Tese-Karine Frehner Kavalco

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EstudosEvolutivosnoGneroAstyanax (Pisces,Characidae)

SoPaulo 2008

KarineFrehnerKavalco

EstudosEvolutivosnoGneroAstyanax (Pisces,Characidae) Tese apresentada ao Instituto de BiocinciasdaUniversidadedeSoPaulo, para a obteno de Ttulo de Doutor em Cincias,nareadeBiologiaGentica. Orientador(a): Dra. Lurdes Foresti de AlmeidaToledo

SoPaulo 2008

FichaCatalogrfica Kavalco,KarineFrehner Estudos Evolutivos no Gnero Astyanax (Pisces,Characidae). 197pp. Tese(Doutorado) Instituto de Biocincias da Universidade de So Paulo. Departamento de Gentica e Biologia Evolutiva. 1. Astyanax; 2. Evoluo Cariotpica; 3. Evoluo Molecular. I. Universidade de So Paulo.InstitutodeBiocincias.Departamentode GenticaeBiologiaEvolutiva.

ComissoJulgadora: Prof(a).Dr(a). Prof(a).Dr(a).

Prof(a).Dr(a).

Prof(a).Dr(a).

Orientadora:Profa.Dra.LurdesForestideAlmeidaToledo

ParaGabrielleeRubens, comamor.

[...]Eoquedisserem Meupaisempreesteveesperandopormim Eoquedisserem Minhamesempreesteveesperandopormim Eoquedisserem Meusverdadeirosamigossempreesperarampormim Eoquedisserem Agorameufilhoesperapormim[...] (RenatoRusso)

Nopossolhedarafrmuladosucesso, masadofracassotentarcontentaratodos (JohnF.Kennedy)

AGRADECIMENTOS Vrias pessoas e instituies tornaram vivel a realizao deste trabalho, ou o tornaram maisagradvel.Aelas,meussincerosagradecimentos: Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento CNPq, que me concedeu bolsa de doutoramento, e Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo FAPESP, pelos recursosnaformadeauxliopesquisa. AoDepartamentodeGenticaeBiologiaEvolutivaeaoInstitutodeBiocinciasdaUniversidade deSoPaulo,pelainfraestruturanecessriaparaarealizaodosexperimentosecoletasdecampo epelasbolsasconcedidasduranteosestgiosdoProgramadeAperfeioamentodeEnsinoPAE. psgraduaoemBiologiaGentica,nafiguradesuacoordenadora,aprofessoraDra.CliaP. Koiffmann. professoraDra.LurdesForestideAlmeidaToledo,pelaorientaoeentusiasmocomotrabalho, epelaconfianaamimdedicada. professora Dra. Angela M. Vianna Morgante, por ceder o fotomicroscpio para finalizao da teseepelaamizade. Ao professor Dr. Srgio R. Matioli, pela amizade e pelas discusses cientficas nos dois anos em quecoordenoumeuestgioPAEnadisciplinadeProcessosEvolutivos.Ainda,aosprofessoresDr. PauloA.OttoeDr.GabrielMarroig,pelascontribuiesnaminhaformaoduranteesteperodo. s professoras Dra. Yatiyo Y. Yassuda, Dra. Priscila Otto e Dra. Maria Jos de Jesus Silva, pelas contribuiesdurantemeuexamedequalificao. professoraDra.FranciscadoVal,pelaamizade,pelasmaravilhosasaquarelaseporcompartilhar comigoapaixopelaEvoluoBiolgicaepelaDivulgaoCientfica. s secretrias do Departamento de Gentica e Biologia Evolutiva, Helenice e Deisy, pela ajuda sempredisponvel,porcompartilharemaesperapelaGabriellecomalegriaeportornaremmeus finaisdetardetoagradveis.MeusagradecimentosSusieD.Genovevatambm. Aosfuncionriosdasecretariadepsgraduao,dabibliotecadoIBUSPeaosmotoristasevigias, eatantosoutrosannimos,quetornarampossvelcadadiadestajornada. AotcnicoCarlosLopeseaGilbertoRigo,pelainestimvelajudaduranteascoletas.

AoscolegasdolaboratriodeIctiogentica,principalmenteCarolineGarcia,KarinadeOliveira Brando, Raquel Maria Rodrigues e Frederico Henning. Deixo ainda um agradecimento muito especial para Caroline Garcia e Karina Brando, pela imprescindvel ajuda na finalizao de experimentosdeminhateseduranteminhalicenamaternidade,eparaRubensPazza,pelaajuda nadiscussodosmanuscritos. Aos meus orientadores anteriores, j que o conhecimento cumulativo e atravs de seus ensinamentos pude galgar mais um degrau: Dr. Vladimir Pavan Margarido e Dr. Orlando Moreira Filho. Aosmembrosdabanca,pelasvaliosascontribuies. amigaKarina,porserestapessoatoespecialeporaguardarcomcarinhoachegadadaminha pequena... Por ter sido minha primeira (des)orientanda, a Pupis que todos gostariam de ter. Enfim,porcompartilharafasemaisimportantedaminhavidaeporestarpresentetodasasvezes emqueprecisei. amigaCarol,portodosestesanosdeamizade,risadasededicao,mesmoquandodistante. Aosamigosdistantes,pormnuncaausentes:LuisA.Bertollo,AlbertoJ.Prioli,SoniaM.A.P.Prioli, Horcio Jlio Jr. e Alexandre Benvindo, pelos emails bemhumorados e pelos encontros nos congressos. Aos amigos polivalentes, que riem conosco nos momentos mais felizes, nos amparam nos momentos menos felizes, e alguns at mudana nos ajudam a fazer: Karina e Leandro, Partiti, Micheli, Jonas, Gabriel, Elton, Dantas, Carlos e Cristiane, Chico, Fabris, Marcelo, Hugo e Kleyne, InadreeChristiane,AnglaeRenato,RenataeDiego,Erika.EumabraomuitoespecialparaaNani. Aoamigo,bilogoamadoreartistaDannielSoares,quemepresenteoucomasgravurasdacapae aberturadoscaptulosdestevolume. Finalmente,aminhafamlia,queminhavida.Agradeopelo apoiodedicadoeincondicionalde meu marido Rubens, meus pais Sydney e Magli, meus irmos Tatiana e Sydney, meus avs Nory, Hiltrud e Friedrich. minha me agradeo especialmente por todo o perodo em que cuidou da flordodiaparaqueestatesefossefinalizada,porserestaavtoamorosa.AoRubensaindadevo a existncia da pessoinha mais linda do mundo, a Gabrielle, cujos sorrisos animam mais que qualquerpalavra. Obrigadaatodos,vocstornaramestajornadapossvel.

RESUMO O gnero Astyanax um dos mais especiosos da ordem Characiformes. Suas mais de 100 espcies distribuemse por praticamente toda a regio Neotropical e habitam os mais diversos ambientes, como regies montanhosas, trechos lticos e leitosderios,poreslnticasoulagunaresenascentes.Durantecercadetrintaanos estes peixes tm sido alvo de estudos cromossmicos, que os caracterizaram como umgrupocomgrandediversidadecitogentica.Recentemente,oadventodetcnicas de citogentica molecular e de estudos empregando marcadores de DNA tem produzido novos dados sobre a biologia evolutiva do grupo, e possibilitado a revisitaodeantigosproblemasdognero,comosuadifcilclassificaotaxonmica. No presente trabalho buscouse a caracterizao citogentica e a anlise de segmentosdomtDNA(seqnciasparciaisdasregiesdosgenesND2eATPase6/8) dediferentesespciesepopulaesdeAstyanax,comafinalidadedecontribuirpara o reconhecimento de padres e processos evolutivos no gnero. Foram analisados exemplares provenientes das bacias hidrogrficas dos rios So Francisco, Tiet, Paranapanema,MogiGuau,Iguau,ParabadoSul,RibeiradeIguapeeGuapimirim. Os resultados forneceram panoramas filogeogrficos e estabeleceram relaes evolutivasentre as espciesanalisadas, utilizando dados associados de duas classes diferentes de marcadores genticos. Atravs da aplicao de tcnicas citogenticas clssicasemolecularessoapresentadosdadoscariotpicosde A.altiparanae,A.aff. bimaculatus,A.bockmanni,A.aff.fasciatus,A.hastatus,A.mexicanuseA.ribeirae.Nos estudos filogenticos foram utilizadas, adicionalmente s seqncias das espcies acima citadas, dados provenientes de Astyanax sp.B, A. giton, A. intermedius, A. lacustris, A. aff. scabripinnis, Bryconamericus iheringii, Mimagoniatis microlepis e Roeboides occidentalis. Foram ainda includas nas anlises seqncias do mtDNA de hapltiposdiferentesdeA.mexicanuseA.bimaculatusretiradosdaliteratura.Paraas diferentespopulaesamostradasdosgrupos A. altiparanae, A.aff.bimaculatuse A. aff. fasciatus, foram efetuadas anlises filogeogrficas associadas a dados cromossmicos. As anlises cromossmicas e moleculares do sistema de drenagem do Leste e de bacias circunvizinhas apresentadas no presente trabalho forneceram dados adicionais para o entendimento da biologia evolutiva do gnero Astyanax. iii

Outra contribuio do presente estudo foi a inferncia das relaes evolutivas de algumasdasmaisbemestudadasespciesdogneroAstyanax,queadespeitodasua importncia ecolgica e de constiturem um modelo para estudos cromossmicos e evolutivos, ainda no apresentam estudos filogenticos amplos. Ainda, a associao dedadoscromossmicosemolecularesforneceuumpanoramainteressantesobreas relaesevolutivasemalgumasespciesdognero,bemcomosobreosprocessose padresevolutivospresentesnosAstyanax.

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ABSTRACT

AstyanaxisoneofthespeciesrichestgenerawithintheorderCharaciformes. Morethan100representativesarewidespreadthroughoutnearlyalltheNeotropical region,inhabitinganarrayofenvironments,suchasmountainareas,loticandlentic river portions, lake systems and headwaters. This fish group has been a target of chromosomalstudiesforover30years,showingaremarkablecytogeneticdiversity. Recently, the advances in molecular cytogenetics and DNA marker studies have provided new data about the evolutionary biology in this group, allowing revisiting former issues in species of this genus, such as their problematic taxonomical classification. In the present work, we attempted to obtain a cytogenetic characterization and analyze mtDNA segments (partial sequences of the genes ND2 andATPase6/8)ofdifferentspeciesandpopulationsofAstyanax,inordertoidentify the evolutionary patterns and processes within the genus. Specimens from So Francisco, Tiet, Paranapanema, MogiGuau, Iguau, Paraba do Sul, Ribeira de Iguape and Guapimirim hydrographic basins were collected. The results revealed phylogeographicscenariosandenabledustoestablishtheevolutionaryrelationships amongtheanalyzedspecies,byassociatingdatafromtwodistinctclassesofgenetic markers. Through classic and molecular cytogenetic techniques, we present karyotypicdatainA.altiparanae,A.aff.bimaculatus,A.bockmanni,A.aff.fasciatus,A. hastatus, A. mexicanus and A. ribeirae. For the phylogenetic studies, we also used, besides those sequences of the species abovementioned, data from the species Astyanaxsp.B,A.giton,A.intermedius,A.lacustris,A.aff.scabripinnis,Bryconamericus iheringii, Mimagoniatis microlepis e Roeboides occidentalis. In the mtDNA analyses, sequencesfromthemtDNAofA.aeneus,anddifferenthaplotypesofA.mexicanusand A. bimaculatus available in the literature were included as well. Phylogeographic analyses coupled with chromosomal data were performed for the distinct populational samples in the groups A. altiparanae, A. aff. bimaculatus and A. aff. fasciatus.BothmolecularandchromosomalanalysesalongEasterndrainagesystems andnearbybasinscarriedoutinthepresentworkprovidedadditionalinformationto the understanding of the evolutionary biology in the genus Astyanax. Another contribution of the present work refers to the inference on the evolutionary v

relationshipsinsomeofthemostintensivelystudiedspeciesinthegenus Astyanax, that,despiteoftheirecologicalimportanceandtheirroleasamodelforchromosomal and evolutionary studies, still lack more complete phylogenetic approaches. Furthermore,theassociationbetweenchromosomalandmoleculardatarevealedan interesting panorama about the evolutionary relationships in some species of this genus,aswellastheevolutionaryprocessesandpatternsidentifiedwithinAstyanax.

