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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA

TESE DE DOUTORADO

AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA INDUÇÃO DE RESPOSTA IMUNE CONTRA ANTÍGENOS

RECOMBINANTES DE Leishmania chagasi

LENITA RAMIRES DOS SANTOS

Salvador-Bahia 2007

PPGIm

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS - GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA

TESE DE DOUTORADO




Orientador: Dr. Geraldo Gileno de Sá Oliveira

Salvador-Bahia 2007

Tese apresentada ao Curso de Pós-graduação em Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia para obtenção do grau de Doutor em Imunologia

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Folha de Aprovação

COMISSÃO EXAMINADORA

Dra Fabíola Cardillo -Pesquisadora Associada - CPqGM-FIOCRUZ-BA ______________________________________________________________________________ Dr. Alan McBride – Pesquisador Visitante - CPqGM-FIOCRUZ-BA ______________________________________________________________________________ Dr. Nicolaus Albert Borges Schriefer – Professor da Pós-graduação em Imunologia – UFBA ______________________________________________________________________________ Dr. Roberto José Meyer Nascimento – Professor da Pós-graduação em Imunologia - UFBA ______________________________________________________________________________ Dr. Geraldo Gileno de Sá Oliveira – Pesquisador Associado– CPqGM-FIOCRUZ-BA- Orientador

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Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Patologia e Bio-Intervenção (LPBI) do

Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz (CpqGM) - BA da Fundação Instituto Oswaldo Cruz com recursos financeiros do Programa RENORBIO (MCT), Programa INOVABIO

(MCT), Programa Milênio Vacinas, FAPESB, CAPES e CNPQ.

v

Dedico esta tese a minha família, que

soube compreender mais este período

de ausência...

Em especial à Julinha, que não se

cansa de dizer:

“Você tá demorando Madrinha!”

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AGRADECIMENTOS

Os meus sinceros agradecimentos ao Dr. Geraldo Gileno de Sá Oliveira, por ter confiado a mim uma parte tão importante de seu trabalho. Agradeço também por sua orientação e pelo exemplo de conduta profissional.

Ao Dr. Lain Carlos Pontes de Carvalho, pelo acompanhamento ao longo de todo o trabalho e pelas sugestões e correções nas etapas finais de elaboração da tese. Agradeço também ao Dr. Washington Luís Conrado dos Santos, pelas sugestões e incentivos, científicos e culturais, durante todo o período em que estive no laboratório.

Ao Dr. Edmilson Domingos da Silva (Biomanguinhos-RJ), pela produção e purificação de parte das proteínas recombinantes utilizadas neste estudo.

Ao Dr. Oswaldo Pompílio (CPqAM-PE), pelas subclonagens de dois clones utilizados e sequenciamento dos insertos dos plasmídeos utilizados neste trabalho.

Ao Dr. Yuri Pepe (Departamento de Física-UFBA), pela elaboração do aparelho de eletroporação e à Dra. Stella Maria Barrouin-Mello (UFBA), que esteve à frente na confecção deste equipamento e nos primeiros experimentos utilizando eletroporação em nosso laboratório.

A Ricardo Fraga, Cristiane Pinheiro, Patrícia Meira, Elivani Sacramento, Andréa Mendes, Diego Moura e Valdir Cerqueira pelo apoio na execução de diversos experimentos aqui descritos.

Aos demais colegas do LPBI, pelo agradável convívio e incentivo, em especial à Micely Hermida e Cláudia Santana, companheiras de defesa.

Ao Programa de Pós-graduação em Imunologia da Universidade Federal da Bahia, pelos ensinamentos proporcionados e apoio administrativo e à Fundação Instituto Oswaldo Cruz, por disponibilizar toda sua infra-estrutura possibilitando a execução deste trabalho.

A todas as pessoas que participaram da realização deste estudo através de inúmeras contribuições técnicas e administrativas:

Ana Maria Fiscina (Biblioteca-CPqGM) Fabienne Petitinga de Paiva (Biotério-CPqGM) Rejane Márcia Chaves de Menezes (Biotério-CPqGM) José Fernando Oliveira Costa (LETI-CPqGM) Matheus Santos de Sá (LETI-CPqGM) Sérgio Vasconcelos (LPBI-CPqGM) Em especial, meus agradecimentos à Gyselle Baccan e Sebastião Martins de Souza Neto, pelo incentivo, sugestões e apoio em todas as etapas deste trabalho e pela compreensão, amizade e amor incondicionais.

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RESUMO

AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA INDUÇÃO DE RESPOSTA IMUNE CONTRA ANTÍGENOS RECOMBINANTES DE Leishmania chagasi. Lenita Ramires dos Santos. A leishmaniose visceral (LV), causada pela L. infantum/L. chagasi, é uma doença infecciosa na qual o cão doméstico é considerado o principal reservatório do agente causal. Uma vacina canina efetiva pode contribuir para o controle da LV tanto no homem como no cão. Nosso grupo de pesquisas está avaliando um painel de proteínas recombinantes de formas amastigotas de L.

chagasi a fim de identificar potenciais candidatos à vacina. Neste estudo, foram testados diferentes protocolos de imunização objetivando induzir uma resposta imune específica tipo Th1 para tais moléculas candidatas. Grupos de camundongos BALB/c foram injetados 3 vezes em intervalos de 3 semanas, com (a) salina, (b) plasmídeo pBK-CMV vazio, (c) pBK-CMV-Lc9, (d) pBK-CMV-Lc13, (e) pBK-CMV-Lc14, (f) pBK-CMV-Lc18; (g) uma mistura de plasmídeos ou (h) uma mistura de plasmídeos associado a pcDNA.3.1-sc-muIL-12. Os plasmídeos foram injetados por via intramuscular seguida de eletroporação. Três outros grupos de animais foram introduzidos no estudo e injetados com (i) uma mistura de plasmídeos por via intramuscular sem eletroporação e (j) Lc9 recombinante (rLc9) associada à saponina e (k) plasmídeo pBK-CMV-Lc9 nas duas primeiras séries de injeções e rLc9/saponina na terceira e última injeção. Após a terceira série de injeções, a produção de anticorpos específicos da classe IgG, assim como a produção de anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2a, foram avaliadas por ELISA e a resposta imune celular foi avaliada em termos de resposta proliferativa e produção de citocinas (IFN-γ, IL-4, IL-5). No dia 30 e 90 após a terceira série de injeções, os grupos de camundongos de (a) a (i) foram desafiados pela injeção de L. chagasi e a carga parasitária no baço foi determinada, respectivamente. Os grupos injetados com pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14 produziram anticorpos específicos da subclasse IgG, com predomínio de anticorpos da subclasse IgG2a. A indução de resposta imune celular foi evidenciada após o desafio com promastigotas de L.infantum/chagasi pela produção específica de IFN-γ no grupo injetado com pBK-CMV-Lc9 (12,77 ng/mL, p < 0,05) e resposta proliferativa em células do grupo de animais injetado com pBK-CMV-Lc14. A produção de IFN-γ foi induzida também após a injeção de uma mistura de plasmídeos associado a pcDNA3.1-scmu-IL-12 após estimulação in vitro com rLc9, antes (0,32 ng/mL, p < 0,05) e após o desafio (7,7 ng/mL, p < 0,05). Entretanto, em apenas dois de seis animais do grupo injetado com pBK-CMV-Lc9 houve diminuição da carga parasitária no baço. Provavelmente a intensidade da resposta imune específica induzida não foi forte o suficiente para induzir proteção nos animais imunizados. O protocolo de imunização com a administração inicial de DNA plasmideal pBK-CMV-Lc9 seguida de reforço com a proteína rLc9/saponina foi capaz de aumentar a intensidade da resposta imune específica. Novos experimentos serão realizados a fim de explorar a capacidade protetora induzida por Lc9, neste e em outros esquemas de imunização. Palavras-chave: vacina, leishmaniose visceral, cão

viii

ABSTRACT EVALUATION OF PROTOCOLS TO INDUCE IMMUNE RESPONSE AGAINST RECOMBINANT ANTIGENS OF Leishmania chagasi. Lenita Ramires Dos Santos. Visceral leishmaniasis (VL) caused by L. infantum/L. chagasi is an infectious disease which dogs are considered the major reservoir of the causal agent. An effective canine vaccine might contribute to human and dog VL control. Our group is evaluating a panel of L. chagasi amastigote recombinant proteins to identify potential vaccine candidate antigens. In this study we tested different immunization protocols aiming to induce a specific Th1 immune response. Groups of BALB/c mice were injected 3 times, at 3-week intervals, with (a) saline; (b) pBK-CMV empty plasmid; (c) pBK-CMV-Lc9, (d) pBK-CMV-Lc13, (e) pBK-CMV-Lc14, (f) pBK-CMV-Lc18; (g) a pool of plasmid or (h) a pool of plasmid associated to pcDNA.3.1-sc-muIL-12. Plasmid DNA was injected through intramuscular injections followed by electroporation. In addition, three another groups of animals were used: (i) pool of plasmid without electroporation; (j) Lc9 recombinant protein (rLc9) associated to saponin as adjuvant and (k) pBK-CMV-Lc9 twice and once with rLc9 (protein). After immunization, specific total IgG as well as IgG1 and IgG2a isotypes were measure by ELISA and cellular immune response was assessed by lymphoproliferative assays and cytokine production (IFN-γ, IL-4, IL-5). At 30 and 90 days after immunization, mice from groups (a) to (i) were challenged by L. chagasi and the splenic parasite burden was determined, respectively. The mice immunized with pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc14 and pBK-CMV-Lc18 developed specific total IgG production with, almost, exclusively IgG2a isotype. The immune cellular immune response was showed after challenge with L.

infantum/chagasi by specific IFN-γ production in the group that was injected with pBK-CMV-Lc9 (7.7 ng/mL, p < 0.05) and proliferative response by splenic cells of pBK-CMV-Lc14 group (p < 0.05). The IFN-γ production was induced also after injection of a pool of plasmid in association with pcDNA3.1-scmu-IL-12 and in vitro stimulation with rLc9, before (0.32 ng/mL, p < 0.05) and after challenge (12.77 ng/mL, p < 0.05). However, only in two out of six mice of the pBK-CMV-Lc9 injected group a reduction of spleen parasite burden was observed. Probably, the specific immune response intensity was not strong enough to induce protection in the immunized animals. The DNA primer/protein booster immunization protocol was able to increase the intensity of the Th1 specific immune response to rLc9 protein. Experiments are underway to assess a possible protective response to these and others immunization schedules.

Key-words: vaccine, visceral leishmaniasis, canine

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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1,

reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais injetados com plasmídeos

recombinantes administrados isoladamente..................................................................................68


reativos a Lc9 ou Lc14, de animais injetados com plasmídeos recombinantes administrados

isoladamente..................................................................................................................................70

FIGURA 3. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG, reativos a Lc18, de animais

injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente.........................................71

FIGURA 4. Avaliação de proliferação celular e produção de IFN-γ por células esplênicas de

camundongos injetados com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, após

cultivo com concanavalina A (Con A) ou extrato bruto de L. chagasi..........................................74


camundongos injetados com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, após

cultivo com proteínas recombinantes de L. chagasi.......................................................................76

FIGURA 6. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1

reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi em animais previamente injetados com

plasmídeos recombinantes administrados isoladamente, .após a infecção por L. chagasi.............78

FIGURA 7. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG reativos a proteínas

recombinantes de L. chagasi em animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes

administrados isoladamente, .após a infecção por L.

chagasi............................................................................................................................................80

FIGURA 8. Avaliação de resposta proliferativa e produção de citocinas por células esplênicas de

camundongos, após injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de concanavalina A ou

extrato bruto de L. chagasi, em animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes

administrados isoladamente............................................................................................................83

x

FIGURA 9. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de

camundongos previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente,

após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc9 recombinante.......................86



após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc14 recombinante.....................89



após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc18 recombinante.....................92

FIGURA 12. Avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por L. chagasi em

animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente.......94


reativos ao extrato bruto de antígenos de promastigotas de L. chagasi, de animais injetados com

um pool de plasmídeos recombinantes...........................................................................................96


camundongos, injetados com um pool de plasmídeos recombinantes, após cultivo com

concanavalina A (Con A) ou extrato bruto de antígenos de L. chagasi.........................................99


camundongos injetados com um pool de plasmídeos recombinantes, após cultivo com proteínas

recombinantes de L. chagasi........................................................................................................102


reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais previamente injetados com um

pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção de promastigotas de L. chagasi...104


camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados

pela injeção de promastigotas de L. chagasi, após cultivo com concanavalina A (Con A) ou

extrato bruto de antígenos de L. chagasi......................................................................................107

xi



pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc9 recombinante.........................109



pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc14 recombinante.......................113



pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc18 recombinante.......................114

FIGURA 21. Avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por L. chagasi. em

animais previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes...............................116


reativos a extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais injetados com DNA plasmideal e

proteína recombinante Lc9...........................................................................................................118


reativos a Lc9, de animais injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9..........120


camundongos, injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9, após cultivo com

concanavalina A (Con A).............................................................................................................122


camundongos, injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9, após cultivo com

Lc9................................................................................................................................................126

xii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Preparações antigênicas de moléculas candidatas a vacina, avaliadas no modelo

murino de leishmaniose visceral experimental...............................................................................38

TABELA 2. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos

cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos

submetidos a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes administrados

isoladamente..........................................................................................................................................72


cultivados na presença ou na ausência de proteínas recombinantes de L. chagasi, obtidos de grupos de

camundongos submetidos a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes administrados

isoladamente..........................................................................................................................................75


de cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de

camundongos submetidos previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes,

administrados isoladamente, e desafiados com promastigotas de L. chagasi......................................82


cultivados com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos

previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e

desafiados com promastigotas de L. chagasi........................................................................................85


cultivados com Lc14 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos

previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e

desafiados com promastigotas de L. chagasi........................................................................................88


cultivados com Lc18 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a

três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e desafiados com

promastigotas de L. chagasi..................................................................................................................91

xiii


cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos

submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos........................................................98


de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos,

cultivados na presença ou na ausência de proteínas recombinantes de L. chagasi.............................101

TABELA 10. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por

esplenócitos cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de

camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos e desafiados com

promastigotas de L. chagasi................................................................................................................106


esplenócitos cultivados em meio de cultura ou meio de cultura com Lc9 em diferentes concentrações,

obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos,

e desafiados com promastigotas de L. chagasi....................................................................................111


esplenócitos cultivados em meio de cultura ou meio de cultura com Lc14 ou Lc18 em diferentes

concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool

de plasmídeos, e desafiados com promastigotas de L. chagasi...........................................................112


esplenócitos cultivados com concanavalina A, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três

séries de injeções com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9..............................................121


esplenócitos cultivados com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos .de grupos de camundongos

submetidos a três séries de injeções com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9..................125

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS

DMSO Dimetilsufóxido

cDNA ácido desoxirribonucleico complementar

DNA ácido desoxirribonucleico

CpG citosina-fosfato-guanosina

Con A concanavalina A

D.O. densidade óptica

EDTA ácido etilenodiaminotetracético

EL eletroporação

ELISA ensaio imunoenzimático

GM-CSF fator estimulador de colôniasde granulócitos e monócitos

IFN-γ interferon gama

Ig imunoglobulina

IL interleucina

IPTG isopropil-β−D-thiogalactosídeo

HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-etano- sulfônico

LB Luria Bertani

LC leishmaniose cutânea

LCD leishmaniose cutânea difusa

xv

LMC leishmaniose mucocutânea

LV leishmaniose visceral

LVZ leishmaniose visceral zoonótica

LCPK leishmaniose cutânea pós-kalazar

MDP muramil dipeptídeo

MHC complexo principal de histocompatibilidade

MS Ministério da Saúde

MPL monofosforil lipídico

NK natural killer

PMSF fluoreto de fenilmetilsufonila

RPMI 1640 Meio 1640 do Instituto Roswell Park Memorial

SBF soro bovino fetal

SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida

TAE tris-acetato-EDTA

Th T helper

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

TMB tetrametilbenzidina

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SUMÁRIO

RESUMO ABSTRACT LISTA DE ABREVIATURAS 1. INTRODUÇÃO E RELEVÂNCIA ........................................................................................ 19 2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................................................... 22

2.1. Leishmaniose – Aspectos Gerais ..................................................................................... 22 2.2. Leishmaniose Visceral ...................................................................................................... 24

2.2.1. Aspectos Epidemiológicos .......................................................................................... 24

2.2.2. Aspectos Clínicos da Leishmaniose Visceral.............................................................. 26

Em Seres Humanos................................................................................................................ 26

Em Cães................................................................................................................................. 27

2.2.3. A Resposta Imune na Leishmaniose Visceral ............................................................. 28

Aspectos Gerais da Imunidade na Leishmaniose .................................................................. 28

Leishmaniose Visceral Humana ............................................................................................ 30

Leishmaniose Visceral Canina .............................................................................................. 33

Leishmaniose Visceral Experimental – O Modelo Murino................................................... 34

2.3. O Controle da Leishmaniose Visceral ............................................................................ 36

2.3.1. O Desenvolvimento de Vacinas .................................................................................. 37

3. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 46

3.1. Objetivo Geral .................................................................................................................... 46 3.2. Objetivos específicos.......................................................................................................... 46

4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................... 47

4.1 Antígenos ............................................................................................................................ 47

4.1.1 Produção de extrato bruto de antígenos de Leishmania chagasi.................................. 47

xvii

4.1.2 Produção de antígenos recombinantes de Leishmania chagasi.................................... 49

Cultivo de E. coli e indução da produção de antígenos recombinantes ................................ 49

Purificação de antígenos recombinantes de L. chagasi ......................................................... 51

Obtenção de proteínas solúveis ou sob a forma de corpúsculos de inclusão ........................ 51

Purificação em coluna de afinidade....................................................................................... 52

4.1.3 Obtenção de plasmídeos para imunização.................................................................... 54

Purificação de plasmídeos pBK-CMV com insertos de antígenos recombinantes de L.

chagasi e de plasmídeocodificando IL-12 murina - pcDNA3.1-scmu-IL12......................... 55

4.2 Animais ............................................................................................................................... 57

4.3 Imunização ......................................................................................................................... 57

4.4. Infecção com Leishmania chagasi ................................................................................... 59

4.5. Avaliação da resposta imune ........................................................................................... 59

4.5.1 Avaliação da resposta imune humoral.......................................................................... 59

Mensuração de anticorpos da classe IgG por ELISA............................................................ 60

Avaliação de anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2a por ELISA....................................... 61

4.5.2 Avaliação da resposta imune celular ............................................................................ 62

Avaliação de proliferação celular .......................................................................................... 62

ELISA para quantificação de IFN-γ, IL-4 e IL-5 de camundongo........................................ 64

4.6. Avaliação de proteção contra desafio com Leishmania chagasi ................................... 66

4.6.1. Determinação de carga parasitária............................................................................... 66

4.7. Análise estatística.............................................................................................................. 67 5. RESULTADOS ........................................................................................................................ 68

5.1. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados com plasmídeos codificando proteínas de L. chagasi ............................................................................................................ 68

5.1.1. Avaliação da resposta imune humoral......................................................................... 68

xviii

5.1.3. Avaliação da resposta imune humoral após desafio com L. chagasi .......................... 79

5.1.4. Avaliação da resposta imune celular após desafio com L infantum/chagasi .............. 83

5.1.5. Avaliação de proteção contra infecção por L. chagasi. ............................................... 95

5.2. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados com uma combinação de plasmídeos codificando proteínas de L. chagasi ................................................................... 97

5.2.1. Avaliação da resposta imune humoral......................................................................... 97

5.2.2. Avaliação da resposta imune celular ........................................................................... 99

5.2.3. Avaliação da resposta imune humoral após desafio com L.infantum/chagasi .......... 105

5.2.4. Avaliação da resposta imune celular após desafio com L. chagasi........................... 107

5.2.5. Avaliação de proteção contra infecção por L. chagasi .............................................. 117

5.3. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados DNA plasmideal seguido por proteína recombinante – DNA primer/proteína booster.............................................. 119

5.3.1. Avaliação da resposta imune humoral....................................................................... 119

5.3.2. Avaliação da resposta imune celular ......................................................................... 123

6. DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 129 7. CONCLUSÕES...................................................................................................................... 142 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 143 9. APÊNDICES .......................................................................................................................... 164

9.1. Apêndice A – Desenho experimental............................................................................... 165

9.2. Apêndice B - Foto do Aparelho eletroporador............................................................166

9.3. Apêndice C – Mapa qualitativo das respostas imunes aos diferentes imunógenos em

ensaios com e sem desafio com L. chagasi..........................................................................................167

9.4. Apêndice D – Manuscrito – primeira versão – a ser submetido posteriormente para publicação em revista científica indexada....................................................................................168

19

1. INTRODUÇÃO E RELEVÂNCIA

Doenças parasitárias causadas por protozoários constituem um dos maiores problemas em

saúde pública no mundo. Várias das doenças causadas por estes microorganismos são as maiores

causas de mortalidade e de morbidade em países tropicais, principalmente naqueles considerados

em desenvolvimento.

A leishmaniose visceral é uma doença causada por parasitos protozoários do gênero

Leishmania. Em sua forma clássica, a doença caracteriza-se pelo comprometimento de órgãos

internos como o fígado e o baço de indivíduos infectados, a partir da disseminação do parasito

(EVANS et al., 1985; de BEER et al., 1991). É uma das formas mais graves de leishmaniose,

sendo fatal quando não tratada.

Em todo o mundo estima-se que 500.000 mil casos de leishmaniose visceral sejam

registrados anualmente (World Health Organization - WHO, 2002). No Brasil, onde a

leishmaniose visceral é causada pela L. infantum/chagasi, a doença era considerada típicamente

de ambientes rurais. Atualmente, há um grande aumento no número de casos registrados em

várias regiões do país, inclusive em áreas urbanas e suburbanas de grandes cidades (COSTA et

al., 1990; JERONIMO et al., 1994; MARZOCHI et al., 1994).

Na forma zoonótica da leishmaniose visceral, o cão doméstico é o principal reservatório

do agente causal (DEANE & DEANE, 1954; LAINSON et al., 1987; MORENO-ALVAR et al.,

2002). O elevado parasitismo na pele de cães infectados, possivelmente mesmo sem apresentação

de sinais característicos da doença, propicia a infecção de insetos vetores e, consequentemente, a

transmissão para o homem (MOLINA et al., 1994).

A estratégia de controle da leishmaniose visceral zoonótica adotada pelo Ministério da

Saúde do Brasil, compreende pelo menos quatro medidas. São elas: o diagnóstico e tratamento de

casos humanos da doença, atividades de educação em saúde, controle do inseto vetor com

borrifação de inseticidas e a identificação e eliminação de cães errantes ou com diagnóstico

positivo de infecção por Leishmania (BRASIL, 2003). No entanto, essas medidas não têm sido

sistematicamente realizadas e por um tempo suficientemente longo e, possivelmente por isso, não

apresentam a eficácia necessária ao controle da doença. Isso ocorre, em parte, porque tais

20

medidas são de difícil execução e de alto custo, o que implicaria em um maior investimento de

recursos na área de Saúde Pública.

A eliminação de cães infectados, identificados por inquérito sorológico, como medida

efetiva no programa de controle da leishmaniose visceral zoonótica, tem sido questionada

(DIETZE et al., 1997; ASHFORD et al., 1998; COURTENAY et al., 2002). Inclusive, tal medida

não é bem aceita pela comunidade, o que dificulta, em parte, sua implementação. No entanto, há

um consenso geral de que o controle da infecção canina pode reduzir a prevalência da doença

humana em áreas endêmicas para leishmaniose visceral. Uma alternativa proposta para alcançar

este controle seria o desenvolvimento de uma vacina efetiva contra a leishmaniose visceral canina

(TESH, 1995; DYE, 1996). Como no Brasil o uso de medicamentos para o tratamento da

leishmaniose visceral não é recomendado para o cão (BRASIL, 2003), a imunoprofilaxia canina

atenderia interesses tanto na área de Saúde Pública como em Medicina Veterinária.

O desenvolvimento de uma vacina para o cão é vantajoso por vários motivos.

Economicamente, o desenvolvimento de uma vacina canina é extremamente viável. O custo e o

tempo necessário para o desenvolvimento de uma vacina para o cão seriam menor que para uma

vacina para seres humanos. A experiência no país com programas de vacinação animal, como o

da vacina anti-rábica canina, é bem sucedida, com campanhas de vacinação de ampla

abrangência. Além disso, uma vacina para o cão teria grande aceitação pela comunidade em áreas

endêmicas, pois evitaria o sacrifício dos animais, como proposto atualmente.

Visando o desenvolvimento de uma vacina contra a leishmaniose visceral canina, nosso

grupo de pesquisas vem trabalhando na identificação, produção e análise de moléculas candidatas

a componentes de uma vacina, quer seja, antígenos de Leishmania, como também moléculas

imunomoduladoras, como citocinas caninas. Assim, considerando que hospedeiros vertebrados

infectados por Leishmania apresentam a forma intracelular do parasito e que a indução da

resposta imune específica ocorre para antígenos expressos neste estágio, uma biblioteca de cDNA

de formas amastigotas de L. infantum/chagasi foi confeccionada por um dos pesquisadores de

nosso grupo (TEIXEIRA et al., 2007), com o objetivo de identificar antígenos em potencial para

o desenvolvimento de uma vacina. Clones desta biblioteca, reativos a amostras de soro de cães

naturalmente infectados, foram selecionados e as proteínas recombinantes correspondentes foram

produzidas, sendo que algumas delas já estão em fase de avaliação. Em experimentos iniciais,

dois destes antígenos, denominados Lc9 e Lc13, foram administrados em cães saudáveis em

21

associação ao adjuvante saponina. Os animais injetados com esta preparação montaram uma

resposta imune humoral específica intensa, mas, nestes experimentos, a indução de resposta

imune celular não foi observada (SANTOS, 2007), resultado este contrário ao tipo de resposta

imune específica que se espera induzir para obtenção de proteção contra infecção por Leishmania

em cães. No cão, a capacidade de controlar a infecção e apresentar resistência ao estabelecimento

da doença, como vista em animais infectados assintomáticos, parece ser dependente da indução

de uma resposta imune celular específica do tipo Th1 (PINELLI et al., 1994; PINELLI et al.,

1995; RHALEM et al., 1999a). As células Th1 estão envolvidas, principalmente, na produção de

IFN-γ e conseqüentemente, na ativação de macrófagos e destruição de parasitos intracelulares.

