UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS CENTRO DE CINCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE QUMICAPROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA Desenvolvimento de procedimentos de anlise por injeo em fluxo para a determinao de furosemida, paracetamol e acetilcistena em formulaes farmacuticas HEBERTH JULIANO VIEIRA* Tese apresentada como parte dos requisitos para aobtenodottulodeDoutoremCincias(rea QUMICA ANALTICA) Orientador: Prof. Dr. Orlando Fatibello-Filho * Bolsista CAPES So Carlos SP 2006 Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitria/UFSCar V658dp Vieira, Heberth Juliano. Desenvolvimento de procedimentos de anlise por injeo em fluxo para a determinao de furosemida, paracetamol e acetilcistena em formulaes farmacuticas / Heberth Juliano Vieira. --So Carlos : UFSCar, 2006. 129 p. Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de So Carlos, 2006. 1. Mtodos ticos. 2. Anlise por injeo de fluxo. 3. Produtos farmacuticos. 4. Espectrofotometria.I. Ttulo. CDD: 543.085 (20a) UNIVERSIDADE FEDERAL DE SOCARLOSCentro de Cincias Exatas e de TecnologiaDepartamento de QumicaPROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICACurso de DoutoradoAssinaturas dos membros da banca examinadora que avaliarameaprovaramadefesadetese dedoutoradodocandidatoHeberthJulianoVieirarealizado em~.~Q.~Profa. Dr. Ana Rita de Araujo Nogueira/,f. Df. Mauro Kom Dedico este trabalho a meus pais, Diomar e Natalina,pelas oportunidades concedidase a meus irmos, pelo apoio. Dedico minha amada Daniele Minholo,pelo apoio durante a realizao deste trabalho. Agradecimentos Ao Prof. Dr. Orlando Fatibello-Filho, pela orientao, incentivo e amizade durante todo o desenvolvimento deste trabalho. Aos professores do Departamento de Qumica. AoprogramadePs-GraduaoemQumicadaUniversidadeFederaldeSo Carlos pela oportunidade da realizao deste trabalho. AosprofessoresdoDepartamentodeQumicadaUniversidadeEstadualde Londrina-UEL. s secretrias da PPG-Q pela ateno nesses anos todos. AosamigosdoLABBES:AnaElisa,Mirella,Cyber,Bruno,Bruna,Fernanda, Dani,Mnica,Alexandro,GeiserGabriel,Luiz,WillianSuarez,Karina,Viviane, Roberta e Heloisy. Aosamigosqueconviveramcomigodurantetodosessesanos,AndrOliveira, Lucas Megale, Lucas Decina, Cludio Dias, Willy, Paulo, James, Willian, Mrcio e Nelson. Ao Oldair pelas discusses e amigvel convivncia. Aos amigos dos outros grupos de pesquisa, pela agradvel convivncia. A CAPES pela concesso da bolsa de doutorado e pelo estgio na Universidade Autnoma de Barcelona (UAB). vii LISTA DE TABELAS TABELA 1.1 Mtodos espectrofotomtricos de anlise................................................ 3 TABELA1.2Reaesqumicasenvolvendoageraoderadicaishidroxila empregando perxido e radiao ultravioleta49. ................................................. 11 TABELA1.3Figurasdemritosdesistemasemfluxocomdeteco espectrofotomtricaparaadeterminaodeparacetamolempregando optossensores..................................................................................................... 21 TABELA1.4Figurasdemritosdesistemasemfluxoparadeterminaode paracetamol em formulaes farmacuticas....................................................... 25 TABELA 1.5 Reagentes utilizados na determinao de paracetamol aps a reao de hidrlise do frmaco....................................................................................... 27 TABELA 1.6 Figuras de mritos de sistemas de anlise por injeo em fluxo para a determinao de paracetamol empregando reao de hidrlise ..................... 28 TABELA1.7Figurasdemritodeprocedimentosanalticosparaadeterminao de acetilcistena .................................................................................................. 34 TABELA1.8Figurademritodesistemaemfluxoparaadeterminaode acetilcistena em formulaes farmacuticas...................................................... 34 TABELA4.1EstudodoefeitodaconcentraodeH2O2nadegradao fotoassistida do resduo gerado do sistema em fluxo (pH 3,0) ........................... 64 TABELA4.2Estudodaotimizaodosparmetrosdosistemaemfluxoparaa determinao de furosemida............................................................................... 66 TABELA 4.3 Estudo da seletividade na determinao de furosemida empregando o sistema de anlise por injeo em fluxo proposto ........................................... 68 TABELA 4.4 Estudo da recuperao de furosemida em formulaes farmacuticas comerciais........................................................................................................... 69 TABELA4.5Determinaodefurosemidaemamostrasfarmacuticaspelo mtodo proposto e pelo mtodo oficial124........................................................... 71 TABELA4.6Parmetrosestudadosnaotimizaodosistemaemfluxocom deteco espectrofotomtrica para a determinao de paracetamol.................. 79 TABELA 4.7 Estudo da seletividade na determinao de paracetamol empregando osistemadeanliseporinjeoemfluxocomhipocloritoeo-tolidinacomo reagentes............................................................................................................ 80 TABELA4.8Estudodarecuperaodeparacetamolempregandoosistemade anlise por injeo em fluxo................................................................................ 81 TABELA 4.9 Determinao de paracetamol empregando o sistema de anlise por injeoemfluxopropostoeomtodocomparativodaFarmacopia Americana46........................................................................................................ 82 TABELA4.10Parmetrosavaliadosnaotimizaodosistemaemfluxocom injeodereagenteparaadeterminaodeparacetamolemformulaes farmacuticas...................................................................................................... 88 TABELA4.11Avaliaodassubstnciasinterferentesnadeterminaode paracetamol ........................................................................................................ 91 TABELA4.12Estudodarecuperaodeparacetamolemformulaes farmacuticas...................................................................................................... 92 TABELA 4.13 Equaes das curvas analticas obtidas em diferentes dias ................ 93 viiiTABELA4.14Determinaodeparacetamolusandoosistemadeanlisepor injeo em fluxo reverso..................................................................................... 95 TABELA4.15Consumodereagentesnadeterminaodeparacetamolem diferentes procedimentos analticos em fluxo ..................................................... 96 TABELA 4.16 Parmetros analticos dos sistema em fluxo proposto e descritos na literatura.............................................................................................................. 97 TABELA4.17Parmetrosavaliadosnaotimizaodosistemaemfluxoparaa determinao de acetilcistena empregando Ce(IV)/ferrona como reagentes . 102 TABELA4.18Influnciadassubstnciasexcipientesnadeterminaode acetilcistena ..................................................................................................... 104 TABELA 4.19 Estudo da recuperao de acetilcistena em produtos farmacuticos105 TABELA4.20Equaesdascurvasanalticasobtidasemdiferentesdiasde trabalhos ........................................................................................................... 105 TABELA4.21Determinaodeacetilcistenaemformulaesfarmacuticas empregandoosistemaemfluxopropostoeomtodocomparativoda Farmacopia Brasileira126................................................................................. 107 TABELA4.22Parmetrosavaliadosnaotimizaodosistemaemfluxoparaa determinao de acetilcistena empregando a gerao de bromo.................... 112 TABELA 4.23 Estudo da seletividade na determinao de acetilcistena................. 113 TABELA 4.24 Estudo da recuperao de acetilcistena............................................ 114 TABELA 4.25 Equaes das curvas analticas obtidas em diferentes dias .............. 115 TABELA4.26Determinaodeacetilcistenaemprodutosfarmacuticos empregandooprocedimentoemfluxopropostoeoprocedimentoda Farmacopia Brasileira126................................................................................. 116 ix LISTA DE FIGURAS FIGURA1.1Esquemadasunidadesconstituintesdosistemaemfluxo.R:reagente;C: carregador; I: Injetor; S: soluo de referncia ou amostra; B: Bobina reacional; D: detector e W: descarte............................................................................................................................. 6 FIGURA1.2Reaesenvolvidasnadegradaodafurosemidaemsoluoaquosa58.(I) Furosemida; (II) Saluamina; (III) espcie furfuril; MeOH: metanol e Uv: radiao ultravioleta.................................................................................................................................................. 12 FIGURA 1.3 Mecanismo reacional mostrando a citotoxicidade do paracetamol quando ingerida em grandes quantidades75. ..................................................................................................... 18 FIGURA 3.1 Sistema de anlise por injeo em fluxo usado para a determinao de furosemida emformulaesfarmacuticas.C:soluotransportadora(NaOH1,5x10-2molL-1;2,0mL min-1); C1: soluo de hipoclorito de sdio 1,2x10-4 mol L-1 em NaOH 1,5x10-2 mol L-1 (1,4 mL min-1),C2:soluodeo-tolidina9x10-5molL-1 emHCl1,9x10-1molL-1 (0,7mLmin-1);C3: soluo de perxido de hidrognio 0,22 mol L-1 (0,9 mL min-1); L: ala de amostragem (375 L);B1;B2eB3:bobinasreacionais(40,60e310cm,respectivamente);D: espectrofotmetro(430nm);E:resduoaspiradoa1,2mLmin-1;Cr:cmaraderadiao contendoalmpadaqueemiteradiaoultravioleta(380nm);S:soluoderefernciaou amostraeW:descarte.Assetasindicamosentidodofluxodassolues.Abomba peristltica no est indicada na Figura. ................................................................................ 42 FIGURA3.2Configuraodosistemaemfluxoparaestudodafotodegradaodoresduo geradonadeterminaodefurosemida.C:soluodeNaOH1,5x10-2molL-1;C1:soluo de hipoclorito de sdio 1,2x10-4 mol L-1; C2: soluo de o-tolidina 9x10-5 mol L-1; C3: soluo de H2O2 0,22 mol L-1 (0,9 mL min-1); B1: bobina reacional de 40 cm; B2: bobina reacional de 60 cm; CR:cmara de radiao contendo abobinareacional de 310cm e a lmpada ( = 380nm);BP:bombaperistltica;X,YeZ:confluncias;E:frascocontendoresduo;eW; descarte. .................................................................................................................................. 43 FIGURA 3.3 Sistema de anlise por injeo emfluxo para a determinao de paracetamol em formulaesfarmacuticasempregandohipocloritoeo-tolidinacomoreagente.C:gua desionizada (2,2 mL min-1); C1: soluo de hipoclorito de sdio 9,4x10-5 mol L-1 em soluo tampo borato 0,05 mol L-1 (0,9 mL min-1); C2: soluo de o-tolidina 9,8x10-5 mol L-1 (1,6 mL min-1);C3:soluodeperxidodehidrognio0,22molL-1(0,9mLmin-1);I:injetor-comutador;L:(400L);B1eB2:bobinasreacionais(75e310cm,respectivamente);D: espectrofotmetro(430nm);E:resduoaspiradoa1,2mLmin-1;CR:cmaraderadiao contendo lmpada que emite radiao ultravioleta (380 nm) e W: descarte. As setas indicam o sentido do fluxo das solues. A bomba peristltica no est indicada na Figura. ........... 