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LISTADEFIGURAS Figura1.1 Esquema mostrando a organizao do mitogenoma de vertebrados. Fonte: Figura2.1 Figura2.2 Figura2.3Passarge(1995)........................................................................................................................................ CaritipodeA.mexicanuscoradoemGiemsa.Emdestaque,AgRONs............................. CaritipodeA.mexicanus apsbandamentoC.Emdestaque,omicrocromossomo B........................................................................................................................................................................ MetfasesdeA.mexicanus (ad).AssetasindicamossitesdeCromomicinaA3(a)e hibridaofluorescenteinsitu(FISH)comsondasderDNA18S(b),rDNA5S(c)e DNA satlite As51 (d). As cabeas de setas indicam o microcromossomo B. Metfases de A. fasciatus (e) e A. bockmanni (f) com FISH com sonda do DNA satliteAs51(lminascontrole).Barra=5m............................................................................. CaritipodeA.bockmannicoradoemGiemsa.Barra=5m....................................................

11 33 33

Figura3.1 Figura3.2 CaritipodeA.bockmanniapsbandamentoC.Barra=5m................................................. Figura3.3 MetfasesdeA.bockmanni.AssetasindicamosstiosdeAgRONs(a)eFISHcom Figura4.1 Figura4.2 Figura5.1 Figura5.2 Figura6.1

34 44 44 45 59 60 71 72

Figura6.2

Figura6.3

Figura6.4

sondasderDNA18S(b)e5S(c).Em(d)ausnciadestiosdoDNAsatliteAs51. Barra=5m................................................................................................................................................... ExemplaresecaritiposcoradosemGiemsadoscittiposA(a),B(b)eC(c)deA. hastatus.Nosdetalhes,AgRONs.Barradoscariogramas=5m......................................... MetfasesdeAstyanaxhastatus. CittiposA,BeCapsbandamentoC(ac)eFISH comsondasderDNA18S(df)eDNAsatliteAs51(gi).Assetasindicamosstios derDNA.Barras=5m...... Caritipo de A. ribeirae corado em Giemsa. No detalhe, cromossomos portadores dasAgRONs.Barra=5m............ Metfases de A. ribeirae. Em (a) metfase submetida ao bandamento C. As setas indicamosstiosdeFISHcomsondasderDNA18S(b)e5S(c).Em(d)ausnciade stiosdoDNAsatliteAs51.Barras=5m.................................................................................... Mapa da regio sudeste do Brasil indicando os principais sistemas hidrogrficos: 1)rioSoFrancisco;2)rioGrande;3)rioParabadoSul;4)rioMogiGuau;5)rio Tiet; 6) rio Ribeira de Iguape; 7) rio Paranapanema. As letras identificam os pontosamostradosnaliteratura(a,b,c,d,e,g,h,)enopresentetrabalho(f,i,j,k,l, m)(verTabela6.1)................................................................................................................................... CaritiposdeA.aff.fasciatus corados emGiemsa eapsFISHcomsondadosatDNA As51.ExemplaresprovenientesdeSeteBarras/SPbaciadorioRibeiradeIguape (ab);eSalespolis/SPbaciadorioTiet[2n=46(cd);2n=48(ef);2n=50(gh)]. Emdestaqueparnmero20docittipode2n=50cromossomos,portadordestios homomrifcosdosatDNAAs51.Barra=5m............................................................................... CaritiposdeA.aff.fasciatus corados emGiemsa eapsFISHcomsondadosatDNA As51.ExemplaresprovenientesdeIndaiatuba/SPbaciadorioTiet(ab);Pilar do Sul/SP bacia do rio Paranapanema (cd); Angatuba/SP bacia do rio Paranapanema(ef);eAraras/SPbaciadorioMogiGuau(gh).Barra=5m......... MetfasesdeA.aff.fasciatus apsbandamentoC.ExemplaresprovenientesdeSete Barras/SPbaciadorioRibeiradeIguape(a);Salespolis/SPbaciadorioTiet [2n=46(b);2n=48(c);2n=50(d)];Indaiatuba/SPbaciadorioTiet(e);Pilardo Sul/SPbaciadorioParanapanema(f).Barras=5m..............................................................

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doscrculosindicamasprincipaisbaciashidrogrficasdosudestebrasileiro:1)rio MogiGuau; 2) rio Tiet; 3) rio Paranapanema; 4) rio Ribeira de Iguape. Demais algarismos indicam os pontos de coleta: 1) Salespolis/SP; 2) Indaiatuba/SP; 3) Barrinha/SP; 4) Cachoeira de Emas/SP; 5) Araras/SP; 6) Ouro Fino/MG; 7) Angatuba/SP;8)PilardoSul/SP;9)SeteBarras/SP................................................................. 111 Figura7.2 Figura 7.2 Caritipos corados em Giemsa e AgRONs de A. aff. fasciatus. ExemplaresprovenientesdeSalespolis/SPbaciadorioTiet[2n=46(a);2n=48 (b); 2n=49 (c); 2n=50 (d)]; Sete Barras/SP bacia do rio Ribeira de Iguape (e); PilardoSul/SPbaciadorioParanapanema(f);Indaiatuba/SPbaciadorioTiet (g);Em(h)AgRONsmostrandostiosdeativaopreferencial.Barras=5m.............. 112

Figura7.1 Mapa mostrandoaspopulaes de A.aff. fasciatus sob estudo. Algarismosdentro

Figura7.3

Metfases de A. aff. fasciatus mostrando stios de rDNA 18S (ag) e 5S (hi) indicados pelassetas.PadrodorDNA18SdeexemplaresprovenientesdeSalespolis/SP[2n=46 (a); 2n=48 (b); 2n=49 (c); 2n=50 (d)]; Sete Barras/SP (e); Pilar do Sul/SP (f); Indaiatuba/SP (g); Padro do rDNA 5S observado nos exemplares provenientes de Salespolis/SP,Indaiatuba/SPePilardoSul/SP(h);PadrodorDNA5Sobservadonos exemplaresprovenientesdeSeteBarras/SP(i).Barras=5m. ................................................

113

Figura7.4 rvoreconsensode314 maisparcimoniosas, construdapelomtododemxima

Figura7.5

Figura8.1

Figura8.2 Figura8.3

Figura8.4

parcimnia(MP)(nmerodepassos=244),mostrandoasrelaesevolutivasda regio ATPase6/8 entre 35 indivduos: ndice de Consistncia (IC) = 0,648649; ndicedeReteno(IR)=0,763636.OsValoresdebootstrap(1000rplicas)esto prximosdosramos.Osgapsforamtratadoscomomissingdata....................................... rvoresinferidaspelomtododeNeighborJoining(NJ).a) rvoreemescala,com comprimentos de ramos nas mesmas unidades das distncias evolutivas usadas para inferir a filogenia, e assumindo taxas evolutivas iguais para todas as linhagens. b) rvore mostrando apenas topologia. As distncias evolutivas foram computadaspelomtododeMximaVerossimilhanaComposta(MCL)eestoem unidadesdenmerodesubstituiesporstio.Ataxadevariaoentrestiosfoi modeladausandodistribuiogama(=0,5).Osgapsforamtratadoscomomissing dataeeliminadosnascomparaesparapar(Pairwisedeletionoption).Asomado comprimentodosramosfoide0,408..................................................................................... MapamostrandoaspopulaesdeA.altiparanae eA. aff.bimaculatussobestudo. Algarismos dentro dos crculos indicam as principais bacias hidrogrficas do sudestebrasileiro:1)rioTiet;2)rioParanapanema;3)rioRibeiradeIguape;4) rio Guapimirim. Letras indicam os pontos de coleta: Penpolis/SP (pe); Indaiatuba/SP (in); Salespolis/SP (sa); Avar/SP (rc); Pilar do Sul/SP (ps); Sete Barras/SP(pp,ad);CachoeirasdeMacacu/RJ(gp)................................................................... Caritipos de A. altiparanae (ab) e A. aff. bimaculatus (cd) corados em Giemsa. PopulaesprovenientesdeSalespolis/SP(a),PilardoSul/SP(b),SeteBarras/SP (c)eCachoeirasdeMacacu/RJ(d).Barra=5m........................................................................... Metfases de A. altiparanae (af) e A. aff. bimaculatus (gl). AgRONs (primeira coluna), FISH18S (segunda coluna) e FISH5S (terceira coluna) das populaes provenientesdeSalespolis/SP(a,b,c),PilardoSul/SP(d,e,f),SeteBarras/SP(g, h,i)eCachoeirasdeMacacu/RJ(j,k,l).Barra=5m.................................................................. Metfases de A. altiparanae (ad) e A. aff. bimaculatus (eh) submetidas ao bandamentoC (primeira coluna) e FISH com sonda do satDNA As51 (segunda coluna). Populaes provenientes de Salespolis/SP (a, b), Pilar do Sul/SP (c, d), SeteBarras/SP(e,f)eCachoeirasdeMacacu/RJ(g,h).Barras=5m..............................

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141 141

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Figura8.5 rvores construdas pelo mtodo de mxima parcimnia (MP). Os Valores de

Figura8.6

Figura9.1

Figura9.2

Figura9.3 Figura9.4 Figura9.5

bootstrap(1000rplicas)estoprximosdosramos.Osgapsforamtratadoscomo missingdata.a)rvoreconsensode43maisparcimoniosas(nmerodepassos= 310) mostrando as relaes evolutivas da regio tRNAmet+ND2 entre 17 indivduos: ndice de Consistncia (IC) = 0,929078; ndice de Reteno (IR) = 0,967742. b) rvore consenso de 22 mais parcimoniosas (nmero de passos = 285)mostrandoasrelaesevolutivasdaregioATPase6/8entre21indivduos: IC=0,577922;IR=0,813754.............................................................................................................. rvores dos dados concatenados de 16 indivduos usando 1.124 poisies. Os Valores de bootstrap (1000 rplicas) esto prximos dos ramos. Os gaps foram tratados como missing data e eliminados apenas nas comparaes parapar no mtodo NJMCL (Pairwise deletion option). a) rvore construda pelo mtodo de mxima parcimnia (MP).rvoreconsensode 5mais parcimoniosas(nmero de passos = 589) mostrando as relaes evolutivas das regies tRNAmet+ND2 e ATPase8/6: ndice de Consistncia (IC) = 0,802410; ndice de Reteno (IR) = 0,884017. b) rvore concatenada inferida pelo mtodo de NeighborJoining (NJ), linearizada e em escala, com comprimentos de ramos nas mesmas unidades das distnciasevolutivasusadasparainferirafilogenia,eassumindotaxasevolutivas iguais para todas as linhagens. As distncias evolutivas foram computadas pelo mtodo de Mxima Verossimilhana Composta (MCL) e esto em unidades de nmero de substituies por stio. A taxa de variao entre stios foi modelada usando distribuio gama (=0,61). A soma do comprimento dos ramos foi de 0,857............................................................................................................................................................... rvore inferida pelo mtodo de NeighborJoining (NJ), em escala, com comprimentos de ramos nas mesmas unidades das distncias evolutivas usadas para inferir a filogenia, e assumindo taxas evolutivas iguais para todas as linhagens. As distncias evolutivas foram computadas pelo mtodo de Mxima VerossimilhanaComposta(MCL)eestoemunidadesdenmerodesubstituies por stio. A taxa de variao entre stios foi modelada usando distribuio gama (=0,73).Acalibraodorelgiomolecularparaconvertedistnciaemtempofoi aproximadamente 75,443 (tempo/altura do n). Os Valores de bootstrap (100 rplicas) esto prximos dos ramos. Os gapsforam tratados como missing datae eliminados nas comparaes parapar (Pairwise deletion option). A soma do comprimentodosramosfoide2,268................................................................................................ rvoreconsensode104 maisparcimoniosas, construdapelomtododemxima parcimnia(MP)(nmerodepassos=1562),mostrandoasrelaesevolutivasda regio ATPase6/8 entre 118 indivduos: ndice de Consistncia (IC) = 0,535131; ndicedeReteno(IR)=0,937476.OsValoresde bootstrap(100rplicas)esto prximosdosramos.Osgapsforamtratadoscomomissingdata........................................ Clado1darvoreconsensoconstrudapelomtododemximaparcimnia(MP), mostrandoasrelaesevolutivasentreoslambarisderabovermelho........................ Clado2darvoreconsensoconstrudapelomtododemximaparcimnia(MP), mostrandoasrelaesevolutivasentreoslambarisderaboamarelo........................... Clado3darvoreconsensoconstrudapelomtododemximaparcimnia(MP), mostrando as relaes evolutivas entre os lambaris provenientes da drenagem costeira............................................................................................................................................................

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SUMRIO Resumo Abstract iii v vii x 01 01 05 06 10 13

ListadeFiguras Sumrio

CaptuloIIntroduoGeralBiologiaevolutivadogneroAstyanax 1.1OambientedosAstyanaxfomentaprocessosevolutivos 1.2Aspectostaxonmicos:grupocomplexo

1.3CromossomosnogneroAstyanax:variabilidadeexcessiva?