Em uma etapa posterior, em experimentos realizados em camundongos, a injeção da

proteína recombinante Lc9 induziu uma resposta imune específica, humoral e celular, com

característica tipicamente Th2. Assim, o uso de diferentes adjuvantes foi avaliado na tentativa de

se obter uma reversão do perfil de resposta imune induzida para Lc9. De cinco adjuvantes

testados, apenas a combinação do antígeno recombinante à saponina foi capaz de levar a uma

resposta específica contra Lc9 com produção mista de anticorpos IgG das subclasses IgG2a e

IgG1 e das citocinas IFN-γ e IL-5 (FRAGA, 2007).

Diante destas observações, foi proposto no presente trabalho a avaliação de diferentes

protocolos de imunização, em camundongos, para a definição de condições adequadas para a

indução de resposta imune do tipo Th1 à moléculas candidatas a componentes de uma vacina

contra leishmaniose visceral canina. A imunização realizada com DNA plasmideal, como

demonstrado em diversos estudos, tende a induzir uma resposta imune com tais características

(LECLERC et al., 1997; ROMAN et al., 1997; ZANGH et al., 2001). Assim, os protocolos

utilizados tiveram como base a injeção de plasmídeos como vetores dos cDNAs correspondentes

a quatro antígenos de L. infantum/chagasi, denominados Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18. As injeções

consistiram da administração de plasmídeos isoladamente, de uma mistura de plasmídeos

associados ou não a plasmídeocodificando IL-12 murina e, ainda, de uma injeção inicial de DNA

plasmideal seguida de reforço com a proteína recombinante.

22

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Leishmaniose – Aspectos Gerais

As leishmanioses, um grupo de doenças infecto-parasitárias de amplo espectro clínico

causadas por protozoários do gênero Leishmania (ROSS, 1903), família Trypanosomatidae,

ordem Kinetoplastidae, compreendem enfermidades de crescente impacto e preocupação

mundial. Estão distribuídas em diversas regiões do mundo e são consideradas endêmicas em pelo

menos 88 países, dentre os quais 72 são países em desenvolvimento (DESJEUX, 1996). Estima-

se uma prevalência mundial de 12 milhões de casos e uma população com risco de infecção de

quase 350 milhões de indivíduos (WHO, 2002). O aumento crescente no número de casos de

leishmanioses é decorrente, em parte, de rápidas mudanças ambientais e do comportamento

humano observadas nos últimos anos e se relaciona com a atual situação sócio-econômica dos

países afetados (DESJEUX, 1996; WHO, 2002).

O impacto real das leishmanioses como um problema em saúde pública é considerado

subestimado (ASHFORD et al., 1991; DESJEUX, 1996). Enquanto a estimativa de ocorrência

mundial de leishmanioses está em torno de 1,5 a 2 milhões de novos casos por ano, apenas

aproximadamente 600.000 casos são registrados oficialmente. Em parte, isso se deve à falta de

obrigatoriedade de notificação, que ocorre em apenas 48 países dentre os 88 considerados

endêmicos (DESJEUX, 1996). Casos de doença não diagnosticados, muitas vezes pela falta de

acesso aos serviços de saúde, também contribuem para esta subestimativa.

As leishmanioses caracterizam-se pelo amplo espectro de manifestações clínicas

apresentadas pelos indivíduos em decorrência da infecção pelo parasito. As formas clínicas

apresentadas e a magnitude da doença são dependentes de muitos fatores, entre eles, a espécie do

parasito e a imunocompetência do hospedeiro. Comumente, a doença vem sendo dividida em 5

principais síndromes clínicas: a leishmaniose cutânea (LC), a leishmaniose cutânea difusa (LCD),

a leishmaniose mucocutânea (LMC), a leishmaniose visceral (LV) e a leishmaniose cutânea pós-

kalazar (LCPK). Até o presente, pelo menos 20 espécies de Leishmania foram identificadas como

sendo agentes etiológicos de infecções em seres humanos (GRIMALDI et al., 1989; ASHFORD,

2000; DESJEUX, 2004).

23

A transmissão do parasito ocorre através da picada dos insetos vetores, flebotomíneos

pertencentes ao gênero Phlebotomus e Lutzomyia, encontrados no Velho e no Novo Mundo,

respectivamente (LAINSON et al., 1977). O parasito apresenta ciclo de vida digenético, o que

confere à Leishmania uma significante diversidade antigênica (FONG & CHANG, 1982;

CHANG & FONG, 1982; HANDMAN et al., 1984). No hospedeiro invertebrado, formas

promastigotas flageladas são encontradas no intestino médio de insetos fêmeas enquanto que, em

hospedeiros vertebrados, formas aflageladas e intracelulares obrigatórias, as amastigotas,

sobrevivem e replicam-se nos fagolissosomos de células do sistema fagocítico mononuclear

(BARD, 1989). O ciclo de transmissão se inicia quando fêmeas de flebotomíneos ingerem formas

amastigotas de Leishmania de um hospedeiro vertebrado infectado. Formas infectivas,

denominadas metacíclicas, diferenciam-se no trato digestivo do inseto vetor e são regurgitadas

intradermicamente no local da picada em novos hospedeiros durante novo repasto sangüíneo

(BARD, 1989; WALTERS et al., 1989a e b; WALTERS et al., 1993).

O ciclo de transmissão do parasito é geralmente zoonótico, mas pode apresentar-se como

antroponótico em focos restritos (DESJEUX, 1991 revisto em ASHFORD et al., 1996). A

infecção por Leishmania no ser humano é considerada incidental para a maior parte das espécies

e o homem assume o papel de hospedeiro secundário (DESJEUX, 1991; DEDET, 1992;

ASHFORD, 1996). No entanto, seres humanos infectados efetuam o papel de hospedeiro

reservatório, em casos como na leishmaniose cutânea causada por L. tropica e na doença visceral

por L. donovani, que ocorrem no Velho Mundo (DESJEUX, 1991; BERMAN, 2006). Os animais

considerados como hospedeiros reservatórios podem incluir roedores, canídeos e outros

mamíferos (ASHFORD, 1996). O cão doméstico, em muitos casos, é considerado também como

hospedeiro secundário, mas desempenha um papel importante como reservatório, contribuindo

para a manutenção do ciclo de transmissão de um dos agentes etiológicos de uma das formas

mais severas de leishmaniose, a leishmaniose visceral zoonótica (LVZ; DEANE & DEANE,

1954; ASHFORD, 1996).

24

2.2. Leishmaniose Visceral

2.2.1. Aspectos Epidemiológicos

A leishmaniose visceral, também conhecida como calazar na Ásia e na África, é causada

por parasitos do complexo Leishmania donovani, o qual compreende talvez três espécies,

Leishmania (Leishmania) donovani, Leishmania (L.) infantum, e Leishmania (L.) chagasi

(LAINSON et al., 1987). Posteriormente, avaliações fenotípicas e genotípicas dentro do

complexo L. donovani foram realizadas em diferentes níveis, bioquímicos e moleculares,

(MOMEN et al., 1987; RIOUX et al., 1990; CUPOLILLO et al., 1994; MAURÍCIO et al.1999;

MAURÍCIO et al., 2000). Os resultados das avaliações sugerem que as espécies L. infantum e L.

chagasi são indistinguíveis entre si e, por isso, alguns autores passaram a considerá-las como

sendo a mesma espécie e a utilizar os nomes como sinônimos. No transcorrer desta revisão, a

denominação L. infantum/chagasi será utilizada como referência para L. infantum e L. chagasi,

embora o nome L. infantum seja considerado o mais apropriado (MAURICIO et al., 2000;

DANTAS-TORRES, 2006a) uma vez que sua descrição em 1908, por NICOLLE, antecede a de

L. chagasi (CUNHA & CHAGAS, 1937).

A distribuição da LV no mundo é mais restrita quando comparada às outras formas de

leishmaniose. Em todo mundo, cerca de 90% dos casos são registrados em apenas cinco países,

sendo eles, Índia, Nepal, Sudão, Bangladesh e Brasil. Segundo a Organização Mundial da Saúde,

a incidência anual está em torno de 500.000 casos e mais de 200 milhões de indivíduos estão sob

risco de infecção (WHO, 2002). A taxa de mortalidade pode chegar a valores próximos ou

mesmo maiores que 10% do número de casos em tratamento, mesmo em regiões com baixa

incidência de LV, como no estado de São Paulo, assim como em outras regiões do Brasil

(JERÔNIMO et al., 1994; EVANS et al 1992; CVE, 2006).

No Brasil, a média anual de casos registrados entre os anos de 1994 e 2002 foi de 3.156

casos, com uma incidência de dois casos a cada 100.000 habitantes. Na última década,

aproximadamente noventa por cento (90%) dos casos de LV foram registrados na região

Nordeste do país, acometendo principalmente os estados da Bahia, Maranhão, Ceará e Piauí. No

entanto, esta situação vem se modificando. O número de casos registrados na Região Nordeste,

no período entre os anos de 2000 e 2002, apresentou uma redução percentual para setenta e sete

25

por cento, o que não resulta propriamente em um controle regional, visto que, neste mesmo

período ocorreu uma expansão territorial da doença, com surtos ocorridos em outras áreas, como

Rio de Janeiro - RJ, Belo Horizonte - MG, Araçatuba - SP, Santarém - PA e Corumbá – MS

(BRASIL, 2003).

Vários são os fatores que contribuem para o avanço da LV no Brasil e no mundo. As

transformações ambientais, as quais incluem fatores eco-epidemiológicos e sócio-econômicos,

aparecem como uma das principais causas (DESJEUX, 1996). Estas transformações têm sido

provocadas por processos migratórios humanos mais intensos, desmatamento de florestas nativas,

crescimento desordenado das cidades e consequentemente baixas condições econômicas e sociais

da população. Além disso, outros fatores podem alterar a susceptibilidade do hospedeiro, como as

mudanças na resposta imune em indivíduos infectados com o vírus da imunodeficiência adquirida

humana (HIV) (BRASIL, 2003; DESJEUX, 1996; GUERRA, 2004; ALVAR et al., 1997).

Na LVZ o cão doméstico participa da manutenção do ciclo de transmissão do parasito,

atuando como hospedeiro reservatório de fundamental importância (DEANE & DEANE, 1954;

LAINSON & SHAW, 1987; MARZOCHI et al. 1994; VIEIRA & COELHO, 1998; MORENO &

ALVAR, 2002). A LV canina chega a apresentar quase 12% de incidência anual, como registrado

recentemente no município de Jequié, no nordeste da Bahia (MOREIRA et al., 2003). Uma alta

taxa de cães infectados tem sido encontrada em regiões endêmicas para LV humana, com valores

que variam em torno de 40%, a depender do teste utilizado para avaliação, seja pela pesquisa de

anticorpos específicos ou por análise microscópica da presença do parasito em culturas (EVANS

et al., 1992; VIEIRA & COELHO, 1998; CORTADA et al., 2004; DANTAS-TORRES, 2006b).

Com a introdução de técnicas mais sensíveis, como a detecção de DNA por PCR, um número

maior de animais infectados, mesmo sem qualquer sinal da doença, pode ser encontrado, com

taxas de positividade de até 80% (ASHFORD et al., 1995; BERRAHAL, et al., 1996;

QUINNELL, et al., 2001; CORTES et al., 2004). Estes valores reforçam a LV canina como

sendo um grave problema em Saúde Pública, uma vez que tanto animais sintomáticos como

assintomáticos podem participar do ciclo de transmissão para o inseto vetor (ABRANCHES et

al., 1991; VEXENAT et al., 1993).

26

2.2.2. Aspectos Clínicos da Leishmaniose Visceral

Em Seres Humanos

A infecção por L. infantum/chagasi em humanos não necessariamente resulta em

manifestações clínicas, uma vez que existe diferença de susceptibilidade entre os insivíduos. Isso

ocorre, em parte, na dependência de fatores genéticos, status imunológico e comprometimento

nutricional de cada indivíduo (CERF et al., 1987; GRADONI & GRAMICIA, 1994). Assim, a

infecção pode resultar em casos assintomáticos ou oligossintomáticos (BADARÓ et al., 1986a;

GAMA et al., 2004) que podem evoluir para cura clínica espontaneamente ou para a doença

plenamente manifesta, a chamada forma clássica da doença.

Na forma clássica da doença, seja em crianças, jovens ou adultos, as manifestações

clínicas são: por febre irregular, palidez discreta e letargia, sendo o estado geral do paciente

preservado. Na medida em que a doença evolui, outros sinais e sintomas são comumente

encontrados, como por exemplo, hepatoesplenomegalia, perda de peso e anorexia, que variam de

grau moderado a acentuado, seguidos por sintomas ou sinais menos frequentes como

sangramentos espontâneos, icterícia e edema (HO et al., 1982; EVANS et al., 1985; de BEER et

al., 1991). Dados laboratoriais geralmente indicam um grau elevado de pancitopenia (anemia,

plaquetopenia e leucopenia), hipoalbuminemia e hipergamaglobulinemia. Infecções secundárias

pulmonares (broncopneumonias) em pacientes hospitalizados levam ao agravamento dos casos e

contribuem para a mortalidade. O óbito, que ocorre frequentemente em crianças menores de 5

anos e em indivíduos com idade avançada, está associado a carga parasitária elevada, anemia

profunda, excessiva perda de massa corporal e distúrbios digestivos com episódios de vômitos

durante o curso de tratamento (SEAMAN et al., 1996).

O tratamento da LV humana é realizado mais comumente com antimoniais pentavalentes.

Apesar de existirem duas diferentes formulações no mercado, apenas o antimoniato de N-metil

glucamina, o Glucantime, está disponível em nosso país, e é a droga de primeira escolha para o

tratamento da LV humana. O surgimento de resistência a este medicamento já foi relatado em

algumas regiões do mundo, como na Índia e no Sudão (JACKSON et al., 1990; GROGL et al.,

1992), mas, no Brasil, não existe nenhuma documentação acerca da presença de cepas de L.

infantum/chagasi resistentes in vitro. No Brasil, o medicamento é distribuído pelo Ministério da

Saúde, com recomendações cautelosas sobre as dosagens e tempo de tratamento utilizado

27

(BRASIL, 2003). Alternativamente o tratamento pode ser realizado com drogas como a

anfotericina B e a miltefosina, mas o uso dessas drogas é recomendado apenas em casos

especiais, como reincidivas (SUNDAR et al., 2002). Em geral, pacientes com LV respondem

bem ao tratamento com Glucantime e desenvolvem cura clínica com aparente resistência à

reinfecções (PAMPIGLIONE et al., 1975; BADARÓ et al., 1986).

Em Cães

Cães infectados com L. infantum/chagasi apresentam um amplo espectro de

manifestações clínicas. Animais infectados podem apresentar-se como assintomáticos,

oligossintomáticos ou polissintomáticos (MANCIANTI et al., 1988; ABRANCHES et al., 1991;

OLIVEIRA et al., 1993; PINELLI et al., 1994). A intensidade do parasitismo em cães pode estar

diretamente associada à gravidade do quadro clínico (BARROUIN-MELO, et al., 2004; REIS et

al., 2006).

Os sinais típicos de LV canina compreendem lesões cutâneas (80 %) - alopecia

generalizada ou localizada, descamação, eczema em focinho e orelhas, pelos opacos, ulcerações

nas orelhas, focinho, cauda e articulações; perda de peso e do apetite; linfoadenopatia localizada

ou generalizada; onicogrifose e lesões oculares (73 %); anemia; diarréia crônica; coriza e edema

das patas. Em casos avançados, são relatados: falência renal, apatia e sonolência intensas,

neuralgia, poliartrite, polimiosite, rachaduras nos cochins plantares, úlceras interdigitais e lesões

ósseas (ALMEIDA et al., 2005).

Há várias alterações bioquímicas e hematológicas em cães infectados naturalmente ou

experimentalmente com L. infantum/chagasi, algumas das quais podem estar correlacionadas ao

estado clínico do animal (REIS et al., 2006). Os achados laboratoriais incluem anemia

normocítica/normocrômica e aumento dos níveis de proteínas totais do soro, com

hipergamaglobulinemia marcante (CIARAMELLA et al., 1997; ALMEIDA et al., 2005).

No Brasil, até o presente momento não há recomendação de tratamento para LV canina

[SÃO PAULO (ESTADO) – nota técnica do MS]. As tentativas realizadas com drogas

tradicionalmente utilizadas para o tratamento de casos humanos apresentam baixa eficácia

(MANCIANTI et al., 1988; GRAMICCIA et al., 1992; BANETH & SHAW, 2002). Em muitos

casos, melhora clínica e redução do parasitismo são observados. No entanto, o tratamento é

incapaz de promover cura clínica persistente e eliminar a infectividade do cão para o inseto vetor

28

(MOLINA et al.1994, FERRER et al. 1995). Além disso, devido à ineficácia do tratamento em

cães com as drogas utilizadas para o tratamento humano, existe a possibilidade de seleção de

cepas resistentes de L. infantum/chagasi (JACKSON et al., 1990; GROGL et al., 1992; LIRA et

al., 1999; ABDO et al., 2003).

2.2.3. A Resposta Imune na Leishmaniose Visceral

Aspectos Gerais da Imunidade na Leishmaniose

Considerando-se que as Leishmania sp. são parasitas intracelulares obrigatórios em seus

hospedeiros vertebrados, a imunidade mediada por células é o principal mecanismo de defesa do

organismo, particularmente pela ação de macrófagos ativados por citocinas derivadas de células

auxiliadoras do tipo Th1. No entanto, uma resposta imune com estas características depende,

dentre outros fatores, da resposta imune inicial, seguindo-se a interação do patógeno com as

células do hospedeiro, o que pode resultar no controle ou no estabelecimento da infecção (revisto

em MULLER, 1989).

Em uma fase bastante inicial, a capacidade de um microorganismo se multiplicar no

interior de células fagocíticas pode ser, em parte, controlada geneticamente. Estudos em

camundongos mostram a participação de um gene envolvido no controle da multiplicação

parasitária, o Scl11A1 (CROKER et al., 1984; VIDAL et al., 1995). Este gene codifica uma

proteína transmembrana, altamente depende de pH, presente na superfície lissosomal, que

participa do fluxo de cátions divalentes contra um gradiente de prótons e regula a homeostase de

íons metálicos (ferro, manganês e zinco) em células de origem macrofágica/monocítica. Estudos

funcionais com Scl11A1 murino implicam seu envolvimento na ativação de macrófagos,

incluindo regulação de citocinas e quimiocinas, proteínas do complexo principal de

histocompatibilidade II (MHC classe II) e indução de óxido nítrico síntase (iNOS) (BARTON et

al., 1995; JABADO et al., 2000). Polimorfismos presentes neste gene afetam diretamente a

resistência inata do hospedeiro à infecções intracelulares. Estudos recentes em leishmaniose

visceral humana e canina, apontam para a existência de polimorfismos no gene Scl11A1 tanto no

homem como no cão, ressaltando a potencial importância de características genéticas na

susceptibilidade ou resistência à infecção na leishmaniose visceral (ALTET, 2002; MOHAMED

et al., 2004; SANCHEZ-ROBERT et al., 2005).

29

Fatores genéticos têm sido implicados com susceptibilidade ou resistência a leishmaniose

visceral não apenas na resposta imune inicial, no controle da infecção, mas também no

desenvolvimento de uma resposta imune adquirida, podendo influenciar no progresso da infecção

e no aparecimento de doença visceral propriamente dita. Neste caso, alterações funcionais em

genes que codificam proteínas relacionadas ao sistema imune, principalmente relacionados ao

complexo principal de histocompatibilidade, estariam envolvidos, mas há dados controversos em

seres humanos e ainda escassos para análise em cães (QUINNEL et al., 2003). No modelo

murino de leishmaniose visceral, genes relacionados ao MHC controlam a susceptibilidade à L.

infantum e L. donovani (BLACKWEL et al., 1980; LECLERCQ et al., 1996) e uma mutação

específica na cadeia I-A beta do MHC classe II está associada à resistência a infecção por L.

donovani (SEN & ROY, 1998). Em seres humanos, um estudo da freqüência de antígenos HLA

de classe 1 em associação à leishmaniose visceral mostrou uma associação significante apenas de

um antígeno, o HLA-A26, e prevalência em indivíduos doentes no Irã (FAGHIRI et al., 1995),

enquanto que outros estudos não apresentam qualquer associação entre alelos HLA e

susceptibilidade à leishmaniose visceral humana (MEDDEB-GARNAOUI et al. 2001;

PEACOCK et al. 2002; SINGH et al., 1997).

Já nos primeiros estágios da infecção, protozoários do gênero Leishmania são capazes de

evadir-se às barreiras imunes naturais do organismo. Alterações na constituição de proteínas na

superfície de formas infectantes de Leishmania permitem ao parasito escapar à lise mediada pelo

complemento. Exemplo disso é a super-expressão de gp63 (glicoproteína) e de longas moléculas

de LPG (lipofosfoglicanos), observada durante o desenvolvimento de promastigotas procíclicas

em promastigotas metacíclicas, ainda no interior do tubo digestivo do inseto vetor, previne a

inserção do complexo lítico C5b-C9 (MAC – complexo de ataque a membrana) na superfície do

parasito (PUNTES et al., 1990; BRITTINGHAM et al., 1995). Já no interior da célula, estas

moléculas agem impedindo a maturação do fagossomo e inibindo a ação de enzimas líticas,

presentes no lissosomo (DESJARDINS et al., 1997; DERMINE et al.,2000). Outros mecanismos

envolvem a inibição das vias de sinalização celular, a inibição da produção de óxido nítrico e de

citocinas (DESCOTEAUX, 1992; MOORE, 1993; REINER et al., 1994; PROUDFOOT, 1995;

CARRERA et al., 1996). Percebe-se que o parasita evoluiu de maneira a explorar o sistema

imune do próprio hospedeiro, modulando-o e proporcionando um ambiente favorável para o

30

estabelecimento da infecção. O desequilíbrio da relação parasita-hospedeiro seria a causa tanto da

eliminação da infecção, quanto do processo patogênico nas leishmanioses.

Leishmaniose Visceral Humana

A leishmaniose visceral humana caracteriza-se por uma deficiência da resposta imune

mediada por célula específica para a Leishmania. Neste contexto, observam-se uma diminuição

de resposta de células T, proliferação e citotoxicidade, com ausência da produção de citocinas do

tipo Th1, como interferon-gama (IFN-γ), interleucina (IL)-2 e IL-12. Indivíduos com

leishmaniose visceral, em sua forma clássica, não apresentam reatividade em resposta ao teste de

Montenegro, o qual mede uma resposta de hipersensibilidade tardia a antígenos de Leishmania

injetados na pele (HALDAR et al., 1983; HO et al., 1983; SARAN et al., 1991). Da mesma

forma, em ensaios in vitro, células do sangue periférico de indivíduos doentes são incapazes de

proliferar ou produzir IFN-γ em resposta a antígenos específicos (CARVALHO et al., 1981;

HALDAR et al., 1983; HO et al., 1983; NEOGY et al., 1988). Já o perfil imunológico observado

na maioria dos pacientes infectados assintomáticos caracteriza-se por apresentar a capacidade

linfoproliferativa e de produção de IFN-γ mantidos frente a exposição in vitro a antígenos

específicos (CARVALHO et al., 1992; HOLADAY et al., 1993a). A imunodeficiência específica

observada em indivíduos com leishmaniose visceral é revertida após tratamento terapêutico, com

o aparecimento da capacidade proliferativa, produção de citocinas do tipo Th1 e resposta positiva

ao teste intradérmico de Montenegro em um período que varia de 2 a 20 semanas (CARVALHO

et al., 1981; HALDAR et al., 1983; HO et al., 1983; HOLADAY et al., 1993).

O controle e a proteção na leishmaniose visceral é, em geral, dependente da produção de

IFN-γ, que, entre outras funções, ativa a capacidade microbicida de macrófagos infectados e

aumenta a expressão de MHC classe I e MHC classe II em células fagocíticas, regulando a

diferenciação e expansão de populações de linfócitos Th1 CD4+ e T CD8+ antígeno-específicos

(MURRAY et al., 1983a; MURRAY et al., 1983b). Dessa forma, a incapacidade de células de

indivíduos doentes em proliferar frente ao estímulo específico e de produzir IFN-γ implica

diretamente no aumento da carga parasitária e nos processos patológicos observados na

leishmaniose visceral humana. Vários são os fatores que regulam a produção de IFN-γ na

31

leishmaniose visceral, mas as citocinas IL-12 e IL-10 têm papel fundamental neste controle

(BACELLAR et al., 2000).

A interleucina 12 (IL-12) é um potente indutor de resposta celular do tipo Th1, agindo

como fator estimulador de células natural killer (NK) e fator de maturação de linfócitos T

citotóxicos e Th1, desempenhando um importante papel na indução da produção de IFN-γ por

células T e NK (KOBAYASHI et al., 1989). A IL-12 é produzida por macrófagos, monócitos,

neutrófilos e células dentríticas e, em menor escala, por linfócitos B, mediante estímulos

inflamatórios gerados por bactérias, parasitos intracelulares e fungos (TRINCHIERI et al., 2003).