47 FIGURA3.4Sistemadeanliseporinjeoemfluxoreversoparaadeterminao espectrofotomtrica de paracetamol empregando nitrito de sdio como reagente. S: Soluo de amostra ou soluo de referncia de paracetamol em HCl 2,4x10-2 mol L-1 (2,2 mL min-1); BP:bombaperistltica;L:aladeamostragem(50L);R:soluodenitritodesdio 8,2x10-2molL-1;B:bobinareacional(150cm);D:espectrofotmetro(=400nm); W:descarte............................................................................................................................... 50 FIGURA3.5Sistemadeanliseporinjeoemfluxocomdetecoespectrofotomtrica empregadoparaadeterminaodeacetilcistenaemprodutosfarmacuticos.C:soluo transportadora(H2O,1,5mLmin-1);C1:soluodeCe(SO4)26,5x10-4molL-1emH2SO4 4,3x10-2 mol L-1 (0,9 mL min-1); C2: soluo de ferrona 2,5x10-4 mol L-1 (0,7 mL min-1); L: ala deamostragem350L;B1:bobinareacional(65cm);B2:bobinareacional(65cm);D: espectrofotmetro (500 nm); BP: bomba peristltica; S: soluo de referncia ou amostra; I: injetor-comutador 2-3-2 e W: descarte. .................................................................................. 53 xFIGURA3.6.Diagramaesquemticodosistemadeanliseporinjeoemfluxoparaa determinao de acetilcistena. BP: bomba peristltica; C: gua desionizada; C1: soluo de brometodepotssio2,2x10-1molL-1;C2:soluodeHCl2,4x10-1molL-1;C3:soluode bromatodesdio1,25x10-2molL-1;C4:soluodecidoascrbico5,0%m/v;I:injetor comutador; L: volume de amostragem (250 L); S: soluo de referncia ou de amostra; B1, B2 e B3: bobinas reacionais de 140, 60 e 60 cm, respectivamente; D: espectrofotmetro e W: resduo. .................................................................................................................................... 56 FIGURA 4.1 Espectro de absoro da o-tolidina e do cromforo (o-tolidina oxidada)................ 58 FIGURA4.2Reaoqumicaenvolvidanadeterminaodehipocloritoempregandoo-tolidina como reagente......................................................................................................................... 59 FIGURA4.3Efeitodocomprimentodabobinareacionalnadeterminaodesoluode referncia de furosemida 2,0x10-5 mol L-1 (n=3). Absorbncia (----) e preciso ()....... 61 FIGURA4.4Efeitodovolumedaaladeamostragemnadeterminaodesoluode referncia de furosemida 2,0x10-5 mol L-1(n=3). Absorbncia (----) e preciso ()........ 62 FIGURA 4.5 Efeito da vazo da soluo de hipoclorito de sdio na determinao de soluo de referncia de furosemida 2,0x10-5 mol L-1 (n=3). Absorbncia (----) e preciso (). ...... 63 FIGURA4.6Espectrosdeabsorodasoluodeo-tolidinaoxidadaempregandosoluode H2O2antesdadegradaofotoassistida(1)edepoisdaradiaoultravioleta(2) empregando uma soluo de perxido de hidrognio 0,22 mol L-1. ...................................... 65 FIGURA4.7Fiagramaobtidonoestudodarepetibilidadenadeterminaodesoluode referncia de furosemida (A) 1,0x10-5 mol L-1 e (B) 5,0x10-5 mol L-1. .................................... 67 FIGURA4.8Sinaistransientesobtidosnadeterminaodefurosemidaemformulaes farmacuticasempregandoosistemadeanliseporinjeoemfluxocomdeteco espectrofotomtrica para solues de referncia nas concentraes (1) 5,0x10-6 mol L-1; (2) 1,0x10-5 mol L-1; (3) 2,0x10-5 mol L-1; (4) 5,0x10-5 mol L-1 e (6) 8,0 x10-5 mol L-1, seguidas dos sinais transientes em triplicatas para as solues de amostras (A-E) e novamente os sinais das solues de referncia em concentraes decrescentes................................................ 70 FIGURA 4.9 Esquema da reao de oxidao do paracetamol134. ............................................. 72 FIGURA 4.10 Produtos da reao de paracetamol com hipoclorito. (1) N-acetil-p-benzoquinona imina (2)1,4-benzoquinona (3)cloro-4-acetoaminofenol (4) dicloro-4-acetoaminofenol135. ... 72 FIGURA4.11Efeitodaconcentraodehipocloritodesdionadeterminaodeparacetamol (n=3). Absorbncia (----) e preciso (). ......................................................................... 73 FIGURA4.12Efeitodaconcentraodeo-tolidinanadeterminaodeumasoluode referncia de paracetamol 5,8x10-4 mol L-1 (n=3). Absorbncia (----) e preciso (). .... 74 FIGURA 4.13 Efeito do pH da soluo de hipoclorito de sdio 9,4x10-5 mol L-1 na determinao de paracetamol. ....................................................................................................................... 75 FIGURA4.14Efeitodovolumedaaladeamostragemnadeterminaoumasoluode referncia de paracetamol 8,5x10-5 mol L-1 (n=3). Absorbncia (----) e preciso (). .... 76 FIGURA 4.15 Efeito da vazo da soluo de hipoclorito de sdio sobre o sinal analtico para a soluo de referncia de paracetamol 5,5x10-5 mol L-1 (n=3). Absorbncia (----) e preciso (). ...................................................................................................................................... 77 FIGURA4.16Sinaistransientesobtidosnadeterminaodeparacetamolemformulaes farmacuticasparasoluesdereferncianasconcentraes(1)8,5x10-6molL-1,(2) 2,3x10-5 mol L-1, (3) 4,6x10-5 mol L-1,(4)9,3x10-5 mol L-1, (5) 1,8x10-4mol L-1 e(6)2,5x10-4 mol L-1, seguida dos sinais transientes das solues das amostras (A-H) e das solues de referncia novamente em ordem decrescente de concentrao. .......................................... 83 FIGURA4.17Esquemareacionalparaadeterminaodeparacetamolempregandonitritode sdio como reagente. .............................................................................................................. 84 FIGURA4.18Estudodaconcentraodecidoclordricosobreosinalanalticodeuma concentraodeparacetamol5,4x10-4molL-1 (n=3).Absorbncia(----)epreciso ()....................................................................................................................................86 xiFIGURA4.19Efeitodocomprimentodabobinareacionalnadeterminaodeparacetamol (n=3). Absorbncia (----) e preciso (). ......................................................................... 88 FIGURA 4.20Sinais transientes obtidos no estudo darepetibilidade do procedimento emfluxo para concentraes de paracetamol: (A) 8x10-4 mol L-1 e (B) 1,0 x10-3 mol L-1. as condies do sistema so as mesmas apresentadas na Figura 3.4. ...................................................... 90 FIGURA4.21Sinaistransientesobtidosnadeterminaodeparacetamolemformulaes farmacuticasempregandoosistemadeanliseporinjeoemfluxoreversoparaas soluesdereferncianasconcentraes(1)4,0x10-5molL-1;(2)1,6x10-4molL-1;(3) 3,2x10-4 mol L-1; (4) 5,4x10-4 mol L-1; (5) 6,5x10-4 mol L-1 e (6) 1,1x10-3 mol L-1, seguidas dos sinais transientes para as solues de amostras (A-K). ........................................................ 94 FIGURA 4.22 Esquema das reaes qumicas envolvidas no sistema de anlise por injeo em fluxo para a determinao de acetilcistena empregando Ce(IV) e ferrona como reagentes.................................................................................................................................................. 98 FIGURA4.23EfeitodaconcentraodasoluodeCe(SO4)2,sobreosinalanalticopara H2SO42,4x10-2molL-1esoluoderefernciadeacetilcistena4,5x10-4molL-1 (n=3). Absorbncia (----) e preciso (). .................................................................................... 99 FIGURA4.24EfeitodocomprimentodabobinareacionalB1sobreosinalanalticodeuma soluo de referncia de acetilcistena 9,6 x10-5 mol L-1 (n=3). Absorbncia (----) e preciso (). .................................................................................................................................... 100 FIGURA4.25EfeitodavazodasoluodeCe(SO4)23,3x10-3molL-1nadeterminaode soluo de referncia acetilcistena (n=3). Absorbncia (----) e preciso (). ............. 102 FIGURA 4.26 Sinais transientes obtidos para solues de referncia de acetilcistena (1) 2,0x10-5 molL-1;(2)5,0x10-5molL-1;(3)8,2x10-5molL-1;(4)1,0x10-4molL-1;(5)1,3x10-4molL-1, seguidos dos sinais transientes em quadruplicadas das solues de amostras (A-C)....... 107 FIGURA4.27Reaesqumicasenvolvidasnadeterminaodeacetilcistenaempregando sistema de anlise por injeo em fluxo utilizando a gerao qumica de bromo (Br2) como reagente................................................................................................................................. 108 FIGURA4.28EstudodaconcentraodeHClnaproduodebromo(Br2).Aabsorbncia refere-se magnitude da linha base. ................................................................................... 109 FIGURA4.29Estudodoefeitodocomprimentodasbobinasreacionais(B1)e(B2)nagerao de bromo................................................................................................................................ 111 FIGURA 4.30 Sinais transientes obtidos em triplicata para a determinao de acetilcistena: (1) 1,6x10-4,(2)3,3x10-4,(3)6,6x10-4,(4)9,8x10-4e(5)1,6x10-3molL-1,seguidosdetrs amostrasA,BeCenovamenteassoluesderefernciaemconcentraodecrescente. NadeterminaodaamostraCempregou-seomtododeadiomltipladepadro(Cs: soluo de amostra; C1: 2,0x10-4 mol L-1;.C2: 3,3x10-4 mol L-1; C3: 5,2x10-4 mol L-1)........... 116 xii Resumo DESENVOLVIMENTODEPROCEDIMENTOSDEANLISEPORINJEOEM FLUXOPARADETERMINAODEFUROSEMIDA,PARACETAMOLE ACETILCISTENA EM FORMULAES FARMACUTICAS Neste trabalho de tese so apresentadosodesenvolvimentodeprocedimentosdeanlisesporinjeoemfluxo comdetecoespectrofotomtricaparaadeterminaodefurosemida,paracetamole acetilcistenaemamostrasdeinteressefarmacutico.Umsistemaemfluxoparaa determinaoindiretadefurosemidafoiotimizadomonitorando-seoexcessode hipocloritodesdionoconsumidoemreaocomafurosemidautilizandoo-tolidina como reagente em 430 nm. A curva analtica apresentou uma linearidade entre 5x10-6 a 8x10-5molL-1eumlimitededetecode2,5x10-6 molL-1.Desviospadrorelativos menores que 2,0% (n=10) para solues de furosemida com concentraes de 1,0x10-5 e5x10-5molL-1efreqnciadeamostragemde60determinaesh-1foramobtidos. Outrosistemaemfluxofoipropostoparaadeterminaoindiretadeparacetamolem formulaesfarmacuticasempregandohipocloritodesdioeo-tolidinacomo reagentes.Nessesistemaemfluxoohipocloritodesdioemexcessofoimonitorado como-tolidinaem430nm.Apsaotimizaoobteve-seumacurvaanalticaentre 8,5x10-6 a 2,5x10-4 mol L-1 e um limite de deteco de 5,0x10-5 mol L-1. Desvio padro relativoparaumasoluodeparacetamolfoide1,5x10-4molL-1de1,2%(n=10)e freqnciadeamostragemde60determinaesh-1foramobtidos.Nossistemasem fluxopropostos,osquaisempregaramo-tolidinacomoreagentefoiacopladauma lmpadaultravioleta(=380nm)apsodetectorquepermitiuadestruiodesse reagenteempregandoconjuntamenteumasoluodeperxidodehidrognio.Um sistemadeanliseemfluxoreversofoitambmpropostoparadeterminaode paracetamol empregando nitrito como reagente. O produto da reao foi monitorado em 430nm.Osistemaemfluxoapresentouumacurvaanalticaentre4,0x10-5a1,1x10-3 molL-1.Olimitededetecofoide2,0x10-5molL-1eafreqnciadeamostragem foram45determinaesporh-1.Desviospadrorelativosmenoresque2%foram obtidosparaasduassoluesderefernciadeparacetamolnasconcentraesde 8,0x10-4molL-1e1,0x10-3molL-1.Umprocedimentoanalticoparadeterminaode acetilcistena,comdetecoespectrofotomtricaem500nm,empregandooCe(IV)e ferronacomoreagentesfoiotimizado.Nessesistemaemfluxoobteve-seumacurva analtica entre 1,3x10-5 a 1,3x10-4 mol L-1. O limite de deteco obtido foi de 8,0 x 10-6 molL-1.Umdesviopadrorelativoparaumasoluoderefernciadeacetilcistena 2,2x10-5molL-1foide1,4%(n=10)eumafreqnciadeamostragemde60 