1.4DNAmitocondrial,estudosevolutivosesuaaplicaonogneroAstyanax 1.5Objetivos

Captulo II Citogentica Molecular do lambari cego mexicano e observaes sobreaevoluocariotpicadogneroAstyanax(Teleostei,Characidae) 16

CaptuloIIIAstyanaxbockmanniVari&Castro,2007:umcaritipoambguono gneroAstyanax 35

Captulo IV Astyanax hastatus (Teleostei, Characidae): um novo complexo de espciesnogneroAstyanax? 46

CaptuloVCitogenticamolecularde Astyanaxribeirae(Teleostei,Characidae), umlambariendmicodamataAtlntica 61

Captulo VI Padro biogeogrfico da distribuio cromossmica de um DNA satlite em Astyanax aff. fasciatus (Teleostei, Characidae) das bacias do sudeste brasileiro 73

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CaptuloVIIAstyanaxaff.fasciatus(Teleostei,Characidae)dosudestedoBrasil: anlisescitogenticasefilogeogrficas

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Captulo VIII Citogentica comparativa e filogeografia molecular do grupo Astyanaxaltiparanaebimaculatus(Teleostei,Characidae) 116

Captulo IX Relaes evolutivas de espcies do gnero Astyanax: anlises cromossmicasemoleculares 146

Captulo X Concluses Padres e processos evolutivos observados no gnero Astyanax 172 173 175 177

10.1OsAstyanaxdadrenagemcosteira

10.2OsAstyanaxdasdrenagenscircunvizinhasaosistemadosRiosCosteiros 10.3Demaisespciesutilizadasnasanlises

10.4 A abordagem multidisciplinar e sua contribuio biologia evolutiva dos Astyanax 178 180 195 197

RefernciasBibliogrficas Biografia Anexo

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1 KarineFrehnerKavalco

CaptuloI IntroduoGeralBiologiaevolutivadogneroAstyanax 1.1OambientedosAstyanaxfomentaprocessosevolutivos OsriosquecompemosistemadedrenagemdoLestecorremexclusivamente em territrio brasileiro, e se estendem da foz do rio So Francisco at o rio Itaja (PAIVA, 1982). Podem ser identificadas trs principais drenagens nesta ampla distribuio: a do rio Paraba do Sul; a do rio Ribeira de Iguape e o conjunto de drenagensatlnticasindependentes,ouRiosCosteiros. SegundoCASTRO e MENEZES(1996),aictiofaunadaporopaulistadabaciado rio Paraba do Sul est agrupada em 22 famlias e aproximadamente 166 espcies, representadas primariamente por espcies de pequeno porte, habitantes de pequenos cursos de gua que constituem cabeceiras hidrogrficas. As pores superioresdabaciadorioRibeiradoIguape(queapresenta12famliase54espcies de peixes), ainda contidas em manchas relativamente intactas de Floresta Costeira Atlntica,apresentamumaricafaunadepeixesdepequenoporte,associadaariachos correntosos de floresta, ainda pouco estudada. Considerase que o nmero de espcies desta bacia seja subestimado, uma vez que ictilogos estimam o total de espcies da regio em torno de 150 (CASTRO e MENEZES, 1996). Tal estimativa certamenterelacionaseaofatodequecrregoscommataciliarmaisbempreservada mantm maior riqueza de espcies de peixes em comparao com reas com coberturavegetalmaisdegradada(BURCHERetal.,2008). Porsuavez,oconjuntodosRiosLitorneos,contm15famliase48espcies de peixes de gua doce. Embora, em termos numricos, menos diversa do ponto de


vistataxonmicoqueasoutrasregies,amaisricaemformasendmicas(cercade 80% dos Ostariophysi dos rios costeiros do leste do Brasil so endmicos), j que possuiumalongahistriaevolutivaindependentedesuasbaciascomponentes.Este nmerodeveraumentarsignificativamentequandoaregioformaisbemexplorada (CASTROeMENEZES,1996). AbaciadorioParancircundagrandepartedosistemadedrenagemdoLeste, comoqualtevebviarelaopretrita(ABSABER,1957)econsideradaumadasoito regiesfaunsticasdaAmricadoSul(GRY,1969).OParanoprincipalriodabacia do Prata e o segundo maior em extenso do continente. Desde sua nascente, no rio Paranaba,atsuafoz,elepercorrecercade3.800km,eaolongodessadistribuio habitam cerca de 35 famlias, representadas por 230 espcies de peixes, sendo a famlia Characidae a mais expressiva em nmero de espcies (A GOSTINHO e JLIO JR., 1999). De fato, a famlia Characidae abrange mais da metade dos caracides neotropicais, e composta em sua grande maioria pelos pequenos tetras (LOWE MCCONNELL, 1999). Segundo CASTRO e MENEZES (1996), a poro paulista do Alto rio Paranpossui22famliaseaproximadamente166espciesdepeixes. Embora estes nmeros reflitam em termos absolutos a biodiversidade conhecida nas respectivas bacias, nem todas as espcies listadas ocorrem em todo bitopo.Emalgunscasosocorremmerosagregadosdepeixes,retidospelaretrao da gua no perodo da seca, o que no representaria comunidades verdadeiras (consideradas um registro de acumulaes de espcies durante tempos geolgicos) (LOWEMCCONNELL,1999),paraasquaisprocessosepadresevolutivosprecisamser sugeridoscomcuidado. A histria natural da ictiofauna das drenagens da costa brasileira est relacionada com a geomorfologia da regio e, segundo ALMEIDA e CARNEIRO (1998),


esta caracterizada pela presena da Serra do Mar, um conjunto de escarpas festonadascomcercade1.000kmdeextenso,queseestendedoRiodeJaneiroat norte de Santa Catarina. No Estado do Paran configura uma cadeia de montanhas com cimos elevados at a 1.800 m de altitude. Em So Paulo, impese como tpica bordadeplanalto,freqentementeniveladapelotopoemaltitudesde800a1.200m. Emborapercorragrandedistncia,aSerradoMarinterrompidanaregiodoVale doRibeiradeIguape.Nestetrecho,aposiodaSerradoMarcomobordalimitedo planaltopassouaserdesempenhadapelaSerradeParanapiacaba,bemmaisparao interior da regio (ALMEIDA e CARNEIRO, 1998). A Serra do Mar, portanto, representa um imponente divisor das guas que correm dentro do continente e desguam na baciadoPratadaquelasquedrenamparaooceanoAtlntico. Regies montanhosas, como esta, impem aos organismos presses seletivas particulares, devidas principalmente a sua topografia. A geografia e a demografia populacional tm desempenhado papel fundamental na maioria dos cenrios de especiao(MAYR,1942;1963).SegundoFUTUYMA(1997),animaisaquticosmostram uma maior diversidade regional em regies montanhosas onde h sistemas de rios isoladoseoisolamentogeogrficodeespciesdepeixesnascabeceirasdosriospode levar estas comunidades a processos evolutivos importantes, culminando na especiaoporalopatria.SegundoFUTUYMA e MAYER(1980),aespeciaoaloptrica o principal meio de especiao na natureza e a diviso de subpopulaes pode impedir o fluxo gnico, levando tais grupos a tornaremse suficientemente divergentes, at constiturem espcies distintas. Populaes geograficamente distantes, ou nas quais no h fluxo gnico, so mais freqentemente isoladas por esterilidadeoudiferenasetolgicasquepopulaesvizinhas. Umaevidnciaparaa diferenciao aloptrica fornecida pela freqente correspondncia entre


descontinuidadebiolgicaetopogrfica(FUTUYMA,1997).Almdisso,sistemasderios tropicais de grande porte admitem que algumas espcies de peixes se isolem geograficamente nas cabeceiras de seus tributrios, atravs de barreiras intrapopulacionaisfsicas,qumicasoubiticas,permitindoqueestasevoluamdentro do prprio sistema (LOWEMCCONNELL, 1969). Dentre estes fatores, as presses seletivasbiticasparecemexercerumpapelpreponderantenosambientesdebaixa latitude. DOZBZHANSKY (1950) ressaltou que a seleo bitica parece ser de importncia especial nas comunidades tropicais e, sendo dependente da densidade, podesermaismoduladoraemseusefeitosdoqueaseleoabitica(independente da densidade) encontrada em ambientes temperados (sazonais); tais presses biticas podem ser responsveis pelas sutilezas de semelhanas protetoras e manifestaes de mimetismo nas faunas tropicais. A constante interao entre predador e presa, com o desenvolvimento de mecanismos para evitar que sejam predados, em contrapartida s adaptaes no predador, contrapostas por mecanismos de comportamentos adicionais antipredatrios, um aspecto das comunidadessulamericanasdeinsetos,eamesmasituaopareceocorrerparaos peixestropicais(LOWEMCCONNELL,1999). Aespeciaotambmpodeocorrerrepentinamenteempequenaspopulaes pelaaodeeventoscomopoliploidizao,rearranjoscromossmicosoumudanas nosistemadecruzamentosaleatrios(AVISE,2004). Entretanto,adivergnciadosorganismosaquticosnascabeceirasderiosest tambm relacionada com os aspectos fsicos destes ambientes, pelo fato de estes apresentarem condies abiticas peculiares, como tambm uma peculiar fauna ictiolgica. Pequenas alteraes ecolgicas (como temperatura da gua, pH, condutividade, disponibilidade de oxignio e turbidez) ocorrem mais rapidamente


nestesambientessecomparadosariosdegrandeporte,emsituaesdemudanas climticas(LOWEMCCONNELL,1969). Em se tratando da ictiofauna de riachos, podese supor que estes ambientes exercerampressesdeseleo,favorecendofortementeopequenoportedasespcies componentes (CASTRO, 1999). Entre os peixes de pequeno porte habitantes destes cursos dgua verificase a presena dos representantes do gnero Astyanax, cuja distribuio observada desde o sul dos Estados Unidos at o norte da Argentina (EIGENMANN,1921). 1.2Aspectostaxonmicos:grupocomplexo O gnero Astyanax abrange peixes conhecidos popularmente como piabas ou lambaris, sendo um dos gneros dominantes na Amrica do Sul (GRY, 1977). Seus exemplares possuem tamanho reduzido, tendo como principais caractersticas morfolgicas: nadadeira adiposa geralmentepresente; linha lateralcompleta, pouco curva na frente; prmaxilar no protrtil; dentes prmaxilares dispostos em duas sries,ainternacomcincodentes;dentescomcspides;alturadocorpocercadetrs vezes ou menos o comprimento padro, e escamas de tamanho normal, cobrindo apenas a base dos raios da nadadeira caudal (Britski et al., 1988). Os lambaris so peixes nomigradores, com fecundao externa e ausncia de cuidado parental (VAZZOLLEReMENEZES,1992). EIGENMANN (1921) props a existncia de 74 espcies e subespcies neotropicaisdeAstyanax,enquantoGRY(1977)afirmahavermaisde62espciese subespcies apenas em rios brasileiros. GARUTTI (1995; 1998), entretanto, sustenta queestegnerocompostoporaproximadamente100espciesesubespcies.Alm


de esse nmero no ser exato, MELO (2001) argumenta que provvel que muitas espciesaindaestejamporserdescritas.Defato,muitosautorestmapresentado comunidade cientfica a descrio de txons recentemente descobertos (CASTRO e VARI, 2004; LIMA e ZUANON, 2004; BERTACO e LUCINDA, 2005; HALUCH e ABILHOA, 2005; BERTACO e LUCENA, 2006; BERTACO e GARUTTI, 2007; VARI e CASTRO, 2007), embora os pequenos tetras sejam bastante semelhantes em sua aparncia e difceis de serem identificados(LOWEMCCONNELL,1999). Em reviso recente foram listadas cerca de 90 espcies vlidas, as quais se encontram insertae sedis dentro da famlia Characidae (REIS et al., 2003). possvel que a variao do nmero de espcies do gnero Astyanax seja devida a erros amostrais.SegundoGARUTTI(1988),umnmeromuitograndedeespcies,muitasdas quais descritas com base em um nmero muito reduzido de exemplares, tem sido colocado nesse gnero. Neste sentido, trabalhos de redefinio das espcies j descritas, como o de MELO e BUCKUP (2006), tm contribudo para a elucidao da histria evolutiva do gnero, eliminando possveis redundncias nas descries especficas. DentreosAstyanaxdeocorrnciaregistradanaregiodadrenagemdosRios Costeiros e Alto Paran, destacamse A. fasciatus, A. bimaculatus, A. bockmanni, A. giton,A.hastatus,A.intermedius,A.parahybae,A.ribeirae,A.scabripinnis,eA.teniatus (compiladocombaseemREISetal.,2003). 1.3CromossomosnogneroAstyanax:variabilidadeexcessiva? OnmerodiplidenogneroAstyanaxvaide2n=36a2n=50cromossomos,e a grande variabilidade cariotpica observada torna difceis quaisquer inferncias