Na leishmaniose visceral humana, células do sangue periférico de indivíduos na fase ativa da

doença não são capazes de produzir IL-12, subunidade p40, após estímulo in vitro com lisado de

L. donovani, mas essa produção é observada em indivíduos curados (GHALIB et al., 1995).

Além disso, a adição de IL-12 recombinante em cultura de células de indivíduos com

leishmaniose visceral induz a produção de IFN-γ e a capacidade proliferativa destas células ao

estímulo por antígenos de Leishmania, ao passo que, sua neutralização, com anticorpos

específicos anti-IL-12, em cultura de células do sangue periférico de indivíduos assintomáticos,

inibe estes mesmos efeitos do estímulo antigênico (GHALIB et al., 1995; BACELLAR et al.,

1996; BACELLAR et al., 2000).

Fatores imunossupressores que atuam em células de indivíduos com leishmaniose visceral

humana estão presentes tanto em nível celular quanto no soro de indivíduos doentes. Foi

demonstrado inicialmente, em um co-cultivo de células de um mesmo indivíduo, obtidas antes e

após o tratamento quimioterápico, que a capacidade de responder a antígenos de Leishmania,

restaurada após o tratamento, podia ser inibida na presença de células obtidas antes do tratamento

(CILLARI et al., 1988; CARVALHO et al., 1989). Dentre estes fatores estão células

imunossupressoras (T TCR γ-δ+ CD4+, T CD8+ e T CD4-CD8-), as citocinas IL-4, IL-6, IL-10 e

IL-13 e receptores solúveis de IL-4 e de IL-2 (ZWINGENBERGER et al., 1990; BARRAL-

NETTO et al., 1991; SANG et al., 1999; BABALOO et al., 2001).

A IL-10 foi inicialmente caracterizada como uma citocina produzida por células do tipo

Th2 (FIORENTINO et al., 1989). Posteriormente foi observado que sua produção ocorre em

diversos tipos celulares, inclusive por macrófagos (MOSMANN & MOORE, 1991; WILLIANS

et al., 1996; PROBST et al., 1997). Esta citocina desempenha um papel central na patogênese da

leishmaniose visceral, especialmente pela regulação negativa da resposta imune do tipo Th1,

32

predominante nos casos de resistência e cura da infecção (GHALIB et al., 1993; HOLADAY et

al., 1993b). Estas afirmações são suportadas pelas observações das funções supressoras de IL-10

exercidas sobre macrófagos, desativação e inibição das atividades leishmanicidas e supressão da

produção de IFN-γ (GAZINELLI et al., 1992).

A participação de IL-10 na leishmaniose visceral humana foi inicialmente observada a

partir da expressão de RNA mensageiro, em amostras obtidas de aspirado de linfonodo e baço de

indivíduos na fase ativa da doença, em pacientes do Sudão e da Índia (GHALIB et al., 1993;

KARP et al., 1993). Ainda nestes dois trabalhos, a análise da expressão de RNA mensageiros que

codificam IL-10 e IFN-γ, demonstrou a co-existência destas duas citocinas no tecido, o que

implicaria na supressão, mediada por IL-10, das funções macrofágicas induzidas por IFN-γ. A

produção de RNA mensageiro que codifica IL-10 e a liberação desta citocina no sobrenadante de

cultura de células também é induzida em células mononucleares do sangue periférico de

indivíduos com leishmaniose visceral quando estimuladas com antígeno de L. donovani ou L.

infantum/chagasi, respectivamente (GHALIB et al., 1993; HOLADAY et al., 1993b). Neste

mesmo contexto, ocorre ausência de proliferação e liberação de IFN-γ no sobrenadante das

culturas. Assim, a presença de IL-10, mais que a ausência de IFN-γ, seria um fator que

beneficiaria a progressão da infecção para a doença ativa. O uso de IL-10 humana recombinante

ou a sua neutralização com anticorpos monoclonais específicos resultam, in vitro, na modulação

negativa ou positiva, respectivamente, da capacidade de células mononucleares do sangue

periférico de indivíduos com leishmaniose visceral ativa, tratados ou assintomáticos, em

responder frente ao estímulo com antígenos específicos (GHALIB et al., 1993; HOLADAY et

al., 1993b; CARVALHO et al, 1994; GHALIB et al., 1995; BACELLAR et al., 2000).

A participação de IL-4 na imunosupressão e, consequentemente, na patogenicidade da

leishmaniose visceral humana ainda é questionável. Esta citocina, embora presente no soro de

indivíduos doentes (ZWINGENBERGER et al., 1990) está ausente ou é detectável em

quantidades muito baixas após em cultivo celular após estímulo específico e a neutralização de

sua atividade não implica na reversão da imunodepressão característica da leishmaniose visceral

humana (CARVALHO et al., 1994; BACELLAR et al., 2000). Apesar disso, quando a

neutralização de IL-4 ocorre simultaneamente com a de IL-10, com o uso de anticorpos

monoclonais específicos para cada uma das citocinas, o efeito de indução da capacidade

linfoproliferativa e de produção de IFN-γ ocorre sinergisticamente, mostrando o envolvimento de

33

IL-4 na modulação da resposta imune induzida na leishmaniose visceral humana (CARVALHO

et al., 1994).

A resposta imune humoral na leishmaniose visceral humana caracteriza-se pela ativação

policlonal de linfócitos B, com produção de altas concentrações de anticorpos e de complexos-

imune no soro (BEHFOROUZ et al., 1983; GALVÃO-CASTRO et al., 1984). Títulos elevados

de anticorpos específicos parecem estar relacionados mais à patogênese da doença, como uma

disfunção imunológica, que à proteção propriamente dita. Em seres humanos, a presença de

anticorpos correlaciona-se a alta parasitemia e esta produção é controlada seguindo-se ao

tratamento (MILES et al., 2005).

Leishmaniose Visceral Canina A resposta imune na leishmaniose visceral canina assemelha-se em muitos aspectos à

resposta induzida na leishmaniose visceral humana. A resposta imune específica mediada por

células, quando presente, é capaz de controlar a infecção e, assim, os animais podem permanecer

sem qualquer sinal da doença (PINELLI et al., 1994). De fato, o desenvolvimento de sinais na

leishmaniose visceral canina está associado a mudanças imunológicas que envolvem a supressão

da imunidade celular, como a ausência de resposta linfoproliferativa a antígenos de Leishmania

de LUNA et al., 1999; MORENO et al., 1999), incapacidade de produção de IFN-γ e de IL-2

(SANTOS-GOMES et al., 2002), além de uma diminuição no número de células T no sangue

periférico de animais naturalmente infectados, predominantemente de células T CD4+

(BOURDOISEAU et al., 1997; MORENO et al., 1999).

Os mecanismos efetores implicados na resistência e no controle da infecção por L.

donovani e L. infantum/chagasi no cão são dependentes do estabelecimento de uma resposta

específica de células Th1, com elevada produção de IFN-γ, IL-2 e TNF-alfa (PINELLI et al.,

1994; PINELLI et al., 1995). O desenvolvimento deste tipo de resposta celular no cão também

está associado à ação de IL-12 (OKANO et al., 1997; SALDARRIAGA et al., 2006). O papel da

IL-12 na indução e manutenção de uma resposta Th1 na leishmaniose visceral canina têm sido

recentemente investigado. Células de sangue periférico de cães com leishmaniose visceral ativa

respondem ao tratamento in vitro com esta citocina pelo aumento na expressão de RNA

mensageiro para IFN-γ e pela detecção desta citocina no sobrenadante de cultura de células (dos

SANTOS et al., 2004; STRAUSS-AYALI, 2005). Além disso, a produção de IFN-γ induzida por

34

IL-12, na presença de antígenos de Leishmania, ocorre com maior intensidade, o que sugere que

seu uso como agente imunoterápico é factível (STRAUSS-AYALI, 2005).

O envolvimento de citocinas produzidas por células Th2 na susceptibilidade à

leishmaniose visceral canina ainda não está esclarecido. Os dados implicam para a existência de

uma resposta mista Th1/Th2, mesmo em cães assintomáticos, embora IFN-γ e IL-2 predominem

nesta situação (SANTOS-GOMES et al., 2002; CHAMIZO et al., 2005). No entanto, comumente

observa-se a expressão de RNA mensageiro para IL-10 e IL-4 em células derivadas de animais

com sinais clínicos de leishmaniose visceral, após estimulação inespecífica com mitógenos ou

com antígenos de Leishmania (PINELLI et al., 1999; QUINNELL et al., 2001). Entretanto, em

cães experimentalmente infectados por L. infantum, a expressão de RNA para IL-10 não têm sido

geralmente detectada, ocorrendo apenas excepcionalmente em períodos mais tardios de infecção

(SANTOS-GOMES et al., 2002; RAFATI et al., 2005).

Em relação à resposta imune humoral na leishmaniose visceral canina, assim como em

seres humanos, está claro que infecções sintomáticas estão associadas à produção elevada de

anticorpos específicos IgG, IgE e IgA (INIESTIA et al., 2005; REIS et al., 2006). Entretanto,

apesar de um grande número de publicações na área de investigação da cinética e distribuição das

subclasses de imunoglobulinas G, seguindo-se às infecções natural ou experimental em cães, não

há um padrão consistente que aponte para um predomínio de subclasses diferentes de

imunoglobulinas associado ao desenvolvimento ou não de sintomas (DEPLAZES et al., 1995;

BOURDOUISEAU et al., 1997; LEANDRO et al., 2001; REIS et al., 2006).

Leishmaniose Visceral Experimental – O Modelo Murino

A maior parte do que se sabe hoje sobre os mecanismos envolvidos na estimulação e

manutenção da resposta imune nas leishmanioses é derivado de estudos realizados em

camundongos. No entanto, a infecção experimental de camundongos de diversas linhagens, seja

com L. donovani ou L. infantum/chagasi, não reproduz o curso fatal da infecção, a exemplo do

que ocorre na leishmaniose visceral humana e canina (KAYE, 2004). Ao contrário, no modelo

murino de leishmaniose visceral experimental, mesmo animais geneticamente susceptíveis à

infecção são capazes de controlar o parasitismo nos diferentes órgãos afetados (WILSON et al.,

35

1996). Assim, este padrão de controle assemelha-se a infecção subclínica observada em alguns

indíviduos das espécies humana e canina (OLIVEIRA et al., 1993; BADARÓ et al., 1996).

O crescimento parasitário diferencial, no fígado e no baço, observada após infecção

murina com L donovani ou L. infantum/chagasi é uma característica marcante da leishmaniose

visceral experimental e não depende da via nem da forma parasitária utilizada (AHMED et al.,

2003). No fígado ocorre uma multiplicação rápida do parasito durante as quatro primeiras

semanas após a infecção, com posterior resolução espontânea por volta da oitava semana. Por

outro lado, no baço e na medula óssea, o que se observa é que a replicação do parasito se inicia

em um momento mais tardio e permanece em níveis baixos durante toda a vida do animal

(WILSON et al., 1996; MELBY et al., 1998).

O desenvolvimento de imunidade mediada por células é necessária para o controle da

infecção por L donovani ou L. infantum/chagasi e, neste contexto, células T são fundamentais

(SKOV et al., 1974; REZAI et al., 1980; MURRAY et al., 1987). A participação tanto de células

T CD4+ como de células T CD8+ foi demonstrada em experimentos em que anticorpos

neutralizadores anti-CD4 e anti-CD8 foram utilizados (STERN et al., 1988). Estas células

participam principalmente pela produção de fatores solúveis que medeiam as ações ativadoras

e/ou imunossupressoras de diversas outras células. A célula T CD4+ é a principal produtora de

IFN-γ (STERN et al., 1988). No entanto, clones de células T CD8+ se desenvolvem no baço de

animais infectados e, além de exibir atividade citotóxica in vitro contra antígenos de L. donovani,

produzem RNA mensageiro para IFN-γ, TNF-α e quimiocinas C-C (TZAGOSIS et al., 2003).

A formação de granulomas no fígado coincide com o início da resolução da infecção neste

órgão, a qual também coincide com a produção de IFN-γ (SQUIRES et al., 1989). Na fase inicial

de replicação do parasito, a produção de IFN-γ é inibida, pelo menos em parte, por TGF-β

(WILSON et al., 1998). Interessantemente, IFN-γ é produzido, em cultura, por esplenócitos de

animais infectados e, no entanto, os parasitos sobrevivem no baço (MELBY et al., 2001).

No modelo murino de leishmaniose visceral experimental, ao contrário do que se observa

na leishmaniose cutânea, não há uma dicotomia clara de células do tipo Th1 e Th2, associadas à

resistência e proteção ou à susceptibilidade, respectivamente. Seja no fígado ou no baço, as

citocinas IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6 e IL-10 são produzidas concomitantemente (KAYE et al., 1991;

MIRALLES et al., 1994; WILSON et al., 1996; MELBY et al., 2001). Assim, a relação entre

resistência ou susceptibilidade e produção de citocinas não está completamente definida. De

36

qualquer forma, assim como ocorre em seres humanos, a IL-10, mais do que IL-4, parece estar

envolvida na progressão da doença (MURRAY et al., 2002) e, junto com TGF-β, pode contribuir

para a supressão da produção de IFN-γ (WILSON et al., 1998). Por outro lado, a produção de IL-

12, direta ou indiretamente, pela indução da produção de IFN-γ, está associada ao controle da

infecção (MELBY et al., 2001).

O tipo e a intensidade de resposta imune humoral específica e o controle da infecção

experimental por Leishmania em camundongos apresentam clara correlação. Em um trabalho

recente foi demonstrado que, o tamanho da lesão causada por L. major, em camundongos

BALB/c normais e deficientes de imunoglobulina, foi modulada na dependência da existência ou

não de anticorpos específicos contra Leishmania, com um aumento considerável no tamanho da

lesão quando anticorpos estavam presentes (MILES et al., 2005). No entanto, a produção de

anticorpos específicos de subclasses distintas está relacionada à citocinas produzidas por células

tipo Th1 ou Th2. Assim, elevação na produção de IgG1 e IgE é fortemente regulada por IL-4,

enquanto que, a produção de anticorpos IgG2a é regulada por citocinas produzidas por células

TCD4+ tipo Th1, como IFN-γ (HEINZEL et al., 1989). Estas subclasses estão frequentemente

presentes no soro dos animais durante a progressão ou controle da infecção, respectivamente.

Dessa forma, a produção e avaliação de anticorpos na leishmaniose murina deve ser considerada

com cautela.

2.3. O Controle da Leishmaniose Visceral

As medidas para o controle da leishmaniose visceral, preconizadas pela Organização

Mundial de Saúde e adotadas pelo Ministério da Saúde do Brasil, envolvem: (i) vigilância

epidemiológica, tanto para seres humanos como para cães, para que se possa realizar o

diagnóstico precoce e o tratamento adequado de casos humanos da doença e a eliminação de cães

identificados como infectados; (ii) combate ao inseto vetor através do uso de inseticida e (iii)

atividades em educação em saúde (BRASIL, 2006). Estas medidas têm se mostrado pouco

efetivas no controle da leishmaniose visceral zoonótica, em parte pela falta de integração entre as

estratégias utilizadas. Além disso, tais medidas são frequentemente descontinuadas, devido ao

alto custo e laboriosidade de execução (TESH, 1995; COURTENAY et al., 2002).

37

Dentre as medidas aplicadas ao controle da leishmaniose visceral, a contribuição efetiva

da eliminação de cães domésticos infectados e animais errantes de áreas endêmicas, tem sido

bastante questionada (DIETZE et al., 1997; ASHFORD, et al. 1998). Alguns fatores estão

relacionados ao insucesso desta medida, como a baixa sensibilidade dos métodos diagnósticos

empregados (EVANS et al., 1990; ASHFORD et al., 1995; BERRAHAL et al., 1996) e o longo

intervalo de tempo entre a realização dos testes e a remoção dos animais (BRAGA et al., 1998).

Uma medida alternativa para o controle da leishmaniose visceral zoonótica seria a

prevenção da infecção canina e/ou da transmissão do parasito do cão para o inseto vetor. Assim, a

imunoprofilaxia contra a leishmaniose visceral, obtida pelo uso de uma vacina efetiva para uso

canino, culminaria, provavelmente, com a redução da incidência de LV humana (TESH, 1995;

DYE, 1996; MORENO & ALVAR, 2002). A busca de imunógenos potenciais, candidatos a

vacina, tem se mostrado bastante promissora e tem resultado em diversos trabalhos nesta área,

tanto no modelo murino de leishmaniose visceral como também, em estágios mais avançados, em

cães experimentalmente infectados.

2.3.1. O Desenvolvimento de Vacinas

Apesar do extenso número de publicações acerca de avaliações de moléculas candidatas a

vacina a imunoprofilaxia contra as leishmanioses ainda é um desafio. Até o presente, apenas um

esquema de vacinação profilática contra a leishmaniose cutânea está em prática no Uzbequistão,

o qual faz uso de um processo antigo de indução de resposta imune protetora, conhecido como

“leishmanização” (GAFUROV, 1999; revisto em KHAMESIPOUR et al., 2006). Nesta vacina,

uma mistura de promastigotas virulentas de L. major, vivas e mortas, isoladas a partir de uma

lesão ativa, é administrada em crianças em idade escolar meses antes do início do ciclo de

transmissão da doença. Apesar de eficaz, este é um método que apresenta inúmeros riscos,

principalmente diante da atual situação frente a infecções por HIV.

Nenhuma vacina contra a leishmaniose visceral humana está em uso, em rotina, em

qualquer parte do mundo. Nas últimas décadas, várias moléculas, frações ou subunidades, têm

sido identificadas como potenciais candidatas a componentes de uma vacina contra leishmaniose

visceral a partir de avaliações em modelos experimentais (Tabela 1). A preparação que se

encontra em estágio mais avançado de investigação, inclusive já comercializada no Brasil, faz

uso de uma preparação com uma fração protéica denominada ligante de manose-fucose (FML),

38

purificada a partir de isolados de L. donovani (PALATNIK et al., 1994). Esta preparação,

proposta para uso em cães, já foi avaliada experimentalmente em diversos modelos e também em

um estudo de fase III, com cães naturalmente expostos à infecção (DA SILVA et al., 2000). No

entanto, diante de algumas incompreensões acerca da real efetividade desta vacina na eliminação

ou redução da transmissão do parasito do cão para seres humanos, e assim, sobre o controle da

leishmaniose visceral humana, o Ministério da Saúde do Brasil não autorizou seu uso como

medida de controle da leishmaniose visceral (BRASIL, 2003). Assim, novos experimentos foram

realizados na tentativa de solucionar esta questão (NOGUEIRA et al., 2005).

Diversos outros estudos de vacinação em cães foram realizados desde a última década.

Além de preparações com frações purificadas de Leishmania, como a descrito anteriormente,

tentativas do uso de parasitos mortos e antígenos recombinantes, em uma série de associações

com adjuvantes compatíveis com o uso em cães, foram feitas objetivando induzir uma resposta

imune protetora contra leishmaniose visceral canina (revisto em BARBIERI, 2006). O uso de

promastigotas de L. brasiliensis e de L. infantum, mortas pelo uso de mertiolate ou pelo calor e

associadas à BCG como adjuvante, apresentaram resultados promissores em avaliações de fase I

e de fase II (MAYRINK et al., 1996, MOHEBALI et al., 2004), mas avaliações de campo não

resultaram em proteção ou não foram ainda realizadas (GENARO et al., 1996).

A capacidade de indução de resposta imune protetora em cães tem sido observada também

para antígenos secretados em cultura de promastigotas de L. infantum, LiESAp, administrado em

associação ao adjuvante muramil dipeptídeo (MDP). Para esta combinação, uma eficácia

protetora de 100% foi registrada após infecção experimental e esta proteção foi correlacionada

com a indução de uma resposta imune específica tipo Th1, forte e duradoura (LEMERSE et al.,

2005). Uma publicação recente apresenta os resultados da avaliação desta preparação em cães

naturalmente expostos em uma área endêmica no sul da França, com uma taxa de proteção em

torno de 92% num período de dois anos de acompanhamento (LEMERSE et al., 2007). A

administração de preparações multicomponentes de antígenos recombinantes de L. infantum

(proteína Q + BCG) e de L. infantum/chagasi [TSA, LeIF e LmSTI1 em associação à

monofosforil lipídico (MPL)] resultou em alto índice de proteção (90%) contra infecção

experimental em cães e capacidade de indução de anticorpos de isotipo IgG2a, respectivamente

(MOLANO et al., 2003; FUGIWARA et al., 2005). Esta mesma preparação, quando avaliada em

campo, não resultou em proteção significativa dos animais (GRADONI et al., 2005). Vale

39

ressaltar também que, em estudos anteriores, a produção de anticorpos neutralizadores contra

proteínas de promastigotas de L. infantum em cães imunizados não resultou em proteção nos

animais vacinados (OGUNKOLADE et al., 1988; DUNAN et al., 1989), o que reforça a

associação entre resistência e imunidade mediada por células.

40

Tabela 1. Preparações antigênicas de moléculas candidatas a vacina, avaliadas no modelo murino de leishmaniose visceral experimental. Referência preparação Resultado (redução carga parasitária e citocinas) 1ª geração STREIT et al., 2001 Infecção subclínica (injeção

cutânea alta dose) promastigotas vivas L. chagasi

fígado (75%) Produção de IFN-γ, IL-4 e IL-10 Não induz TGF-β

BRETON et al.,2005 L. tarentolae promastigotas vivas

fígado (80%) e baço (85%) - 30 dias após desafio Produção de IFN-γ IL-4 não detectável

2ª geração WILSON et al., 1995d Lcr1/Adjuvante de Freund fígado (40%) e baço (37,5%)

proliferação e produção de IFN-γ (pt recomb. em células animais infectados)

SANTOS et al., 1999 FML/rIL-12 FML/BCG FML/saponina R ou Quil A ou QS21

fígado – preparação FML/QS21 (79,2%) Acs IgG1 = IgG2a (maioria) DTHa em todas combinações exceto BCG, sendo QS21 + elevado IFN-γ apenas FML/QS21 FML/IL-12 - falha em reduzir carga parasitária

STAGER et al., 2000 rHASPB1 fígado e baço (até 90% após 80 dias infecção) Resposta de Ac exclusivamente IgG1 com proliferação celular e produção de IFN-γ preferencialmente por T CD8+ e ausência de IL-4

DOLE et al.,2000 rORFF/rBT1 81% (baço e fígado) Títulos elevados de anticorpos específicos e proliferação de esplenócitos.

PARAGUAI-DE-SOUZA et al., 2001

gp36 purificada/saponina (R) fígado (68,1%) Produção de Ac específicos IgG1 e IgG2a Proliferação células linfonodo e resposta de DTH

GHOSH et al., 2001a rA2 fígado - 89% Produção de Ac específicos IgG1 e IgG2a Proliferação de esplenócitos e produção elevada de IFN-γ. Animais imunizados e grupo controle apresentam produção de IL-4 a níveis similares

TONUI et al., 2003 LPG + BCG Induz resposta Th1 mas não protege

TEWARY et al., 2004a rORFF/ODN* fígado e baço (84%) Produção anticorpos IgG1 e IgG2a Proliferação celular e aumento produção de IFN-γ sem alteração níveis IL-4 em relação aos controles

TEWARY et al., 2006 rORFF + pIL-12 82-83% fígado e no baço Ac IgG1 e IgG2a específicos rORFF com proliferação celular, predomínio de IFN-γ e baixa produção IL-4

ROSA et al., 2007 rLIRIC1 e LIRIC2 baço 50,4% para LiRic1 e 66,9% para LiRic2 Induz proliferação celular e IFN-γ. Diminuição produção IL-10 e IL-4 após estímulo in vitro.

Forte participação células T CD4+

continuação

41

Referência preparação Resultado (redução carga parasitária e citocinas)

3ª. geração

MELBY et al., 2000 “biblioteca” de cDNA amastigota

baço até 1000x - 4 semanas após o desafio Produção de IFN-γ elevada Produção de IL-4 e IL-10 não detectadas

GHOSH et al., 2001b A2 DNA 65% fígado Produção de Ac específicos IgG1 e IgG2a Proliferação celular e produção de IFN-γ. Produção de IL-4 não difere dos controles.

MARQUES-DA-SILVA et al., 2005

p36 (LACK) DNA Não houve proteção no fígado e no baço Produção concomitante de IFN-γ e IL-10

TEWARY et al., 2005 rORFF/alum ORFF-DNA ORFF-DNA primer / rORFF/alum booster

fígado e baço (DNA e DNA/pt) em torno de 75-80% Ac IgG2a > IgG1, proliferação celular e produção de IFN-γ IL-4 produção mínima

AGUILAR-BE et al., 2005 rNH36/saponina NH36-DNA

fígado: 79% (NH36/sap) e 88% (NH36-DNA) Ac específicos IgG1 e IgG2a. (fraca) Reação de DTH e aumento de 2-5x T CD4+

produtoras de IFN-γ (NH36-DNA)

DONDJI et al.,2005 LACK-DNA primer

LACK-Vaccinia virus booster

baço (9-30x), fígado (6-9x), linfonodo (144-244x). Produção de IFN-γ, TNF-alfa e IL-10 (IFN-γ > IL-10)

RAFATI et al., 2006 cpa-DNA/cpb-DNA primer (2x) seguido por rCPA e rCPB booster

(Montanide 720 e ODN)

fígado e baço (proteção completa) Predomínio Ac IgG2a Produção de IFN-γ e IL-5

CARTER et al., 2007 γ-GCS DNA fígado (44%) Ac IgG1 e IgG2a Produção de IFN-γ similar aos controles

a DTH – reação de hipersensibilidade do tipo tardia bODN – oligonucleotídeos CpG não-metilados

Vacinas de DNA Contra Leishmaniose Visceral

A imunização com moléculas de DNA capazes de expressar proteínas recombinantes in

vivo é uma tecnologia recente que vem sendo amplamente avaliada como ferramenta para induzir

a prevenção ou para o tratamento de doenças infecciosas (WAHREN, 1996; ALARCON et al.,

1999). De um modo geral, neste sistema, os cDNAs de antígenos candidatos à vacina são

clonados em vetores de expressão, apropriados para células de mamíferos, que utilizam a

maquinaria da célula hospedeira necessária para a expressão do gene ou do fragmento do gene de

interesse. Estes vetores podem ser injetados diretamente na pele ou no músculo e, rapidamente,

são internalizados pelas células locais, onde, após translocação para o núcleo, ocorre a transcrição

42

do RNA mensageiro e, posteriormente, a produção da proteína recombinante (WOLFF &

BUDKER, 2005). Assim, após processamento por células apresentadoras de antígenos e

apresentação via moléculas do MHC, na dependência das características imunogênicas da

proteína, ocorre a indução de uma resposta imune específica (TANG et al., 1992).