determinaesporhoraforamobtidos.Outroprocedimentoemfluxoparaa determinaodeacetilcistenaempregandobromo(Br2)geradoquimicamentefoi proposto. Nesse sistema, o bromo produzido quimicamente reage com o analito e seu excessofoimonitoradoem400nm.Acurvaanalticafoilinearnointervalode concentraodeacetilcistenade1,6x10-4a1,6x10-3molL-1eumdesviopadro relativo de 1,2% (n=10) para uma soluo de acetilcistena 5,3x10-4 mol L-1 foi obtido. O sistemaapresentouumafreqnciadeamostragemde60determinaesh-1euma soluo de cido ascrbico foi empregada para destruio do bromo em linha. xiii Abstract DEVELOPMENTOFFLOWINJECTIONANALYSISPROCEDURESTO DETERMINATIONOFFUROSEMIDE,PARACETAMOLANDACETYLCYSTEINEIN PHARMACEUTICAL FORMULATIONS. In this thesis are presented the development of flow injection analysis procedures with spectrophotometric detection for determination of furosemide, paracetamol and acetylcysteine in samples of pharmaceutical formulations. Aflowinjectionsystemwasoptimizedforindirectdeterminationoffurosemide monitoringtheexcessofsodiumhypochloritenotconsumedinthereactionwiththe furosemide using o-tolidine as reagent at 430 nm. The analytical curve was linear from 5.0x10-6 to 8.0x10-5 mol L-1 and the detection limit was 2.5x10-6 mol L-1. A RSD smaller than2.0%(n=10)for1.0x10-5and5.0x10-5molL-1furosemidesolutionsandan analyticalfrequencyof60determinationsh-1wereobtained.Anotherflowinjection systemwasproposedtodetermineparacetamolinpharmaceuticalsamplesemploying sodium hypochlorite and o-tolidine as reagents. In this flow system, sodium hypochlorite reacted with paracetamol and its concentration in excess was monitored with o-tolidine. Aftersystemoptimization,theanalyticalcurvewaslinearintheparacetamol concentrationrangefrom8.5x10-6 molL-1to2.5x10-4molL-1withadetectionlimitof 5.0x10-5molL-1.ARSDof1.2%(n=10)wasobtainedfor1.5x10-4molL-1paracetamol solution.Theanalyticalfrequencyofthesystemwas60determinationsh-1.Theo-tolidineanditsproductsusedinbothproposedflowinjectionsystemswereonline destroyedusinganultravioletlamp(=380nm)andhydrogenperoxidesolution.The reversed flow system was proposed for determination of paracetamol employing sodium nitriteasreagent.Theproductformedwasmonitoredat400nm.Theanalyticalcurve was linear in the paracetamol concentration range from 4.0x10-5 to 1.1x10-3 mol L-1 with a limit of detection of 2.0x10-5 mol L-1 and analytical frequency of 45 determinations h-1. RSD smaller than 2% were obtained for 8.0x10-4 and 1.0x10-3 paracetamol solutions. A flowsysteminjectionprocedurewithspectrophotometricdetectiontodetermine acetylcysteinewasdeveloped.Inthisprocedure,acetylcysteinereactswithCe(IV) solutionandtheexcessofcerium(IV)wasmonitoredwithferroinat500nm.An analyticalcurverangedfrom1.32x10-5to1.35x10-4molL-1withalimitofdetectionof 8.0x10-6 mol L-1 were obtained. A RSD of 1.4% (n=10) for 2.2x10-5 mol L-1 acetylcysteine solutionandananalyticalfrequencyof60determinationsh-1wereobtained.Another flowinjectionsystemfordetermineacetylcysteineusingbromine(Br2)asreagentwas alsoproposed.In thissystem, Br2chemicallygeneratedonlinereacts withtheanalyte anditsexcessmonitoredat400nm.Theanalyticalcurveobtainedwaslinearfrom 1.6x10-4and1.6x10-3molL-1andRSDof1.2%(n=10)for5.3x10-4solutionwere obtained.Thesystemshowedtheanalyticalfrequencyof60determinationsh-1 and ascorbic acid solution was used to destruct bromine on line. xiv Sumrio 1Introduo ............................................................................................................... 1 1.1Reviso histrica..................................................................................................... 2 1.2Sistemas de anlise por injeo em fluxo ............................................................... 5 1.2.1 Automao em laboratrios qumicos ..................................................................... 8 1.3Sistema de anlise por injeo em fluxo reverso (r-FIA)....................................... 10 1.4Fotodecomposio assistida por radiao ultravioleta.......................................... 10 1.5Furosemida ........................................................................................................... 11 1.5.1 Aspectos gerais..................................................................................................... 11 1.5.2 Propriedades farmacolgicas................................................................................ 12 1.5.3 Alguns mtodos para a determinao de furosemida ........................................... 14 1.6Paracetamol .......................................................................................................... 15 1.6.1 Aspectos gerais..................................................................................................... 15 1.6.2 Propriedades farmacolgicas................................................................................ 17 1.6.3 Mtodos de determinao de paracetamol ........................................................... 18 1.7Acetilcistena ......................................................................................................... 29 1.7.1 Aspectos gerais..................................................................................................... 29 1.7.2 Propriedades Mucolticas ...................................................................................... 29 1.8Determinao de acetilcistena ............................................................................. 30 2Objetivos ............................................................................................................... 35 3Parte Experimental ................................................................................................ 37 3.1Instrumentao...................................................................................................... 38 3.1.1 Balana analtica.................................................................................................. 38 3.1.2 pHmetro................................................................................................................ 38 3.1.3 Eletrodo de vidro combinado................................................................................ 38 3.1.4 Espectrofotmetros .............................................................................................. 38 3.1.5 Bomba peristltica................................................................................................ 39 3.1.6 Tubos e conexes ................................................................................................ 39 3.1.7 Injetor comutador ................................................................................................. 39 3.1.8 Registrador........................................................................................................... 39 3.2. Sistema de anlise por injeo em fluxo com deteco espectrofotomtrica para a determinaoindiretadefurosemidaempregandohipocloritoeo-tolidinacomo reagentes ...................................................................................................................... 40 3.2.1 Reagentes e solues.......................................................................................... 40 3.2.3 Mtodo comparativo............................................................................................. 41 3.2.4 Diagrama esquemtico do sistema de anlise por injeo em fluxo com deteco espectrofotomtricaparaadeterminaodefurosemidaempregandohipocloritoeo-tolidina como reagente.................................................................................................. 41 3.3 Sistema de anlise por injeo em fluxo com deteco espectrofotomtrica para a determinaoindiretadeparacetamolempregandohipocloritoeo-tolidinacomo reagente........................................................................................................................ 44 3.3.1 Reagentes e solues.......................................................................................... 44 3.3.2 Preparo das amostras e determinao de paracetamol ....................................... 45 3.4.3 Mtodo comparativo............................................................................................. 49 xv3.4.4Diagramaesquemticodosistemadeanliseporinjeoemfluxoreversocom detecoespectrofotomtricaparaadeterminaodiretadeparacetamolem formulaes farmacuticas empregando nitrito de sdio como reagente ..................... 49 3.5Sistemadeanliseporinjeoemfluxoparaadeterminaoindiretade acetilcistena empregando Ce(IV) e ferrona como reagente125.................................... 50 3.5.1 Reagentes e solues.......................................................................................... 50 3.5.3 Mtodo comparativo............................................................................................. 52 3.6. Sistema de anlise por injeo em fluxo para a determinao espectrofotomtrica indireta de acetilcistena utilizando a gerao qumica de bromo127............................. 53 3.6.1 Reagentes e solues.......................................................................................... 53 3.6.2 Preparao das amostras farmacuticas ............................................................. 54 3.6.3 Mtodo comparativo............................................................................................. 55 3.6.4 Diagrama esquemtico do sistema de anlise por injeo em fluxo com deteco espectrofotomtricaparaadeterminaoindiretadeacetilcistenaempregandobromo (Br2) gerado quimicamente como reagente................................................................... 55 4Resultados e Discusses ...................................................................................... 57 4.1Sistema de anlise por injeo em fluxo com deteco espectrofotomtrica para a determinao de furosemida em produtos farmacuticos............................................. 58 4.1.1 Estudos dos parmetros qumicos do sistema FIA ............................................... 59 4.1.2 Otimizao dos parmetros fsicos do sistema de anlise por injeo em fluxo... 60 4.1.3 Fotodegradao da o-tolidina empregando radiao UV e H2O2.......................... 63 4.1.4 Parmetrosanalticosdosistemadeanliseporinjeoemfluxoparaa determinao de furosemida......................................................................................... 66 4.1.5 Estudo de interferncia ......................................................................................... 67 4.1.6 Teste de adio e recuperao............................................................................. 68 4.1.7 Aplicao............................................................................................................... 69 4.2Sistema de anlise por injeo em fluxo com deteco espectrofotomtrica para a determinao indireta de paracetamol em produtos farmacuticos .............................. 71 4.2.1 EstudodosparmetrosqumicosdosistemaFIAparaadeterminaode paracetamol................................................................................................................... 73 4.2.2 Estudos dos parmetros fsicos do sistema FIA.................................................... 75 4.2.3 Fotodegradao da o-tolidina empregando radiao ultravioleta e H2O2.............. 