sobre a evoluo cromossmica do grupo, sobretudo nas espcies com alto grau de polimorfismos(pararevisovejaPAZZAeKAVALCO,2007). A.schubartipossuiomenornmerocromossmicodognero,compequenas variaes em relao s frmulas cariotpicas (MORELLI et al., 1983; DANIELSILVA e ALMEIDATOLEDO, 2001, 2005). Alm de A. schubarti, pelos estudos realizados at o momento, outras espcies tambm possuem nmeros cromossmicos conservados. Por exemplo, A. parahybae apresenta 2n=48 cromossomos nas duas populaes estudadas,umanoalto(KAVALCO e MOREIRAFILHO,2003)eoutranomdioParabado Sul (CENTOFANTE et al., 2003). Entretanto, a maioria das espcies de Astyanax com nmerocromossmicoconservadoapresenta2n=50cromossomos.Emgeraltratase deespciesdedistribuiorestrita,endmicosdecertasbaciashidrogrficasecom poucas amostragens ao longo dos sistemas hidrogrficos em que habitam (PAZZA e KAVALCO,2007).Porestarazo,namedidaemqueosestudosavanarem,possvel que este agrupamento se mostre artificial e no reflita a real situao dos nmeros diplidesdestasespcies. NogneroAstyanaxsoobservadoscomplexosdeespcies,relativosapelo menos trs grupos, onde tanto nmeros diplides quanto frmulas cariotpicas so variveis: A. scabripinnis (MOREIRAFILHO e BERTOLLO, 1991); A. fasciatus (JUSTI, 1993; PAZZA et al., 2006) e A. altiparanae (FERNANDES e MARTINSSANTOS, 2004). Nos complexos A. scabripinnis e A. fasciatus observado alto grau de variabilidade, sobretudo no tocante s suas macroestruturas cariotpicas, nmeros diplides, presena de cromossomos supranumerrios ou Bs e polimorfismos de blocos heterocromticos e das regies organizadoras nucleolares (RONs). A variao no nmerocromossmicoemespciesde Astyanaxpodeaindaserdevidaocorrncia de triploidias (PAZZA e KAVALCO, 2007). No complexo A. altiparanae, entretanto, a


diversidade cariotpica parece estar limitada macroestrutura cariotpica, uma vez queoutrostiposdepolimorfismoscromossmicosestoausentes. A ocorrncia desses complexos de espcies demonstra a dificuldade de inferir a filogenia cromossmica do grupo, uma vez que relativamente pequeno o nmerodeespciesinformativasdeAstyanaxanalisadas,eestasapresentamgrande diversidade.Ainda,diantedavariaoobservadanasanlisescromossmicas,no difcil concordar que o grupo possa ter origem polifiltica, como foi sugerido por WEITZMANeMALABARBA(1998),baseandoseemanlisesmorfolgicasdognero. OsdadosreferentessespciesdeocorrncianabaciadoLestesoescassos, estandopraticamentelimitadosdrenagemdorioParabadoSul.Dentreasespcies deocorrnciaregistradanabaciadorioParabadoSulhdadoscitogenticospara populaesdeA.scabripinnis2n=50(SOUZA e MOREIRAFILHO, 1995; NEO etal., 2000, 2001; FERRO etal., 2001; KAVALCO e MOREIRAFILHO, 2003),A.parahybae2n=48(JUSTI, 1993; HERAS, 1998; KAVALCO e MOREIRAFILHO, 2003),A.gitoneA.intermediusambos com 2n=50 cromossomos (KAVALCO e MOREIRAFILHO, 2003). A. janeiroensis, provenientedabaciadorioRibeiradeIguape,possui2n=50cromossomos(CARVALHO et al., 2002). As demais espcies ocorrentes na regio costeira ainda no foram estudadasdopontodevistacitogentico. Apesardeaindaincipientes,osestudosnaregiopuderamindicaraevidncia citogenticadeagrupamentosbemdefinidosnabaciadorioParabadoSul(KAVALCO e MOREIRAFILHO, 2003; KAVALCO etal., 2004, 2007).Segundoosautores,nasubbacia dorioParaitingasoobservadosdoisgrupos,umpossuidordepoucoscromossomos acrocntricos,compresenadeDNAsatlitepAs51estiosGCricos(constitudodas espcies A. scabripinnis e A. parahybae), e outro grupo, com muitos cromossomos


acrocntricos,semheterocromatinaGCricaouDNAsatlitepAs51(formadoporA. gitoneA.intermedius). Maisumsuporteaestesdadosfornecidopelalocalizaognicadestiosde rDNA 5S. Dentre estas espcies, podemse verificar claramente dois grupos com relaoaonmeroelocalizaodoslocidesteDNAribossmico.A.scabripinniseA. parahybae possuem um stio intersticial em um cromossomo metacntrico, ausente em A. giton e A. intermedius (KAVALCO et al., 2004). A ocorrncia deste stio em A. scabripinnis e A. parahybae, previamente observado em outras espcies do gnero Astyanax(ALMEIDATOLEDOetal.,2002),almdeumnmeroreduzidodelocignicos (6 e 4, respectivamente), denota o provvel relacionamento entre estas espcies e outrasocorrentesnasbaciasdorioTieteSoFrancisco,eseudistanciamentodeA. intermediuseA.giton,ambospossuidoresde10stiosderDNA5S. Adicionalmente, atravs de anlises multivariadas das similaridades cariotpicas dos dados publicados para o gnero Astyanax, PAZZA E KAVALCO (2007) geraram um dendrograma de NeighbourJoining, baseado na distncia euclidiana, onde possvel observar que os caritipos de A. giton e A. intermedius so mais semelhantesaodeoutrapopulaodeA.scabripinnisdoParabadoSuldoquecomA. scabripinniseA.parahybaedorioParaitinga,grupandoaindacom A.janeiroensis,A. schubartieumapopulaodeA.scabripinnisdosriosCosteiros. As caractersticas apontadas tornam interessantes os estudos neste grupo, sobretudo no sistema hidrogrfico do Leste brasileiro, uma vez que tais tendncias talvez ocorram igualmente nas demais espcies e/ou populaes da regio, muitas dasquaissoaindadesconhecidasdopontodevistacitogentico.


1.4DNAmitocondrial,estudosevolutivosesuaaplicaoemAstyanax A anlise da similaridade nucleotdica pode fornecer dados para estudos de relaes evolutivas, sendo possvel para tal, a escolha de genes mitocondriais e nucleares. Segundo PAGE e HOLMES (1998), cada uma das diferentes tcnicas para inferncia filogentica tem sua vantagem e desvantagem, e sua aplicao correta dependedogrupotaxonmicoaserestudadoeashiptesesaseremtestadas,ouseja, o direcionamento filogentico das questes. Para os autores, os dados moleculares, particularmenteaseqncianucleotdica,oferecempotencialmenteumaimensidade deinformaes,queultrapassaaextensodovastoconhecimentotaxonmico. Os dados de seqenciamento possibilitam a visualizao de diferenas moleculares com alta resoluo (transies versus transverses; substituies sinnimas versus no sinnimas; substituies de nucleotdeos versus inseres ou delees;mudanasemregiescodificantesouno,etc.),epodemseraplicadospara anlisesintraespecficas,quandogenesouregiescomevoluomaisrpidasoos indicadosparaanlise,ouentretxonssuperiores,quandogenesqueevoluemmais lentamente so a melhor escolha (AVISE, 2004). Por exemplo, a regio controle do mtDNA (Dloop) normalmente utilizada para estudos populacionais, enquanto o Citocromob,encontradonamesmamolcula,geralmenteutilizadoparaanlisesem txonsacimadonveldeespcie(PEREIRA,2000). O genoma mitocondrial apresenta algumas particularidades, entre as quais o fato de codificar, de leveduras a mamferos, praticamente as mesmas protenas, apesar de possuir distintas organizaes gnicas (BOORE, 1999). O mtDNA dos vertebrados muito pequeno (15 a 20 kb), com uma organizao extremamente compacta, com 37 genes (Figura 1.1) e poucos nucleotdeos intergnicos no codificantes, apesar de aparecer em vrias (102 a 104 ) cpias por clula (PEREIRA,


2000). Caractersticas como alta taxa de evoluo em relao do DNA nuclear; ausncia de recombinao (na maioria dos casos) e herana predominantemente materna,entreoutras,otornamvisadoparaestudosgenticoseevolutivos(AVISEet al.,1987).Emboraincomuns,evidnciasderecombinaonomtDNAdepeixesforam observadas,porexemplo,emlinguados(HOARAUetal.,2002)eemcarpastriplides (GUOetal.,2006).

AorganizaobsicadomtDNAdealgunsgruposdevertebrados,considerada conservada(Figura1.1),assumidacomotendoaregiocontrolenocodificante,13 genes que codificam para protenas, dois genes de rRNAs, e 22 tRNAs arranjados numa molcula circular (JOHANSEN et al., 1990). Em alguns peixes so observados rearranjosnaorganizaodogenomamitocondrial(MIYA e NISHIDA,1999;MIYAetal.,Figura1.1Esquemamostrandoaorganizaodomitogenomade vertebrados.Fonte:Passarge(1995).


2001, 2003; MABUCHI et al., 2004), normalmente com relao aos genes de tRNAs (STANTON et al., 1994). Entretanto, em exemplares da subordem Notothenioidei (Perciformes)provenientesdaAntrtidanofoiobservadaaexistnciadaregioque codificaogenedasubunidade6daNADHdesidrogenaseedotRNA Glu(PAPETTIetal., 2007). A regio controle do mtDNA, ou Dloop, responsvel pela variao no tamanho da molcula (URSING e ARNASON, 1998), que pode ser de 6 kb at mais de 2000kb,seconsideradostodososorganismosjanalisados(P AGEeHOLMES,1998). VriostrabalhostmaplicadoaanlisedeseqnciasdomtDNAparaoestudo das relaes evolutivas entre os peixes, entretanto, os grupos neotropicais ainda possuem poucas informaes a esse respeito (ALVESGOMES et al., 1995; ORT et al., 1996;ORTeMEYER,1997;HILSDORFetal.,2002;SHIMABUKURODIASetal.,2004;MOYSS, 2005). Com relao ao gnero Astyanax, os recentes estudos com marcadores molecularessoaindaincipientes,estandorelacionadosaferramentascomooRAPD polimorfismodeDNAamplificadoaoacaso(PAIVA etal., 2001; GALINDO etal., 2002; MATOSO, 2002; PRIOLI et al., 2002; LEUZZI et al., 2004; PAZZA et al., 2007), RFLP polimorfismos no comprimento dos fragmentos de restrio (TOLEDO et al., 2002; MOYSS e ALMEIDATOLEDO, 2002; MATOSO, 2002),eISSRrepetiesentreseqncias nicas (PAZZA et al., 2007). As anlises de seqncias gnicas so observadas em poucostrabalhos(ORTeMEYER,1997;VIEIRA etal., 2001; PRIOLI etal., 2002; STRECKER et al., 2003, 2004; CALCAGNOTTO et al., 2005), sendo ausentes em espcies da regio costeira.Osestudosdeseqnciasnuclearesaindanoforamaplicadosnaresoluo deproblemasintrnsecosdognero,comonaabordagemfilogenticaentrediferentes espcies.