A magnitude e o perfil da resposta imune induzida após injeção de DNA plasmideal são

dependentes de fatores relacionados ao antígeno produzido, a características específicas do vetor

carreador do gene, e, ainda, da via de administração utilizada. Estudos baseados em avaliação das

subclasses de anticorpos e padrão de citocinas têm demonstrado que a resposta imune induzida

após injeção intramuscular com DNA plasmideal é preferencialmente do tipo Th1. Este perfil de

resposta imune foi observado, inicialmente, em camundongos imunizados com

plasmídeocodificando a proteína β-galactosidase, nos quais ocorre uma produção acentuada de

anticorpos de isotipo IgG2a e secreção de IFN-γ por células T CD4+, mas não a secreção de IL-4

ou IL-5. Um padrão inverso, com produção de anticorpos de isotipo IgG1 e secreção de citocinas

tipo Th2, foi encontrado quando a mesma proteína foi administrada em salina ou hidróxido de

alumínio como adjuvante (RAZ et al., 1996). Credita-se a capacidade imunoestimulatória da

injeção com DNA a sequências repetitivas de nucleotídeos presentes na molécula de plasmídeo.

Estas sequências consistem de dinucleotídeos não-metilados de citosina-fosfato-guanosina (CpG)

que podem diretamente estimular células do sistema imune (HALPERN et al., 1996; KLINMAN

et al., 1997; LECLERC et al., 1997).

O primeiro estudo em que foi feita a avaliação de um candidato a vacina sob a forma de

DNA contra leishmaniose foi publicado há pouco mais de 10 anos (XU & LIEW, 1994). Neste

trabalho foi registrado que a injeção intramuscular de um plasmídeo, capaz de expressar em

células eucarióticas o gene gp63, induziu uma forte resposta imune tipo Th1 em camundongos,

assim como, uma significante proteção contra infecção por L. major. Subseqüentemente, vários

foram os relatos de moléculas candidatas a vacina contra leishmaniose cutânea administradas sob

a forma de DNA (GURUNATHAN et al., 1997; SJOLANDER et al., 1998; RAFATI et al.,

2001; MENDEZ et al., 2001; SEREZANI et al., 2002; DUMONTEIL et al., 2003; IBORRA et

al., 2003; CAMPBEL et al., 2003). A mesma abordagem, para avaliação de moléculas candidatas

a uma vacina contra a leishmaniose visceral, tem sido recentemente explorada (Tabela 1).

As proteínas recombinantes A2 (amastigote-specific), ORFF (open read frame F), NH36

(nucleoside hidrolase 36) e CPA/CPB (cisteína proteases), produzidas in vivo após injeção de

43

plasmídeos recombinantes, foram capazes de induzir a produção de anticorpos específicos de

isotipo IgG2a, proliferação celular e produção de IFN-γ em camundongos BALB/c,

características típicas de uma resposta imune predominantemente do tipo Th1. A resposta obtida

para cada uma destas proteínas foi associada a diversos níveis de proteção contra a infecção,

tanto no fígado como no baço dos animais desafiados (GHOSH et al., 2001; SUKUMARAN et

al., 2003; AGUILAR-BE et al., 2005; RAFATI et al., 2006). Há apenas três relatos na literatura

onde a injeção com plasmídeo recombinante não foi capaz de induzir proteção contra

Leishmania. Dois destes registros mostram que a administração de proteína LACK sob a forma

de DNA apesar de altamente imunogênica, com perfil claro de resposta imune tipo Th1, não

conferiu proteção em camundongos BALB/c, quer seja contra L. donovani ou L.

infantum/chagasi (MELBY et al., 2001; MARQUES-DA-SILVA et al., 2005), apesar de sua

eficácia no controle de lesões cutâneas induzidas por L. major (GURUNATHAN et al., 1997). O

terceiro registro é de um caso em que uma resposta imune tipo Th2, induzida pela proteína Meta

1, não pode ser revertida para Th1 mesmo quando a injeção com plasmídeo recombinante foi

utilizada (SEREZANI et al., 2002).

Até o presente, pelo menos três avaliações de possíveis candidatos a componentes de uma

vacina de DNA contra a leishmaniose visceral foram realizadas no modelo canino de infecção

experimental. Uma preparação com 10 diferentes cDNAs (H2A, H2B, H1, H3, H4, p36 – LACK,

PSA-2, TSA, STI1 e ARP-1) de L. donovani, todos sob a forma de plasmídeo, foram utilizados

em um protocolo de imunização e posterior desafio com L. donovani (SALDARRIAGA et al.,

2006). Nos outros dois estudos foram avaliados protocolos de imunização heteróloga, nos quais a

primeira injeção foi realizada com plasmídeos capazes de codificar a proteína LACK ou as

cisteínas proteínases CPA e CPB de L. infantum/chagasi e, posteriomente, um reforço feito com

o vírus vaccinia capaz de expressar a proteína LACK e a administração das cisteínas proteínases

recombinantes, respectivamente. (RAMIRO et al., 2003; RAFATI et al., 2005).

O protocolo de administração de LACK-DNA (plasmídeo seguido de vírus vaccinia), e

posterior desafio com L. infantum/chagasi, conferiu proteção em 60% dos animais vacinados,

acompanhados durante um período de 17 meses (RAMIRO et al., 2003). Proteção contra o

desafio com L. infantum, em cães, também foi observada após imunização com DNAcodificando

cisteínas proteínases seguido de reforço com as proteínas recombinantes. Neste estudo, células

mononucleares de sangue periférico de animais imunizados apresentaram uma capacidade

44

proliferativa específica e produção de RNA mensageiro para IFN-γ elevada quando comparados

aos animais do grupo controle não vacinados. Também o perfil da produção de anticorpos e a

capacidade de responder ao teste intradérmico de Montenegro foram diferentes entre os grupos,

com aumento de IgG2a e reação positiva no grupo imunizado. Além disso, após o desafio com L.

infantum/chagasi, parasitos foram identificados apenas em material da medula óssea do grupo

controle não imunizado (RAFATI et al, 2005). Uma resposta imune com as características

descritas acima, também foi observada após a administração da preparação multicomponente em

cães (SALDARRIAGA et al., 2006). Neste estudo, o controle da multiplicação do parasito nos

linfonodos drenantes ocorreu, nos animais imunizados, após o desafio por L. infantum/chagasi

logo na fase inicial da infecção, mas não foi capaz de impedir a disseminação para outros órgãos.

Avaliações de fase III para preparações baseadas em imunização com DNA plasmideal não foram

realizadas até o momento.

Dentre as várias estratégias utilizadas para identificação de antígenos com potencial para

uso em uma vacina, a busca por antígenos que ocorrem no estágio intracelular de Leishmania é

freqüentemente utilizada (WILSON et al., 1995; MELBY et al., 2000; MARTINS et al., 2006).

A forma amastigota das diversas espécies de Leishmania é a que persiste no interior de células do

sistema monofagocítico do hospedeiro vertebrado. Dessa maneira, uma resposta imune protetora

deve ser induzida para antígenos expressos neste estágio (McMAHON-PRATT et al., 1998).

Assim, nosso grupo de pesquisa confeccionou uma biblioteca de cDNA de formas amastigotas de

L. chagasi e, diferentemente de outros grupos, os antígenos identificados nesta biblioteca foram

selecionados a partir do uso de um pool de soro de cães infectados obtidos de uma área endêmica

para leishmaniose visceral (TEIXEIRA et al., 2007). Estes animais apresentavam além de

resposta imune humoral, resposta celular com DTH positivo para antígenos de L.

infantum/chagasi. Dessa forma, apenas antígenos naturalmente reconhecidos pelo sistema imune

canino foram selecionados.

Considerando-se que uma vacina canina efetiva contra a leishmaniose visceral deve, em

princípio, ser capaz de induzir uma resposta imune predominantemente celular do tipo Th1, a

identificação de antígenos, adjuvantes e/ou métodos de imunização que propiciem uma resposta

com estas características deve ser o alvo para a obtenção desta vacina. Como demonstrado em

experimentos anteriores, o uso de injeções de DNA tem levado a resultados bastante promissores

neste sentido (RAMIRO et al., 2003; RAFATI et al., 2005; SALDARRIAGA et al., 2006). Além

45

disso, a imunização com plasmídeo tem a vantagem de ser altamente estável, reprodutível e de

baixo custo. Estes fatores, somados à capacidade de indução de uma resposta imune protetora que

seja capaz de impedir e/ou controlar a infecção em cães e contribuir para a interrupção do ciclo

de transmissão do parasito para seres humanos, serão avaliados em uma vacina que venha

substituir os métodos atualmente empregados para o controle da leishmaniose visceral.

46

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Avaliar diferentes protocolos de imunização na indução de resposta imune, em

camundongos, a moléculas candidatas a componentes de uma vacina contra leishmaniose visceral

canina.

3.2. Objetivos específicos

1. Avaliar a capacidade de indução de resposta imune humoral e celular contra antígenos

recombinantes de L. chagasi, injetados em camundongos sob forma de plasmídeo,

isoladamente ou como uma combinação de plasmídeos ou, ainda, após injeção inicial com

DNA e reforço com a proteína recombinante correspondente, nos seguintes aspectos:

a) Produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1; b) Resposta proliferativa de esplenócitos após estimulação específica in vitro;

c) Produção de citocinas (IFN-gama, IL-4 e IL-5) em sobrenadantes de

esplenócitos após estimulação específica in vitro.

2. Avaliar a capacidade de antígenos recombinantes de L. chagasi, administrados

isoladamente sob a forma de plasmídeo ou como uma combinação de plasmídeos, em

induzir proteção e/ou controle contra infecção homóloga em camundongos.

47

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Antígenos

4.1.1 Produção de extrato bruto de antígenos de Leishmania chagasi

A cepa de L. chagasi MHOM/BR2000/Merivaldo2 foi utilizada para a preparação de

extrato bruto de antígenos de Leishmania. Esta cepa foi isolada inicialmente, através de punção

esplênica, de um paciente com leishmaniose visceral de uma área endêmica do município de

Jequié-Bahia (PARANHOS-SILVA et al., 2001). A partir de isolamento e expansão, alíquotas de

formas promastigotas dessa cepa de L. chagasi foram armazenadas em nitrogênio líquido. A cepa

foi mantida em nosso laboratório através de cultivo em meio Schneider (Sigma-Aldrich, Saint

Louis, MO, EUA) ou de passagens sucessivas em hamsters. As infecções de hamsters foram

realizadas por injeção intraperitoneal de 1 x 107 formas de promastigotas de cultura ou de

suspensão de fragmentos macerados de baço ou fígado de um hamster previamente infectado.

A preparação de extrato bruto de antígenos de Leishmania foi iniciada a partir da

obtenção de formas promastigotas de L. chagasi. Para a obtenção de promastigotas, fragmento de

baço ou fígado de hamster infectado foi macerado e incubado em meio de cultura Schneider

Drosophila (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA Sigma-Aldrich, EUA), pH 7.2,

suplementado com 20% de soro bovino fetal inativado (SFB, Gibco, EUA), a temperatura de 24o

C, conforme método descrito por Paranhos-Silva e colaboradores (PARANHOS-SILVA et al.,

1996). Formas promastigotas geradas foram transferidas para frascos de cultura e submetidas a

passagens sucessivas em volumes de cultura cada vez maiores. Volumes de meio de cultura com

Leishmania na fase logarítmica ou na fase estacionária de multiplicação foram misturados de

modo a originar uma suspensão com proporção de 30% e 70% de parasitos da primeira e da

última fase, respectivamente, conforme descrito previamente (RODRIGUES, 2004). A suspensão

resultante foi centrifugada a 500 x g, a 4oC, por 10 minutos. Em seguida, os parasitos foram

lavados três vezes com salina tamponada com fosfato, pH 7,2 (PBS, NaCl a 137 mM, KCl a 2,68

mM, Na2HPO4 a 9,58 mM e NaK2PO4 a 1,47 mM). O sedimento obtido após a última lavagem

contendo 12,75 x 1010 promastigotas foi ressuspenso para a concentração de 7,5 X 109 parasitos

48

por mL, em 17 mL de PBS, pH 7.2, com inibidores enzimáticos para inibir proteólise, nas

seguintes concentrações finais: antipaína a 5 µg/mL, fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) a 1

mM, pepstatina A a 5 µg/ml, L-trans-epoxisuccinil-L-leucilamino-4-guanidinobutano (E-64) a 8

µM, leupeptina a 5 µg/mL (Sigma-Aldrich). A suspensão foi submetida a sonicação com cinco

pulsos de 40 Hz, sobre gelo. Os pulsos foram realizados cada um com dez segundos de duração,

com intervalo de 60 segundos entre cada dois pulsos consecutivos, usando-se o aparelho

Ultrasonic Processor (PGC Scientifics, Gaithersburg, Maryland, EUA). Posteriormente, a

concentração protéica foi mensurada pelo método da fluorescamina, conforme método

previamente descrito (UDENFRIEND et al., 1972; BOHLEN et al., 1973). A partir daí, amostras

de 500 µL de extrato bruto de antígenos com concentração protéica de 18,28 mg/mL foram

submetidas à esterilização por irradiação gama e armazenadas a – 20°C. Para a esterilização,

tubos de microcentrifugação de 1,5 mL, com amostra de extrato bruto de antígenos, foram

colocados em um saco contendo gelo e expostos a 60.000 rads usando-se um irradiador gama

IBL Cs137 (CIS Bio International, Gif-Sur-Yvette Cedex, França).

A preparação de extrato bruto de antígenos de formas promastigotas de L. chagasi para

uso como antígeno na sensibilização de placas de microtitulação em ELISA foi realizada

essencialmente como descrita no parágrafo acima, com algumas modificações. Resumidamente,

formas promastigotas de L. chagasi, em fase estacionária, cultivadas por até sete passagens,

foram obtidas por centrifugação a 800 x g, por 10 minutos, à 4ºC. Em seguida, os parasitos foram

lavados três vezes em PBS, pH 7,2 por centrifugação e o sedimento final ressuspenso em 10 mL

de PBS, pH 7,2, foi sonicado, sobre o gelo, com cinco pulsos de 40 Hz (Ultrasonic Processor,

PGC Scientifics, Gaithersburg, Maryland, EUA). Os pulsos foram realizados com 45 segundos de

duração/pulso, com intervalo de 60 segundos entre cada dois pulsos consecutivos. A

determinação da concentração de proteína solubilizada de L. chagasi foi realizada pelo método de

Bradford (BRADFORD, 1976), comparando a densidade óptica desta com a de concentrações

conhecidas de albumina sérica bovina. A quantidade de antígeno, obtida a partir de 3 x 1010

promastigotas de L. chagasi foi de 97,5 mg, foi ressuspensa em um volume de 10 mL de solução

salina, resultando em uma concentração de 9,75 mg/mL. O extrato de antígenos foi aliquotado à -

20º C até o momento do uso.

49

4.1.2 Produção de antígenos recombinantes de Leishmania chagasi

Em estudos prévios em nosso laboratório, uma biblioteca de DNA complementar (cDNA)

de formas amastigotas de L. chagasi (cepa MHOM/BR2000/Merivaldo2) foi confeccionada em

fago lambda (fago lambda ZAP Express, Stratagene, La Jolla, CA, EUA), visando à seleção e à

avaliação de antígenos protéicos recombinantes para o desenvolvimento de uma vacina, um

método imunoterápico e ensaios imunodiagnósticos para leishmaniose visceral humana e canina.

Clones de fagos recombinantes produzindo, em Escherichia coli, antígenos capazes de

reagir com anticorpos de uma mistura de soros de quatro cães naturalmente infectados por

Leishmania, que apresentavam resposta imune humoral e celular específicas, foram selecionados

e submetidos à excisão, seguindo-se recomendações da Stratagene, de modo a gerar clones

correspondentes de fagímideos, plasmídeos que exibem a seqüência COS de fago lambda

(TEIXEIRA et al., 2007). Quatro desses clones de plasmídeo foram denominados pBKCMV-

Lc9, pBKCMV-Lc13, pBKCMV-Lc14 e pBKCMV-Lc18. A seqüência de DNA das

extremidades 5’ e 3’ de cada inserto desses clones foi determinada e o gene que codifica cada

polipeptídio foi identificado no genoma de Leishmania infantum do banco de dados do Instituto

Sanger (http://www.genedb.org/genedb/linfantum/), através de uma colaboração com o Dr.

Osvaldo Pompilio de Melo Neto do Departamento de Microbiologia do Centro de Pesquisas

Aggeu Magalhães (FIOCRUZ, Recife, PE). Posteriormente, parte dos insertos que codificam os

polipeptídeos Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 foi subclonado em plasmídeo pRSET (Invitrogen,

Carlsbad, California, EUA), gerando as construções pRSETB-Lc9, pRSETB-Lc13, pRSETA-

Lc14 e pRSETB-Lc18, respectivamente, capazes de promover super-expressão de cada um dos

polipeptídeos recombinantes na linhagem de Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (Invitrogen). O

plasmídeo pRSET acrescenta, na extremidade amina do polipeptídio recombinante, uma

seqüência de seis histidinas.

Cultivo de E. coli e indução da produção de antígenos recombinantes

Para a produção de proteínas recombinantes de L. chagasi Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 em E.

coli, volumes de 2 litros a 10 litros de cultura de E. coli da cepa BL21(DE3)pLysS (Invitrogen)

transformada com cada uma das construções plasmidiais pRSETB-Lc9, pRSETB-Lc13,

pRSETA-Lc14 e pRSETB-Lc18, respectivamente, foram utilizados. Resumidamente, uma

50

colônia de cada bactéria transformada com pRSETB-Lc9, pRSETB-Lc13, pRSETA-Lc14 ou

pRSETB-Lc18 foi inoculada, separadamente, em um volume de 50 mL de meio de cultura Luria-

Bertani [caldo LB: 1% de bacto-triptona (HiMedia, Mumbai, Índia), 0,5% de extrato de levedura

(Isofar, Duque de Caxias – RJ), 1% de cloreto de sódio (Isofar), pH 7.0] com 50 µg/mL de

ampicilina (Sigma-Aldrich) e 35 µg/mL de cloranfenicol (Sigma-Aldrich), e cultivada a 37°C, em

uma incubadora orbital (Orbit Environ Shaker, Lab-Line, Seatlle, WA, EUA), sob agitação

constante a 250 rpm, por aproximadamente 16 horas para obtenção de um pré-inóculo. Após esse

período, a leitura de densidade óptica (D.O.) de cada pré-inóculo foi avaliada a 600 nm. O pré-

inóculo de cada preparação foi utilizado para gerar grandes volumes de cultura, entre 2 a 5 litros

por preparação. Cada pré-inóculo foi diluído em meio de cultura LB sem antibióticos, de modo a

obter-se uma leitura de D.O. a 600 nm de valor próximo ou igual a 0,1. O volume final de cultivo

de cada bactéria foi preparado de acordo com a D.O. obtida de cada pré-inóculo. Frascos

Erlenmeyers de 1000 mL e de 2000 mL receberam um volume máximo de 200 mL e 400 mL da

cultura recém diluída, respectivamente, não ultrapassando portanto 20% da capacidade máxima

de cada frasco. As culturas bacterianas de cada frasco Erlenmeyer foram incubadas, a 37° C, sob

agitação constante a 250 rpm. Quando a medida da densidade óptica da cultura, avaliada a 600

nm, atingiu um valor entre 0,4 e 0,6, um volume de isopropil-thio-B-D-galactosídio (IPTG,

Invitrogen) preparado a 1M foi acrescentado para obter-se a concentração final de 0,25 mM nas

culturas de E. coli transformadas com as construções pRSETB-Lc9 ou pRSETA-Lc14 e

concentrações finais de 0,125 mM de IPTG para culturas de E. coli transformadas com as

construções pRSETB-Lc13 ou pRSETB-Lc18, com a finalidade de induzir a produção da

proteína recombinante. Estas concentrações foram determinadas em experimentos prévios nos

quais foram avaliados o pontos máximo de produção de cada uma das proteínas recombinantes a

partir de ensaios de dose-resposta e cinética de produção. Após a indução com IPTG, as culturas

de cada frasco Erlenmeyer foram incubadas por mais três horas nas condições indicadas acima. A

suspensão de bactéria de cada frasco foi centrifugada a 5.000 x g, a 4° C, por 15 minutos. Os

sedimentos de cada preparação, correspondentes a todo o volume de cada cultura, foram pesados

e armazenados a –20°C até o momento da purificação. Sedimentos obtidos a partir de alíquotas

de um mililitro da cultura de bactéria, coletadas antes e após três horas de indução com IPTG,

foram usadas para avaliação da produção da proteína recombinante.

51

Purificação de antígenos recombinantes de L. chagasi

As purificações de antígenos recombinantes foram realizadas separadamente para uso em

cultivo celular, para estímulo in vitro de esplenócitos murinos e para uso em ELISA, para

sensibilização de placas de microtitulação. As proteínas recombinantes purificadas e utilizadas

em cultivo celular foram gentilmente preparadas pelo Dr. Edmilson Domingos da Silva, de

Biomanguinhos, Instituto Fundação Osvaldo Cruz, RJ, utilizando-se três metodologias:

cromatografia de afinidade com metal imobilizado (como realizado em nosso laboratório), diálise

em G25 e troca Iônica (Poros HQ), seguindo-se as instruções dos fabricantes. As proteínas

recombinantes de Leishmania chagasi Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 utilizadas para ensaios de ELISA,

foram purificadas apenas usando-se colunas de cromatografia de afinidade preparadas com

Sepharose quelada por níquel (“Sepharose Chelating Sepharose Fast Flow”, Amersham

Biosciences Corp., New Jersey, EUA), como descrito posteriormente. Uma etapa prévia à

purificação das proteínas envolveu a lise bacteriana e obtenção de cada proteína recombinante

seja na forma solúvel ou sob a forma de corpúsculos de inclusão, na fração insolúvel da

preparação (SAMBROOK & RUSSEL, 2000).

Obtenção de proteínas solúveis ou sob a forma de corpúsculos de inclusão

Para a purificação de Lc9, sedimento bacteriano de 5 litros do cultivo de bactéria

[BL21(DE3)pLysS transformada com pRSETB-Lc9, pesando 8.5 g, dividido em quatro tubos de

polipropileno do tipo Falcon de 50 mL, foi descongelado a 4°C e ressuspenso em tampão de lise

(20 mM Na2HPO4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0), com auxílio de um agitador vórtex

(Labnet, Woodbridge, NJ) e reunidos em um só tubo. Para cada grama de sedimento foram

utilizados três mililitros de tampão de lise. Um miligrama de lisozima (Sigma) foi acrescentado

para cada mililitro da suspensão. Em seguida, o tubo foi incubado por 20 minutos sobre gelo.

Posteriormente, para auxiliar no processo de lise bacteriana, foram adicionados quatro

miligramas de ácido deoxicólico (Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany) para cada grama

do sedimento bacteriano original. O material foi, então, incubado a 37ºC, durante 15 minutos, em

banho-maria. Depois disso, visando à fragmentação de DNA genômico da bactéria, o conteúdo

do tubo foi sonicado sob o gelo. Foram aplicados quatro pulsos ultrassônicos com potência de

52

300 Watts (cada pulso teve 30 segundos duração e os intervalos entre cada dois pulsos

consecutivos foram de 10 segundos), usando-se um aparelho ultrasonicador (Sonifier Cell

Disruptor, Branson Sonic Power Company, Danbury, Connecticut, EUA). A suspensão resultante

foi centrifugada a 17.000 x g, a 4° C, por 15 minutos. O sobrenadante e o sedimento, esse último

depois de três lavagens com tampão de lise, foram separadamente transferidos para tubos Falcon

de 50 mL, os quais foram armazenados a -20ºC até o uso. Uma amostra do sobrenadante e outra

do sedimento, retiradas antes do armazenamento, foram analisadas através de gel de

poliacrilamida contendo dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE; LAEMMLI, 1970) para

determinar-se qual das duas frações exibia maior enriquecimento da proteína recombinante Lc9.

A análise revelou que a fração solúvel exibia cerca de 80 % da proteína Lc9 produzida em E. coli

(FRAGA, 2007).

As preparações de Lc13, Lc14 e Lc18, para posterior purificação em coluna de afinidade

por cromatografia, foram obtidas seguindo-se o procedimento descrito no parágrafo anterior, com

apenas pequenas modificações. Foram utilizados sedimentos bacterianos armazenados em tubos

tipo Falcon de 50 mL, equivalentes a volumes de cultura de 2,8 L, 10L e 2L litros do cultivo de

bactéria BL21(DE3)pLysS transformada com pRSETB-Lc13, pRSETA-Lc14 ou pRSETB-Lc18,

pesando 10,3 g, 14,37 g e 4,62 g, respectivamente. Após a lise bacteriana e etapas de

centrifugação, os sedimentos insolúveis de BL21(DE3)pLysS-pRSETB-Lc13, BL21(DE3)pLysS-

pRSETA-Lc14 ou BL21(DE3)pLysS-pRSETB-Lc18 foram ressuspensos com aproximadamente

30 mL, 29 mL e 20 mL de tampão de ligação com agente denaturante (20 mM Na2HPO4, 500

mM NaCl, 10 mM imidazol, 8M uréia, pH 8,0), respectivamente, e armazenados a -20ºC até o

momento de uso. Amostras do sobrenadante e dos sedimentos, retiradas antes do armazenamento,

foram analisadas através de SDS-PAGE para determinar-se qual das duas frações exibia maior

enriquecimento das proteínas recombinantes Lc13, Lc14 e L18. A análise revelou que a fração

insolúvel exibia maior concentração de cada uma das proteínas analisadas em relação a fração

solúvel.