78 4.2.4 Parmetrosanalticosdosistemadeanliseporinjeoemfluxoparaa determinao de paracetamol .................................................................................... 79 4.2.5 Estudo de interferentes ......................................................................................... 79 4.2.6 Estudo da recuperao em amostras comerciais.................................................. 80 4.2.7 Aplicao............................................................................................................... 82 4.3Desenvolvimentodeumsistemadeanliseporinjeoemfluxoreversoparaa determinao de paracetamol empregando nitrito de sdio como reagente................. 84 4.3.1 Estudos dos parmetros qumicos do sistema em fluxo ....................................... 85 4.3.2 Estudo dos parmetros fsicos do sistema em fluxo ............................................ 86 4.3.3 Parmetrosanalticosdosistemadeanliseporinjeoemfluxoparaa determinao de paracetamol empregando nitrito de sdio como reagente................. 89 4.3.4 Estudo da seletividade .......................................................................................... 89 4.3.5 Estudo da recuperao das amostras comerciais................................................. 91 4.3.6 Robustez ............................................................................................................... 92 4.3.7 Aplicao............................................................................................................... 93 xvi4.4Sistema de anlise por injeo em fluxo com deteco espectrofotomtrica para a determinao indireta de acetilcistena empregando sistema Ce(IV)/ferrona .............. 97 4.4.1 Avaliaodosparmetrosqumicosdosistemadeanliseporinjeoemfluxo para a determinao de acetilcistena em formulaes farmacuticas ......................... 98 4.4.2 Estudo dos parmetros fsicos do sistema em fluxo ........................................... 100 4.4.3 Parmetrosanalticosdosistemadeanliseporinjeoemfluxoparaa determinao de acetilcistena.................................................................................... 103 4.4.4 Estudo de interferncia ....................................................................................... 103 4.4.5 Estudo da recuperao de acetilcistena em produtos farmacuticos................. 104 4.4.6 Robustez ............................................................................................................. 105 4.4.7 Aplicao............................................................................................................. 106 4.5Sistema de anlise por injeo em fluxo para a determinao espectrofotomtrica indireta de acetilcistena utilizando a gerao qumica de bromo127........................... 108 4.5.1 Avaliaodosparmetrosqumicosdosistemadeanliseporinjeoemfluxo para a determinao de acetilcistena em formulaes farmacuticas ....................... 109 4.5.2 Estudo dos parmetros fsicos do sistema FIA ................................................... 110 4.5.3 Parmetrosanalticosdosistemadeanliseporinjeoemfluxoparaa determinao de acetilcistena empregando bromo como reagente........................... 112 4.5.4 Estudo de interferncia ....................................................................................... 113 4.5.5 Estudo da recuperao de acetilcistena em formulaes comerciais ................ 113 4.5.6 Robustez ............................................................................................................ 114 4.5.7 Aplicaes.......................................................................................................... 115 5Concluses ......................................................................................................... 117 6Sugestes de Trabalhos Futuros ........................................................................ 119 7Referncias Bibliogrficas................................................................................... 121 1 Introduo Introduo 21.1Reviso histrica Amaioriadassubstnciasqueapresentamaofarmacolgicaso incoloreseportanto,estudosquerevelaramsuascaractersticasdeabsorverluz somentetornaram-sepossvelquando,nasegundametadedosculo19,foi descobertoqueainteraoentrevriosalcalideseoutrassubstnciasorgnicas naturaisdesenvolviamcorquandotratadascomcertassubstnciasinorgnicas1. Taisprocedimentosdesenvolvidosalavancaramoempregonasdeterminaes qualitativasdefrmacos,sendoquealgumasdeterminaessemi-quantitativas foram dedicadas deteco de substncias de interesse nas anlises forenses1-3. De 1900 a 1920 ocorreram os principais progressos em instrumentao ptica4.Oaparecimentodeinstrumentoscompartespticasdeslicavtrea especialmentemanufaturadafoioalicerceparaodesenvolvimentode procedimentosespectrofotomtricosparaaanlisedeprincpiosativos,tanto qualitativocomoquantitativamente5.Emboraainstrumentaoparavarredurana regio ultravioleta e visvel do espectro estivesse disponvel em 1910 e os espectros deabsorodassubstnciasestivessemsendodisponibilizados,aoperaodos espectrofotmetroserademasiadamentemorosa,sendoassiminadequadospara uso em laboratrios de rotina3,6. Os fotmetros com filtros, entretanto, ampliaram a gama de aplicaes da fotometria7. Daqueles desenvolvidos, o mais conhecido foi o fotmetro de Pulfrich noqualofeixederadiaoemergentedafontederadiaoeradivididoemdois feixesdemesmaintensidade;estespassamatravsdascelascontendoasoluo deamostraasermedidaeumsolventeapropriado,respectivamente.Vidros coloridos foram empregados como filtros para selecionar uma faixa de comprimento deondaadequadaparaadeterminao.Aintensidadedofeixederadiaoera atenuadamecanicamente,pelousodeumdiafragmacalibrado,paraaunidadede absorbnciaatqueaintensidadefosseidnticaaofeixedeluzquepassava atravsdasoluodeamostranaqualeramonitoradapeloanalistavisualmente7. Porvoltade1941,haviamcercade800trabalhospublicadosnoempregoem amostrasclnicasqueusaramesteespectrofotmetro3.Medidasmaisprecisase exatas,obtidasdemodoconfortvelforampossveispeloacoplamentode fotoclulasparamediraintensidadedaluztransmitida5.Umacaractersticadesses instrumentoseraqueelesoperavamapenasnomonitoramentodaradiao Introduo 3transmitidanaregiovisveldoespectro,entoasamostrasdeveriamser convertidas em substncias coloridas previamente deteco.Duranteosanos1920e1930,ocorreramestudosenfocadono desenvolvimentoadicionaledenovostestescolorimtricosqualitativosparadar suporteaodesenvolvimentodeprocedimentosfotomtricos.Osprimeiros procedimentosquantitativosforamdescritos,como:adeterminaodesalicilato baseado na formao do complexo com Fe3+ (1919), a determinao de aminocidos empregando cido 1,2-naftoquinona-4-sulfnico (1922) e a determinao de aminas aromticas depois da diazotao e acoplamento com -naftol (1927)1.Comoresultado,afotometriatornou-seoprimeiroeeficienteramo instrumentaldaanlisedeprodutosfarmacuticos,atentoobjetivode procedimento volumtricos e gravimtricos1. Procedimentos analticos alternativos e novosprocedimentosforamdesenvolvidosnosanosseguintes,exemplosso apresentados na Tabela 1.1. TABELA 1.1 Mtodos espectrofotomtricos de anlise analitoReagenteReferncia Aminocidos1,2-naftoquinona-4-sulfonato de sdio J.Biol. Clin., 156, 467 (1944) AminocidosNinhidrinaAnalyst, 80, 209 (1955) Frutosep-anisidinaAnal. Chem., 31, 1234 (1959) CistenaFormao de nitrosotiolAnalyst, 84, 188 (1959) adaptado de MEITES (1963)8. Ummarconodesenvolvimentodaespectrofotometriaemanlisesde frmacosfoiaintroduodoespectrofotmetroUV-VisBeckmanDUnoinciodos nos401,3,6.Anteriormenteonicoequipamentodisponvelcomercialmenteerao espectrofotmetroGeneralElectricHardy,instrumentocaro,dedifciloperaoe sua amplitude espectral restringia sua aplicao9. Outros dois espectrofotmetros de maior emprego, eram o espectrofotmetro Cemco e o Coleman Modelo DM3,6. O espectrofotmetro UV-Vis Beckman DU foi concebido para ser usado na maioria dos laboratrios de rotina e, depois da Segunda Guerra Mundial, seu uso Introduo 4se tornou mais difundido, medida que outros instrumentos comearam aparecer no mercado1,6. Com a propagao da tcnica espectrofotomtrica na faixa de radiao ultravioleta,apareceramnovosprocedimentosparadeterminaodeumaenorme variedadedefrmacossemanecessidadedeconversoemprodutoscoloridos.A diminuiodotempodeanlisepermitiumaiordifusodessesprocedimentosem anlises de rotinas1,6. Osmtodosespectrofotomtricosforambaseadosnacomparaoda intensidade de cor que varia com a concentrao do cromforo, diluio sofrida pela soluo ou alterao no comprimento do caminho ptico da soluo de amostra ou soluodereferncia1,7.Essetipodeanlisefoidenominadodeanlise colorimtricaeeramrealizadaseminstrumentoscontendofiltrosparaseleoda regioespectral.Finalmente,aaplicaodeinstrumentosbaseadonaabsorode umfeixederadiaomonocromticaedetectoreltricofoidenominada espectrofotometria1. Emboraaespectrofotometriapossaserclassificadaatualmentecomo mtodo clssico de anlise de frmacos, sua importncia no tem diminudo com o passardosanos1,10.verdadequesuaslimitaesvosurgindomedidaque novasanlisessorequeridas,mascomoresultadodisso,tem-seo desenvolvimentodemtodosmatemticosmodernosparatratamentodosdados obtidoseoacoplamentodaespectrofotometriacomoutrosmtodos,como cromatografia ou eletroforese capilar1,11. Quantoaplicaodaespectrofotometria,umespectrodeabsoro, perfildeabsorodaradiaoeletromagnticanumafaixaespectral,permitea identificaodeumfrmacoeistorecomendadoatnasediesrecentesdas principaisfarmacopias(FarmacopiaAmericanaeBritnica).Emdeterminadas situaes,aobtenodoespectrodeumfrmacoemsoluoforneceinformao com um valor similar como uma medida de outra constante fsica. A tcnica tambm auxiliacominformaesparaelucidaodeestruturasqumicasdosprincpios ativos.Istoassociadosstcnicasdeespectroscopiademassa,infravermelhoe RMN permitem a elucidao da estrutura dos frmacos12. Ao contrrio das tcnicas anteriormente citadas, a aplicao analtica quantitativaquetornaaespectrofotometriaimportantenaanlisedefrmacos. Procedimentos baseados na absoro da radiao por um frmaco ou um derivado, Introduo 5originadoporumtratamentoqumico,soextensivamenteaplicadosnaanlisede frmacos1,10.Quandoocorreafaltadeseletividade,essapodeserobtidapelo acoplamento com um mtodo cromatogrfico. 