Segundo VIEIRA et al. (2001), as estimativas de distncia gentica entre dez populaes de A. scabripinnis, obtidas atravs do seqenciamento do gene mitocondrial12SrRNA,indicamquesetratadeumgrupopolifiltico,comosugerido anteriormente por estudos citogenticos. O polifiletismo do gnero tambm ficou evidenteemanlisesdeseqnciasnuclearesemitocondriaisdeA.bimaculatuseA. scabripinnis, em um estudo das relaes evolutivas da ordem Characiformes (CALCAGNOTTOetal.,2005).Poroutrolado,foiobservadaaltasimilaridadeemanlises de seqncias mitocondriais (incluindo a regio controle) de populaes de A. altiparanaedorioIguau(PRIOLIetal.,2002),oqueindicaqueavariaonognero Astyanax pode ser ampliada por ser um agrupamento artificial, e demonstra seu grande potencial para estudos genticos e evolutivos, alm da necessidade de revisestaxonmicas. 1.5Objetivos A ictiofauna da bacia do Leste possui formas endmicas, provavelmente em virtude das caractersticas geolgicas da regio e dos processos evolutivos que ocorrem nas pequenas populaes habitantes de cabeceiras. Esta fauna, extremamente interessante pela existncia de isolados populacionais, que podem proporcionar abruptamente eventos de especiao, carece de estudos que visem compreensodesuabiodiversidadeedesuasrelaesevolutivas. Aricabiodiversidadedospequenospeixeshabitantesdascabeceirasderios facilmente observada nos Astyanax, tanto com relao a sua morfologia como nos estudos citogenticos. A complementao das anlises citogenticas com dados moleculares, utilizandose a comparao das seqncias nucleotdicas com a finalidade de serem identificadas possveis relaes de parentesco, pode auxiliar na


visualizao do panorama evolutivo do gnero na regio. Em vista destes dados, o presentetrabalhobuscou: 1EfetuarestudoscariotpicosemespciesdogneroAstyanaxprovenientes da bacia do Leste brasileiro, na tentativa de mapear os eventos ocorridos na divergncia cromossmica do grupo, comparando os dados obtidos com os dados disponveisparapopulaespreviamenteestudadas; 2 Analisar os complementos cromossmicos de populaes de Astyanax provenientesdebaciascircunvizinhasaosistemadedrenagemdoLesteeestabelecer comparaescomosdadosdisponveisnaliteratura; 3 Realizar o seqenciamento nucleotdico de regies do genoma mitocondrial, com a finalidade de perfazer anlises das relaes evolutivas de espcies do gnero Astyanax, sobretudo nas previamente caracterizadas pelos estudoscitogenticos. Para elucidao destes questionamentos, propuseramse a utilizao de anlises cromossmicas (colorao convencional, bandamento C, deteco das regiesorganizadorasdenuclolos,hibridaoinsitufluorescenteutilizandosondas derDNA18S,rDNA5SedoDNArepetitivopAs51,eaplicaodefluorocromosbase especficos) e moleculares [amplificao, purificao e seqenciamento de fragmentos mitocondriais que correspondem s seqncias parciais do tRNA da metionina (tRNAMET) e da subunidade 2 do gene da NADHdesidrogenase (ND2); e das subunidades 6 e 8 da ATPase e de regio parcial da subunidade 3 do gene da citocromooxidase (CO3)], em exemplares de diversas populaes e espcies de Astyanax e de espcies relacionadas, provindos de diferentes bacias hidrogrficas brasileiras.


Taisdados,numaabordagemconjunta,propiciaramaobtenode caracteres diagnsticos entre populaes e/ou espcies e de inferncias filogenticas para algumas espcies do gnero Astyanax que habitam as regies dos rios costeiros e continentaisdasregiessulesudestedoBrasil.

Vt E


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CaptuloII Citogenticamoleculardolambaricegomexicanoeobservaessobreaevoluo cariotpicadogneroAstyanax(Teleostei,Characidae).1 Abstract AstyanaxmexicanusispopularlyknownastheblindMexicantetraorblindcavetetra and has been extensively studied regarding various aspects of its biology and genetics. Despite the identification of linkage maps of genes related to QTLs (QuantitativeTraitLoci)bymanyrecentstudies,onlyitsdiploidnumberwasknown from a cytogenetical point of view. With the purpose of providing a base for comparative studies and for the elucidation of physical maps for the species, cytogeneticalstudieswereperformedinagroupof10blindspecimensfromMexico. All the individuals presented 2n=50 chromosomes and a karyotypic formula composed of 8M+18SM+12ST+12A. A few specimens presented one or two B microchromosomes of the acrocentric type. Although simple AgNORs were evidenced, FISH (fluorescence in situ hybridization) with an 18S rDNA probe evidenced eight sites, and six sites were observed with a 5S rDNA probe. Little constitutive heterochromatin was observed, mainly related with the AgNOR region andlocatedclosetothecentromeres,includingthosefromtheBmicrochromosomes. A few pericentromeric heterochromatin regions were mainly constituted by GC, including the one from the AgNOR. Very subtle markings were observed by FISH with an As51 satellite DNA probe. The B microchromosome did not present

KAVALCO KF, ALMEIDATOLEDO LF.MolecularCytogeneticsofblindmexicantetraandcommentsonthe karyotypicevolutionofgenusAstyanax(Teleostei,Characidae).Zebrafish4(2):103111,2007. (AnexoI)1


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ribosomal genes or satellite DNA. Chromosomal aspects of the genus Astyanax are discussed. Resumo Astyanax mexicanus conhecido popularmente como tetra cego mexicano ou tetra cegodascavernas,etemsidoextensivamenteestudadocomrelaoavriosaspectos de sua gentica e biologia. Apesar da recente identificao de mapas de ligao de genes relacionados a QTLs (Loci de caracteres quantitativos), apenas seu nmero diplideconhecidodopontodevistacitogentico.Comoobjetivodeproverabase para estudos comparativos e a elucidao de mapas fsicos para a espcie, estudos citogenticos foram realizados em um grupo de 10 exemplares cegos provindos do Mxico.Todososindivduosapresentaram2n=50cromossomosefrmulacariotpica composta por 8M+18SM+12ST+12A. Poucos espcimes apresentaram um ou dois microcromossomos B do tipo acrocntrico. Embora AgRONs simples tenham sido identificadas, a hibridao fluorescente in situ FISH com sonda de rDNA 18S evidenciouoitostios,eseisstiosforamobservadoscomasondaderDNA5S.Pouca heterocromatina constitutiva foi observada, em sua maioria relacionada com as Ag RONs ou localizada prxima aos centrmeros, incluindo aquela observada no microcromossomoB.Algumasdestasheterocromatinasapresentaramseconstitudas predominantemente por bases GC, incluindo a da regio das AgRONs. Foram observadasmarcaesbastantesutisatravsdaFISHcomsondadeDNAsatliteAs 51. O microcromossomo B no apresentou genes ribossmicos ou DNA satlite. AspectoscitogenticosdogneroAstyanaxsodiscutidos.


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Introduo O grupo Astyanax abrange peixes conhecidos popularmente como piabas ou lambaris, sendo um dos gneros dominantes na Amrica do Sul (GRY, 1977). Em recente reviso foram listadas cerca de 90 espcies vlidas, as quais se encontram insertaesedisnafamliaCharacidae(REISetal.,2003). Alm dos estudos referentes anlise da macroestrutura dos cromossomos, localizaodecstronsribossmicoseDNAssatlites,acaracterizaodeseqncias oriundasdecromossomosBtambmproduziudadosinteressantes(MESTRINERetal., 2000), os quais colocam o gnero numa posio de destaque em relao a outros grupos de distribuio neotropical, ainda pouco explorados neste sentido. Segundo LANGECKER et al. (1995) e JEFFERY (2001), o gnero Astyanax tem se mostrado um excelentemodeloparaestudosgeraissobremecanismosevolutivos. Astyanaxmexicanus,conhecidonomeioaquaristacomotetracego,umadas 86 espcies de peixes que habitam regies caverncolas e apresentam traos troglomrficos(ROMERO e PAULSON,2001).AespcieeraconsideradasubespciedeA. fasciatus (MELO, 2001), um grupo com expressiva variabilidade cariotpica, do qual vrios cittipos (2n=45 a 2n=48) so observados convivendo em simpatria, sem aparentehibridismo(PAZZAetal.,2006). EstudoscitogenticosemA.mexicanusforamrealizadosnasdcadasde60,70 e80,ecaracterizaramonmerodiplidedetrspopulaes,umadasquaisfoicitada como Astyanax jordani, uma sinonmia antiga de A. mexicanus. Tais estudos identificaram dois nmeros diplides diferentes, 2n=50 (K IRBY et al., 1977; VASIL'EV, 1980) e 2n=48 (POST, 1965). Dados mais refinados sobre a estrutura dos cromossomosdessaespcie,comopadresdebandamentoselocalizaodegenese


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seqnciasdeDNA,soausentes,impossibilitandoabordagenscomparativascomas demaisespciesdognero. Acaractersticadaausnciadevisonaspopulaescaverncolas,decorrente dasupressodaexpressodogenePax6eposteriordegeneraodaestruturaocular (TIAN e PRICE, 2005), despertou o interesse para estudos da biologia evolutiva e do desenvolvimentodosolhos,paraosquaisA.mexicanustornouseummodelo(JEFFERY, 2001). Populaes subterrneas de A. mexicanus exibem olhos degenerados, afundados nas rbitas e cobertos com uma camada de pele; reduo ou perda completa da pigmentao melnica; sistema gustativo expandido e outros traos troglomrficos (DOWLING et al., 2002). Alm disso, apresentam metabolismo mais eficiente e so mais sensveis a estmulos qumicos e mecnicos, caractersticas que constituem,obviamente,pontosdedivergncia(PANARAMeBOROWSKY,2005). Osestudossobreogrupotmidentificadodesdegruposdegenesimportantes no desenvolvimento morfolgico das estruturas oculares (JEFFERY et al., 2003) at o padrodeheranadosalelosqueproduzemofentipocego,exclusivodepopulaes caverncolas. Atravs do cruzamento controlado em laboratrio entre as formas caverncolasedesuperfcie,marcadoresquantitativosdotipoQTLtmsidoisolados emaisde30gruposdeligaoforamidentificados(PROTASetal.,2006).Ohibridismo natural como conseqncia de contato secundrio entre as formas de superfcie e caverncola de A. mexicanus ocorre em cerca de 30% das populaes estudadas (MITCHELL et al., 1977), embora estudos genticos e bioqumicos indiquem baixos nveis de heterozigosidade nas populaes subterrneas (AVISE e SELANDER, 1972; PANARAM e BOROWSKY, 2005), talvez devido infertilidade das proles (BOROWSKY e WILKENS,2002).


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Estudos biogeogrficos de A. mexicanus sugerem doiseventos de colonizao no continente norteamericano, de acordo com filogeografia obtida a partir de seqncias do DNA mitocondrial de populaes de caverna e de superfcie. As populaes de caverna so divididas em dois grupos: SEP, com olhos grandes e pigmentao reduzida; e VEP, com olhos variveis e presena de pigmentao (WILKENS, 1988). Embora geograficamente prximas, populaes SEP em geral so maisdistantesdaspopulaesVEPedesuperfcie,enquantoasformasVEPsomais prximas das populaes de superfcie. STRECKER et al. (2004) sugerem que aps a primeira migrao, ocorrida aps a formao do Istmo do Panam por volta de 4,5 milhes de anos atrs, as populaes de superfcie nas regies mais ao Norte sucumbiram ao frio, enquanto as populaes de caverna (SEP) e mais ao Sul da AmricaCentralficaramprotegidas.Comaelevaodatemperatura,entre1,8e3,0 milhes de anos, uma nova migrao aconteceu, recolonizando as regies de superfcieealcanandonovasregiescaverncolas(STRECKERetal.,2004). Comointuitodefornecerdadoscitogenticosrecentesecomplementaresaos

anteriormente descritos, que possibilitem estudos comparativos, foram realizadas anlisescariotpicasemexemplaresdotetracego,Astyanaxmexicanus,dogrupoSEP. Foramutilizadas,almdasmetodologiasdebandamentocromossmicoconvencional efluorocromos,ahibridaofluorescenteinsitu(FISH)comsondasderDNAs18Se 5S e de um DNA satlite isolado de Astyanax scabripinnis (As51). Aspectos da evoluo cariotpica do gnero Astyanax e das particularidades biolgicas de A. mexicanussodiscutidos.


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MaterialeMtodos Foram estudados 10 exemplares de Astyanax mexicanus, provenientes de

estoques importados do Mxico para fins de aquariofilia no Brasil. O comprimento padromdiodosexemplaresfoide40mm.Devidoaoseutamanhoreduzido,nofoi possvelrealizarasexagemdosanimais.Osexemplaresapresentamausnciatotalde pigmentaoedodesenvolvimentodeestruturasperceptveisrelacionadasviso. Os cromossomos mitticos foram obtidos segundo GOLD et al. (1990), utilizandosoluodeHanksparamelhorcontroledotempodeaodacolchicina.A impregnao pelo nitrato de prata (AgRON Regies Organizadoras de Nuclolos Argeoflicas)seguiuoprotocolodeKAVALCO e PAZZA(2004),utilizandoseaparelhode microondas. A localizao direta dos cstrons ribossmicos foi realizada atravs de hibridao fluorescente in situ (FISH) (PINKEL et al., 1986; PAZZA et al., 2006), com sondas especficas 18S (HATANAKA e GALETTI Jr., 2004) e 5S (MARTINS e GALETTI Jr., 1999). Adicionalmente, foi realizada FISH utilizando sonda de DNA satlite As51, isolada a partir de uma populao de A. scabripinnis (MESTRINER et al., 2000). Com intuito de evitar resultado falsonegativo ou falsopositivo, as preparaes de A. mexicanus foram submetidas ao procedimento de FISH juntamente com lminas de preparaesdeAstyanaxfasciatus,sabidamenteportadorasdeseqnciashomlogas com a sonda, e de A. bockmanni, as quais no possuem homologia com tal DNA satlite,comoformadecontrole. Aproximadamente50metfasesforamanalisadasparacadaprocedimentode FISH, e cerca de 15 metfases de cada exemplar foram analisadas nas preparaes comGiemsa,BandaCeAgRONs.