Purificação em coluna de afinidade

Lc9

Um volume de 25 mL de proteínas da fração solúvel de bactéria BL21(DE3)pLysS-

pRSET-Lc9 foi aplicado, oito vezes, sobre uma coluna de 2 mL da resina Sepharose-níquel

53

(“Sepharose Chelating Sepharose Fast Flow”, Amersham Biosciences Corp., New Jersey, EUA),

preparada seguindo-se as recomendações do fabricante. Resumidamente, para preparação da

coluna, 2 mL de resina foram lavados três vezes com 10 mL de água destilada de cada vez e, em

seguida, expostos a um volume de 1,5 mL de NiSO4 (Merck, São Paulo, São Paulo, Brasil) a 100

mM, por 15 minutos. A resina foi então lavada mais três vezes com água destilada e equilibrada

com 10 mL de tampão de uma solução a 20 mM Na2HPO4, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH

8,0 e depois transferida para o suporte da resina. Após drenagem do tampão de lise, foram

aplicados, em cada passagem, 3 mL da fração solúvel mencionada acima. Depois de 30 minutos,

o fluxo foi ajustado para permitir exposição das proteínas à resina por mais 30 minutos. A resina

foi lavada três vezes com 10 mL de solução Na2HPO4 a 20 mM, NaCl a 500 mM, imidazol a

31,25 mM, pH 8,0 (solução de lavagem) de cada vez e, em seguida, proteínas foram eluídas da

coluna com quatro lavagens de 4 mL de solução Na2HPO4 a 20 mM, NaCl a 500 mM, imidazol a

500 mM, pH 8,0 (solução de eluição) de cada vez. Amostras efluentes da coluna, obtidas após

aplicação das proteínas, durante a lavagem e durante a eluição, foram coletadas para análise por

SDS-PAGE, juntamente com o material inicialmente aplicado na coluna para avaliação do

processo de purificação da proteína recombinante. As frações cromatrográficaS exibindo Lc9

foram reunidas e submetidas à diálise contra PBS, pH 7.2, realizada em três banhos de 8 horas a

4° C. Após a diálise, a fração solúvel obtida após a centrifugação a 17000 g durante 15 minutos a

4° C, foi quantificada através do método da fluorescamina (Sigma-Aldrich) de determinação

protéica, e armazenadas, em PBS, a -20°C até o momento de uso. Algumas amostras, antes de

serem armazenadas, foram submetidas à esterilização por irradiação gama, como descrito

anteriormente, para uso posterior em ensaios celulares.

Lc13, Lc14 e Lc18

As proteínas recombinantes Lc13, Lc14 e Lc18 foram purificadas por cromatografia de

afinidade, como descrito para a purificação de Lc9, usando-se uma resina quelada com níquel,

exceto que, para estas purificações foi utilizado o método de centrifugação (“batch”) ao invés de

coluna, propriamente dita. Um volume de aproximadamente 1 mL, 29 mL e 20 mL de proteínas

da fração insolúvel de bactéria BL21(DE3)pLysS-pRSETB-Lc13, BL21(DE3)pLysS-pRSETA-

Lc14 ou BL21(DE3)pLysS-pRSETB-Lc18 foi utilizado para purificação, em tubos tipo Falcon de

54

15 mLcontendo 2 mL da resina de Sepharose carregada com níquel (“Sepharose Chelating

Sepharose Fast Flow”, Amersham Biosciences Corp., New Jersey, EUA), preparada seguindo-se

as recomendações do fabricante. As amostras foram incubadas durante 30 minutos, a temperatura

ambiente, sob agitação constante tipo end-over-end em agitador hematológico (Fisher Scientific,

EUA). Posteriormente, os tubos foram centrifugados a 500 x g, durante 5 minutos a 4oC. O

sobrenadante foi removido e armazenado para análise. A resina foi lavada três vezes com 10 mL

de tampão fosfato a 20 mM, NaCl a 500 mM, imidazol a 31,25 mM, uréia a 8 M, pH 8,0 (solução

de lavagem) de cada vez e, em seguida, proteínas foram eluídas da resina com quatro lavagens de

4 mL de tampão fosfato a 20 mM, NaCl a 500 mM, imidazol a 500 mM, uréia a 8 M, pH 8,0

(solução de eluição) de cada vez. As frações cromatrográficas das purificações de Lc13, Lc14 ou

Lc18 foram analisadas por SDS-PAGE, e submetidas à diálise contra PBS, pH 7.2, realizada em

três banhos de 8 horas a 4°C. Após a diálise, as frações insolúveis obtidas após a centrifugação a

17000 x g durante 15 minutos a 4° C, foram quantificadas através do método da fluorescamina

(Sigma-Aldrich) de determinação protéica e armazenadas, em PBS, a -20°C até o momento de

uso.

4.1.3 Obtenção de plasmídeos para imunização

Como descrito anteriormente, no item 4.1.2., uma biblioteca de cDNA de formas

amastigotas de L. chagasi foi confeccionada, por um dos pesquisadores do nosso laboratório,

tendo como um dos objetivos o desenvolvimento de uma vacina contra a leishmaniose visceral

canina, na qual antígenos protéicos recombinantes, provenientes desta biblioteca, seriam

utilizados. Clones da biblioteca de cDNA, que foi confeccionada em fago lambda (fago lambda

ZAP Express, Stratagene, La Jolla, CA, EUA), são capazes de gerar facilmente, por um processo

denominado de excisão, fagimídios (pBK-CMV). Tais fagimídios comportam-se como

plasmídeos e são capazes de levar a expressão de proteínas recombinantes tanto em células

procarióticas (E. coli) quanto em células eucarióticas (células de mamíferos). Dessa forma,

plasmídeos purificados podem ser utilizados diretamente para injeção de animais e avaliados

como vacinas de DNA pela análise da imunogenicidade de cada proteína recombinante produzida

in vivo. Quatro desses clones de plasmídeos denominados pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13,

pBKCMV-Lc14 e pBKCMV-Lc18 foram selecionados e obtidos para imunização de

camundongos BALB/c. Cada um destes plasmídeos é capaz de produzir in vivo a proteína

55

recombinante correspondente acrescida de uma seqüência de 32 aminoácidos de β-galactosidase,

devido à uma seqüência de nucleotídeos que codifica para B-galactosidase que antecede o sítio de

inserção do cDNA clonado. Por este motivo, pBK-CMV, sem inserto exógeno, foi purificado e

utilizado como controle negativo.

Purificação de plasmídeos pBK-CMV com insertos de antígenos recombinantes de L.

chagasi e de plasmídeocodificando IL-12 murina - pcDNA3.1-scmu-IL12

Para obtenção de plasmídeos pBKCMV-B-gal, pBKCMV-Lc9, pBKCMV-Lc13,

pBKCMV-Lc14, pBKCMV-Lc18 e pcDNA3.1-scmu-IL-12, usados para injeção dos animais,

foram utilizadas colunas de troca iônica (sílica-DEAE) para a purificação de DNA em média

escala (Qiagen Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA, EUA), seguindo-se as recomendações

do fabricante. Resumidamente, E. coli da linhagem TOP10, transformadas previamente com cada

uma das construções, pBKCMV-B-gal, pBKCMV-Lc9, pBKCMV-Lc13, pBKCMV-Lc14,

pBKCMV-Lc18 e pcDNA3.1-scmu-IL-12, foram semeadas, a partir de um estoque de bactéria

permanente armazenado a -70oC, em uma placa de meio de cultura LB-ágar (Gibco) com 50

µg/mL de kanamicina ou 50 µg/mL de ampicilina (para TOP10/pcDNA3.1-scmu-IL-12) e

cultivadas por 18 horas a 37oC. No dia posterior à preparação de cada placa, uma colônia de

TOP10 de cada um dos clones de plasmídeo foi inoculada em um tubo de vidro estéril de 50 mL

contendo 5 mL de meio de cultura LB (Gibco) com 50 µg/mL de kanamicina ou 50 µg/mL de

ampicilina e cultivada por 8 horas a 37oC sob agitação constante de 250 rpm. Em seguida, 4 mL

de cada pré-inóculo foi misturado a 2 litros de meio LB com 50 µg/mL de kanamicina ou 50

µg/mL de ampicilina resultando em uma diluição de 1:500. O volume total de cada cultura foi

redistribuído em 5 frascos Erlenmeyers de 2000 mL, sendo 400 mL de cultura em cada um. Cada

cultura foi incubada durante cerca de 18 horas a 37oC sob agitação constante de 250 rpm. O

sedimento bacteriano de cada cultura foi obtido após centrifugação a 6000 x g, por 15 minutos, a

4oC e armazenado a -20oC até o momento do uso.

Para obtenção dos plasmídeos em fase aquosa/solúvel para posterior passagem na coluna

de purificação foi realizada lise alcalina como recomendado pelo fabricante do kit de purificação.

Então, cada sedimento bacteriano de TOP10 transformada com pBKCMV, pBKCMV-Lc9,

pBKCMV-Lc13, pBKCMV-Lc14, pBKCMV-Lc18 ou pcDNA3.1-scmu-IL-12 foi ressuspenso

56

completamente com 200 mL de tampão P1 (50 mM Tris-Cl, pH 8,0; 10 mM EDTA; 100 µg/mL

RNAse A) em um frasco Erlenmeyer de 1000 mL. Em seguida foram adicionados à suspensão

bacteriana 200 mL de solução P2 (200mM NaOH, 1% SDS) e, após agitação suave por inversão

de 4 a 6 vezes, incubados a temperatura ambiente por 5 minutos. Após este período de incubação

foram adicionados 200 mL de solução P3 (3M acetato de potássio, pH 5,5) seguido novamente de

agitação suave por inversão de 4 a 6 vezes seguida de incubação por 30 minutos no gelo. O lisado

bacteriano de cada preparação foi transferido para frascos de centrifugação (Beckman Coulter,

EUA) em volumes de aproximadamente 150 mL por frasco e centrifugados a 20.000 x g durante

30 minutos a 4o C. O sobrenadante foi removido, transferido para novos frascos e submetidos a

centrifugação de 20.000 x g por 15 minutos a a 4o C. Após esta última centrifugação, o

sobrenadante foi passado através de um filtro de pano de algodão para completa remoção de

partículas.

Cada coluna utilizada para purificação dos plasmídeos foi preparada seguindo-se as

instruções do fabricante. Resumidamente, 35 mL de tampão QBT (750mM NaCl; 50 mM MOPS,

pH7,0; 15% isopropanol; 0,15% Triton X-100) foi utilizado para equilibrar cada coluna. A

passagem de cada tampão pela coluna, assim como das amostras contendo plasmídeo, ocorreu

por fluxo gravitacional. Após a aplicação da amostra foram adicionados a cada coluna 200 mL de

tampão de lavagem QC (1M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7,0; 15% isopropanol). A eluição foi feita

com 35 mL de tampão QF (1,25 M NaCl, 50 mM Tris.Cl, pH 8,5; 15% de isopropanol). Cada

eluato foi armazenado em tubos Falcon de 50 mL a 4o C até o momento da precipitação do DNA.

Para a precipitação, foram adicionados 24,5 mL de isopropanol (Sigma, St Louis, EUA) para

cada eluato. Após agitação suave, o material foi centrifugado a 5000 x g durante 60 minutos a 4o

C. O sobrenadante da centrifugação foi descartado e cada sedimento obtido foi lavado com 3,5

mL de etanol 70% por centrifugação de 5000 x g durante 60 minutos a 4o C. Ao final, o

sedimento contendo DNA plasmideal foi ressuspenso com cerca de 1 mL de água Mili Q, para

armazenamento, ou solução salina [cloreto de sódio a 0,85 %, (Isofar)], para uso em injeções, e

solubilizado a 65o C por cerca de 30 a 60 minutos. A concentração de plasmídeo e a pureza do

material obtido foi determinada pela leitura de densidade óptica em filtro de 260 nm e 280 nm,

respectivamente, em aparelho espectrofotômetro Ultrospec. Cerca de 100 ng de cada plasmídeo

foi analisado em gel de agarose (Amersham Biosciences) a 1% corado com brometo de etídeo

(Sigma-Aldrich) a 0,5 µg/mL em tampão Tris-acetato-EDTA (TAE; 20 mM de Tris, 0,1% de

57

ácido acético e 1 mM de EDTA – pH 8,0) após eletropforese por 1 hora a 80V. Uma amostra de

marcadores de pares de bases (1 Kb DNA ladder; Invitrogen Corporation) também foi fracionado

no gel. A migração das bandas presentes no gel foi documentada pelo sistema Eagle Eye II

(Stratagene, La Jolla, CA, EUA). Os plasmídeos foram armazenados em alíquotas a -20 oC até o

uso.

4.2 Animais

Foram utilizados 180 camundongos da linhagem isogênica BALB/c, machos e fêmeas,

com idade entre 5 e 6 semanas, mantidos no biotério do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz

(CPqGM-FIOCRUZ-Salvador-Bahia). Os camundongos foram alojados em caixas de 30 x 19,5 x

12 cm, entre três e seis animais por caixa, durante todo o período do experimento, no biotério do

CPqGM, sob condições adequadas de temperatura (21oC ± 1o C) e de umidade (50 - 60%). Os

animais foram mantidos com alimentação (ração comercial BioBase, Base Química Prod. Quím.

Ltda., Brasil) e água ad libitum.

4.3 Imunização

Foram realizados três protocolos de imunização, nos quais plasmídeos (pBK-CMV-Lc9,

pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-14 e pBK-CMV-Lc18) foram (i) administrados isoladamente ou

como (ii) uma combinação (pool) de plasmídeos, associados ou não a plasmídeocodificando IL-

12 murina (pcDNA3.1-scmu-IL-12) ou ainda, (iii) um protocolo de imunização tipo DNA

primer/proteína booster, no qual pBK-CMV-Lc9 foi injetado nas duas primeiras injeções e

posterior reforço com Lc9 recombinante associada a saponina (ver Apêndice A). Para realização

das injeções foram formados cinco grupos de doze animais e um grupo de dezoito animais para o

protocolo (i), quatro grupos de doze animais e um grupo de dezoito animais para o protocolo (ii)

e seis grupos de seis animais para o protocolo (iii). Como grupos controles, os animais receberam

salina, pBK-CMV vazio, saponina ou Lc9 apenas. Foram realizadas três séries de injeções com

intervalos de 21 dias entre cada duas injeções consecutivas. Os animais receberam injeção

intramuscular, na região do quadríceps, de 50 µL de cada plasmídeo na concentração de 1 mg/mL

(50 µg/injeção) ou 50 µL de uma mistura em partes iguais de cada um, preparados na

concentração de 5 mg/mL (200 µg total/injeção ou 250 µg total/injeção quando associado a

58

pcDNA3.1-scmu-IL-12) e submetidos a eletroporação (ver Apêndice B; MIR et al., 1999;

LUCAS & HELLER, 2001). Um grupo de animais foi formado para receber a injeção de um pool

de plasmídeos sem serem submetidos a eletroporação. Os grupos controles foram injetados com

50 µL de salina ou 50µL de pBK-CMV vazio (50 ou 200 µg para os protocolos nos quais

plasmídeos foram administrados isoladamente ou como pool, respectivamente). Para a realização

de eletroporação, os animais foram previamente anestesiados com 100 mg/kg de quetamina

(Agribrands do Brasil Ltda, Paulínia, SP) e 15 mg/kg de xilazina (Bayer S.A., São Paulo, SP) por

via intraperitoneal. Imediatamente após as injeções anteriormente citadas, eletrodos do

eletroporador foram introduzidos na região muscular, em torno do local da injeção, e foram

aplicados cinco pulsos elétricos de 100 volts/cm, com duração de 20 milisegundos por pulso e

intervalo de um segundo entre cada dois pulsos consecutivos. O aparelho eletroporador utilizado

foi projetado e elaborado pelo prof. Dr. Yuri Pepe, do Departamento de Física, da Universidade

Federal da Bahia.

Quando a proteína recombinante purificada, Lc9, foi utilizada para avaliação em um

protocolo de imunização com injeção incial de DNA seguida de reforço com a proteína, a

preparação foi feita em salina/saponina de forma a obter-se uma mistura com concentração de 1

mg/mL de Lc9 e 1 mg/mL de saponina. Para realização deste protocolo de imunização foram

formados seis grupos. Os animais foram injetados com salina, saponina, pBK-CMV vazio, Lc9

associada a saponina, pBK-CMV-Lc9 ou, por fim, pBK-CMV-Lc9 (duas primeiras injeções) e

Lc9 associada a saponina (última injeção). Os animais do grupo Salina (50 µL) e dos grupos

injetados com plasmídeo (volume de 50 µL/50 µg de plasmídeo) receberam eletroporação no

músculo, na região do quadríceps, logo após as injeções, como descrito acima. Os grupos

Saponina (volume de 200 µL/100 µg de saponina) e Lc9 associada a saponina (volume de 200 µL

contendo 100 µg de saponina/100 µg de Lc9) receberam injeções por via subcutânea, na região

dos flancos, nos dias 0, 21 e 42 do experimento. Os animais do grupo previamente injetado com

pBK-CMV-Lc9 receberam uma injeção de Lc9 associada a saponina, por via subcutânea, apenas

na última série de injeções, dia 42 do experimento.

59

4.4. Infecção com Leishmania chagasi

Para avaliar a capacidade de os antígenos recombinantes Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 em

induzir resposta imune capaz de conferir proteção contra e/ou controle da infecção por L.

chagasi, camundongos BALB/c injetados com cada uma das proteínas recombinantes sob a

forma de DNA plasmideal, como citados em dois dos protocolos de imunização avaliados neste

trabalho, foram desafiados pela infecção com promastigotas de L. chagasi, cerca de três a quatro

semanas após a terceira série de injeções. Para obtenção de promastigotas, fragmento de fígado

de hamster infectado com L. chagasi MHOM/BR/2000/Merivaldo2, foi macerado em meio de

cultura Schneider (Sigma), com 20% de soro fetal bovino (Gibco) como previamente descrito no

item 4.1.1. O cultivo foi realizado em frasco de cultura de 25 cm2 (Corning, Nova Iorque, EUA) e

mantido a 26oC. Após a primeira passagem, iniciada com 5 x 106 promastigotas de L.

chagasi/mL, e mantida por aproximadamente quatro dias em cultivo, promastigotas foram

coletadas e lavadas três vezes com solução salina estéril. O sedimento obtido após a última

lavagem foi ressuspenso com 1 mL de salina estéril. Em seguida foi realizada contagem das

células em câmara de Neubawer e a concentração de promastigotas foi ajustada com salina para 1

x 108 parasitos/mL.

Para a infecção de camundongos, seis animais por grupo foram injetados, por via

intraperitoneal, com 1 x 107 parasitos em um volume de 100 µL. Os grupos experimentais foram

previamente injetados conforme descrito no item anterior. Como grupo controle sem infecção,

animais previamente injetados com salina foram injetados novamente apenas com 100 µL de

salina estéril por via intraperitoneal. A avaliação de carga parasitária no baço e a avaliação da

resposta imune humoral e celular de cada animal foi realizada entre 54-60 dias após a infecção.

4.5. Avaliação da resposta imune

4.5.1 Avaliação da resposta imune humoral

A avaliação da produção de anticorpos (IgG total ou subclasses IgG1 e IgG2a) anti-

Leishmania (extrato bruto de antígenos ou antígeno recombinante) foi realizada em amostras de

soro obtidas 10 dias após a terceira série de injeções e entre 54-60 dias após a infecção com L.

chagasi, realizando-se ensaios imunoenzimáticos em fase sólida (ELISAs).

60

Para obtenção de soros, amostra de sangue de cada animal, coletada pelo plexo retro-

orbitário após aplicação de uma gota de anestésico (cloridrato de proximetacaína a 0,5 %,

Anestalcon, Alcon Laboratórios do Brasil Ltda, São Paulo, SP) na mucosa ocular, foi incubada,

em tubo de microcentrifugação, a temperatura ambiente por 1 a 2 horas para permitir a

coagulação. Depois disso, os tubos foram centrifugados a 1500 x g e a temperatura ambiente, por

10 minutos. Após a transferência para novos tubos, as amostras de soro foram armazenadas a

-20° C até o momento de uso.

Mensuração de anticorpos da classe IgG por ELISA

Para avaliar a produção de anticorpos específicos da classe IgG, ensaios

imunoenzimáticos foram realizados em placas de microtitulação de poliestireno com 96 poços

(Cliniplate, Thermo Labsystems, Helsinki, Finlândia). Poços das placas de microtitulação foram

sensibilizados com 100 µL de Lc9 a 5 µg/mL, 100 µL de uma preparação de Lc13 a 1,5 µg/mL,

100 µL de Lc14 a 10 µg/mL, 100 µL de Lc18 a 1,5 µg/mL ou 100 µL de extrato bruto de

antígenos de L. chagasi a 10 µg/mL, diluídos em tampão carbonato-bicarbonato de sódio a 0,1

M, pH 9.6, por 16 horas, a 4o C em câmara úmida. Após a sensibilização, os poços das placas

foram lavados quatro vezes com PBS. Em seguida, para bloquear sítios de ligação de proteína

não ocupados pelos antígenos, foram colocados 150 µL de leite desnatado (Itambé, Belo

Horizonte, Brasil) a 10% em PBS (m/v) em cada poço. As placas foram então incubadas por 1

hora, a temperatura ambiente, em câmara úmida. Os poços foram lavados três vezes com PBS

contendo 0,05% de Tween 20 (v/v, PBS-T, Sigma-Aldrich). Cem microlitros de cada amostra de

soro diluída foram colocados por poço e as placas foram incubadas por 1 hora, a temperatura

ambiente, em câmara úmida. As amostras de soros foram testadas em uma única diluição (1:100

ou 1:200), em duplicata, ou nas diluições de 1:200, 1:1000, 1:5000, 1:25000 e 1:125000 (para

avaliar amostras dos animais injetados com proteína recombinante ou a combinação de DNA

seguido de proteína) em PBS-T, com 10% de leite desnatado.

Como controles negativo e positivo do ensaio, foram usados soros de camundongos

BALB/c injetados com salina ou com a proteína recombinante Lc9 ou Lc13 emulsionadas em

adjuvante completo de Freund, obtidos em um experimento realizado previamente. Soro de

camundongos BALB/c injetados com plasmídeo pBKCMV-Lc14, obtidos em um experimento

piloto, foram utilizados como controle em ELISA para detecção de anticorpos anti-Lc14. Soro de

61

camundongos BALB/c infectados com L. chagasi (gentilmente cedido por uma pesquisadora de

nosso laboratório, Dra. Neuza Alcântara) foi utilizado como controle positivo de testes ELISA

para detecção de anticorpos anti-Lc18 e anti-L. chagasi. Após o período de incubação das

amostras, os poços das placas de microtitulação foram lavados três vezes com PBS-T. Cem

microlitros de anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo conjugado a peroxidase (Sigma-

Aldrich) diluído a 1: 400 ou 1:4000 em PBS-T com 10 % de leite desnatado foram colocados por

poço e as placas foram incubadas por 1 hora, a temperatura ambiente, em câmara úmida. Os

poços foram lavados três vezes com PBS-T e a reação foi revelada pela adição de 150 µL do

substrato peróxido de hidrogênio na presença de tetrametilbenzidina (TMB; Sigma), por 15

minutos, a temperatura ambiente e ao abrigo de luz. O substrato foi preparado, em volume

suficiente para uma placa de 96 poços, pela mistura de 150 µL de TMB [10mg/mL em

dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma)], 2,91 mL de acetato de sódio 0,5 M (Sigma), 90µL de ácido

cítrico 0,5 M (Sigma), 12 mL de água destilada e 15µL de peróxido de hidrogênio 30% P.A.

(Isofar). A reação foi neutralizada com 50 µL de ácido sulfúrico a 4 M (Quimex, São Paulo,

Brasil) por poço. A leitura da densidade óptica a 450 nm foi realizada em espectrofotômetro

(Spectramax Precison Microplate Reader, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, EUA)

usando o programa de computação Softmax Pro versão 5.0 (Molecular Devices Corporation,

Sunnyvale, CA, EUA). Os resultados foram expressos individualmente e como média aritmética

de cada grupo.

Avaliação de anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2a por ELISA

A produção de anticorpos específicos das subclasses IgG1 ou IgG2a foi avaliada através

de ensaios imunoenzimáticos realizados, essencialmente, conforme descrito acima.

Resumidamente, placas de microtitulação de 96 poços foram sensibilizadas com proteína

recombinante Lc9, Lc14 ou extrato bruto de L. chagasi. Após lavagem dos poços, bloqueio de

sítios inespecíficos com 200 µL de PBS contendo 10% de soro fetal bovino (PBS-SFB) e

lavagem novamente, os poços receberam 100 µL de amostras de soros diluídas a 1:500 ou 1:1000

(para ELISA anti-L. chagasi),1:3000 (para ELISA anti-Lc9 ou anti-Lc14 ) ou 1:350.000 (para

ELISA anti-Lc9 com amostras obtidas a partir da injeção de proteína Lc9 ou injeção inicial com

DNA seguida de reforço com Lc9) em PBS-SFB. Após incubação das placas e lavagem, os poços

62

receberam 100 µL de anticorpos de rato anti-IgG1 ou anti-IgG2a de camundongo conjugados a

biotina (BD Pharmingen, EUA) diluídos a 1:500 em PBS-SFB. As placas foram incubadas por

duas horas a temperatura ambiente e lavadas. Os poços receberam 100 µL de avidina conjugada a

peroxidase (Sigma-Aldrich) estocada a 1 mg/mL e diluída a 1:400. As placas foram incubadas

por 45 minutos, a temperatura ambiente e, em seguida, lavadas oito vezes. Os poços receberam

100 µL de substrato TMB por 15 minutos. A solução contendo substrato foi preparada pela

mistura de 1 mL de TMB a 1 mg/mL em DMSO, 9 mL de tampão citrato-fosfato a 0,05 M, pH

5.0 [fosfato de sódio dibásico 0,2 M (Isofar), ácido cítrico 0,1M (Sigma)] e 2 µL de peróxido de

hidrogênio 30% P.A (Isofar). Transcorridos 15 minutos, a reação enzimática foi interrompida

pela adição de 50 µL/poço de ácido fosfórico (Quimex) a 1:20 (v/v). Finalmente, foi realizada a

leitura da densidade óptica usando-se filtro de 450 nm.