1.2Sistemas de anlise por injeo em fluxo Atualmente a necessidade de obteno de dados de anlises qumicas deformarpidaeprecisadeprimordialimportnciadevidodemandasocial exigidapelanossasociedade.Dentrodesteescopo,aanliseporinjeoemfluxo (FIA)umatcnicaanalticaquesupreasatuaisnecessidades,destacando-se ainda, o grande aumento do desempenho analtico e a capacidade do uso efetivo da instrumentaoanalticacomoracionalgerenciamentodosregentesqumicos 10,13,14. Nesteamplocontexto,aanliseporinjeoemfluxocontnuorefere-se a um processo de automatizao de procedimentos analticos, no qual a amostra emsoluointroduzidaemumfluidotransportadorqueaconduzemdireoao detector 15. Quando a converso da amostra a uma espcie detectvel necessria, aamostrapodereceberumasriedereagentesoutratamentosparaasua converso. SegundoMotola(apudVALCARCELeLUQUEDeCASTRO)11,a anliseporinjeoemfluxo,nasuasdiferentesverses,constituiumadasmais avanadasformasdemanipulaodesoluesdisponvelparaqumicosanalticos paramisturaretransportarparaopontodedeteco,produtosdeumaoumais reaes qumicas. Aanliseemfluxocontnuomostra-sebastanteflexvelpararealizar umvariadonmerodeoperaesnecessriasnaanlisequmicaclssica. Somando-sesoperaesquepodemserrealizadasemprocedimentosem bateladacomoaquecimento,diluio,misturaeadiodereagentes;mdulosde anlise em fluxo contnuo podem executar dilises, destilao, extrao por solvente eoutrotiposdeseparao10,13.Deve-sedestacartambmapossibilidadede geraoeletroqumicadereagentesnastubulaesdosmdulosdeanlise,como agentesoxidantesouredutoresinstveiscomoU(III)eAg(II),comodescritopor DEN BOEF16. Introduo 6Os sistemas em fluxo diferem dos mtodos discretos (batelada) devido aofatodenohavernecessidadedeatingiroequilbrioqumico,poisuma caractersticadessessistemas,almdainjeodaamostraedispersocontrolada dazonadeamostra,ointervalodetempoentreaintroduodaamostraea deteco ser altamente repetitvel13,17. Ossistemasemfluxossoconstitudospor,asaber:umaunidade propulsoradefluidos,deinserodeamostras,dereao/misturaededeteco, comoindicadonaFigura1.1.Ainda,asunidadesapresentadaspodemser controladas por uma unidade de controle, como por exemplo, microcomputador. CRBPIBWSDBomba peristlticaPresso por gs inerteBomba de pistoGravidadeVlvula rotacionalVlvula solenideInjeo hidrodinmicaInjetor comutadorBobina reacionalReator enoveladoCmara de difusoExtrao por solventeReagentes imobilizadosForno de microondasEspectrofotmetroPotenciostatoA. AtmicaBalana de quartzoPotencimetroPropulso InjeoMistura/reaoDeteco FIGURA 1.1 Esquema das unidades constituintes do sistema em fluxo. R: reagente; C: carregador; I: Injetor; S: soluo de referncia ou amostra; B: Bobina reacional; D: detector e W: descarte. Aunidadepropulsoranamaioriadosmdulosdeanlises desenvolvidos e descritos na literatura a bomba peristltica. Ela permite operao de vazes de 0,1 L min-1 a 10 mL min-1. O emprego de dispositivos alternativos so tambmdescritos,comoexemploapropulsoporaodapressodegases inertes18,bombasdepisto19,microbombassolenides20oumesmoaao Introduo 7gravitacional13.MATOSetal.21propuseramapropulsoemsistemaemfluxo empregandomini-compressoresdeardotipobombadediafragma,originalmente destinados ao borbulhamento de ar em aqurios domsticos. O dispositivo fundamental do sistema em fluxo sem dvida o injetor, poisovolumedasoluoinjetadaumaimportantevarivelpoisogradientede concentraocriadoporessaamostraachavedainformaoanalticaobtidano sistema11.Dentreosrequerimentosessenciaisnecessriosparaumsistemade anliseporinjeoemfluxo,ovolumedeamostradeveserinjetadocomoum pluguenocarregadordemaneirareprodutvelsemcausardistrbiosnofluxo. Inicialmente,foirealizadacomousodeseringashipodrmicasemumsepto acopladoaumsistemahidrulicoqueconduziaaodetector13.Como desenvolvimentodametodologia,aseringacedeulugarsvlvulasrotatrias,nas quais uma ala tubular (ou loop) de volume fixo preenchida com a amostra e, aps arotaodavlvula,aalaintercaladanocircuitodefluxoedescarregadapor deslocamento em direo bobina de reao e/ou outros dispositivos que precedem o detector. Entre as inmeras contribuies dos pesquisadores brasileiros, destaca-seuminjetordeslizanteacionadoporvlvulassolenides11,22,bemcomoo desenvolvimentodeumaversosimpleserobustaquepermitiramaconcepode diversasconfiguraesdomdulodeanlise,caractersticainerenteaossistemas emfluxos23.Umdispositivosimpleserobustoconstrudocomtrsvlvulas solenidesdetrsvias,comumcircuitotemporizadorfoidescritoeaplicadona determinao de Cr(VI) e NH3 com destacvel repetibilidade24. O percurso analtico a unidade do sistema em fluxo onde ocorrem as misturae/oureaesnecessriasparadeteco.Suacomposionocomplexa em sistema em fluxo com configuraes de linha nica, coalescncia ou confluncia. Emmdulosquerequeiramalgumtratamentodaamostra,podem-seacoplar unidades de aquecimento como banhos com temperatura controlada, sem dvida o maisusado,bemcomofornosdemicroondas25-27.Oempregodereagentes imobilizados em suporte slidos tm sido bastante empregado, bem como cmaras dediluio,deextraoporsolventes13entreoutros.Reatorcontendoespuma poliuretana foi acoplado no percurso analtico de um sistema em fluxo proposto para eliminaodainterfernciaocasionadapormetais,Fe(II),Cu(II)eCo(II),na determinao de Al(III)28. Introduo 8Unidadesparafotodegradaoemlinhadosresduosgeradosem sistemasemfluxodesenvolvidosparadeterminaoderesorcinol29epesticidada classe dos carbamatos30 foram descritos, promovendo a mineralizao dos produtos das reaes empregando a associao entre radiao UV e TiO2 (anatase). Aunidaderesponsvelpeladetecodescritanossistemasemfluxo so as mais diversificadas, caracterstica inerente anlise por injeo em fluxo. De acordocomaespcieaserdetectada,praticamentetodasastcnicasusuaistm sidoempregadas10,11,comoespectrofotometrianoUV-Vis31,absoroeemisso atmica32,potenciometria33,condutometria,voltametria,quimiluminescncia34,35, entreoutrosemmenorexpresso,comodetectorespiezeltricos 36,37.Ainda,um espectrofotmetro convencional pode ser empregado com sucesso como detector da radiao produzida em uma reao quimiluminescente 38,39 Nocasodesistemasquepossuemdetecoespectrofotomtrica, algunstrabalhosdescritosnaliteraturapriorizamodesenvolvimentodecelasde fluxodebaixocusto,visandoobtermelhoriasemsuascaractersticasanalticas. OLIVEIRAetal.40desenvolveramumaceladefluxodecamadadelgadaque possibilitouoempregodeumasoluodereagentediluda2,5vezesna determinao de Cr(IV) com um tempo de limpeza muito menor, quando comparada cela de fluxo comercial. 1.2.1 Automao em laboratrios qumicos Agrandevantagemnautilizaodesistemasemfluxoa possibilidade de alternar o sistema de deteco de maneira simples, podendo usar o mesmosistemafsicoparaquantificaodediversosanalitos.Recentestrabalhos descritosnaliteraturadestacamoutracaractersticadegrandeimportncia,a possibilidadededetecosimultneadeprincpiosfarmacuticosassociados, devidoaaquisiodedadoscomputacionais,naqualadeterminaosimultnea dos frmacos realizada empregando mtodos matemticos32,41-43. Aagnciaambientalamericana(EPA)44recomendaumsistemade anliseporinjeoemfluxocomdetecoamperomtricaparadeterminaode cianetoemguas(mtodoOIA-1677),baseadonainjeodaamostracontendo cianetoemumfluxo,queaoreceberporconflunciasoluodeHCl,converteo Introduo 9cianetoacidociandrico(HCN)quepermeiaatravsdeumacmaradedifuso paraumfluidoreceptoralcalinoqueconverteoHCNaoncianeto(CN-).A quantidadedecianetonofluxoalcalinodetectadaamperometricamente empregando um eletrodo de trabalho de prata, um eletrodo de referncia de Ag/AgCl e um contra-eletrodo de platina e potencial de trabalho de 0 Volt. A corrente gerada na cela proporcional concentrao de cianeto na amostra. A agncia estabelece esse procedimento como oficial destacando dois itens importantes para a segurana doanalista:(i)reduzidaformaodeHCN,quandocomparadocommtodos convencionaisdedeterminao;(ii)diminuiodaquantidadedereagentestxicos pordeterminao.Ainda,amaiorseletividadedesseprocedimento,amelhor exatido e preciso quando comparado com mtodos convencionais e menor tempo deanlisecontribuemparaainserodesseprocedimentoemfluxocomomtodo oficial. OsMtodosPadroparaguaseguasResidurias45tambm recomenda o procedimentos analticos automatizados para determinao de ctions (Al3+eNH4+)enions(Cl-,F-,SO42-,NO3-eHPO42-).Osprocedimentosdescritos soindicadosparaseremusadosempregandosistemaemfluxocomercialda Technicon Autoanalyser ou configurao equivalente. O emprego de sistemas de anlise por injeo em fluxo na anlise de produtosfarmacuticostambmtemmostradoaeficciadaautomaode procedimentosanalitos,somando-sediminuiodecustos,isto,apossibilidade derealizarumgrandenmerodeanlisesemummenorespaodetempo,com baixo consumo de reagente, quando comparado com procedimentos em bateladas. Algumas configuraes de sistemas em fluxo tm sido propostas na quantificao de produtosfarmacuticosemlaboratriosderotina.AFarmacopiaAmericana descreve alguns sistemas para determinao de algumas substncias46. Um sistema emfluxosegmentadocomdetecoespectrofotomtricabaseadonareaode antibiticoscomestrutura-lactana,comocefalosporinasepenicilinas,com hidroxilaminas e ons frrico foi descrito. Outro sistema segmentado indicado para determinaoindiretadeiodetoempregandoareaocomcidoarsenosoe Ce(IV)46. Onmeroelevadodeaplicaesdessametodologiadescritasna literatura,empregadetecoespectrofotomtrica,comoumresultadolgicodaalta flexibilidadedestatcnicaparacontornarproblemasanalticos31.Nessessistemas, Introduo 10reaesdexido-reduo,decomplexao,dederivatizaoentreoutrasso geralmenteempregadas,sendooprodutoformadoouoconsumodereagente monitorado espectrofotometricamente em comprimento de onda apropriado10,31. 1.3Sistema de anlise por injeo em fluxo reverso (r-FIA) Osistemadeanliseporinjeoemfluxoreversofoiinicialmente propostoporJOHNSONePETTY47.Nestesistema,ocorreinversoentrea soluodereagenteesoluodereferncia/amostras.Originalmentefoielaborado paradeterminaodefosfatoempregandoomtododeazuldemolibdnioem guas marinhas aspiradas continuamente por um analisador oceanogrfico13,47. Sistemasr-FIAtmcomoprincipaisvantagenssobreoutras configuraes o aumento da sensibilidade e a economia de reagentes11,13,47. Isso se deveprincipalmenteaofatodequandoseempregaaamostracomocarregador,a concentrao da amostra na zona de reagente dispersa aumenta com o aumento da disperso.Ocontrrioocorreemsistemasemfluxocontnuo,poisoaumentoda dispersodazonadeamostraresultanumadiminuiodaconcentraodoanalito em questo11,47. O volume de amostra disponvel para anlise um fator crtico para seu emprego11,13.

1.4Fotodecomposio assistida por radiao ultravioleta Oempregodeprocessosoxidativosavanados(POA)possuigrande aplicaonareadepesquisaambientalemquesoutilizadoscomsucessona degradaodesubstnciasorgnicaspresentesemamostrasdeguasnaturaise residurias48. Umavariedadedesistemasqumicostemsidodescritapara tratamentoderesduosempregandoareaodeFenton48-50,fotocatlise heterognea,queempregaoTiO2(anatase)29,48,51,areaofotofenton48,52,53. Recentemente,estudosindicamqueaassociaoderadiaoUVemcombinao comH2O2empresenadeFe2+,conhecidacomofotofenton,acentua significativamente a decomposio de compostos refratrios orgnicos53. Introduo 11A combinao da radiao ultravioleta e H2O2 na degradao de fenol mostrou-se mais efetiva quando comparada com a fotlise e oxidao com perxido dehidrognio54,indicandoqueesseprocessoproduzumaquantidademaiorde radicais hidroxilas que promovem a degradao. Adegradaodeherbicidasdaclasseacetanilidafoiavaliadapor FRIEDMANetal.50empregandoumprocessoandicoFenton,ondeageraode radicaispromovidapelageraoeletrolticadeFe2+quereagecomsoluode H2O2. Afotliseempregandoradiaoultravioletacombinadacomperxido dehidrognioumdosmaisimportantesprocessosoxidativosavanadospara remoodesubstnciasorgnicastxicas.Esteprocessoenvolveageraode radicaishidroxilas,altamentereativos,quesocapazesdemineralizar contaminantesorgnicos,comofenol48,resduosdeindstriasdecurtimentode couro49 e solues contendo benzeno, tolueno e xilenos55. Radiaocomcomprimentosmenores49que400nmsohbeispara fotolisarmolculasdeH2O2.Omecanismoaceitoparaafotliseaquebrada molcula em dois radicais hidroxilas (equao 1, Tabela 1.2). Outras reaes podem ocorrer, de acordo com as condies, como mostradas na Tabela 1.2. TABELA1.2Reaesqumicasenvolvendoageraoderadicaishidroxila empregando perxido e radiao ultravioleta49 H2O2 + h 2 OH (1) H2O2 + OHH2O + HO2 (2) OH + HO2-HO2 + OH-(3) H2O2 + HO2HO + H2O + O2(4) 1.5Furosemida 1.5.1Aspectos gerais Furosemidasolvelemacetonaeemsoluesdehidrxidos alcalinos;ligeiramentesolvelemlcool,levementesolvelemter,altamente solvel em clorofrmio e praticamente insolvel em gua56. Introduo 12A furosemida (I) susceptvel hidrlise cida, na qual o nitrognio do grupamento amino protonado, seguido de um ataque nucleoflico sobre o carbono do grupamentofurfurilpararesultarnoprodutodahidrlise,asaluamina(II).O logaritmo da constante de velocidade em funo do pH do meio reacional (log k vs. pH) revelou que a catlise efetiva em solues cidas (pH < 6). Pode-se aumentar a estabilidade da soluo contendo furosemida pela adio de lccool57. A degradao da furosemida (I) ocorre seguindo esquema mostrado na Figura 1.2, onde (II) a saluamina e (III) indica espcies furfuril58,59. (I)(III)OHNOOClH2NO2SOHNOOH2NO2SOHNH2OClH2NO2SHOO+OHNH2OClHO3SH+H2OMeOHUvMeOHUvH2O+H3C COCH2CH2C CH3O(II) FIGURA1.2Reaesenvolvidasnadegradaodafurosemidaemsoluo aquosa58.