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AssondasforammarcadascomUridinaBiotinilada(BdUTP),atravsdokitde Nick Translation Bionik Labeling System, Invitrogen. Durante o procedimento de FISH optouse por lavagens de alta estringncia, utilizandose Formamida 20% em 0,1xSSC. Os sinais foram amplificados utilizandose soluo de FITCavidina e anti avidina conjugada com biotina, incubadas em tampo NFDM. As lminas foram montadas com 25L de Vectashield Mounting Medium antifade, Vector with PropidiumIodide(1.5g/mL). ObandamentoCeacoloraopelofluorocromoCromomicinaA3seguiramas metodologiasdeSUMNER(1972)eSCHMID(1980),respectivamente. As preparaes foram analisadas em microscpio tico e capturadas (utilizandose5Mpdedefinio)comosistemadeanlisedeimagensCoolSnapProe com o software Image Pro Plus (Media Cybernetics). A classificao dos tipos cromossmicos levou em considerao a razo de braos (RB), classificando os cromossomos em quatro tipos: M metacntrico (RB=1,001,70), SM submetacntrico (RB= 1,713,00), ST subtelocntrico (RB= 3,017,00) e A acrocntrico(RB=maiorque7,00),deacordocomLEVANetal.(1964). Resultados Todos os exemplares apresentaram 50 cromossomos e frmula cariotpica

compostade8M+18SM+12ST+12A(Figura2.1).Foiobservadaaocorrnciademicro cromossomos B do tipo acrocntrico em alguns indivduos (Figuras 2.2, 2.3). A freqncia deste elemento foi varivel, sendo de dois supranumerrios em algumas metfasesdoindivduo(ocorridoemdoisexemplares,em5%dasmetfases),ouum


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supranumerrio, em 100% das metfases analisadas (ocorrido em dois exemplares, dosquaismaisde30metfasesforamanalisadasparafinsdecontagem). Aimpregnaopelonitratodeprataevidenciouduasmarcaesterminaisnos

braoscurtosdedoiscromossomosdotipoacrocntrico,correspondentesaopar24 (Figura2.1detalhe).EmboraonitratodepratatenhaevidenciadoAgNORssimples, a hibridao de sonda de rDNA 18S demonstrou que A. mexicanus possui oito cromossomosportadoresdestios,esuadistribuiofoipreferencialmenteterminal em braos longos e curtos de alguns pares cromossmicos SM, ST e A. No foram identificadasmarcaesnomicrocromossomoB(Figura2.3b). A FISH5S evidenciou a existncia de oito stios, sendo seis deles localizados

emregiesterminaisdecromossomosSTA, edoislocalizadosintersticialmenteem umparSM(Figura2.3c). O bandamentoC evidenciou pouca heterocromatina, predominantemente na regio pericentromrica de alguns cromossomos: blocos conspcuos foram observadosapenasnoscromossomosdopar24,portadoresdeconstriosecundria (Figura 2.2). A Cromomicina A3 evidenciou heterocromatinas GCricas restritas s regiesprximasaoscentrmeros,emcromossomosA.OmicrocromossomoBno apresentou afinidade com o corante GCespecfico (Figura 2.3a), e mostrouse parcialmenteheterocromtico,emsuaregiopericentromrica(Figura2.2detalhe). No foram observados sinais conspcuos resultantes da hibridao com a

sonda do DNA satlite As51 em A. mexicanus, tanto nos cromossomos do complemento quanto no cromossomo B (Figura 2.3d). Entretanto, sutis marcaes parecemtersidoproduzidasnasregiesterminaisdosbraoscurtosdedoisoutrs pares cromossmicos. As marcaes mostraram sinais difusos e pouco perceptveis,


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sobretudo nos ncleos interfsicos. As lminas do controle positivo, A fasciatus, apresentaram marcaes conspcuas em vrios cromossomos do complemento (Figura 2.3e), bem como nos ncleos interfsicos, ao contrrio das preparaes do controle negativo, A. bockmanni, as quais no mostram qualquer homologia com a sondaAs51(Figura2.3f). Discusso O gnero Astyanax tem se mostrado um modelo evolutivo bastante

interessantedentreospeixesNeotropicais,sobretudopelaspesquisasrealizadasem sua espcie mais estudada, Astyanax mexicanus. Embora praticamente todos os aspectos explorados na pesquisa gentica do grupo tenham sido realizados em populaes deste tetra cego, dados sobre os seus cromossomos mostravamse incipientes. Uma das aplicaes prticas oriundas da caracterizao cromossmica das espcies constitui a correta definio taxonmica, interface denominada citotaxonomia. Segundo BERTOLLO et al. (1986), as contribuies da citotaxonomia so:umaboacaracterizaocromossmicadasespcies;aevidnciacariotpicapara as suas relaes evolutivas; o suporte adicional para a identificao de espcies taxonomicamenteproblemticas;eareuniodeevidnciassobre possveiscasosde espciescrpticas. As informaes citogenticas disponveis para o gnero Astyanax mostram a existncia de complexos de espcies, relativos a pelo menos trs grupos: A. scabripinnis (MOREIRAFILHO e BERTOLLO, 1991); A. fasciatus (JUSTI, 1993) e A. altiparanae(FERNANDESeMARTINSSANTOS,2006b).Nestescomplexossoverificados: alto grau de variabilidade, sobretudo no tocante s macroestruturas cariotpicas;


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presena de cromossomos supranumerrios ou Bs (os quais podem tambm variar emtamanhoecomposio);polimorfismosdeblocosheterocromticosedasregies organizadorasnucleolares(RONs). Avariabilidadecariotpicadognero(osnmerosdiplidesvariamde36a50 cromossomos) torna difceis concluses sobre a evoluo cromossmica do grupo, sobretudo nestas espcies com alto grau de polimorfismos. Adicionalmente, so observadas espcies que apresentam a macroestruturacariotpicamais conservada, como A. bimaculatus, A. parahybae (antes considerada subespcie de A. fasciatus MELO, 2001) e A. schubarti. Neste sentido, o estudo das demais espcies, alm de favorecer abordagens comparativas, pode identificar corretamente populaes ou espcies, delimitando os caracteres biolgicos exclusivos de cada subgrupo, e direcionando a anlise das unidades de seleo e de outros estudos genticos, fornecendoumpanoramamaisconfiveldahistriaevolutivadognero. Assim como a maioria das espcies de Astyanax, A. mexicanus apresentou 50 cromossomos, sem diferenciao aparente entre machos e fmeas, uma vez que apenas uma frmula cariotpica, assim como padres de bandamentos, foram observados. Alm disso, o primeiro par metacntrico, caracterstico dos Characidae (SCHEEL, 1973; MORELLI et al., 1983; PORTELA et al., 1988; DANIELSILVA e ALMEIDA TOLEDO,2001;2005),tambmsemostroupresente. O caritipo de A. mexicanus mostrouse bastante assimtrico (Figura 2.1), sendo composto por vrios cromossomos do tipo SM, uma tendncia do grupo formadoporalgumaspopulaesdeA.scabripinnis(NOetal.,2000a;2000b;FERRO etal.,2001;KAVALCO e MOREIRAFILHO,2003),A.parahybae(KAVALCO e MOREIRAFILHO, 2003)eporA.fasciatus,especificamenteocittipopadro2n=48(PAZZAetal.,2006),


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emboraadistribuioentreosquatrotiposdecromossomossejamaisequilibradana espcie ora estudada. A frmula cariotpica mostrou diferenas em relao s descriesanteriores.KIRBYetal.(1977)observaramapresenade40cromossomos MSMe10STA,pormosdadosoraobtidosindicamaexistnciade26MSMe24 STA. Diferenas sutis na classificao dos tipos cromossomos podem decorrer de diferentes medies ou razes de brao utilizadas. Neste caso, as razes de braos consideradas so iguais, porm KIRBY et al. (1977) obtiveram suas preparaes cromossmicas a partir de epitlio das brnquias, por um protocolo descrito por MCPHAILeJONES(1966).Odesenvolvimentodeprocedimentosquegarantissemmaior qualidade nas preparaes seguiuse nas dcadas posteriores ao desenvolvimento desta tcnica, o que nos possibilitou a obteno de cromossomos mais distendidos, paraosquaismaisfcildeterminaroposicionamentodocentrmero,e,portanto,a razo de braos. Ainda, segundo KIRBY et al. (1977), esfregaos de testculos so materiais de difcil anlise, o que pode ter dificultado a determinao do nmero haplidecorretoparaosespcimesestudadosporP OST(1965),queindicaumn=24. Uma das discusses mais atuais em relao ao estudo dos cromossomos advm da presena no obrigatria de elementos supranumerrios, sua evoluo e influncias nos organismos que os possuem. Embora sejam cromossomos encontrados em uma ampla diversidade de organismos (como plantas, crustceos, insetos, peixes, anfbios, rpteis e mamferos), o gnero Astyanax tem mostrado variaesemrelaoaotamanho,nmeroefreqnciadesteselementosemrelao aosexo(MIZOGUCHI e MARTINSSANTOS,1997;1998a;1998b).OsmicrocromossomosB observadosnopresentetrabalhorepresentamaprimeiradescriodesteselementos emestudoscitogenticosdaespcie.


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Em relao aos cromossomos B, dois grupos podem ser identificados no gnero Astyanax: o primeiro deles composto por espcies que apresentam esporadicamentecromossomosBs,comoA.eigenmanniorum(STRIPECKEetal.,1985), A.fasciatuseA.schubarti(MOREIRAFILHOetal.,2001),etambmA.mexicanus,eoutro composto basicamente por A. scabripinnis, para o qual relatada em diversas populaes a ocorrncia de variados tipos destes cromossomos. Embora tenha sido cogitadaumarelaoancestralentreoscromossomos supranumerriosobservados emdiversasespciesdognero(MOREIRAFILHOetal.,2004),estudosmaisprofundos comrelaocomposiodoDNAdestesmostramsenecessriosparaaconfirmao detaisinferncias,umavezquedadosdagenticamoleculardeAstyanaxmexicanus indicamquepopulaesisoladas podemdesenvolverhomoplasias, comoaevoluo doalbinismo(PROTASetal.,2006),equeaconvergnciadecaracteresnopodeser desconsiderada. Como em outros estudos, o presente trabalho evidenciou que A. mexicanus exibe caractersticas comuns a organismos que constituem populaes pequenas e limitadas geograficamente, as quais sofrem os processos evolutivos de maneira particular,influenciadospelaalopatria.Taisevidnciasestorelacionadaspequena diversidade gentica das populaes caverncolas, inferida por estudos enzimticos (AVISE e SELANDER, 1972) ou com marcadores de DNA (PANARAM e BOROWSKY, 2005), nas quais processos, como a deriva gnica, podem atuar efetivamente na flutuao dasfreqnciasgnicas. A deriva gnica tambm pode ter influenciado a freqncia dos micro cromossomos B nos indivduos ora estudados, uma vez que em muitos casos estes elementostmsidoconsideradosneutrosemrelaoaofitnessdosseusportadores,e


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tambmqueaspopulaescaverncolassonormalmentepequenas.Adicionalmente, o fato de o elemento supranumerrio ter se mostrado quase totalmente heterocromticopodeindicaraausnciaderelaoadaptativaparaseusportadores. A ausncia das seqncias identificadas por meio de FISH indica, ainda, que este microcromossomo no est relacionado com genes ribossmicos, no apresenta heterocromatinaGCricaousimilaridadecomoDNAsatlitedifundidonogenomade alguns Astyanax. Entretanto, NO et al. (2000a; 2000b) argumentam que cromossomosBemA.scabripinnispodemdesempenharalgumpapeladaptativo,uma vez que observada a ocorrncia de tais elementos apenas em populaes distribudasacimados1000mdealtitudenaSerradaMantiqueira(Brasil). O padro de bandamento C observado destoou dos encontrados em populaesdeA.fasciatus,espcieemqueblocosconspcuospodemserobservados, osquaissoequivalentesaosstiosdeDNAsatliteAs51.AssimcomoA.mexicanus, outras espcies de Astyanax (A. giton e A. intermedius) apresentam pouca heterocromatina, que se encontra restrita s regies pericentromricas e das Ag RONs.Porm,diferenasmarcantesentresuasfrmulascariotpicassoobservadas, umavezqueA.mexicanuspossuiumnmerobastanteequilibradodecromossomos MSM e STA, e que A. giton e A. intermedius apresentam predominncia de cromossomos A (KAVALCO e MOREIRAFILHO, 2003). A. mexicanus no apresentou marcaesresolutivaspormeiodaFISHAs51,sugerindo,talvez,pequenonmerode cpias ou homologia parcial entre as regies terminais de alguns cromossomos e a sonda. Anlises comparativas em relao presena do DNA satlite As51 em espciesdognerosugeremaexistnciadedoisgruposnasbaciassulamericanasdo rio Paran e Paraba do Sul: um grupo com caritipos constitudos de poucos