4.5.2 Avaliação da resposta imune celular

A avaliação da resposta imune celular específica foi realizada entre três e quatro semanas

após a terceira série de injeção. Para os animais desafiados pela injeção de promastigotas de L.

chagasi, uma avaliação foi realizada entre 54-60 dias após a infecção. A resposta imune celular

foi avaliada através da mensuração da proliferação celular e produção de citocinas por células

esplênicas expostas a extrato bruto de antígenos de L. chagasi e aos antígenos recombinantes

Lc9, Lc14 e Lc18 in vitro.

Avaliação de proliferação celular

O baço de cada animal foi removido imediatamente após o sacrifício, em condições

assépticas, e transferido para uma placa de Petri de poliestireno (Corning Incorporated, Nova

Iorque, EUA) de 35 mm de diâmetro contendo 2 mL de meio 1640 do Instituto Rosewell Park

Memorial (RPMI 1640, Sigma-Aldrich) e gentamicina a 40 µg/mL (Sigma-Aldrich). Em seguida,

o baço foi macerado com auxílio de êmbolo de seringa (Injex, Indústrias Cirúrgicas LTDA,

Distrito Industrial Ourinhos, SP), gerando uma suspensão celular. Cada suspensão foi submetida

a centrifugação a 100 x g, por 15 segundos. O sobrenadante foi coletado e transferido para um

novo tubo e, posteriormente, centrifugado a 450 x g, por 10 minutos, a 4ºC. Cada sedimento

celular foi ressuspenso em 2 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal

63

[(v/v), SFB, Gibco BRL Life Technologies], 2 mM L-glutamina (Sigma-Aldrich) e 0,01 mM 2-

mercaptoetanol (Sigma-Aldrich; RPMI suplementado). A partir daí, uma amostra de cada

suspensão celular foi diluída a 1:10 em azul de tripan a 0,4% (Sigma-Aldrich) e a concentração

de células foi determinada, usando-se uma câmara de Newbauer (Boeco). Para isso, foram

contadas pelo menos 100 células de cada suspensão. A concentração de células de cada

suspensão foi ajustada para 3 x 106/mL, usando-se meio RMPI suplementado. As células foram

cultivadas em placas de microtitulação de 96 poços, de poliestireno, de fundo chato, apropriadas

para cultura celular (Costar Corning Inc., Nova Iorque, EUA). Um volume de 100 µL, com 3 x

105 células, de cada suspensão de células foi aplicado por poço, em triplicata, para cada animal e

para cada uma das avaliações realizadas. Para determinação do nível basal de proliferação

(controle negativo, em três e cinco dias de cultivo) e adequação das condições de cultura para

proliferação celular (controle positivo de ensaio), respectivamente, foram acrescentados 100 µL

de meio RMPI suplementado ou 100 µL de concanavalina A (Con A, Sigma-Aldrich) a 4 µg/mL

de meio suplementado, em triplicata, para cada animal. Para avaliação de proliferação

conseqüente a estímulo específico, foram adicionados, em triplicata, para cada animal, 100 µL de

extrato bruto de antígenos de L. chagasi diluído a 20 µg/mL ou 100 µL de cada uma das

proteínas recombinantes, Lc9, Lc13, Lc14 ou Lc18 diluídas a 20 µg/mL (para avaliação após as

três séries de injeção) e 0,2 µg/mL, 2 µg/mL ou 20 µg/mL de meio suplementado (para avaliação

realizada após a infecção). As placas de microtitulação foram incubadas a 37º C, em atmosfera

úmida com CO2 a 5% (v/v). Após incubação por três dias, para placas onde células foram

incubadas com Con A, e de cinco dias, para placas onde células foram incubadas com antígenos,

30 µL de RPMI suplementado contendo 1 µCi de timidina[H]3+ (Amersham Biosciences,

Uppsalla, Suécia) foram acrescentados a cada poço. As placas foram incubadas por mais 18 horas

nas mesmas condições anteriores e, depois disso, foram mantidas a -20º C até a coleta das

células. As células foram coletadas em papel de filtro de fibra de vidro (Packard Canberra

Company, Meriden, EUA) e partículas beta emitidas durante o período de um minuto (cpm)

foram determinadas por um contador beta modelo Matrix 9600 (Packard Canberra Company). Os

resultados foram expressos em índice de proliferação (média aritmética de cpm de triplicatas nas

quais células foram estimuladas com Con A ou antígenos dividida pela média aritmética de cpm

de triplicatas nas quais as células foram cultivadas somente com meio de cultura suplementado).

64

Avaliação da produção de citocinas por ELISA

Para a mensuração da produção de citocinas (IFN-γ, IL– 4 e IL-5) esplenócitos foram

cultivados em placas de 24 poços, de poliestireno, de fundo chato, apropriadas para cultura

celular (Costar Corning Inc.). Para isso, um volume de 300 µL de suspensão de esplenócitos de

cada animal na concentração de 3 x 106/mL, cuja obtenção foi descrita acima, foi colocado em

cada um de sete poços de uma placa (para os grupos injetados com salina ou pBK-CMV vazio do

protocolo de imunização no qual plasmídeos foram (i) administrados isoladamente e para todos

os grupos do protocolo de imunização no qual uma (ii) mistura de plasmídeos foi utilizada), em

cada um de quatro poços de uma placa [demais grupos do protocolo (i)] e em cada um seis poços

de uma placa (para os grupos de animais do protocolo de imunização do tipo DNA

primer/proteína booster). Em seguida, em cada um dos poços, foram acrescentados 300 µL de

RMPI suplementado, 300 µL de concanavalina A [4 µg/mL ou 1,5 µg/mL para células de

animais utilizados no protocolo de imunização (iii)], 300 µL de antígeno bruto de L. chagasi [20

µg/mL, apenas para o células de animais utilizados no protocolo de imunização (i) e (ii), 300 µL

de Lc9 a 20 µg/mL ( para todos os grupos experimentais) e 300 µL de Lc14 ou Lc18 a 20 µg/mL

[para os grupos experimentais utilizados nos protocolos de imunização (i) e (ii)]. As células

foram incubadas durante 48 horas em estufa a 37º C, em atmosfera úmida com 5% CO2. Após

este período, o sobrenadante de cada poço foi coletado em tubos para microcentrífuga de 1,5 mL

e centrifugado a 280 x g, durante 5 minutos, à temperatura ambiente, para a remoção de células e

estocado a -20º C, até o momento do uso.

ELISA para quantificação de IFN-γγγγ, IL-4 e IL-5 de camundongo

Ensaios imunoenzimáticos de captura (ELISA) foram utilizados para a mensuração da

concentração de IFN-γ, IL-4 e IL-5 murinos presentes nos sobrenadantes de esplenócitos

cultivados conforme descrição acima. Para a sensibilização das placas de microtitulação de 96

poços (“High Binding”; Corning Incorporated Life Sciences) anticorpos monoclonais de rato

anti-IFN-γ, anti-IL-4 e anti-IL-5 murino (BD Pharmigen) foram usados na concentração de 2

µg/mL, e aplicados um volume de 50 µL/poço, seguindo-se a incubação durante 16 horas em

câmara úmida, a 4º C. Os poços foram lavados duas vezes com 200 µL/ poço de PBS-T e em

seguida, 200 µL/ poço de PBS contendo 10% de soro fetal bovino (CULTILAB) foram

65

adicionados para bloquear os sítios de ligação livres, por 2 horas em câmara úmida, a temperatura

ambiente. Diluições duplas e seriadas de IFN-γ recombinante (BD pharmingem), IL-4

(sobrenadante de células transfectadas) e IL-5 murinos recombinante (BD Pharmigen) foram

usadas em duplicatas de poços, no volume de 100 µL/poço, para a elaboração da curva de

calibração em cada placa utilizada. As curvas de calibração variavam de 30 ng/mL a 0,029 ng/mL

para IFN-γ e de 5000 pg/mL a 4 pg/mL para IL-4 e IL-5, além de somente o diluente das

amostras como branco do ensaio. As amostras do sobrenadante de cultura foram testadas em

duplicatas com 100 µL/poço, sem diluições prévias, ou diluídas a 1:2 ou 1:5, em pool ou

individualmente, por 4 horas em câmara úmida, a temperatura ambiente. Após 4 lavagens dos

poços com PBS-T, 100 µL de anticorpos biotinilados anti-IFN-γ, anti-IL-4 e anti-IL-5 produzidos

em rato (BD Pharmigen), usados na concentração de 2 µg/mL, foram aplicados por poço e

incubados por 45 minutos em câmara úmida, a temperatura ambiente. Em seguida, foram feitas 6

lavagens com PBS-T e 100 µL/poço de avidina conjugada a peroxidase (SIGMA), estocada a 1

mg/mL e, diluída a 1:400 foram adicionados e incubados por mais 30 minutos, sob as mesmas

condições. Os poços foram lavados oito vezes com PBS-T e a reação foi revelada pela adição de

100 µL/poço do substrato peróxido de hidrogênio preparado pela mistura de 1mL de cromógeno

TMB a 1 mg/mL em DMSO, 9 mL de tampão citrato-fosfato pH 5,0 e 2µL de peróxido de

hidrogênio a 30 volumes. A reação foi neutralizada com a adição de 50 µL de ácido fosfórico,

diluído a 1:20 (v/v). A leitura da densidade óptica a 450 nm foi realizada em um

espectrofotômetro (Spectramax Precison Microplate Reader, Molecular Devices Corporation,

Sunnyvale, CA, EUA) usando o programa de computação Softmax Pro versão 5.0 (Molecular

Devices Corporation). A média dos valores de densidade óptica foi usada para a elaboração da

curva de calibração e determinação da concentração de cada uma das citocinas das amostras,

usando-se o programa de computação GraphPad, PRISM, versão 4.0 (GraphPad Software, Inc).

Posteriormente, a concentração foi corrigida pelo fator de diluição utilizado.

66

4.6. Avaliação de proteção contra desafio com Leishmania chagasi

4.6.1. Determinação de carga parasitária

A capacidade de proteínas recombinantes de L. chagasi em induzir resposta imune capaz

de conferir proteção contra e/ou controle da infecção por L. infantum/chagasi, foi determinada

pela avaliação da carga parasitária em animais imunizados e posteriormente desafiados pela

injeção de formas promastigotas do parasito. A carga parasitária de cada animal foi determinada

pela avaliação microscópica da presença de formas promastigotas em diluições de macerado de

baço através de ensaio de diluição limitante (BUFFET et al., 1995). Resumidamente, o baço de

cada animal foi removido assepticamente, como descrito no item 4.4.2.1, e pesado em balança de

precisão (Gehaka Ind. e Com. eletro-eletrônica, São Paulo, Brasil). Em seguida, os baços foram

macerados com o auxílio de um embôlo de seringa em 2 mL de meio de cultura de Schneider

suplementado com 20% de SFB (meio de Schneider suplementado), resultando em um volume de

aproximadamente 2,2 mL e uma diluição de aproximadamente 1/10. Para soltar os grumos

celulares, o macerado foi passado através de uma agulha de 21G acoplada a uma seringa de 3

mL. Em placas de microtitulação de 96 poços, estéreis, tratadas para cultivo celular, foi

adicionado um volume de 180 µL de meio de cultura de Schneider suplementado da 1a linha de

poços (linha A) até a 8a linha de poços (linha H). Foi analisado macerado de baço de dois animais

em cada placa, cada um em sextuplicata de poços. Portanto, em cada seis poços da 1a linha de

uma placa (linha A) foram adicionados 20 µL de macerado de baço de um animal, diluído

previamente a aproximadamente 1/10, resultando em uma diluição de aproximadamente 1/100.

Em seguida, realizou-se diluição seriada, com volume de 20 µL nos 180 µL da linha B (diluições

seriadas de 1/10) até a última linha da placa (linha H). O mesmo volume foi descartado após

homogeneização na linha H. As placas foram incubadas em estufa BOD a 25oC. A presença ou

ausência de Leishmania foi avaliada a partir de observações realizadas 7 e 15 dias após o início

da incubação. O título foi determinado, para cada um de seis poços da sextuplicata de cada

animal, como a recíproca da última diluição onde foi possível visualizar pelo menos uma

Leishmania, e, em seguida, calculando-se a média geométrica da recíproca dos seis títulos

obtidos. Para o cálculo da carga parasitária utilizaram-se as seguintes fórmulas:

67

Carga parasitária (no de parasitos/g de tecido) = média geométrica das recíprocas dos

títulos/peso da secção de baço macerado (g) x 100 (recíproca da fração do baço macerado

inoculado no 1o poço).

Carga parasitária total = carga parasitária x peso total do baço (g)

4.7. Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas através dos testes paramétricos de análise de

variância (ANOVA) e a comparação entre os grupos foi realizada pelo pós-teste Tukey. O valor

fixado para significância estatística foi de p < 0.05.

68

5. RESULTADOS

5.1. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados com plasmídeos codificando

proteínas de L. chagasi

5.1.1. Avaliação da resposta imune humoral

A indução de resposta imune humoral em camundongos injetados com pBK-CMV-Lc9, pBK-

CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18 foi avaliada em amostras de soro obtidas 10 dias

após três séries de injeção de plasmídeo. Os resultados da avaliação da produção de anticorpos

específicos, realizada por ELISA, foram descritos abaixo.

Os grupos de camundongos injetados com pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14, mas não os

injetados com pBK-CMV-Lc13 ou pBK-CMV-Lc18, produziram anticorpos da classe IgG reativos

com o extrato bruto de antígenos de L. chagasi (Figura 1). A comparação das médias dos valores de

densidade óptica revelou diferença estatisticamente significante entre os grupos (ANOVA, p <

0,001). Comparação adicional mostrou diferenças estatisticamente significativas tanto entre a média

dos valores de densidade óptica (X ± SD) dos grupos injetados com pBK-CMV-Lc9 (0,257 ± 0,059) e

pBK-CMV-Lc14 (0,477 ± 0,086; Tukey, p < 0,001) quanto entre a média do grupo pBK-CMV-Lc9

ou do grupo pBK-CMV-Lc14 e a dos demais grupos (Tukey, p < 0,001). A relação entre todos os

grupos foi: pBK-CMV-Lc14 > pBK-CMV-Lc9 > pBK-CMV-Lc13 = pBK-CMV-Lc18 = pBK-CMV

vazio = salina (Tukey, p < 0,05).

Em análise subseqüente, para mensuração de anticorpos das subclasses IgG2a e IgG1 reativos

com o extrato bruto de antígenos, foi observado que o grupo injetado com pBK-CMV-Lc14 produziu

anticorpos tanto de isotipo IgG2a (D.O.450 nm de 0,660 ± 0,137) como IgG1 (0,272 ± 0,101)

enquanto que o grupo injetado com pBK-CMV-Lc9 produziu anticorpos apenas de isotipo IgG2a

(0,276 ± 0,103; Figura 1). A comparação das médias de densidade óptica, correspondentes à

mensuração de IgG2a ou de IgG1 revelou diferença estatisticamente significativa entre os grupos

(ANOVA, p < 0,0001 para IgG2a e para IgG1). Além disso, a comparação de cada dois grupos entre

si indicou que a média de densidade óptica obtida para IgG2a tanto do grupo pBK-CMV-Lc9 (Tukey,

p < 0,01) como do grupo pBK-CMV-Lc14 (Tukey, p < 0,001) foi significativamente maior do que a

média dos grupos controles Salina e pBK-CMV vazio. Finalmente, a média de densidade óptica

69

obtida para IgG1 do grupo pBK-CMV-Lc14 foi significativamente superior a média de todos os

outros grupos (Tukey, p < 0,001). A proporção da média de densidade óptica, relacionada à

mensuração de IgG2a e de IgG1, para o grupo injetado com pBK-CMV-Lc9 e para o grupo injetado

com pBK-CMV-Lc14 foi de 2,10 ± 0,83 e 2,78 ± 1,25.

A avaliação da produção de anticorpos reativos a cada uma das proteínas recombinantes de L.

chagasi (Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18) foi avaliada para cada grupo de animais injetados com plasmídeos

pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18.

No ensaio para avaliação de anticorpos da classe IgG reativos a Lc9, os valores de densidade

óptica (X ± SD) obtidos para o grupo de animais injetados com pBK-CMV-Lc9 foram

significativamente maiores (1,827 ± 0,774; ANOVA, p < 0,0001, Tukey, p < 0,001, Figura 2A) do

que os valores obtidos para os grupos de animais que receberam salina ou pBK-CMV vazio.

Adicionalmente, os valores de densidade óptica referentes à mensuração de anticorpos das subclasses

IgG2a e IgG1 foram estatisticamente maiores (1,545 ± 0,379 e 0,619 ± 0,279, ANOVA, p < 0,0001,

Tukey, p < 0,001) no grupo de camundongos injetados com pBK-CMV-Lc9 do que nos grupos Salina

e pBK-CMV vazio (Figura 2A). Embora ambas subclasses de IgG tenham sido produzidos após a

injeção de pBK-CMV-Lc9, a proporção entre os valores de densidade óptica obtidos para IgG2a e

IgG1 das amostras do grupo de animais injetados com pBK-CMV-Lc9 foi de 3,29 ± 2,32.

Também na avaliação de anticorpos da classe IgG reativos a Lc14, os valores de densidade

óptica (X ± SD) obtidos para o grupo de grupo de animais injetados com pBK-CMV-Lc14 foram

estatisticamente superiores (1,525 ± 0,336; ANOVA p < 0,0001 e Tukey, p < 0,001) aos valores

obtidos para os grupos controles Salina e pBK-CMV vazio (Figura 2B). Da mesma forma, em análise

subseqüente, os valores de densidade óptica referentes à mensuração de anticorpos das subclasses

IgG2a e IgG1 foram estatisticamente maiores (1,198 ± 0,386 e 0,711 ± 0,536, respectivamente;

ANOVA, p < 0,0001, Tukey, p < 0,001) no grupo de camundongos injetados com pBK-CMV-Lc14

do que nos grupos Salina e pBK-CMV vazio (Figura 2B). A proporção entre os valores de densidade

óptica obtidos para IgG2a e IgG1 das amostras do grupo de animais injetados com pBK-CMV-Lc14

foi de 2,76 ± 2,28.

70

Figura 1. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1, reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente. Camundongos BALB/c (12 a 18 animais/grupo) foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Amostras de soro, obtidas 10 dias após a terceira série de injeção, foram diluídas de 1:100 para a detecção de anticorpos IgG e diluídas de 1:500 para a detecção de anticorpos IgG1 e IgG2a e avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL de extrato total de antígenos de L.

chagasi a 10 µg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores de densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação aos grupos controles.

0.0

0.5

1.0

*

*

Salin

apB

K-C

MV

EL

pBK-C

MV

Lc9

EL

pBK-C

MV

Lc13

EL

pBK-C

MV

Lc14

EL

pBK-C

MV

Lc18

EL

0.0

0.5

1.0

*

*

0.0

0.5

1.0

*

IgG

IgG1

IgG2a Den

sid

ade

Óp

tica

(45

0 n

m)

71

Os valores de densidade óptica encontrados no ensaio para mensuração de anticorpos da

classe IgG reativos a Lc13 para o grupo de animais injetados com pBK-CMV-Lc13 e para os grupos

controles (Salina e pBK-CMV vazio) foram semelhantes (dados não mostrados), indicando que não

houve produção de anticorpos específicos para Lc13 após a injeção de pBK-CMV-Lc13.

No ensaio para avaliação da produção de anticorpos da classe IgG reativos a Lc18, os valores

(X ± SD) de densidade óptica encontrados para amostras de animais do grupo injetado com pBK-

CMV-Lc18 (0,135 ± 0,025) foram muito próximas daquelas encontradas para amostras dos grupos

controles Salina e pBK-CMV vazio. No entanto, a comparação das médias das leituras de densidade

óptica revelou diferença estatisticamente significante entre os grupos (ANOVA p<0,0001). A

comparação de cada dois grupos entre si indicou que a média de densidade óptica obtida para o grupo

de animais injetados com pBK-CMV-Lc18 foi maior que a média dos valores obtidos para os grupos

controles (Tukey p < 0,001; Figura 3).

72

Figura 2. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1, reativos a Lc9 ou Lc14, de animais injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente. Camundongos BALB/c (12 a 18 animais/grupo) foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9 ou pBK-CMV-Lc14, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Amostras de soro, obtidas 10 dias após a terceira série de injeção, foram diluídas de 1:200 para a detecção de anticorpos IgG e diluídas de 1:3000 para a detecção de anticorpos IgG1 e IgG2a e avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL de Lc9 a 5 µg/mL ou Lc14 a 10 µg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores de densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação aos grupos controles.

Den

sid

ade

Óp

tica

(45

0 n

m)

*

Salin

a

pBK-CM

V EL

pBK-CM

V-Lc1

4 EL

Salin

a

pBK

-CM

V EL

0

1

2

3*IgG

0

1

2

3 *IgG2a

0

1

2

3

*

IgG1

IgG

*IgG2a

*

IgG1

pBK

-CM

V-Lc

9 EL

A B

73

Figura 3. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG, reativos a Lc18, de animais injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente. Camundongos BALB/c (12 a 18 animais/grupo) foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Amostras de soro, obtidas 10 dias após a terceira série de injeção, foram diluídas de 1:200 e avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL da proteína recombinante Lc18 a 1,5 µg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores de densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação aos grupos controles.

Salin

a EL

pBKCMV E

L

pBKCMV L

c18

EL

0.0

0.1

0.2

0.3

*

Den

sid

ad

e Ó

pti

ca (

450 n

m)

74

5.1.2. Avaliação da resposta imune celular

A resposta proliferativa e a produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5), por células esplênicas,

após a estimulação in vitro com um mitógeno (Con A), extrato bruto de antígenos de

L.infantum/chagasi ou proteína recombinante purificada (Lc9, Lc14 ou Lc18), foram avaliadas três a

quatro semanas depois de três séries de injeções de salina, plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-

Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-14 ou pBK-CMV-Lc18.

Os valores de cpm (X ± SD) encontrados quando as células esplênicas foram cultivadas, por

três dias, somente em meio de cultura ou meio de cultura contendo Con A ou, por cinco dias, em

meio de cultura ou meio de cultura contendo extrato bruto de antígeno de L. chagasi, estão

apresentados na Tabela 2. Os valores de índice de proliferação [valor de cpm de células cultivadas na

presença de estímulo (Con A) / valor de cpm de células cultivadas somente com meio de cultura]

correspondentes a cada grupo de animais foram obtidos. A comparação entre as médias dos valores

de índice de proliferação não revelou diferença significativa entre os grupos após estimulação

inespecífica com o mitógeno Con A (Figura 4A).

Tabela 2. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente.

Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (4 a 6 animais/grupo). Esplenócitos foram obtidos entre três a quatro semanas após as injeções e cultivados a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e Métodos.

Condições de cultura

3 dias 5 dias

Grupos de camundongos

Meio de cultura

Con A

(2 µg/mL) Meio de cultura

Extrato bruto de antígenos L. chagasi

(10 µg/mL)

Salina EL 277 ± 83 13740 ± 4421 410 ± 353 510 ± 247

pBK-CMV EL 249 ± 121 11060 ± 4544 262 ± 97 496 ± 177

pBK-CMV-Lc9 EL 289 ± 133 11300 ± 4868 311 ± 168 760 ± 405

pBK-CMV-Lc13 EL 384 ± 271 10770 ± 5635 411 ± 74 805 ± 162

pBK-CMV-Lc14 EL 414 ± 165 13740 ± 5389 568 ± 250 934 ± 311

pBK-CMV-Lc18 EL 488 ± 274 11550 ± 4866 357 ± 134 766 ± 417

75

A avaliação da produção de citocinas no sobrenadante das culturas de células esplênicas

mantidas em cultivo por 48 horas com Con A foi realizada por ELISA utilizando-se anticorpos

comerciais específicos. A produção de IFN-γ foi observada em todos os grupos avaliados (Figura

4C). A comparação das médias dos valores de concentração de IFN-γ obtido para cada grupo não

apresentou diferença significativa (Figura 4C). Os valores correspondentes a concentração de IFN-γ

(ng/mL) presente no sobrenadante das culturas de células esplênicas mantidas em cultivo por 48 horas

apenas em meio de cultura foram de 0,6 ± 1,1 para o grupo injetado com salina; 0,3 ± 0,5 para o

grupo injetado com pBK-CMV vazio; 0,3 ± 0,4 para o grupo injetado com pBK-CMV-Lc14 e não

determinado (ND) para os grupos injetados com pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13 ou pBK-CMV-

Lc18. As citocinas IL-4 e IL-5 não foram detectadas no sobrenadante das culturas mantidas apenas

em meio de cultura, mas foram detectadas nos sobrenadantes das células estimuladas com Con A

(dados não mostrados). No entanto, os valores da concentração de IL-4 e de IL-5 encontrados após

estimulação com Con A foram muito próximos aos valores do limite de detecção do ensaio que

correspondem a 20 pg/mL e 40 pg/mL, respectivamente.

Já quando esplenócitos foram cultivados na presença de extrato bruto de antígenos de L.

chagasi, os valores de índice de proliferação encontrados não apresentaram diferença entre os grupos

(Figura 4B). Os valores de concentração de IFN-γ (Figura 4D), IL-4 e IL-5 (dados não mostrados),

avaliados no sobrenadante de células cultivadas por 48 horas meio de cultura contendo extrato bruto

de antígeno de L.infantum/chagasi permaneceram abaixo do limite de detecção do ensaio em todos os

grupos avaliados.