(I)Furosemida;(II)Saluamina;(III)espciefurfuril;MeOH:metanoleUv: radiao ultravioleta. 1.5.2 Propriedades farmacolgicas Afurosemida(cido4-cloro-N-furfuril-5-sulfamoil-antranlico)uma substnciapertencenteclassedosdiurticos,umgrupodesubstnciasusadas paraajustaracomposioevolumedosfludoscorporaisemnumerososcasosde doenascomoinsuficinciascardacas,renaisehepticas,cirrose,bemcomo,no tratamentodehipertenso.Dopontodevistafarmacolgico,sodrogasquealm de aumentarem o volume urinrio, aumentam tambm a excreo urinria de sdio por uma ao direta sobre o rim60,61. Introduo 13Noexisteumaclassificaoidealparasassubstnciaspertencentes classedosdiurticosdevidofaltadeconhecimentosdasbasesmolecularesdo transporte de ons no nfron. A avaliao da estrutura qumica tambm no fornece elementosbsicosparaacompreensodomecanismo,dolocaldeaoedo empregoclnicodessasdrogas.Dessaforma,osdiurticossulfonamdicospodem ser divididos em inibidores da anidrase carbnica, tiazdicos e furosemida, cada um comdiferentesefeitossobreacomposiodaurinaecomdiferenteslocaisde ao61. Osdiurticospodemdeterminaroaumentodofluxourinrioeda excreo do sdio por dois processos, a saber: a) aumento do fluxo de fludo filtrado; b) diminuio da reabsoro tubular de sdio e gua. O mecanismo de ao se baseia na inibio da reabsoro de cloreto desdionaporoascendentedaaladeHenle(sistemadeco-transporteNa+/Cl-/K+). A inibio desse sistema de transporte previne a reabsoro desses ons e uma diurese ocorre61. Afurosemidaquandoadministradaporviaoralabsorvida rapidamentedentrode5a10minutos.Oinciodaaodessediurticorpido quando administrada via venosa, sendo de 1 a 5 minutos. Quandoadministradaemdosesmxima,chegaadeterminara excreode30%dacargafiltradadesdio.SimultaneamenteperdadeNa+ (natriurese), ocorre tambm um aumento na excreo de potssio, embora a relao de Na+/K+ ser maior devido perda de Na+. Por isso, alguns produtos farmacuticos comerciais contendo furosemida contm KCl associado, como o Lasix. Com relao aosonsclcioeaomagnsio,afurosemidaaumentaaexcreodestesctions proporcionalmente a natriurese61,62. A furosemida atualmente empregada em algumas situaes clnicas: a)naretenodesdio,b)noedemaagudodopulmo,c)nainsuficinciarenal crnica,d)nahipertensoarterial,e)nainsuficinciarenalcrnica,f)em intoxicaes exgenas, g)no caso de hipercalcemia e h) no diabetes insipidus. Introduo 141.5.3 Alguns mtodos para a determinao de furosemida Amaioriadosprocedimentosanalticosparadeterminaode sulfonamidasbaseadaemreaesqumicas,quetmcomoalvoogrupoamino primriodamolcula.Oprocedimentoamplamenteempregadobaseadona formao de um sal de diaznio seguido pela reao com uma substncia adequada paraformaodeumcromforoazo,sendoestareaoamaisempregadanos procedimentosanalticoscommaiorseletividadeesensibilidadeparaa determinao de furosemida em produtos farmacuticos e amostras clnicas1. AFarmacopiaInternacional63recomendaavolumetriacomo procedimento para quantificao de furosemida. O procedimento descrito emprega o azuldebromotimolemdimetilformamidacomoindicadoreasoluodeamostra titulada com soluo de NaOH 0,1 mol L-1. Oparinicofurosemida-AliquatfoiimobilizadoporDIASetal.64em uma membrana de cloreto de polivinila (PVC) para a determinao potenciomtrica defurosemidaemformulaesfarmacuticas.Oeletrodoexibiuumarepostalinear entre 1,6 x 10-4 a 1,0x10-2 mol L-1. BASAVAIAHetal.65empregaramareaodefurosemidacomuma soluodebromoeindicadoralaranjadodemetila,paraadeterminaodoanalito emformulaesfarmacuticas.Oprocedimentovolumtricodesenvolvidocom detecovisualdopontofinaldeviragemapresentouumalinearidadeentreuma variao de massa de 2 a 20 mg. J o procedimento espectrofotomtrico apresentou uma curva analtica com linearidade entre 0,25-3,50 g mL-1. ABDELHAY66desenvolveuumprocedimentoespectrofotomtrico derivativoparaadeterminaodefurosemidanapresenadeseuprodutode degradao,asaluamina.Oprocedimentoenvolveuamedidadeabsorbncia empregandoacurvadaprimeiraderivadaem254e262nm(sinalzeropara saluamina) e, a absorbncia da curva da segunda derivada em 265 e 272 nm (sinal zero para a furosemida) para a determinao da saluamina. GARCIAetal.67empregaramareaoentreafurosemidacomPd2+ para desenvolver um procedimento em fluxo com deteco espectrofotomtrica para a quantificao de furosemida em formulaes farmacuticas. O complexo foi obtido entre a furosemida e Pd2+ a 55C e foi monitorado espectrofotometricamente em 550 Introduo 15nm. O procedimento apresentou uma curva analtica linear entre 2,0x10-5 a 4,0x10-4 mol L-1. GOTARDOetal.68empregaramareaodafurosemidacomp-dimetilaminocinamaldedo,emmeiocido,paraodesenvolvimentodeum procedimentoanalticoempregandoatcnicaderefletnciadifusa.Areaoentre essasduassubstnciasa80Cproduzumcromforosobumpapeldefiltroque pode ser medido em 585 nm. O procedimento apresentou uma curva analtica com uma faixa linear de concentrao entre 7,6x103 a 6,0x102 mol L-1 do frmaco. 1.6Paracetamol 1.6.1Aspectos gerais Cristal branco inodoro ou p cristalino. Sua solubilidade de 1 g em 70 mL de gua a 25C , 7 mL de lcool, 13 mL de acetona 40 mL de glicerina e 9 mL de propilenoglicol. insolvel em benzeno e ter, e solvel em soluo de hidrxido de metal alcalino56,69. Apresenta estabilidade em soluo aquosa, na qual o mximo de estabilidade ocorre em pH 6-756. Aprincipalrotadedegradaoquecontribuiparaainstabilidadedo paracetamol (IV) a sua hidrlise que produz p-aminofenol (V) e cido actico (VI). A reao de hidrlise (equao 1) catalisada por cidos ou bases56. NHOHCO CH3NH2OHCH3COOHH2O+ +(IV)(eq. 1)(V)(VI) Areaoentreoparacetamol(IV)eaaspirina(VIII)foidescritanos comprimidosslidos,tendocomoprodutocidosaliclicoediacetil-p-aminofenol (equao2).Estudosposterioresnoobservaramomesmocomportamento.A Introduo 16estabilidadefoidiminudacomaumentodaconcentraonamistura,temperatura, presena de codena fosfato e estearato de magnsio. Cafena no contribui para o aumento da instabilidade da mistura de aspirina-paracetamol56. NHOHCO CH3COOHOCOCH3+NHCO CH3OCOCH3COOHOH+(IV)(VIII)(eq. 2) Foiencontradoqueoparacetamolformaestruturasmolecularescom estequeometria1:1comantipirinaecafenaeteofilina,masnocomteobromina, quandoassociadosemformaslida(comprimidos).Essacomplexaoaumentaa solubilidadedoparacetamol.Foiverificadaainda,aformaodecomplexosde paracetamol com polietilenoglicol 4000 (PEG4000) e polivinilpirrolidona (PVP). Essa complexaoaumentaasolubilidadeemguaeavelocidadededissoluodo paracetamol,sendomaiorparamisturadeparacetamol-PEGemproporo1:2 m/m56. AsaminasalifticasprimriasreagemcomHNO2,comformaode sais de diaznio; como, porm os sais de diaznio alifticos so poucos estveis e, ao decompor-se, do origem a misturas complexas70. As aminas secundrias, tanto alifticascomoaromticas,reagemcomcidonitrosocomformaodeN-nitrosaminas. A nitrosao do anel uma reao de substituio aromtica eletrfila, em que o on nitrosilo (+NO), ou uma espcie (como H2O+-NO) pode transferir para o anelbenznicoogrupamento +NO.Oonnitrosiloeletrfilomuitofraco,em comparaocomosagentesresponsveispelanitrao,sulfonao,halogenao; normalmente a nitrosao d-se apenas emanis portadores de dialquilamnicos (-NR2) ou nos grupo hidroxila (OH) fortemente ativados70. Introduo 171.6.2 Propriedades farmacolgicas Paracetamol(acetaminofenol,N-acetil-p-aminofenol)umanalgsico-antipirticopertencenteclassedosderivadosdop-aminofenol,introduzidono sculopassadocomoresultadodepesquisasdestinadasasubstitutospara acetanilida. Embora possuam propriedades analgsicas-antipirticas, a fenacetina e aacetanilidadoorigemametemoglobina(hemoglobinaincapazdetransportar oxignio), devido formao de um precursor da anilina. Tanto a acetanilida quanto a fenacetina so metabolizadas a paracetamol, a substncia ativa. Outros frmacos dessaclassesoaanidoxina,butacetina,etoxazena,fenacetinol,parapropamole parsalmida71,72. O paracetamol no tem atividade antiinflamatria, mas mesmo assim provavelmenteoantipirtico-analgsicodesegundaescolha,sobretudopara pacientesalrgicosaocidoacetilsaliclicoouquesofremdelcerasppticas.Por sermenostxicoqueafenacetina,oparacetamolacabousubstituindo-aem diversasformulaesfarmacuticas,sendohabitualadministrardosesdirias variandode650mga4gpordia,emdosesdivididas72.Ainda,noapresentaos efeitos colaterais da aspirina (cido acetilsaliclico) e pode ser adquirido no comrcio sem prescrio mdica, o que o torna um frmaco de crescente uso domstico. Esta temsidoumadasprincipaispreocupaesdaANVISA73.Medicamentoscomao analgsicaeantipirticasoutilizadostantoparaocontroledadorquantopara baixaratemperaturacorpreaemcasosdefebre.Estasindicaesfavorecema automedicao, principalmente durante o vero, perodo do ano onde ocorrem tanto casos de dengue quanto outra virose infantil. EmumlevantamentorealizadonoHospitalOcidentaldaAustrlia envolvendoonmerodeinternaesdevidointoxicaoporanalgsicos,o paracetamolfoisubstnciamaisencontrada,correspondendoa19,3%,o ibuprofeno foi responsvel por 2% das internaes e 1% foi a porcetagem relativa a aspirina74. Contudo,asuperdosagemagudacausaleseshepticasfatais62. Quandoadministradoemaltasdoses,aproximadamente250mgkg-1,podeexibir toxicidade resultante do principal metablito N-acetil-p-benzoquinona imina (NAPQI) 75.Omecanismoproposto(Figura1.3)paraativaometablicaocorreatravsda oxidao do paracetamol no grupamento amino a N-hidroxiacetoaminofenol, seguida Introduo 18pelaformaodoNAPQI.ANAPQI,umasubstnciaaltamenteeletroflica,pode reagir facilmente com glutationa ou grupamento tiol das protenas. O N C CH3ONAPQIO N C CH3O H.O2O OHO OHHOR S H.nion superxidoperxido.radicalhidroxilacitoxicidadefenoxiacetoaminofenol FIGURA1.3Mecanismoreacionalmostrandoacitotoxicidadedoparacetamol quando ingerida em grandes quantidades75. Omecanismodahepatotoxicidadedeve-seaofatodoNAPQIser capazdeoxidargrupamentostiis,sofrendoassimumcicloredoxcomaformao denionssuperxidospormeiodereduocomoxignio.Estaetapadereduo acaba produzindo perxidos e por final radical hidroxilas (.OH), que forte oxidante implicado no stress oxidativo celular75. 