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cromossomos A e com presena de DNA satlite As51 e stios GCricos, que seria representadoporalgumaspopulaesdeA.scabripinnis,A.parahybaeeA.fasciatus,e outrogrupoportadordemuitoscromossomosA,noqualheterocromatinasGCricase DNA satlite As51 esto ausentes, representado por A. giton e A. intermedius (KAVALCO et al., 2007). MESTRINER et al. (2001) sugerem que A. scabripinnis e A. fasciatus possuem um padro de distribuio do DNA As51 considerado ancestral, uma vez que as populaes por eles analisadas mostraram poucos cromossomos portadores deste DNA satlite. Neste sentido, podese sugerir uma diminuio gradativa deste satlite nas espcies A. giton e A. intermedius. Porm, como a seqncia deste DNA satlite mostrase bastante semelhante a transposons identificados no genoma de Anopheles, podese inferir que o padro ancestral teria uma distribuio bastante baixa no genoma, e que o acmulo deste DNA satlite poderia ser uma tendncia. Considerandose a distribuio no caritipo de A. mexicanus como semelhante a uma condio basal, os dois grupos derivados apresentariam tendncias contrrias. Uma vez que as bacias do rio Paran (A. fasciatus, A. scabripinnis) e do Orinoco (A. mexicanus) dividiramse muito antes da formao da bacia do rio Paraba do Sul (A. scabripinnis, A. parahybae, A. giton e A. intermedius),poderiaserhipotetizadoqueenquantoemA.scabripinnis,A.parahybae eA.fasciatusmecanismosdeacmuloedispersoteriamdisseminadoosstiosdeAs 51emdiversoscromossomos,emA.gitoneA.intermediusumprocessoposteriorde perda deste DNA teria culminado na ausncia dos stios. Por outro lado, devido s vrias diferenas observadas nos caritipos destas duas espcies em relao s demais espcies estudadas (quantidade de cromossomos A, ausncia de heterocromatina e satlite As51, muitos stios de rDNA 5S e ausncia de stio no


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cromossomoMmarcadordosAstyanax),ahiptesedequeambasfaampartedeum subgrupo independente dentro do gnero e que tais caractersticas no constituam sinapomorfias,massimplesiomorfiasdeoutroramo,deveserconsiderada.Aidiade queAstyanaxrepresenteumgrupopolifilticofoiprimeiramentepropostacombase emcaracteresmorfolgicosporWEITZMAN e MALABARBA(1998),epodersertestada atravsdefilogeniasmoleculares. Emboraasrelaesentreestasespciesaindapermaneampouco resolvidas, a caracterizao da heterocromatina como indicador de relacionamentos taxonmicos j foi utilizada anteriormente, e o DNA satlite mostrou ser uma ferramenta resolutiva (DEUMLING e GREILHUBER, 1982). Sendo um grupo especioso, esperase que o aumento dos dados referentes a outras espcies de Astyanax possa elucidarestasquestes. A distribuio dos genes ribossmicos em Astyanax seguiu um padro j observado em estudos anteriores. Dados da distribuio de stios 5S em Astyanax demonstramquepodemsertambmobservadosdoisgruposquantoaestecarter,e que esses grupos tm se mostrado congruentes com a diviso anterior. ALMEIDA TOLEDOetal.(2002)identificaramumparMmarcador,presenteemcincoespciesde Astyanax(A.altiparanae,A.lacustris,A.fasciatus,AscabripinniseA.schubarti).Talpar foitambmobservadoemA.mexicanus(presentetrabalho),A.scabripinnis(KAVALCO et al., 2003; MANTOVANI et al., 2005), A. fasciatus (PAZZA et al., 2006) e A. parahybae (KAVALCO et al., 2003), sendo ausente em A. giton e A. intermedius (KAVALCO et al., 2003).Adicionalmente,ograndenmerodestiosrDNA5Spresentesnestasltimas espcies (10 a 12 stios) pode refletir um estreito relacionamento entre elas e seu distanciamentofilogenticodasdemais.


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Regies GCricas associadas com as AgRONs, alm de serem comuns em peixestantoquenopassadofoisugeridooempregodefluorocromosGCricospara sua localizao (MAYR et al., 1985; AMEMIYA e GOLD, 1986) so tambm caractersticas conservadas para o gnero. Entretanto, nem todo stio CGrico, bem comonemtodamarcaocomnitratodepratanoscromossomosseguramenteum stioportadorderDNA45S(DOBIGNYetal.,2002). A.mexicanus,aexemplodeoutrasespciesdognero,apresentoumarcaes GCricas adicionais aos stios das AgRONs principais (Figura 2.3a), e oito cromossomos portadores do rDNA 18S (Figura 2.3b). Os stios de rDNA 18S em Astyanax mostramse mltiplos, podendo variar mesmo entre populaes de uma espcie,ouemespciesdeumcomplexo(MANTOVANIetal.,2005).Soobservadosnas regiesterminaisnoscromossomos(FERROetal.,2001;ALMEIDATOLEDOetal.,2002; KAVALCO e MOREIRAFILHO, 2003; MANTOVANI et al., 2005; PAZZA et al., 2006), ou em posio intersticial (ALMEIDATOLEDO et al., 2002), e normalmente mostramse de difcildeterminao,porseustamanhosreduzidos(P AZZAetal.,2006). Vrias espcies de Characidae apresentam populaes pequenas, sobretudo aquelas que representam txons caractersticos de ambientes de cabeceiras de rios ouhabitantesdepequenosriachos.Nestegrupo,aespeciaopormeiodealopatria indicada como o provvel mecanismo gerador de diversidade entre grupos, assim comooqueocorreemregiesmontanhosas,ondeossistemashdricosapresentam selimitadosgeograficamenteporelevaes(FUTUYMA,1997).CASTRO(1999)ressalta que muito da fauna das cabeceiras dos rios ainda est por ser descrita na regio Neotropical, e provavelmente ser constituda de peixes de pequeno porte. Ambientescomocavernas,emquehconfinamentodemassasdeguacompoucoou


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nenhumtrnsitodefauna,atuamcomoambientesinsulares,umavezqueatrocade genes seria limitada por fatores geogrficos. De uma forma geral, podemos pensar nospeixescomo umgrupocujodeslocamentorestritoemsua bacia,umavezque para praticamente todos os grupos, percursos de terra seca representam barreiras intransponveis(CASTRO,1999),emboramesmoacalhadosgrandesriospossaserum divisorefetivoparaafaunadascabeceiras(KAVALCOeMOREIRAFILHO,2003). RefernciasBibliogrficas As referncias correspondentes a este captulo encontramse sumarizadas no final destevolume.


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Figura2.1CaritipodeA.mexicanus coradoemGiemsa.Emdestaque,Ag RONs.

Figura2.2CaritipodeA.mexicanus apsbandamentoC.Emdestaque,o microcromossomoB.


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Figura2.3MetfasesdeA.mexicanus (ad).AssetasindicamossitesdeCromomicinaA3(a)e hibridaofluorescenteinsitu(FISH)comsondasderDNA18S(b),rDNA5S(c)eDNAsatlite As51(d).AscabeasdesetasindicamomicrocromossomoB.MetfasesdeA.fasciatus(e)eA. bockmanni(f)comFISHcomsondadoDNAsatliteAs51(lminascontrole).Barra=5m.

Vt F


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CaptuloIII AstyanaxbockmanniVari&Castro,2007:umcaritipoambguonogneroAstyanax.1 Abstract Despite of the widespread distribution of Astyanax bockmanni in streams along the Upper Paran River system in central, southeastern, and southern Brazil, only recently, it has been recognized as a distinct Astyanax species. Cytogenetic studies wereperformedintwodifferentpopulationsandshowedconservativefeatures.The species presented 2n=50 chromosomes, a karyotype formula composed of 10M+12SM+12ST+16A and multiple AgNOR sites. FISH (fluorescent in situ hybridization) with 18S rDNA probes evidenced eight sites, located on ST/A chromosomes.Foursignalswereobservedwith5SrDNAprobes,twoofthemlocated attheinterstitialregiononaMchromosomalpairandtwoattheterminalregionon an A chromosomal pair. Little amounts of constitutive heterochromatin were observed, mainly distributed at the distal region on two chromosomal pairs. Additionally, some heterochromatin was located close to the centromeres. Regions showing homologies with the As51 satellite DNA were not identified in the chromosomal complement of A. bockmanni. The species presented a set of features previously identified in two different groups within Astyanax. The chromosomal evolutioninthegenusAstyanaxisdiscussed.

1 KAVALCO KF, PAZZA R, ALMEIDATOLEDO LF. Astyanax bockmanni Vari & Castro, 2007: an ambiguous

karyotypeintheAstyanaxgenus.Genetica(aceito).


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Resumo Embora Astyanax bockmanni seja amplamente distribuda em rios do centrooeste, sudesteesulbrasileiros,apenasrecentementeaespciefoidescritaediferenciadade outras espcies de Astyanax. Estudos citogenticos realizados em duas populaes indicaram a conservao dos caracteres analisados. A espcie apresenta 2n=50 cromossomos,distribudosem10M+12SM+12ST+16A,AgRONsestiosderDNA18S mltiplos, localizados em cromossomos ST/A. Quatro stios de rDNA 5S foram identificados, sendo que dois deles localizaramse intersticialmente em um cromossomoM,edoisterminalmenteemumcromossomoA.Foiobservadaescassa heterocromatina constitutiva, distribuda em regio distal de dois pares cromossmicos. Adicionalmente, as regies pericentromricas dos cromossomos tambmforammarcadas.NoforamidentificadasregiesdehomologiacomoDNA satlite As51 nos cromossomos de A. bockmanni. A espcie apresenta uma conflunciadecaractersticasidentificadaspreviamenteemdoisgruposdistintosde Astyanax. Dados da evoluo cromossmica do grupo e seu posicionamento taxonmicosodiscutidos. Introduo A bacia do rio Paranapanema drena o sudeste do Brazil, nas fronteiras dos

Estados de So Paulo e Paran. Suas nascentes so localizadas na Serra de Paranapiacaba, um importante divisor de guas para as bacias dos rios Paraba do Sul, Paranapanema e Paran. A regio compreende parte da formao inicial do rio Paran,epossuiumafaunapeculiar.CASTRO e VARI(2004)admitemcertoendemismo narea,devidoaoisolamentopretritopropiciadoporSeteQuedas,hojesubmersas nolagodeItaipu.


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CASTRO (1999) considera que grande parte ictiofauna de cabeceiras ainda esteja por ser descrita na regio Neotropical, e que consistir provavelmente de peixes de pequeno porte. Para o gnero Astyanax isso especialmente verdadeiro. Nos ltimos anos algumas espcies vm sendo descritas, a maior parte delas provindas de pequenos rios e crregos, como A. cremnobates e A. brachypterygium (BERTACO e MALABARBA, 2001); A. biotae (CASTRO e VARI, 2004); A. dnophos (LIMA e ZUANON, 2004); A. totae (HALUCH e ABILHOA, 2005); A. elachylepis (BERTACO e LUCINDA, 2005); A. microschemos e A. pelecus (BERTACO e LUCENA, 2006), A. henseli (MELO e BUCKUP,2006)eA.bockmanni(VARIeCASTRO,2007). A.bockmanniumaespcieamplamentedistribudaemriachosdosistemado alto rio Paran, nas regies centrooeste, sudeste e sul do Brasil, tendo sido identificadapreviamentecomoA.eigenmanniorum.AlocalidadetipodeA.bockmanni orioParanaba,localizadoaonortedadistribuiodescritaeprximoabaciadorio Tocantins(VARIeCASTRO,2007). O processo de descrio de espcies importante devido aquisio de

subsdios para a compreenso da histria biolgica das mesmas. Ainda, a identificaodasespciesgeralmenteocorrecombaseemcaractersticasecolgicase morfolgicas.Entretanto,considerandooconceitobiolgicodeespcie,algunstxons podemserdiferenciadosapenasporcaractersticasdependentesdeumaabordagem mais refinada, como a propiciada pelos marcadores citogenticos e genticos. Alm disso, alguns caracteres interessantes tm sido descritos no gnero Astyanax, como polimorfismoscromossmicos(PAZZAetal.,2006)ecromossomosB(MOREIRAFILHO et al., 2004). Adicionalmente, os dados sobre diferentes espcies podem contribuir comoconhecimentosobreaevoluocariotpicadognero,demaneirageralainda obscura.