A resposta proliferativa e a capacidade de produção de citocinas por células esplênicas foram

avaliadas após estimulação in vitro com Lc9, Lc14 e Lc18. A proteína recombinante Lc13 purificada

para avaliações in vitro apresenta um pequeno fragmento de β-galactosidase, peptídeo presente

também na porção N-terminal da proteína codificada in vivo pelo plasmídeo pBK-CMV. Dessa

forma, a avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas dos animais

do grupo injetado com pBK-CMV-Lc13, realizada a partir da estimulação com a proteína purificada

descrita acima, ficou comprometida por apresentar dados que não discriminam entre resposta imune

específica para Lc13 ou para β-galactosidase (dados não mostrados).

76

Figura 4. Avaliação de proliferação celular e produção de IFN-γ por células esplênicas de camundongos injetados com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, após cultivo com concanavalina A (Con A) ou extrato bruto de L. chagasi. Camundongos BALB/c (4 a 6 animais/grupo), previamente injetados com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL), foram sacrificados cerca de 3 a 4 semanas após a terceira série de injeção. Células esplênicas foram estimuladas com Con A a 2 µg/mL (A e C) ou extrato bruto de antígenos de L. chagasi a 10 µg/mL (B e D). Para a avaliação da proliferação (A e B), o cultivo foi realizado por 3 dias (Con A) ou 5 dias (extrato bruto) a 37oC e 5% de CO2 em atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (C e D), sobrenadantes das culturas de células, nas mesmas condições supracitadas, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA, individualmente (C) ou como uma mistura de partes iguais de sobrenadante por grupo (D). Os gráficos mostram valores de índice de proliferação (A e B) e concentração de IFN-γ (ng/mL, C e D). Os símbolos (A e B) representam valores individuais e média aritmética de cada grupo e as barras representam médias aritméticas ± SD de cada grupo (C e D).

0

5

10

25456585

100

200

300A B

Salin

a EL

pBK-CM

V EL

pBK-CM

V-Lc9

EL

pBK-CM

V-Lc1

3 EL

pBK-CM

V-Lc1

4 EL

pBK-CM

V-Lc1

8 EL

0

10

20

30

40C

Ìndi

ce d

e P

rolif

eraç

ão

IFN

- γγ γγ(n

g/m

L)

Salin

a EL

pBK-CM

V EL

pBK-CM

V-Lc9

EL

pBK-CM

V-Lc1

3 EL

pBK-CM

V-Lc1

4 EL

pBK-CM

V-Lc1

8 EL

D

Con A Extrato de antígenosL. chagasi

77

Os valores de cpm (X ± SD) encontrados quando esplenócitos foram cultivados, por cinco

dias, somente com meio de cultura ou meio de cultura contendo Lc9, Lc14 ou Lc18, estão

apresentados na Tabela 3. A comparação das médias dos valores dos índices de proliferação não

revelou diferença significativa entre os grupos em qualquer das condições testadas (Figura 5A, B e

C). Também não houve diferença entre as médias dos valores de concentração de IFN-γ, avaliado no

sobrenadante das células, obtido após o cultivo por 48 horas com cada uma das proteínas

recombinantes (Figura 5D, E e F). Já os valores de concentração de IL-4 e IL-5 estiveram sempre

abaixo do limite de detecção do ensaio (dados não mostrados).

Tabela 3. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos cultivados na presença ou na ausência de proteínas recombinantes de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente.


5 dias


Meio de cultura

Lc9 (10 µg/mL)

Lc14 (10 µg/mL)

Lc18 (10 µg/mL)

Salina EL 410 ± 353 1478 ± 192 1165 ± 296 3208 ± 2055

pBK-CMV EL 262 ± 97 2578 ± 1241 1264 ± 228 2901 ± 992 pBK-CMV-Lc9 EL 311 ± 168 1395 ± 229 -a - a

pBK-CMV-Lc14 EL 568 ± 250 - a 1588 ± 606 - a

pBK-CMV-Lc18 EL 489 ± 327 - a - a 3945 ± 117

Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (4 a 6 animais/grupo). Esplenócitos foram obtidos entre três a quatro semanas após as injeções e cultivados a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e Métodos. a não realizado

78

Figura 5. Avaliação de proliferação celular e produção de IFN-γ por células esplênicas de camundongos injetados com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, após cultivo com proteínas recombinantes de L. chagasi. Camundongos BALB/c (4 a 6 animais/grupo), previamente injetados com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9; pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL) foram sacrificados cerca de 3 a 4 semanas após a terceira série de injeção. Células esplênicas foram estimuladas com Lc9, Lc14 e Lc18 a 10 µg/mL. Para a avaliação da proliferação celular (A, B e C) o cultivo foi realizado por 5 dias a 37oC e 5% de CO2 em atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (D, E e F), sobrenadantes das culturas de células, nas mesmas condições supracitadas, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA. Os gráficos mostram valores de índice de proliferação (A, B e C) e concentração de IFN-γ (ng/mL, D, E e F).Os símbolos (A, B e C) representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas ± SD de cada grupo (D, E e F).

0

5

10

15

2020

40

60

80A B C

Índi

ce d

e P

rolif

eraç

ão

Salin

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pBK-CM

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pBK-CM

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0

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pBK-CM

V EL

pBK-CM

V-Lc1

8 EL

F

IFN

- γγ γγ(n

g/m

L)

Lc9 Lc14 Lc18

79

5.1.3. Avaliação da resposta imune humoral após desafio com L. chagasi

Os resultados da avaliação da produção de anticorpos específicos, realizada por ELISA, em

amostras de soro obtidas cerca de 60 dias após a injeção com promastigotas de L.infantum/chagasi

estão descritos a seguir.

Anticorpos da classe IgG reativos com o extrato bruto de L. chagasi foram detectados em

amostras de soro dos grupos de camundongos desafiados pela injeção com promastigotas de L.

chagasi que haviam sido previamente injetados com pBK-CMV-Lc9 ou pBK-CMV-Lc14 (Figura 6).

A comparação das médias dos valores de densidade óptica revelou que os valores de densidade óptica

(X ± SD) obtidos para os grupos injetados com pBK-CMV-Lc9 (0,237 ± 0,079) foram superiores

apenas em relação aos valores encontrados para o grupo de animais injetados apenas com salina, sem

infecção enquanto que a média dos valores de densidade óptica obtida para amostras do grupo pBK-

CMV-Lc14 (0,569 ± 0,100) foi superior aos valores obtidos para todos os demais grupos (ANOVA, p

< 0,0001 e Tukey, p < 0,05). A relação entre todos os grupos foi a seguinte: pBK-CMV-Lc14 > pBK-

CMV-Lc9 > Salina sem infecção = Salina = pBK-CMV vazio = pBK-CMV-Lc13 = pBK-CMV-Lc18

(Tukey, p < 0,05).

Posteriormente, em análise para a mensuração de anticorpos das subclasses IgG2a e IgG1

reativos com o extrato bruto de antígenos, anticorpos de ambas subclasses foram detectados em

amostras do grupo de animais injetados previamente com pBK-CMV-Lc14 e apresentaram valores de

densidade óptica de 0,410 ± 0,080 e 0,238 ± 0,127, respectivamente (Figura 6). A comparação

estatística entre as médias de densidade óptica obtidas para cada grupo avaliado revelou que os

valores encontrados em amostras do grupo previamente injetado com pBK-CMV-Lc14 foram

maiores que os valores encontrados para amostras dos demais grupos (ANOVA, p < 0,0001 para

IgG2a e para IgG1 e Tukey, p < 0,05). A proporção da média de densidade óptica, relacionada à

mensuração de IgG2a e de IgG1 para o grupo pBK-CMV-Lc14, foi de 2,19 ± 1,29.

80

Figura 6. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1 reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi em animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente, .após a infecção por L. chagasi. Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram previamente submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Aproximadamente 30 dias após as injeções supracitadas, cada grupo, exceto 6 animais do grupo Salina (Salina EL s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L.infantum/chagasi por via intraperitonial. Amostras de soro, obtidas aproximadamente 60 dias após o desafio, foram diluídas de 1:100 para a detecção de anticorpos IgG e diluídas de 1:500 para a detecção de anticorpos IgG1 e IgG2a e avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL de extrato total de antígenos de L. chagasi a 10 µg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores de densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação ao grupo salina, sem infecção.

0.0

0.5

1.0

*

*

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de Ó

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50 n

m)

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L

pBK-CMV-L

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/ infec

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0.0

0.5

1.0

*

0.0

0.5

1.0

*

IgG2a

IgG1

81

A avaliação da produção de anticorpos reativos com as proteínas recombinantes Lc9 e Lc14

foi avaliada, por ELISA, em amostras de soro obtidas após a injeção de promastigotas de L. chagasi.

A comparação das médias dos valores de densidade óptica obtidos em ELISA para detecção de

anticorpos anti-Lc9 e anti-Lc14 revelou diferença estatisticamente significativa entre os grupos

(ANOVA, p < 0,0001). Comparação adicional mostrou que os valores (X ± SD) de densidade óptica

obtidos para o grupo injetado previamente com pBK-CMV-Lc9 (2,412 ± 0,249) ou com pBK-CMV-

Lc14 (1,687 ± 0,419) foi superior aos valores obtidos para os grupos controles (Tukey, p < 0,05).

A determinação das subclasses de anticorpos IgG1 e IgG2a reativos com as proteínas

recombinantes não foi realizada em amostras de soro obtidas após a injeção de L. chagasi.

82

Figura 7. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG reativos a proteínas recombinantes de L. chagasi em animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente, .após a infecção por L. chagasi. Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram previamente submetidos a injeção com foram previamente submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9 ou pBK-CMV-Lc14, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Aproximadamente 30 dias após as injeções supracitadas, cada grupo, exceto 6 animais do grupo Salina (Salina EL s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L.infantum/chagasi por via intraperitonial. Amostras de soro, obtidas aproximadamente 60 dias após o desafio, foram diluídas de 1:200 e avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL de Lc9 a 5 µg/mL (A) ou 100 µL de Lc14 a 10 µg/mL. Os gráficos mostram valores de densidade óptica correspondentes a mensuração de IgG anti-Lc9 (A) e de IgG anti-Lc14 (B). Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores de densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação aos grupos controles.

Salin

a EL s

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Salin

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pBK-CM

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pBK-CM

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2

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sida

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ptic

a (4

50 n

m)

83

5.1.4. Avaliação da resposta imune celular após desafio com L infantum/chagasi

A resposta proliferativa e a capacidade de produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5) após

estimulação in vitro de esplenócitos murinos com Con A, extrato bruto de antígenos de

L.infantum/chagasi ou proteína recombinante purificada (Lc9, Lc14 ou Lc18) foram avaliadas oito

semanas depois da infecção de camundongos com promastigotas de L.infantum/chagasi, previamente

submetidos a três séries de injeções de salina, plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9, pBK-

CMV-Lc13, pBK-CMV-14 ou pBK-CMV-Lc18. Os resultados são apresentados abaixo.



meio de cultura ou meio de cultura contendo extrato bruto de antígenos de L. chagasi, estão

apresentados na Tabela 4.

A comparação dos valores de índice de proliferação encontrados, com base nos valores de

cpm, não apresentou diferença estatisticamente significante entre os grupos após estimulação

inespecífica com Con A (Figura 8A).

Quando as células foram mantidas em cultura por 48 horas na presença de Con A houve

também a indução da produção de IFN-γ, IL-4 e IL-5 em todos os grupos avaliados, como

demonstrado pela mensuração de cada citocina no sobrenadante das culturas (Figura 8C, E e G). A

comparação dos valores de concentração de IFN-γ não revelou diferença significante entre os grupos.

A concentração de IFN-γ, IL-4 e IL-5, presente no sobrenadante da cultura de esplenócitos após

cultivo somente em meio de cultura por 48 horas, esteve sempre abaixo do limite de detecção do

ensaio (dados não mostrados).

Já quando esplenócitos foram cultivados na presença de extrato bruto de antígenos de L.

chagasi, os valores de índice de proliferação encontrados não apresentaram diferença entre os grupos

(Figura 8B).

Para avaliação da produção de citocinas as células foram cultivadas por 48 horas na

presença de extrato bruto de antígenos de L. chagasi. Os valores de concentração de IFN-γ,

detectado no sobrenadante das culturas, estiveram abaixo ou muito próximo ao valor de limite de

detecção do ensaio (0,1 ng/mL), exceto para o grupo injetado com pBK-CMV vazio que

apresentou 0,6 ± 1,2 ng/mL de IFN-γ no sobrenadante (Figura 8D). No entanto, este valor não

foi estatisticamente superior aos valores encontrados para os demais grupos. Da mesma forma,

84

os níveis de IL-4 e IL-5 estiveram abaixo do limite de detecção do ensaio que correspondem a 20

pg/mL e 40 pg/mL, respectivamente (Figura 8F e H).

Tabela 4. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos de cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos submetidos previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e desafiados com promastigotas de L. chagasi.


3 dias 5 dias


Meio de cultura

Con A (2 µg/mL)

Meio de cultura


(10 µg/mL) Salina sem infecção 744 ± 403 17490 ± 8344 2174 ± 812 3102 ± 1496 Salina EL 699 ± 402 16790 ± 12830 2273 ± 734 2999 ± 1550

pBK-CMV EL 543 ± 347 13240 ± 10720 2052 ± 1112 3671 ± 2286

pBK-CMV-Lc9 EL 601 ± 588 20190 ± 13410 2280 ± 841 3109 ± 1848

pBK-CMV-Lc13 EL 675 ± 308 20360 ± 11360 2130 ± 1084 3361 ± 2162

pBK-CMV-Lc14 EL 759 ± 627 19920 ± 20870 1369 ± 451 2194 ± 1353

pK-CMV-Lc18 EL 489 ± 332 21100 ± 11720 1625 ± 770 2765 ± 1973

Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (6 animais/grupo). Células esplênicas foram obtidas aproximadamente 60 dias após a injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L.

chagasi e cultivadas a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e Métodos.

85

0

10

2020

60

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V-Lc1

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H


86

Figura 8. Avaliação de resposta proliferativa e produção de citocinas por células esplênicas de camundongos, após injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, em animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente. Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram previamente submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, os animais foram desafiados pela injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi, exceto 6 animais do grupo Salina (Salina EL s/ inf). A proliferação celular (A e B) e a produção de citocinas, IFN-γ (C, D), IL-4 (E, F) e IL-5 (G e H) foram avaliadas cerca de 60 dias após a infecção. Esplenócitos foram estimulados com Con A a 2 µg/mL (A, C, E e G) ou extrato bruto de L. chagasi a 10 µg/mL (B, D, F e H) a 37o C e 5% de CO2 em atmosfera úmida. Para a avaliação da proliferação, o cultivo foi realizado por 3 dias (Con A) ou 5 dias (extrato bruto). Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), IL-4 e IL-5 (pool), sobrenadantes das culturas de células, nas mesmas condições supracitadas, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA. Os símbolos representam valores individuais (A e B) e as barras representam médias aritméticas ± SD (C e D).

87

Os resultados correspondentes à avaliação da resposta proliferativa e da capacidade de

produção de citocinas após a estimulação in vitro com Lc9, Lc14 e Lc18 estão descritos abaixo.

O valor de índice de proliferação (X ± SD) encontrado quando as células esplênicas

obtidas do grupo previamente injetado com pBK-CMV-Lc9 foram cultivadas por cinco dias na

presença de Lc9 (10 µg/mL) foi de 2,9 ± 3,9 (Figura 9A). Quando Lc9 foi utilizada em

concentrações menores (1 µg/mL ou 0,1 µg/mL) os valores de índice de proliferação encontrados

foram semelhantes ao apresentado acima (Figura 9B e C). Em nenhuma das condições testadas, a

comparação das médias dos valores de índice de proliferação de cada grupo apresentou diferença

estatística significativa entre os grupos. Os valores de cpm que deram origem a estes resultados

estão descritos na Tabela 5.

Já a produção de IFN-γ, avaliada após a estimulação com Lc9 (10 µg/mL) por 48 horas,

foi observada no sobrenadante da cultura de células do grupo previamente injetado com pBK-

CMV-Lc9 (Figura 9D). O valor correspondente à concentração de IFN-γ (X ± SD), obtido para

este grupo, foi superior aos valores encontrados para os demais grupos (12,78 ± 9,38 ng/mL;

ANOVA, p = 0,0075 e Tukey, p<0,01 em relação ao grupo injetado apenas com salina, sem

infecção e p<0,05 em relação ao grupo injetado com salina e desafiado com L. infantum/chagasi).

Na mesma condição descrita acima, a produção de IL-4 ou de IL-5 não foi detectada em nenhum

dos grupos avaliados (dados não mostrados).

Tabela 5. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos cultivados com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e desafiados com promastigotas de L. chagasi.




5 dias


Meio de cultura

Lc9 (0,1 µg/mL)

Lc9 (1 µg/mL)

Lc9 (10 µg/mL)

Salina sem infecção 2625 ± 1036 5550 ± 2105 6485 ± 1356 6893 ± 2287

Salina EL 2753 ± 1258 4994 ± 2502 5303 ± 2063 6980 ± 2982

pBK-CMV EL 2131 ± 889 3840 ± 1554 4084 ± 2171 4748 ± 1502

pBK-CMV-Lc9 EL 1507 ± 622 4263 ± 1722 3799 ± 2424 4212 ± 3867

88

Salina

EL

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fec

Salina

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pBK-C

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pBK-C

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N- γγ γγ

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89

Figura 9. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de camundongos previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente, após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc9 recombinante. Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram previamente submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou, pBK-CMV-Lc9, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, os animais foram desafiados pela injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi, exceto 6 animais do grupo Salina (Salina EL s/ inf). A proliferação celular (A, B e C) e a produção de IFN-γ (D) foram avaliadas cerca de 60 dias após a infecção. Esplenócitos foram cultivados com Lc9 nas concentrações de 10 µg/mL (A e D), 1 µg/mL (B) ou 0,1 µg/mL (C). Para a avaliação de proliferação, o cultivo foi realizado por 5 dias a 37oC e 5% CO2 em atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), sobrenadantes das culturas de células, estimuladas com Lc9 a 10 µg/mL, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA. Os símbolos representam valores individuais (A, B e C) e as barras representam médias aritméticas ± SD (D). * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey (p < 0,01 em comparação ao grupo Salina sem infecção e em relação ao grupo Salina infectado).

90

Os valores de cpm encontrados após o cultivo de células esplênicas obtidas de grupos de

camundongos injetados somente com salina ou injetados com salina, pBK-CMV vazio ou pBK-

CMV-Lc14 e desafiados pela injeção de L. chagasi, em meio de cultura ou meio de cultura contendo

Lc14, estão apresentados na Tabela 6. A comparação das médias dos índices de proliferação

revelou diferença significante entre os grupos quando as células esplênicas foram cultivadas na

presença de Lc14 a 0, 1 µg/mL (ANOVA, p = 0,0313) contudo, não mostrou diferença significante

quando tais células foram cultivadas em meio contendo Lc14 nas concentrações de 1 µg/mL ou 10

µg/mL (Figura 10A e 10B). Quando o índice de proliferação de esplenócitos submetidos à

estimulação com 0,1 µg/mL de Lc14 foram comparados entre os grupos houve diferença

estatística significante entre os animais previamente injetados com pBK-CMV-Lc14 (5,6 ± 2,7) em

relação aos demais grupos, previamente injetados com salina ou pBK-CMV vazio (Tukey, p < 0,05;

Figura 10C).

Em análise subseqüente, para mensuração da produção de IFN-γ no sobrenadante das culturas,

a comparação dos valores encontrados (X ± SD) não apresentou diferença estatística significante

entre os grupos avaliados (Figura 10D). Além disso, as citocinas IL-4 e IL-5 também não foram

detectadas no sobrenadante das culturas de nenhum dos grupos testados (dados não mostrados).

Tabela 6. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos cultivados com Lc14 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos previamente a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e desafiados com promastigotas de L. chagasi.




5 dias


Meio de cultura Lc14 (0,1 µg/mL)

Lc14 (1 µg/mL)

Lc14 (10 µg/mL)

Salina sem infecção 3099 ± 931 9151 ± 2167 9788 ± 5615 3548 ± 939,1 Salina EL 3813 ± 1728 8097 ± 2476 7898 ± 4323 2525 ± 828 pBK-CMV EL 2663 ± 1029 6381 ± 2356 6233 ± 3433 2452 ± 1523 pBK-CMV-Lc14 EL 1822 ± 1020 9110 ± 5017 9281 ± 6247 1975 ± 729

91

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IFN

- γγ γγ(n

g/m

L)

92

Figura 10. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de camundongos previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente, após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc14 recombinante. Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram previamente submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, ou pBK-CMV-Lc14, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, os animais foram desafiados pela injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi, exceto 6 animais do grupo Salina (Salina EL s/ inf). A proliferação celular (A, B e C) e a produção de IFN-γ (D) foram avaliadas cerca de 60 dias após a infecção. Esplenócitos foram cultivados com Lc14 recombinante nas concentrações de 10 µg/mL (A e D), 1 µg/mL (B) ou 0,1 µg/mL (C). Para a avaliação de proliferação, o cultivo foi realizado por 5 dias a 37oC e 5% CO2 em atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço. As células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), sobrenadantes das culturas de células, estimuladas com Lc14 a 10 µg/mL, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA. Os símbolos representam valores individuais (A, B e C) e as barras representam médias aritméticas ± SD (D). *p < 0,05 em comparação aos grupos Salina e pBK-CMV vazio infectados.

93

O cultivo de esplenócitos em meio de cultura apenas ou meio de cultura contendo Lc18 a 0,1

µg/mL e 1 µg/mL, com células obtidas de grupos de camundongos injetados somente com salina ou

infectados com L.infantum/chagasi, previamente injetados com salina, pBK-CMV vazio ou pBK-

CMV-Lc18, resultou em índices de proliferação cujos valores das médias não apresentaram diferença

estatística significante quando comparadas entre os grupos (Figura 11A e B). Os valores de cpm que

deram origem a estes resultados estão apresentados na Tabela 7.

Da mesma forma, a comparação dos valores de concentração de IFN-γ, mensurados no

sobrenadante das culturas obtidos após 48 horas na presença de 1 µg/mL de Lc18, não apresentou

diferença estatística entre os grupos (Figura 11C). Nas mesmas condições avaliadas, IL-4 e IL-5 não

foram detectadas no sobrenadante das culturas (dados não mostrados).

Um mapa qualitativo da resposta imune murina aos diferentes imunógenos utilizados para

injeção, antes e após o desafio com L. chagasi, está apresentado no Apêndice C.

Tabela 7. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos cultivados com Lc18 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com plasmídeos recombinantes, administrados isoladamente, e desafiados com promastigotas de L. chagasi.




5 dias


Meio de cultura

Lc18 (0,1 µg/mL)

Lc18 (1 µg/mL)

Salina sem infecção 3410 ± 1752 8544 ± 2184 2324 ± 632

Salina EL 3307 ± 1018 5882 ± 2430 1836 ± 713

pBK-CMV EL 2014 ± 843 5646 ± 2215 1474 ± 451

pBK-CMV-Lc18 EL 1414 ± 807 4135 ± 2284 1355 ± 376

94

Figura 11. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de camundongos previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente, após a injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc18 recombinante. Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram previamente submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, os animais foram desafiados pela injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi, exceto 6 animais do grupo Salina (Salina EL s/ inf). A proliferação celular (A, B e C) e a produção de IFN-γ (D) foram avaliadas cerca de 60 dias após a infecção. Esplenócitos foram cultivados com Lc18 recombinante nas concentrações de 1 µg/mL (A e C) ou 0,1 µg/mL (B). Para a avaliação de proliferação, o cultivo foi realizado por 5 dias a 37o C e 5% CO2 em atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), sobrenadantes das culturas de células, estimuladas com Lc18 a 1 µg/mL, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA, como descrito em Material e Métodos. Os símbolos representam valores individuais (A e B) e as barras representam médias aritméticas ± SD ( C).

0

2

4

6

8

10B

0

2

4

6

8

10A

Salin

a EL s

/ infe

c

Salin

a EL

pBK-CM

V EL

pBK-CM

V-Lc1

8 EL

0

5

10

15C

Índi

ce d

e P

rolif

eraç

ãoIF

N- γγ γγ

(ng/

mL

)

95

5.1.5. Avaliação de proteção contra infecção por L. chagasi.

Os resultados da avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por

L.infantum/chagasi, realizada por diluição limitante cerca de 8 semanas após a infecção, estão

descritos abaixo.

A injeção de pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18

não induziu proteção contra a infecção após a injeção de promastigotas de L.infantum/chagasi

(Figura 12A). No entanto, a comparação entre as médias dos valores de carga parasitária total

indicou diferença entre os grupos (ANOVA, p = 0,0491). Comparação adicional revelou que esta

diferença ocorreu apenas entre as médias dos grupos previamente injetados com pBK-CMV-Lc9

e pBK-CMV-Lc18 (Tukey, p<0,05). De fato, em dois de seis animais do grupo previamente

injetado com pBK-CMV-Lc9, não foi observada a presença de formas promastigotas na menor

diluição do macerado da secção de baço utilizado para avaliação da carga parasitária.

Além disso, não houve qualquer alteração relacionada ao tamanho do baço dos animais em

nenhum dos grupos infectados. Os valores encontrados (X ± SD), correspondentes ao peso do

baço, estão apresentados na Figura 12B.

96

Figura 12. Avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por L. chagasi em animais previamente injetados com plasmídeos recombinantes administrados isoladamente. Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram previamente submetidos a três séries de injeções com 50 µL de salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18, por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, os animais foram desafiados pela injeção intraperitonial de 1 x 107 promastigotas de L.infantum/chagasi, exceto 6 animais do grupo Salina (Salina EL s/ inf). Após aproximadamente 60 dias, os animais foram sacrificados e o baço foi utilizado para determinação da carga parasitária por ensaio de diluição limitante, como descrito em Material e Métodos. (A) carga parasitária total (log 10). (B) peso do baço em relação ao peso corporal (valores em %). Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey (p < 0,05) em relação ao grupo pBK-CMV-Lc18.