1.6.3 Mtodos de determinao de paracetamol 1.6.3.1 Medida espectrofotomtrica direta Naliteraturaexistemalgunsprocedimentosquedescrevema determinao de paracetamol pela medida intrnseca do analito1. Formulaesfarmacuticasdisponveiscomercialmentepodemno apenasconterparacetamolcomonicoprincpioativo.Vriosprodutoscomerciais contm outros princpios ativos associados ao paracetamol como potencializador de seusefeitos,oucomoutrasfinalidades.Emvriasformulaesfarmacuticas Introduo 19encontram-sediferentesprincpiosativossendoadeterminaopor espectrofotometria de absoro na regio do UV dificultada pela sobreposio das bandas1.A resoluo entre cido acetilsaliclico, paracetamol e salicilamida, bem comoadeterminaodecafena,L-cidoascrbico,antioxidante(hidroxianisola butilada),sedativosehipnticos(fenobarbitalesecobarbital)eainda,anti-histamnicos (prometazina) pode ser realizada empregando o mtodo da 4 derivada do espectro76. A curva da 2 derivada do espectro de absoro foi empregada para a determinaodeparacetamolemformulaescontendocafenaepropifenazona associados,observandoaamplitudedosinalem230nm(sinalzeropara propifenazonaecafena).Paraosoutrosanalitos,foinecessriaacorreoda amplitude do pico77. ERKeONUR(1997)78efetuaramadeterminaodeparacetamole analginaassociadosemformulaesfarmacuticasutilizandoaespectrofotometria derivativanaregiodoUV.Adeterminaopodeserrealizadatomando-sea amplitudedoespectroem249,2nme264,8nm,paraanalginaeparacetamol, respectivamente. Asdeterminaessimultneasdeparacetamolassociadocafenae cido acetilsaliclico puderam ser efetuadas utilizando medidas espectrofotomtricas naregioentre210a300nm.Aeliminaodainterfernciapodeserrealizada baseando-senacalibraomultivariadaempregandomtodosdosmnimos quadrados parciais79. ERKetal.80estudaramadeterminaosimultneadeparacetamole metocarbamol,associadosemcomprimidos.Asmedidasforamfeitasempregando-seaamplitudeobtidaem243nm(paracetamol)e230nm(metocarbamol)da primeira derivada do espectro obtido. Grande nmero de procedimentosanalticos empregando sistemas de anliseporinjeoemfluxocontendoacopladosuportesslidosnacelade deteco(optossensores)edeteconaregioultravioletaforamdescritos.Estes sistemasemfluxospropostospermitiramadeterminaodeparacetamolem formulaes farmacuticas contendo substncias associadas, como: (i) cafena81 (ii) salicilamida82, (iii) cido ascrbico83, (iv) cafena e cido acetilsalclico84 e (v) cafena Introduo 20epropifenazona 42.Asfigurasdemritosdessessistemaemfluxocontendo optossensores acoplados esto mostradas na Tabela 1.3. Dois sistemas em fluxos baseados na absoro de radiao intrnseca doparacetamolnafaixaespectraldoinfravermelhoforamdesenvolvido85.Um sistemaemfluxopropostoempregouaconfiguraoconvencionaleoutrocom paradadefluxo.Asanlisesforamrealizadasempregando-sesoluodeetanol 10%v/vemclorofrmioemedidasem1515cm-1,usandocomolinhabase absorbncia em 1900 cm-1. O limite de deteco obtido foi de 33 g mL-1 e 8 g mL-1, para o sistema FIA em modo normal e com parada de fluxo, respectivamente. A fluorescncia nativa do paracetamol pode ser empregada para a sua determinao em formulaes farmacuticas. As medidas de fluorescncia (excitao = 333 nm e emisso = 382 nm) foram feitas diretamente sobre as amostras depois de pulverizadas.Aintensidadedefluorescnciaapresentou-selinearnafaixade concentrao 100 a 400 mg g-1. O limite deteco variou entre 13 a 16,7 mg g-1 para amostras com diferentes propores de excipientes 86. Introduo 21 TABELA1.3Figurasdemritosdesistemasemfluxocomdetecoespectrofotomtricaparaadeterminaodeparacetamol empregando optossensores. ConcomitanteEluenteRSD/% Limite de deteco / mol L-1 Linearidade / mol L-1 Freqncia de amostragem / h-1 Ref. Cafenae propifenazona metanol/gua(10%e 50% v.v-1) >24,9x10-5 1,6x10-4 a 2,31x10-3 11 42 cafenagua/metanol 10% v/v 0,5-2,1a 5x10-6 e 1,3x10-5 (a) 6,6x10-5 a 1,01x10-3 15 e 20a81 Salicilamida0,601,6x10-5 a 2,6x10-4 36 82 cido ascrbicoTampo acetato (pH 5-6)e0,05molL-1NaCl (pH 12,5) 1,51,4x10-7 2,6x10-6 a 1,6x10-4 30 83 cido acetilsaliclicoe cafena HClO4 0,5 % v/v (pH 1) 87 (-)0,08molL-1NaCl(pH 11) 1,241,44x10-7 3,3x10-6 a 5,3x10-5 40 88 asoluo NaOH pH 12,0. Introduo 221.6.3.2 Derivatizao pela oxidao Muitosprocedimentosparaaanlisedeprincpiosativosem formulaes farmacuticas so baseados na reao de oxidao do frmaco, com o subseqentemonitoramentodoprodutooxidado(queapresentaabsoro)oudo excessodereagente.Vriossoosagentesoxidantesempregadosparaessa finalidade,asaber:hexacianoferrato(III)depotssio,Ce(IV),dicromato,iodato, periodato,iodo(I2),MnO2ePbO2.Tambmsoencontradosagentescommdio poder oxidante como 2-iodilbenzoato, cloramina T e on Fe(III)1,2,10. Umaestratgiaparaaumentarasensibilidadeemprocedimentos analticos empregar reagentes para a converso da espcie de interesse em uma formaquepermitaamedidadeabsorodaradiaocommaior sensibilidade/seletividade, isto , obter uma substncia como produto que apresente maior absortividade molar ()89. Nessesentido,areaodeumamisturadep-diaminaaromtica(p-difenilenodiamina,N,N-diaquil-p-fenilenodiamina)ouumaminofenol(o-,m-,p-aminofenol,metol)comumcomponentedareao,umfenol(ouarilamina)eum agenteoxidanteapropriado(K3Fe(CN)6,K2S2O8,cloraminaT,KIO4,FeCl3,2-iodilbenzoato, N-cloro ou bromosuccinimida)2 produz um composto indofenlico (IX), indoanilina (X) ou indoaminas (XI), que apresenta alta absortividade molar.

(XI)N OH O(IX)N N(CH3)2ON N(CH3)2N(X) AoxidaodoparacetamolaN-acetil-p-bezoquinonaiminapor hexacianoferrato(III)depotssiofoiempregadaparaadeterminaodiretade paracetamolemumespectrofluormetroacopladoaumsistemadeanlisepor injeoemfluxo90.Oprodutodareaodeoxidaoapresentafluorescnciano Introduo 23comprimentodeondade426nm,apstersidoexcitadoem241nm.Amedidada variaodaintensidadedefluorescnciadoprodutopermitiuadeterminaodo frmaco em uma faixa de concentrao de paracetamol entre 0,5 a 15,0 g mL-1. Umsistemadeanliseporinjeoemfluxocomdeteco espectrofotomtricaparaadeterminaodeparacetamolfoidesenvolvido empregando-secomooxidantehexacianoferratodepotssioesubseqentereao doproduto(N-acetil-p-bezoquinonaimina)comfenolemmeioamoniacala80C paraproduziraN-(p-hidroxifenil)-p-bezoquinonaimina(XII),umcromforoque absorveem660nm.Esseprocedimentopermitiuadeterminaodesseanalitoem formulaes contendo substncias concomitantes como a salicilamida e a cafena91. OHNCO HOHONCO HOK3Fe(CN)6OHONOH(XII) Aoxidaodoparacetamolcomhipocloritofoiempregadana determinaodesseanalitoutilizandoumsistemadeanliseporinjeoemfluxo com deteco espectrofotomtrica92. No sistema desenvolvido, em que substituiu-se oreagentetxicofenolporsalicilatodesdio,asoluoinjetadacontendo paracetamolrecebeuporcoalescnciaumasoluodeNaClO.Apsabobina reacional uma soluo de salicilato de sdio em meio alcalino reagiu com a zona de amostra. O produto da reao N-[p-hidroxifenil]-p-benzoquinona imina foi monitorado espectrofotometricamente em 640 nm. Umsistemadeanliseporinjeoemfluxocontnuoparaa determinaoindiretadeparacetamolempregandoosistemaquimiluminescente luminol-H2O2-[Fe(CN)6],cujaradiaoemitidafoiproporcionalconcentraode paracetamol na soluo injetada foi proposto por ALAPONTet al.93. O paracetamol Introduo 24foioxidadopelohexacianoferrato(III)eoexcessodoreagentefoideterminadopelo aumentodamagnitudedaquimiluminescnciadareaoentreH2O2,luminole K3[Fe(CN)6] do qual participa como catalisador. Os dados do estudo de recuperao das trs amostras (uma slida e duas lquidas) analisadas no foram apresentados. Permanganatofoiempregadocomoagenteoxidanteemumsistema paraadeterminaodeparacetamolutilizandodetecoquimiluminescente94.O paracetamol foi consumido pelo oxidante (5 mol L-1;1,7 mL min-1) e seu excesso foi monitorado pela reao com luminol (2,5 mmol L-1; 1,7 mL min-1). Dessa maneira, a quedadosinalquimiluminescentefoiproporcionalaconcentraodoparacetamol em soluo. A faixa linear obtida foi entre 2,5x10-8 a 2,5x10-7 mol L-1 com um limite dedetecode1,0x10-8molL-1.Odesviopadrorelativoparaumasoluode paracetamolcontendo1,8x10-8molL-1foide2,3%(n=12).Afaixaderecuperao obtidacomoprocedimentodesenvolvidovariouentre98,2a104,4%nasamostras analisadas. Aformaodeumasubstnciaqueapresentefluorescnciauma estratgiaempregadaparaodesenvolvimentodemetodologiasanalticasparaa determinaodoparacetamol95.Omtodobaseia-senaformaodeuma substnciacoumarnicaobtidapelareaoentreoparacetamoleetilacetoacetato emmeiodecidosulfrico.Asubstnciaformadaapresentaacentuada fluorescncia (excitao = 446 nm e emisso = 478 nm). A curva analtica foi linear para uma faixa de concentrao entre 0,1 a 0,4 g mL-1, com um limite de deteco de 57 ng mL-1. Umsistemadeanliseporinjeoemfluxocomdeteco espectrofotomtricafoipropostoporVERMAetal.96empregando2-iodilbenzoato comoagenteoxidante.Oprodutodareao(N-acetil-1,4-benzoquinonaimina)foi monitoradoem445nm.Oestudodarecuperaovariouentre96,3a105,2%nas amostrasanalisadas.Odesviopadrorelativovariouentre0,5a2%euma freqncia de amostragem de 360 amostras por hora foi obtida. MARTNEZ-CALATAYUDeBENITO31desenvolveramumsistemade anliseporinjeoemfluxocomdetecoespectrofluomitricaparadeterminao doparacetamol.Nestesistema,oparacetamolreagecomhexacianoferrato(III) imobilizado em resina aninica e o produto da reao fluorescente foi detectado. Introduo 25 TABELA 1.4 Figuras de mritos de sistemas em fluxo para determinao de paracetamol em formulaes farmacuticas. Detecoreagente Linearidade / mol L-1 Limite de deteco / mol L-1 RSD / % Freqncia de amostragem / h-1 Ref. QuimiluminescenteKMnO4/luminol2,5x10-8 a 2,5x10-7 1,0x10-8 2,31711 Espectrofotomtrica [Fe(CN)6]3-/fenol1,6x10-6 a 2x10-4ND0,42691 Espectrofotomtrica [Fe(CN)6]3-/cido saliclico 3,3x10-6 a 6,6x10-4 1,6x10-6 < 18092 Quimiluminescenteluminol-H2O2-[Fe(CN)6]3-1,6x10-5 8,3x10-51,4x10-5 2,28793 Espectrofotomtrica 2-iodilbenzoato5,3x10-6 a 6,6x10-4 2,0x10-6 0,5-2,036095 ND: no determinado. Introduo 261.6.3.3 Reao de hidrlise Areaodehidrlisedoparacetamoltemcomoprodutoop-aminofenol56.Estasubstnciatemacapacidadedesofrerreaesdeacoplamento dasmaisdiversas.Aetapadehidrlisedoparacetamoltornou-seumaestratgia interessante para o desenvolvimento de procedimentos analticos1,10. Osprincipaismtodosdescritosparaadeterminao espectrofotomtricadeparacetamolqueempregamaderivatizaodoprodutoda reaodehidrlise,formandoumasubstnciaindofenolcomoprodutoparaser monitorado so indicados na Tabela 1.5.AhidrlisebsicadoparacetamolempregandooTiron(cido4,5-dihidroxo-1,3-benzenodisulfnico)comoreagenteparaproduodeumcromforo paradeterminaodaconcentraodeparacetamolemformulaesfarmacuticas foi proposto para determinao de paracetamol em formulaes farmacuticas. CRIADO et al.26 desenvolveram um sistema de anlise por injeo em fluxocontnuoparaadeterminaodeparacetamolcontendoacopladoaosistema umfornodemicroondas,acionadoaumapotnciade250Waps30sdainjeo dasoluodeamostraoureferncia,comofontedeenergiaparapromovera hidrlisealcalinadoanalito.Apsofornofoinecessrioacoplarumbanhodegelo para resfriamento do fluxo emergente do forno. O produto da reao, p-aminofenol, reageemseguidacomumfluxodeo-cresolemmeiodeNaOH3,5molL-1.O produto da reao foi monitorado em 620 nm.A mesma estratgia de hidrlise foi empregada no desenvolvimento de um sistema de anlise por injeo em fluxo empregando radiao microondas para hidrlise alcalina em linha97. O produto da reao, 4-aminofenol, reagiu em seguida com8-hidroxiquinolinanapresenadeperiodatodepotssioparaaobtenoda substncia indofenol, que foi monitorada em 608 nm. FILIK et al.98 propuseram um sistema de anlise por injeo seqencial emqueoprodutodahidrlisealcalinadeparacetamolreagecom2,2'-(1,4-fenilenedivinileno)bis-8-hidroxiquinolina(PBHQ)formandoumasubstnciaque absorve em 650 nm. Introduo 27TABELA1.5Reagentesutilizadosnadeterminaodeparacetamolapsareao de hidrlise do frmaco Tiron OHHOSO3Na NaO3S o-cresol OHCH3 8-hidroxiquinolina NOH PBHQ NOHNHO PBHQ: 2,2'-(1,4-fenilenedivinilene) bis-8-hidroxiquinolina. Introduo 28TABELA 1.6 Figuras de mritos de sistemas de anlise por injeo em fluxo para a determinao de paracetamol empregando reao de hidrlise Reagentes/L mol-1 cm-1nm Limite de deteco Curva analticaRef. o-cresol6,05x104 6201,3x10-6 4x10-6 a 1,2x10-4 26 Tiron1,1x1046001,2x10-61x10-5 a 1x10-4 99 8-hidroxiquinolina2,0x104 6081,3x10-6 1,1 a 3,2x10-5 97 PBHQ3,4x1046506x10-7 2,9x10-6 a 3,6x10-5 98 S2-/Fe3+ 3,2x1035401,3x10-6 0 a 3,0x10-4 100 NQS1,118x1045702,8x10-6 6,6x10-6 a 1,3x10-4 101 PBHQ: 2,2'-(1,4-fenilenedivinilene) bis-8-hidroxiquinolina. Areaodenitrosaodoparacetamol,queproduzumasubstncia estvelqueabsorveem430nmemmeioalcalino,foiempregadaparao desenvolvimento de sistemas em fluxo com deteco espectrofotomtrica102-104.