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Este artigo apresenta dados cromossmicos sobre a espcie recentemente

descrita, A. bockmanni, na tentativa de contribuir para a caracterizao do grupo. Segue discusso considerando os aspectos citogenticos de outras espcies de Astyanaxprovenientesdedrenagensprximas. MaterialeMtodos Foram analisados espcimes de A. bockmanni de dois diferentes pontos da

baciadorioParanapanema,Brasil.Oitoindivduos(cincofmeasetrsmachos)so provenientes do ponto de So Miguel Arcanjo (S 235444/ Wo 475740), e sete (sendoumafmeaeseismachos)soprovenientesdePilardoSul(S234845/Wo 474231). Os cromossomos mitticos foram obtidos de acordo com G OULD et al. (1990), por procedimento de airdrying. As Regies Organizadoras de Nuclolos (RONs), analisadas por meio de colorao com nitrato de Prata (AgRONs) foram realizadasde acordo com KAVALCO e PAZZA (2004), usando microondas. As bandasC seguiramoprotocolodeSUMNER(1972),baseadoemtratamentocomHClBa(OH)2. A localizao cromossmica dos cstrons ribossmicos por hibridao fluorescente in vitro (PINKEL et al., 1986; PAZZA et al., 2006) foi realizada usando sondasderDNA18S(HATANAKA e GALETTIJr.,2004)e5S(MARTINS e GALETTIJr.,1999). Adicionalmente,FISHusandoasondadoDNAsatliteAs51(MESTRINER etal.,2000) foirealizada.AssondasforammarcadascomUridinaBiotinilada(BdUTP),atravsdo kitdeNickTranslationBionikLabelingSystem,Invitrogen.Duranteoprocedimento deFISHoptouseporlavagensdealtaestringncia,utilizandoseFormamida20%em 0,1xSSC. Os sinais foram amplificados utilizandose soluo de FITCavidina e anti avidina conjugada com biotina, incubadas em tampo NFDM. As lminas foram montadas com 25L de Vectashield Mounting Medium antifade, Vector with


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Propidium Iodide (1.5g/mL). Com intuito de evitar resultados falsonegativos ou falsopositivos, as preparaes de A. bockmanni foram submetidas ao procedimento de FISH juntamente com lminas de preparaes de outras espcies de Astyanax (dadosnomostrados).Oscromossomosforamclassificadoscomometacntrico(M), submetacntrico(SM),subtelocntrico(ST)eacrocntrico(A)(LEVANetal.,1964). Resultados No foram observadas diferenas entre as duas populaes analisadas, nem

entre exemplares de sexos distintos. Os espcimes analisados apresentaram 2n=50 cromossomos,caritipocompostopor10M+12SM+12ST+16Aenumerofundamental NF=84 (Figura 3.1). O bandamento C revelou pequena quantidade de heterocromatina constitutiva, localizada subterminalmente em dois pares cromossmicos (11 e 12 pares), e nas regies pericentromricas de alguns cromossomos(Figura3.2).AcoloraocomnitratodepratamostrouRONsmltiplas, variando de 1 a 4 marcaes em cromossomos ST/A (Figura 3.3a). Entretanto, oito stiosderDNA18Sforamlocalizados(Figura3.3b).OsstiosderDNA5Sencontram selocalizadosnaregiodistaldobraocurtodeumpardeSTmedianoseemposio intersticial de um par M de tamanho mdio (Figura 3.3c). A FISH com a sonda do satDNAAs51noidentificouregiesdehomologianocomplementocromossmico deAstyanaxbockmanni(Figura3.3d). Discusso OnmerocromossmicomodalparaAstyanax50,eaespcieoraanalisada

possui este nmero diplide, sem diferenas entre os sexos. O caritipo bastante simtrico,semgrandesdiferenasrelacionadasaotamanhonostiposcromossmicos,


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caracterstica pouco comum em outras espcies de Astyanax provindas da bacia do rioParanapanema(MANTOVANIetal.,2004;ABELetal.,2006).Entretanto,oprimeiro par metacntrico caracterstico dos Characidae (SCHEEL, 1973; MORELLI et al., 1983; PORTELA et al., 1988; DANIELSILVA e ALMEIDATOLEDO, 2001, 2005) est presente (Figura3.1). Algumas espcies de peixes parecem ser restritas a pequenos tributrios e

crregos,ondeadiferenciaoaloptricafacilmenteocorre(K AVALCOeMOREIRAFILHO, 2003),eogneroAstyanaxpossuialgunsgruposcomcaractersticascompartilhadas: em espcies provenientes da bacia do rio Paraba do Sul, cujas nascentes so prximas as da bacia do rio Paranapanema, dois grupos foram identificados com relao aos dados citogenticos. A. scabripinnis e A. parahybae mostram caritipos com maior numero de cromossomos de dois braos, enquanto A. giton e A. intermedius possuem grande numero de cromossomos A (KAVALCO e MOREIRAFILHO, 2003). Adicionalmente, A. scabripinnis e A. parahybae possuem um cromossomo marcador, um M mediano portador de um stio intersticial com rDNA 5S, enquanto emA.gitoneA.intermediusestacaractersticacitogenticaausente(KAVALCOetal., 2004).Estemarcadorfoiencontradopelaprimeiravezemespciesprovenientesdas bacias dos rios So Francisco e Paran, por ALMEIDATOLEDO et al. (2002). Estes autores identificaram o cromossomo marcador em cinco diferentes espcies, A. altiparanae, A. lacustris, A. fasciatus, A. schubarti e A. scabripinnis. Estudos subseqentesemalgumasespciesdocomplexoA.fasciatusprovindasdabaciadorio Paranmostraramomesmocromossomomarcador(PAZZAetal.,2006). OsstiosderDNA5Stmsidoassociadosaoutrascaractersticascomofimde

sustentarhiptesessobreadiversificaocariotpicanogneroAstyanax(KAVALCOet al., 2007). Dados sobre a grande quantidade de cromossomos acrocntricos em A.


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giton e A. intermedius (KAVALCO e MOREIRAFILHO, 2003), adicionados ausncia de regies de homologia com o DNA satlite As51, enquanto A. scabripinnis e A. parahybaepossuemesteDNAsatlite,sustentamaidiadaexistnciadedoisgrupos nabaciadorioParabadoSul(KAVALCOetal.,2007).Ainda,opolifiletismodognero baseado em caracteres morfolgicos foi previamente sugerido por WEITZMAN e MALABARBA (1998) e tem sido confirmado em estudos posteriores (V ARI e CASTRO, 2007). Entretanto, em A. bockmanni as caractersticas citogenticas encontramse

embaralhadas. Alm da presena do stio de rDNA 5S em posio intersticial num cromossomo M (Figure 3.3c), o DNA satlite As51 ausente (Figura 3.3d). Alm disso,A.bockmannipossuiigualquantidadedecadatipocromossmico(Figura3.1)e poucaheterocromatinaconstitutiva(Figura3.2).Emborasuadistribuiosejadistal, estaheterocromatinanotemrelaocomoDNAsatliteAs51(Figura3.3d),como normalmente observado em outras espcies de Astyanax (MANTOVANI et al., 2004; ABELetal.,2006;PAZZAetal.,2006). A colorao com nitrato de prata e a FISH do rDNA 18S mostraram uma tendncia anteriormente observada no gnero: muitos stios distribudos em cromossomosST/A,algunsdelesdedifcilidentificao(F ERROetal.,2001;KAVALCO e MOREIRAFILHO,2003;FERNANDESeMARTINSSANTOS,2006a,2006b;PAZZAetal.,2006). Devidoaestamisturadecaracteres,qualquerinfernciasobreasrelaesde

A.bockmannicomasdemaisespciesdognerosetornadifcil.Poroutrolado,uma detalhadaconsideraopodeserfeitaemrelaoaosdoismarcadorescitogenticos em uso para o gnero Astyanax, o rDNA 5S e o DNA satlite As51. A natureza dos marcadores precisa ser avaliada para realizao de qualquer inferncia sobre a evoluocariotpicadognero.


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O rDNA 5S considerado um trao conservado em diferentes espcies com

relaoseqnciagnica,enquantoaseqnciadoNTSmaisvarivel.Defato,no gnero Astyanax, este carter parece ser mais conservado que o DNA satlite As51 (ABELetal.,2006;PAZZAetal.,2006).Poroutrolado,aorganizaocomplexa,coma existnciadeseqnciasparlogas,tornadifceisquaisquerabordagensfilogenticas com o rDNA 5S (MARTINS e GALETTI JR., 2001b). Por esta razo, estudos com a associao de abordagens genticas e citogenticas tm sido mais bem sucedidos (FERREIRAetal.,2007). Assumesequeaorganizaodogene5Semdoisclusterspodecorrespondera

diferentesstioscromossmicos(MARTINS e GALETTIJR.,2001b;MARTINSetal.,2002). Neste sentido, o stio em regio intersticial nos cromossomos de Astyanax pode ser devido presena da menor unidade, portadora do NTS tipo II, como em Leporinus (Anostomidae) (MARTINS e GALETTI JR., 2001b), Brycon (Characidae) (WASKO et al., 2001), Oreochromis (Perciformes) (MARTINS et al., 2002) e em espcies de Curimatidae (SANTOS et al., 2006). Este cstron pode estar disperso em posio subterminalnoscromossomosdeA.gitoneA.intermedius,pelaausnciadetaisstios intersticiais nos mesmos. A caracterizao da seqncia destes dois tipos de NTS precisaserrealizadaparaqualquerinfernciasegura,umavezqueoutrasespciesde peixes tm apresentado a ausncia de stios de rDNA 5S na regio intersticial dos cromossomosM/SM,comoosSiluriformesHypostomusaffiniseHarttialoricariformis (KAVALCOetal.,2004). Por sua vez, o DNA satlite As51 possui seqncia similar a um

retrotransposondescritoinicialmenteparagenomadeAnophelesgambiae(MESTRINER etal.,2000).Elementostransponveistmumcomportamentoparticularnogenoma, esuadispersopodeserconsideradaumatendncia.Almdisso,elesparecemestar


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relacionadoscomeventosdeevoluocariotpicaemdiversosorganismos.MESTRINER etal.(2000)isolaramoDNAsatliteAs51deumcromossomoBde A.scabripinnis. CromossomosBtmmostradoumpadroindependentedeevoluoeparecemser importantes na diversificao cariotpica do gnero Astyanax (MOREIRAFILHO et al., 2003). Portanto, essa seqncia de DNA repetitivo possui um padro mais varivel

que o rDNA 5S nos cromossomos de Astyanax, sendo que A. giton e A. intermedius possuem os fentipos mais disruptivos, sobretudo quando os dois marcadores so associados. ABEL et al. (2006) mostra dados sobre a distribuio do DNA As51 em populaesde A. scabripinnis provenientesdasbaciasdosriosParanapanemaeSo Francisco,emqueasdiferentesbaciasapresentamgrandediferenanaquantidadede DNA satlite. Um panorama similar tem sido identificado em espcies de A. aff. fasciatus(KAVALCOetal.,2006;PERESetal.,2006),eavariaointraespecficatornao marcador uma caracterstica complexa. Ou seja, os marcadores rDNA 5S e DNA satlite As51 podem ser frgeis para abordagens parciais, e as abordagens comparativas, alm da adio de novos marcadores, seria a melhor opo. Em concluso,constatasequeestesmarcadorescromossmicos(rDNA5SesatDNAAs 51)parecemsernoresolutivosparaoentendimentodasrelaesevolutivasentreA. bockmannieoutrasespciesdogneroAstyanax. RefernciasBibliogrficas As referncias correspondentes a este captulo encontramse sumarizadas no final destevolume.


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Figura3.1CaritipodeA.bockmannicoradoemGiemsa.Barra=5m.

Figura3.2CaritipodeA.bockmanniapsbandamentoC.Barra=5m.


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Figura3.3MetfasesdeA.bockmanni.AssetasindicamosstiosdeAg RONs(a)eFISHcomsondasderDNA18S(b)e5S(c).Em(d)ausnciade stiosdoDNAsatliteAs51.Barra=5m.

Vt G


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CaptuloIV AstyanaxhastatusMyers1

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