polpação biokraft. P. tremellosa foi a espécie que provocou a maior
perda de glucana e polioses, conseqüência de uma maior atividade de
xilanase e endocelulase. O fato desta espécie ter provocado uma maior
degradação dos polissacarídeos, apesar da perda de lignina semelhante
a C. subvermispora SS3, fez com que o rendimento na polpação Kraft
fosse menor e sendo assim esta cepa se tornou menos adequada ao
pré-tratamento na polpação bioKraft.
Dentre as três cepas avaliadas, as cepas que se mostroram mais
adequadas ao processo de biopolpação foram C. subvermispora SS3 e
CS1.
Nos cultivos em meio de cultura líquido, as duas cepas de C.
subvermispora cresceram mais do que P. tremellosa, no entanto, C.
subvermispora SS3 produziu mais clamidósporos tanto em cultivos
convencionais como no caso de cultivos com indução com CaCl2 1% e
este fato contribui para a utilização desta cepa na produção de inóculo
para aplicação em biodegradação em escala ampliada. C.
subvermispora SS3 também se mostrou mais eficiente no teste de
viabilidade do inóculo batido induzido para a produção de
clamidósporos.
85
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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