1.6.3.4 Mtodos eletroanalticos Umsistemadeanliseporinjeoemfluxocomdeteco biamperomtricaparaadeterminaoindiretadeparacetamolfoidescritopor GALVEZetal.105.Nestesistema,foiempregadooparredoxFe(III)/Fe(II)eVO3-/VO2+paraaquantificaodofrmaco.Acurvaanalticafoilinearparaafaixade concentrao de paracetamol de 0,1 a 7 g mL-1 empregando Fe(III)/Fe(II) e at 20 gmL-1empregandoVO3-/VO2+comoreagente.Osdesviospadrorelativosforam menoresque1,6%(n=10)paraambosossistemaseafreqnciadeamostragem obtidafoide149e79h-1empregandoFe(III)/Fe(II)eVO3-/VO2+comoreagentes, respectivamente. Modelos matemticos contriburam para a determinao simultnea de paracetamolefenobarbitalemformulaesfarmacuticasempregandovoltametria depulsodiferencialeeletrododecarbonovtreo.Oempregodedoismtodos matemticos,mnimosquadradosparciais(PLS)ecomponentederegresso principal(PCR),foinecessriodevidosobreposiodosvoltamogramasdosdois Introduo 29analitos.Acurvaanalticafoilinearparaumavariaonaconcentraode paracetamol entre 0,9 a 11,7 mg L-1 106. VIEIRAetal.107desenvolveramumprocedimentobaseadona formaodoprodutodaoxidaodoparacetamol,N-acetil-p-benzoquinonaimina, empregando enzima peroxidase extrada de pepino (Cucurbita pepo) imobilizada em um eletrodo de pasta de carbono. A determinao foi realizada reduzindo a N-acetil-p-benzoquinonaiminaaparacetamola-0,10V.Osvoltamogramascclicosforam obtidos entre +0,5 a -0,5 V. A intensidade de corrente de reduo foi proporcional concentrao de paracetamol, obtendo-se uma curva analtica linear entre 1,2x10-4 a 2,5x10-3 mol L-1, com um limite de deteco de 6,9x10-5 mol L-1. 1.7Acetilcistena 1.7.1Aspectos gerais Aacetilcistenatemumaatuaoimportante,poisparticipada produo da glutationa, um importante antioxidante hidrossolvel e cofator essencial paraenzimasantioxidantes62.Ainda,apresentapropriedadesmucolticase hepatoprotetoras62. A acetilcistena empregada em casos agudos de bronquite 108, bem como na proteo das doenas pulmonares109. 1.7.2Propriedades Mucolticas Expectorante denominao genrica que se aplica a recursos fsicos eadrogasquefacilitamaproduoe/oueliminaodassecreesbronquiais. Grandenmerodedrogastmsidousadocomoexpectorante,atuandopor mecanismonemsempreelucidados62.Entreosfluidificantesempregados atualmente,destacam-se:ovapordgua;CO2queatuadevriasmaneiras;cido benzicoebenzoatos;acetatos;iodetos(I-),comumenterepresentadospelos iodetos de sdio e potssio; surfactantes; alm dos mucolticos. Introduo 30Das substncias mucolticas experimentadas, a acetilcistena foi a que apresentou resultados mais vantajosos, sendo utilizada de diversas maneiras, tanto inalao, bem como via oral. Aacetilcistenaempregadaparafluidificaromucoefacilitara expectorao.Recentemente,tm-seusadoaacetilcistenaassociadaa surfactantes e algumas enzimas proteolticas em aerossol. A acetilcistena liquefaz o muco,masnotemefeitosobreafibrina,oscogulosdesangueetecidosvivos. Sua ao diretamente nas mucoprotenas, abrindo a ligao dissulfeto, levando a uma diminuio da viscosidade do muco. Sua atividade mxima em valores de pH 7e9.Seuefeitomximoseproduzaofimde10a15minutos,depoisda administrao62. 1.8Determinao de acetilcistena Substnciasoxidantescompotencialdeoxidaomediano,comoo Fe(III)podeserempregadoparaadeterminaodeacetilcistena110.Aquantidade de Fe(II) produzida na reao equivalente concentrao de acetilcistena. Vrias so as substncias que permitem a quantificao de Fe(II) por meio da formao de complexos que absorvem radiao, permitindo o desenvolvimento de procedimentos espectrofotomtricosparaadeterminaoindiretadeacetilcistena.Entreeles, destacam-se um reagente muito sensvel para a determinao de Fe(II), 3-(2-piridil)-5,6-bis(cido4-fenilsulfnico)-1,2,4-triazinadesdio(XIII),empregadoparaa determinaodeacetilcistenaemformulaesfarmacuticasemprocedimento espectrofotomtrico em batelada111. Outro reagente freqentemente empregado a 1,10-fenantrolina(XIV)2,110,112.Aquantificaodeacetilcistenafoiobtida monitorando-seoFe(II)produzidopelaformaodocomplexocoloridoemum procedimento em batelada113. Introduo 31NNNNSOSOO OOOHNaNN(XIII) (XIV) Diversosprincpiosativostmsidodeterminadospelaradiao quimiluminescenteproduzidadurantesuaoxidaoporumoxidanteforte10.O permanganatoemmeiocidooxidaaacetilcistenaaacetilcistenadissulfetocom liberaodeumafracaradiaoquimiluminescente.Ofluorforoquininafoi empregadaporLIetal.114paraacentuararadiaoemitidaemumsistemade anliseporinjeoemfluxoparaadeterminaodeacetilcistenaemfrmacos.O mesmocomportamentoquimiluminescentefoiobservadoparaoutrostiis,asaber: cistena, glutationa e captopril. Areaoentreacetilcistenaeo-quinonaproduzidapelareaoentre polifenol oxidase fngica e o substrato o-difenol, foi empregado para a determinao indiretadeacetilcistenautilizandoummtodocintico.Oprocedimentobaseia-se na medida da fase lag na formao do produto da reao enzimtica, o-quinona115. Outrareaodexido-reduoempregadaparaadeterminao indiretadeacetilcistenaemformulaesfarmacuticapromovidapeloiodo(I3-). Umsistemaemfluxodelinhanicaempregandoumeletrododepratarecoberto com iodeto de mercrio foi utilizado para a determinao da quantidade de iodeto (I-) produzida na oxidao de acetilcistena116.Ocido1,2-naftoquinona-4-sulfnico(XV)freqentemente empregado para a determinao de princpios ativos em frmacos, substncias que contm dois tomos de hidrognio reativos sob um tomo de nitrognio, ou carbono, como aminas primrias e secundrias, aminocidos (equao 3). Seu emprego tem sido amplo na determinao de frmacos2,10,101. Introduo 32(XV)OOSO3H+ HNR1R2OONR1R2(eq. 3) Umprocedimentoparaadeterminaodeacetilcistenabaseadona suareaocomNQSfoiempregadoparaadeterminaoindiretadeacetilcistena emformulaesfarmacuticas.DepoisdareaodaacetilcistenacomNQS,esse foireduzidoacido1,2-dihidroxinaftaleno-4-sulfnicoqueapresentafluorescncia (excitao em 318 nm e emisso em 480 nm)117. O procedimento fluorimtrico proposto foi tambm aplicado para quantificao de captopril, D-penicilamina em formulaes farmacuticas. Areaodeoxidaodaacetilcistena110com[Fe(CN)6]3-levaa formaodo[Fe(CN)6]4-.Aquantidadeformadaproporcionalconcentraodo analito que pode ser monitorada pela reao com Fe(III) formando o azul da Prssia, queabsorveem700nm2.EssasreaesforamempregadasporLENARCZUKet al.118nodesenvolvimentodeumoptossensorquepermitiuadeterminaoindireta de mercapto-compostos, como a acetilcistena. CARMOetal.119desenvolveramumeletrodocompastadecarbono contendo nitroprussiato de ferro(II) imobilizado. A determinao de acetilcistena em formulaesfarmacuticasfoirealizadaacorrentegeradapeloparredox [Fe2+(CN)5NO]/[Fe3+(CN)5NO], empregando a tcnica de voltametria cclica. Asaminasprimriasreagemrapidamentecomo-ftalaldedona presenadeumtiolpararesultarem1-alquiltio-2-alquil-substitudasisoindols,que apresentamfluorescncia120.Adeterminaoespectrofotomtricadoprodutoda reaoentreacetilcistena,o-ftalaldedoeisoleucinaapH9,5possibilitoua determinaodeacetilcistenaemformulaesfarmacuticas121.Estamesma reaoqumicafoiutilizadaparaodesenvolvimentodeumsistemadeanlisepor injeoemfluxoparaadeterminaodeacetilcistenaemformulaes farmacuticas com deteco espectrofotomtrica122. Introduo 33AcapacidadedaacetilcistenaformarcomplexoscomPd2+emmeio cidoqueabsorveem380nmfoiexploradaparaodesenvolvimentodedois sistemasemfluxo,umemlinhanicaeoutrocominjeodoreagente,para quantificao de acetilcistena123. Introduo 34 TABELA 1.7 Figuras de mrito de procedimentos analticos para a determinao de acetilcistena ReagentesDetecoCurva analtica / mol L-1 Limite de deteco Referncia Fe(III)-ferronaEspectrofotomtrica4,5 a 80x10-6 2,3x10-6113 OPA e isoleucinaEspectrofotomtrica3,06x10-6 a 3,0x10-4 9,1x10-7 121 Fe(III)-ferrozinaEspectrofotomtrica1,22x10-7 a 3,67x10-5ND 111 [Fe(II)(CN)5NO]Voltametria cclica9,6 10-4 a 1,4 10-21,9 10-4 119 NQSFluorimtrica3,06x10-6 a 2,7x10-5ND 117 NQS= cido 1,2-naftoquinona-4-sulfnico; OPA: o-ftalaldedo. TABELA 1.8 Figura de mrito de sistema em fluxo para a determinao de acetilcistena em formulaes farmacuticas ReagentesDetecoCurva analtica / mol L-1 Freqncia amostragem Referncia Fe(III)Espectrofotomtrica3,5x10-6 a 4,3x10-460 112 KMnO4 Quimiluminescente3,06x10-7 a 1,22x10-5120 114 I3- Potenciomtrica4,0x10-6 e 1,0x10-340 116 Pd2+ Espectrofotomtricoa 5,0x10-5 a 5,0x10-245 123 aempregando a configurao de picos duplos. 2 Objetivos Objetivos 36 Os objetivos desse trabalho de tese compreendem o desenvolvimento de sistemas de anlise por injeo em fluxo com deteco espectrofotomtrica para adeterminaodefurosemida,paracetamoleacetilcistenaemformulaes farmacuticas.Nestessistemasemfluxo,asubstituiodosreagentesdealta toxicidade, a reduo do volume e/ou tratamento em fluxo dos resduos gerados nos sistemas em fluxo sero implementados. 3 Parte Experimental Parte Experimental 383.1Instrumentao 3.1.1 Balana analtica Todasaspesagensforamfeitasutilizando-seumabalanaanaltica Mettler, modelo H10 com preciso de 0,1 mg. 3.1.2 pHmetro AsdeterminaesdepHdassoluesforamfeitasemumpHmetro Orion, modelo EA 940. 3.1.3 Eletrodo de vidro combinado AsdeterminaesdepHforamrealizadasusando-seumeletrodode vidro combinado Analion, modelo V 620, com um eletrodo de referncia de Ag/AgCl, contendo uma soluo de KCl 3,0 mol L-1. 3.1.4 Espectrofotmetros NossistemasFIAdesenvolvidosnestetrabalhoasdeterminaes espectrofotomtricasforamrealizadascomumespectrofotmetrodefeixesimples Femto, modelo 435 com cela de fluxo de vidro Hellma (caminho ptico de 1,00 cm e volume de 180 L). Asdemaismedidasespectrofotomtricasforamfeitasemum espectrofotmetrocomarranjolineardediodosHewlettPackard,modelo8452A, empregando-se uma cubeta de quartzo de 1,00 cm de caminho ptico. Parte Experimental 393.1.5 Bomba peristltica Para propulso das solues de reagentes e amostras utilizou-se uma bomba peristltica Ismatec IPC-12 (Zurique, Sua) com 12 canais. 3.1.6 Tubos e conexes Foramempregadostuboseconexesdepolietilenocomdimetro internode0,8mmparaconfecodasbobinasreacionais,alasdeamostrageme linhasdeconduodassoluesderefernciaeamostras.Ostubosdepropulso utilizados foram de Tygon de diferentes dimetros internos. 3.1.7 Injetor comutador As amostras e solues de referncia foram introduzidas no sistema de fluxo utilizando-se um duplo injetor comutador manual 2-3-2 construdo em acrlico23. 3.1.8 Registrador Para registros dos sinais obtidos utilizou-se um registrador x-t, de dois canais Cole Parmer (Niles, IL, USA), modelo 1202.0000. 3.1.9 Cmara de irradiao ultravioleta Umaminilmpadafluorescenteultravioletacom28Wdepotnciae reator eletrnico a