Salin

a EL s

/ infe

c

Salin

a EL

pBK-CM

V EL

pBK-CM

V-Lc9

EL

pBK-CM

V- Lc1

3 EL

pBK-CM

V-Lc1

4 EL

pBK-CM

V-Lc1

8 EL

0

1

2B

.

% b

aço/

peso

cor

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lca

rga

para

sitá

ria

tota

l (lo

g10)

0

2

4

6

8

10

*A

97

5.2. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados com uma combinação de

plasmídeos codificando proteínas de L. chagasi


Os resultados da avaliação da produção de anticorpos específicos, realizada por ELISA,

em amostras de soro obtidas 10 dias após três séries de injeção de uma mistura de plasmídeos

estão descritos abaixo.

A injeção de uma mistura (pool) de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-

CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18), na presença ou na ausência de plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-

12, e o mesmo pool de plasmídeos injetados sem eletroporação, induziu a produção de anticorpos

da classe IgG reativos a extrato bruto de antígenos de L. chagasi (Figura 13). A comparação das

médias dos valores de densidade óptica obtidos para cada grupo revelou diferença

estatisticamente significante (ANOVA, p < 0,0001). Comparação adicional entre os grupos,

usando-se o pós-teste Tukey, mostrou a seguinte relação: pool de plasmídeos + pIL-12 EL > pool

de plasmídeos EL = pool de plasmídeos > pBK-CMV = Salina (p < 0,05).

Posteriormente, a mensuração de anticorpos das subclasses IgG2a e IgG1 reativos a

extrato bruto de antígenos foi realizada. Anticorpos reativos com extrato bruto de antígenos de L.

infantum/chagasi de isotipo IgG2a foram detectados em todos os grupos que foram injetados com

pool de plasmídeos (Figura 13). A comparação estatística das médias de densidade óptica,

correspondentes à mensuração de IgG2a revelou diferença entre os grupos (ANOVA, p < 0,0001).

Além disso, comparação adicional entre as médias de densidade óptica obtidas para IgG2a

mostrou a seguinte relação: pool + pIL-12 EL > pool EL > pool s/ EL > pBK-CMV = Salina

(Tukey, p < 0,05). Finalmente, a medida de densidade óptica obtida para IgG1 do grupo injetado

apenas com pool de plasmídeo, sem eletroporação, foi a única com valor de média superior às médias

dos grupos controles Salina e pBK-CMV vazio (ANOVA, p < 0,003 e Tukey, p < 0,05). A proporção

IgG2a/IgG1 encontrada para os grupos que receberam eletroporação após as injeções, pool de

plasmídeos e pool de plasmídeos associado à pIL-12 e para o grupo injetado com o pool de

plasmídeos apenas, sem eletroporação foi de 3,89 ± 0,98; 5,18 ± 2,68 e 2,42 ± 1,31,

respectivamente.

98

Figura 13. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1, reativos ao extrato bruto de antígenos de promastigotas de L. chagasi, de animais injetados com um pool de plasmídeos recombinantes. Camundongos BALB/c (12 a 18 animais/grupo) foram submetidos a três séries injeções de salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou 200 µg de um pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18) acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1-scmur-IL-12 (50 µg), por via intramuscular seguido de eletroporação (EL). Um grupo de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem EL. Amostras de soro, obtidas 10 dias após a terceira série de injeção, foram diluídas de 1:100 para a detecção de anticorpos IgG e diluídas de 1:1000 para a detecção de anticorpos IgG1 e IgG2a e avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL de extrato total de antígenos de L. chagasi a 10 µg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores de densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação aos grupos controles.

Den

sid

ade

Óp

tica

(45

0 n

m)

Salina EL

pBK-CMV EL

pool plasm EL

pool plasm

+ pÍL-12 EL

pool plasm

0.0

0.5

1.0

* * *IgG

0.0

0.5

1.0* * *

0.0

0.5

1.0

*

IgG2a

IgG1

99



após a estimulação in vitro com um mitógeno (Con A), extrato bruto de antígenos de L. chagasi ou

proteína recombinante purificada (Lc9, Lc14 ou Lc18), foram avaliadas três a quatro semanas depois

de três séries de injeções de salina, plasmídeo pBK-CMV vazio, pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9,

pBK-CMV-13, pBK-CMV-14 e pBK-CMV-18) ou pool de plasmídeos acrescido de pcDNA3.1sc-

mur-IL-12 (p-IL-12) seguido de eletroporação (EL) ou ainda, pool de plasmídeos sem eletroporação.



meio de cultura ou meio de cultura contendo extrato bruto de antígenos de L.infantum/chagasi, estão

apresentados na Tabela 8.

A comparação dos valores de índices de proliferação [valor de cpm de células cultivadas na

presença de estímulo (Con A) / valor de cpm de células cultivadas somente com meio de cultura]

correspondentes a cada grupo de animais, não revelou diferença significativa entre os grupos (Figura

14A).

As suspensões de células esplênicas obtidas foram cultivadas também somente em meio de

cultura ou meio de cultura contendo Con A por 48 horas visando a avaliação da produção de

citocinas. A produção de IFN-γ, IL-4 e de IL-5 foi observada em todos os grupos avaliados (Figura

14C, E e G). Não houve diferença entre os grupos em relação a produção de IFN-γ como revelado

pela comparação entre as médias dos valores de concentração de IFN-γ obtidos. A produção de

IFN-γ, IL-4 ou de IL-5 não foi detectada no sobrenadante de células cultivadas somente em meio de

cultura.

Quando esplenócitos foram cultivados na presença de extrato bruto de antígenos de L.

chagasi por um período de cinco dias, os valores de índice de proliferação encontrados não

apresentaram diferença entre os grupos (Figura 14B). Os valores que deram origem a este resultado

estão apresentados na Tabela 8. Quando o cultivo das células foi realizado por 48 horas, para

avaliação da produção de citocinas, a concentração de IFN-γ (Figura 14D), IL-4 (Figura 14F) e IL-5

(Figura 14H) permaneceram abaixo do limite de detecção do ensaio em todos os grupos.

100

Tabela 8. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos.

Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (5-6 animais/grupo). Esplenócitos foram obtidos entre três a quatro semanas após as injeções e cultivados a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e Métodos.


3 dias 5 dias


Meio de cultura Con A (2 µg/mL)

Meio de cultura


(10 µg/mL) Salina EL 443 ± 419 15820 ± 2428 576 ± 437 781 ± 577

pBK-CMV EL 642 ± 362 12930 ± 5048 945 ± 599 1324 ± 597

pool plasm EL 800 ± 708 10030 ± 6097 1223 ± 1280 1708 ± 986

pool plasm + pIL-12 EL 409 ± 199 14940 ± 8137 670 ± 432 1016 ± 453

pool de plasm 390 ± 220

17130 ± 6632 478 ± 281

1119 ± 572

101

0

5

10

25456585

100

200

300A B

0

10

20

30C D

0

100

200

300

400 E

Ìndi

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e P

rolif

eraç

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N- γγ γγ

(ng/

mL

)

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pBK-CM

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sm E

L

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EL

pool pla

sm

0

100

200

300

400 G

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(pg

/mL

)IL

-5 (

pg/m

L)

F

Salin

a EL

pBK-CM

V EL

pool pla

sm E

L

pool pla

sm +

pIL

-12

EL

pool pla

sm

H


102

Figura 14. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de camundongos, injetados com um pool de plasmídeos recombinantes, após cultivo com concanavalina A (Con A) ou extrato bruto de antígenos de L. chagasi. Camundongos BALB/c (5 a 6 animais/grupo), foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18) acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg), por via intramuscular seguido de eletroporação (EL). Um grupo de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação. A avaliação da proliferação celular (A e B) e da produção de citocinas IFN-γ (C e D), IL-4 (E e F) e IL-5 (G e H) foram realizadas entre 3 e 4 quatro semanas após a terceira série de injeção. Esplenócitos foram cultivados com Con A a 2 µg/mL (A, C, E e G) ou extrato bruto de L .infantum/chagasi a 10 µg/mL (B, D, F e H). Para a avaliação de proliferação, o cultivo foi realizado por 3 dias (Con A) ou 5 dias (extrato bruto) a 37o C e 5% de CO2 em atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), IL-4 e IL-5 (pool), sobrenadantes das culturas de células, nas mesmas condições supracitadas, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA, como descrito em Material e Métodos.Os gráficos mostram valores de índice de proliferação (A e B) e concentração de IFN-γ (ng/mL, C e D), IL-4 (pg/mL, E e F) e IL-5 (pg/mL, G e H). Os símbolos (A e B) representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas ± SD de cada grupo (C e D).

103

A resposta proliferativa e a produção de citocinas foram avaliadas também após o cultivo de

células esplênicas em meio de cultura ou meio de cultura contendo Lc9, Lc14 ou Lc18. Os valores de

cpm referentes a estes resultados estão apresentados na Tabela 9.

Os valores de índices de proliferação obtidos após a estimulação de esplenócitos com Lc9,

Lc14 ou com Lc8 não apresentaram diferença estatisticamente significante entre os grupos

(Figura 15A, B e C).

A produção de IFN-γ, avaliada pela mensuração por ELISA no sobrenadante das culturas,

foi observada em alguns grupos de animais após o cultivo com as proteínas recombinantes

correspondentes (Figura 15D, E e F). Contudo, a comparação das médias de cada grupo revelou

diferença estatística significante apenas quando as células foram cultivadas na presença de Lc9

(ANOVA, p=0,0126). Comparação adicional, usando o pós-teste de Tukey, mostrou que a

produção de IFN-γ foi significantemente maior no grupo de animais injetados com pool de

plasmídeos + p-IL-12 EL (0,32 ± 0,2 ng/mL), apresentando a seguinte relação entre os grupos:

pool de plasmídeos + p-IL-12 EL > pool de plasmídeos sem eletroporação = pBK-CMV vazio >

pool de plasmídeos EL = Salina (p < 0,05) . As citocinas IL-4 e IL-5 não foram detectadas em

nenhum dos grupos em nenhuma das condições de cultivo, seja na presença de Lc9, Lc4 ou Lc18

(dados não mostrados).

Tabela 9. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos, cultivados na presença ou na ausência de proteínas recombinantes de L. chagasi.

Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (5 a 6 animais/grupo). Esplenócitos foram obtidos entre três a quatro semanas após as injeções e cultivados a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e Métodos. a células esplênicas cultivadas apenas em meio de cultura na mesma placa onde houve o cultivo com Lc9. b células esplênicas cultivadas apenas em meio de cultura na mesma placa onde houve o cultivo com Lc14 e Lc18.


5 dias


Meio de culturaa

Lc9 (10µg/mL)

Meio de culturab

Lc14 (10µg/mL)

Lc18 (10µg/mL)

Salina EL 624 ± 382 1668 ± 891 595 ± 559 2046 ± 544 3525 ± 944

pBK-CMV EL 945 ± 599 2579 ± 1321 672 ± 370 1886 ± 774 2340 ± 534

pool plasm EL 1447 ± 1292 696 ± 263 1505 ± 1545 1385 ± 403 2177 ± 510

pool plasm + pIL-12 EL 670 ± 432 2029 ± 885 942 ± 499 1843 ± 1022 4008 ± 4325

pool de plasm 478 ± 281 1518 ± 557 459 ± 275 1780 ± 647 2649 ± 840

104

Figura 15. Avaliação de proliferação celular e produção de IFN-γ por células esplênicas de camundongos injetados com um pool de plasmídeos recombinantes, após cultivo com proteínas recombinantes de L. chagasi. Camundongos BALB/c (5 a 6 animais/grupo), foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18) acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg), por via intramuscular seguido de eletroporação (EL). Um grupo de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação. A avaliação da proliferação celular (A, B e C) e da produção de IFN-γ (D, E e F) foi realizada entre 3 e 4 quatro semanas após a terceira série de injeção. Esplenócitos foram cultivados em meio de cultura, meio de cultura contendo Lc9 (A e D), Lc14 (B e E) ou Lc18 (C e F) a 10 µg/mL. Para a avaliação de proliferação, o cultivo foi realizado 5 dias a 37o C e 5% de CO2 em atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ, sobrenadante das culturas de células, nas mesmas condições supracitadas, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA. *ANOVA seguido de pós-teste de Tukey (p < 0,05) em comparação aos grupos pBK-CMV vazio e pool de plasmídeos sem eletroporação. Os símbolos (A e B) representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas ± SD de cada grupo (C e D).

0

5

10

15

2020

40

60

80A B C

Salin

a EL

pBK-CM

V EL

pool pla

sm E

L

pool pla

sm+p

IL-1

2 EL

pool pla

sm

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0D

*

Salin

a EL

pBK-CM

V EL

pool pla

sm E

L

pool pla

sm+p

IL-1

2 EL

pool pla

sm

E

Salin

a EL

pBK-CM

V EL

pool pla

sm E

L

pool plas

m+pIL

-12

EL

pool pla

sm

F

Índi

ce d

e P

rolif

eraç

ão

IFN

- γγ γγ(n

g/m

L)

Lc9 Lc14 Lc18

105

5.2.3. Avaliação da resposta imune humoral após desafio com L.infantum/chagasi

Os resultados da avaliação da produção de anticorpos específicos, realizada por ELISA, em

amostras de soro obtidas cerca de 60 dias após a injeção com promastigotas de L. chagasi foram

descritos abaixo.

Anticorpos da classe IgG reativos a extrato bruto de L. chagasi foram detectados em amostras

obtidas após o desafio com promastigotas, de grupos de animais previamente submetidos a três séries

de injeções com salina, pBK-CMV vazio, pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-13, pBK-

CMV-14 e pBK-CMV-18) ou pool de plasmídeos acrescido de pcDNA3.1sc-mu-IL-12 (p-IL-12),

todos estes grupos com injeção intramuscular seguida de eletroporação (EL) e ainda, um grupo

injetado com pool de plasmídeos sem eletroporação (Figura 16). Amostras de camundongos

somente injetados com salina, sem infecção, apresentaram valores de densidade óptica de 0,076 ±

0,012. A comparação das médias de cada grupo revelou diferença estatisticamente significativa entre

eles (ANOVA, p<0,0001). Comparação adicional mostrou a seguinte relação: pool + pIL-12 EL =

pool EL = pool s/ EL > Salina = Salina s/ inf = pBK-CMV vazio (Tukey, p < 0,01).

Em análise subseqüente, anticorpos das subclasses IgG2a e IgG1 reativos a extrato bruto

de antígenos foram mensurados (Figura 16). Anticorpos de isotipo IgG2a foram detectados nos

três grupos previamente injetados com pool de plasmídeos. A comparação das médias de

densidade óptica, correspondentes à mensuração de IgG2a, revelou diferença estatisticamente

significativa entre os grupos (ANOVA, p < 0,0001) e, por comparação adicional encontrou-se a

seguinte relação: pool + pIL-12 EL = pool EL = pool s/ EL > pBK-CMV = Salina = Salina s/ inf

(Tukey, p < 0,001). Já em relação à detecção de anticorpos de isotipo IgG1, a comparação das

médias de densidade óptica obtidas revelou diferença significativa entre os grupos (ANOVA, p <

0,0033), contudo, a comparação adicional pelo pós-teste de Tukey revelou diferença significante

apenas entre o grupo injetado com pool de plasmídeos sem eletroporação e os grupos Salina sem

infecção e Salina infectado (p < 0,05). Finalmente, a proporção IgG2a/IgG1 foi de 4,60 ± 1,96; 4,38

± 2,92 e 3,04 ± 1,51 para os grupos injetados com pool de plasmídeos seguido de eletroporação,

com ou sem pIL-12 e para o grupo injetado com pool de plasmídeos sem eletroporação,

respectivamente.

106

Figura 16. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1, reativos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção de promastigotas de L. chagasi. Camundongos BALB/c (5 a 6 animais/grupo) foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18) acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg) por via intramuscular, seguida de eletroporação (EL). Um grupo de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação. Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, cada grupo, exceto 6 animais do grupo salina (salina EL s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi por via intraperitonial. Amostras de soro, obtidas 10 dias após a terceira série de injeção, foram diluídas de 1:100 para a detecção de de anticorpos IgG e diluídas de 1:1000 para a detecção de anticorpos IgG1 e IgG2a e avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL de extrato total de antígenos de L. chagasi a 10 µg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores de densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação aos grupos controles.

0.0

0.5

1.0

* **

0.0

0.5

1.0

* **

0.0

0.5

1.0

*

IgG

IgG2a

IgG1

Salina EL

pBK-CMV EL

pool plasm EL

pool plasm

+ pÍL-12 EL

pool plasm

Salina s/ in

fec

Den

sid

ade

Óp

tica

(45

0 n

m)

107

5.2.4. Avaliação da resposta imune celular após desafio com L. chagasi

Células esplênicas de animais injetados com pool de plasmídeos, em qualquer das variações

testadas, com ou sem eletroporação, na presença ou na ausência de pIL-12, foram obtidas após

infecção experimental com promastigotas de L. chagasi e estimuladas in vitro com Con A, por três

dias, ou com extrato bruto de antígenos de L. chagasi, por 5 dias. Os valores de cpm encontrados,

para as condições descritas, estão apresentados na tabela 10.

A comparação entre as médias dos valores de índice de proliferação, encontrados após a

estimulação com Con A, não apresentou diferença estatisticamente significativa entre os grupos

(Figura 17A). Da mesma forma, a produção de IFN-γ e de IL-4 foi observada em todos os grupos

avaliados (Figura 17C e E). A comparação dos valores de concentração de IFN-γ obtidos para cada

grupo não apresentou diferença entre eles. Infelizmente, não foi possível avaliar a produção de IL-5

nestas mesmas amostras.

Os valores de índices de proliferação, correspondentes à condição onde extrato bruto de

antígenos de L. chagasi foi adicionado a cultura, não apresentaram valores de média

estatisticamente diferente entre os grupos (Figura 17B).

Na avaliação da produção de IFN-γ (Figura 17D), foi observado que em dois grupos

desafiados pela injeção de L. chagasi valores detectáveis de IFN-γ foram mensurados, animais

previamente injetados com salina (5,23 ± 12,14 ng/mL) e com pool de plasmídeos acrescido de pIL-

12 (5,34 ± 12,09 ng/mL). No entanto, quando as células de animais destes dois grupos foram

cultivadas somente em meio de cultura foi observada produção de IFN-γ (6,69 ± 11,98 ng/mL e 7,49

± 12,27 ng/mL, respectivamente) sem adição de estímulo exógeno, sendo que células de um animal

de cada grupo apresentaram os mesmos valores, acima do limite de detecção do ensaio, seja após

cultivo em meio de cultura ou em meio de cultura com extrato bruto de antígenos. Não foi possível

detectar IL-4 em nenhum dos grupos, permanecendo sempre abaixo do limite de detecção do ensaio

(Figura 17F).

108

Tabela 10. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos cultivados com concanavalina A ou extrato bruto de L. chagasi, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos e desafiados com promastigotas de L. chagasi.




3 dias 5 dias


Meio de cultura

Con A (2 µg/mL)

Meio de cultura

Extrato bruto de antígenos

(10 µg/mL) Salina sem infecção 1152 ± 565 30030 ± 13470 2491 ± 1634 4148 ± 1657 Salina EL 1703 ± 677 36710 ± 10860 3666 ± 2045 5415 ± 3156

pBK-CMV EL 1389 ± 846 33630 ± 16990 1682 ± 992 2889 ± 1546

pool plasm EL 667 ± 339 10810 ± 13040 3032 ± 2217 6967 ± 5483

pool plasm + pIL-12 EL 1684 ± 1009 43930 ± 20130 2224 ± 2378 3557 ± 2650

pool de plasm 1010 ± 216 29970 ± 10740 3117 ± 2842 8346 ± 4612

109

Figura 17. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção de promastigotas de L. chagasi, após cultivo com concanavalina A (Con A) ou extrato bruto de antígenos de L. chagasi. Camundongos BALB/c (5 a 6 animais/grupo), foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos, acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg), por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Um grupo de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação. Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, cada grupo, exceto 6 animais do grupo Salina (salina EL s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L .infantum/chagasi por via intraperitonial. A avaliação da proliferação celular (A e B) e da produção de citocinas IFN-γ (C e D) e IL-4 (E e F) foi realizada cerca de 60 dias após a infecção. Esplenócitos foram cultivados com Con A a 2 µg/mL (A, C, E) ou extrato bruto de L. chagasi a 10 µg/mL (B, D, F). Para a avaliação de proliferação, o cultivo foi realizado por 3 dias (Con A) ou 5 dias (extrato bruto) a 37o C e 5% de CO2 em atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais) e IL-4 (pool de sobrenadante), sobrenadantes das culturas de células, nas mesmas condições supracitadas, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA. Os gráficos mostram valores de índice de proliferação (A e B) e concentração de IFN-γ (ng/mL, C e D) e IL-4 (pg/mL, E e F). Os símbolos (A e B) representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas ± SD de cada grupo (C e D).

0

10

2020

60

100A B

Ìndi

ce d

e P

rolif

eraç

ão

0

10

202575

125 C D

Salin

a EL s

/ inf

Salin

a EL

pBK-CM

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pool pla

sm E

L

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sm+p

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0

100

200

300

400E

Salina

EL s/ in

f

Salina

EL

pBK-CM

V EL

pool plas

m E

L

pool pla

sm+p

IL-1

2 EL

pool pla

sm

F

IFN

- γγ γγ(n

g/m

L)

IL-4

(pg

/mL

)


110

A resposta proliferativa e a capacidade de produção de citocinas após estimulação in vitro

com Lc9, Lc14 e Lc18 foram avaliadas para cada grupo e estão descritos abaixo.

Na presença de Lc9, mesmo em três concentrações diferentes, 10 µg/mL, 1 µg/mL e 0,1

µg/mL, esplenócitos murinos obtidos após a injeção de promastigotas de L. chagasi apresentaram

valores de índices de proliferação celular que, quando comparados, não resultou em diferença

significativa entre os grupos (Figura 18A, B e C). Os valores de cpm que deram origem a esses

resultados estão descritos na Tabela 11.

Em avaliação subseqüente, para mensuração da produção de IFN-γ, por ELISA (Figura

18D), foi observado que células esplênicas de um dos grupos de animais, previamente injetado

com pool de plasmídeos e pIL-12, produziram IFN-γ após cultivo com Lc9 (7,77 ± 6,43 ng/mL) e

esta produção foi estatisticamente significativa quando comparada ao grupo somente injetado

com salina e animais infectados previamente injetados com pBK-CMV vazio (ANOVA, p =

0,0116; Tukey, p < 0,05). A produção de IL-4 não foi detectada no sobrenadante da cultura de

células de nenhum dos grupos, permanecendo sempre abaixo do limite de detecção do ensaio.

111

0

10

20C

0

10

20B

0

10

20

A

Índi

ce d

e P

rolif

eraç

ão

Salina

EL s/

inf

Salina

EL

pBK-C

MV EL

pool p

lasm

EL

pool

plas

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12

pool p

lasm

0

5

10

15

20D *

IFN

- γγ γγ(n

g/m

L)

112

Figura 18. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc9 recombinante. Camundongos BALB/c (5 a 6 animais/grupo), foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18) acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg) por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Um grupo de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação. Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, cada grupo, exceto 6 animais do grupo Salina (salina EL s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi por via intraperitonial. A proliferação celular (A, B e C) e a produção de IFN-γ (D) foram avaliadas cerca de 60 dias após a infecção. Esplenócitos foram cultivados em meio de cultura apenas ou em meio de cultura contendo Lc9 nas concentrações de 10 µg/mL (A e D), 1 µg/mL (B) ou 0,1 µg/mL (C). Para a avaliação da proliferação celular, o cultivo foi realizado por 5 dias 37o C e 5% de CO2 em atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), sobrenadantes das culturas de células, incubadas na presença de 10 µg/mL de Lc9, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA, como descrito em Material e Métodos. * p < 0,05 em comparação aos grupos Salina sem infecção e pBK-CMV vazio infectado. Os símbolos (A, B e C) representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas ± SD de cada grupo (D).

113

Já a incubação in vitro com Lc14 e Lc18, nas concentrações de 0,1 µg/mL e 1 µg/mL, não

resultou em proliferação celular que apresentasse valores de índice de proliferação

significativamente diferente entre os grupos (Figura 19A e B, 20A e B). Os valores de cpm

obtidos após estimulação com Lc14 ou Lc18 foram apresentados na Tabela 12. Quanto à

produção de citocinas, apenas um dos grupos, animais injetados com salina e infectados com L.

chagasi, apresentou valor de média da concentração de IFN-γ estatisticamente superior em

relação à média obtida para o grupo de animais não infectados (ANOVA, p = 0,0051 e Tukey, p

< 0,05) e do grupo injetado com pBK-CMV e infectado ( p <001, Figura 19C). Este resultado não

foi observado em um experimento anterior no qual células de animais infectados, previamente

injetados com salina foram cultivadas na presença de 10 µg/mL de Lc14 (Figura 10D). A

comparação das médias da concentração de IFN-γ encontradas após o cultivo com Lc18 não

apresentou diferença entre os grupos avaliados. A produção de IL-4 não foi detectada em

qualquer condição de estímulo, quer seja na presença de Lc14 ou de Lc18.

Tabela 11. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos cultivados em meio de cultura ou meio de cultura com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos, e desafiados com promastigotas de L. chagasi




5 dias


Meio de cultura

Lc9 (0,1 µg/mL)

Lc9 (1 µg/mL)

Lc9 (10 µg/mL)

Salina sem infecção 2311 ± 1677 4640 ± 2003 5178 ± 1595 7813 ± 3337

Salina EL 2704 ± 1443 5053 ± 2309 5989 ± 2044 6344 ± 2252

pBK-CMV EL 1478 ± 1044 3368 ± 1925 5372 ± 1171 7058 ± 741

pool plasm EL 2775 ± 2060 6214 ± 4041 8535 ± 3292 7009 ± 3163

pool plasm + pIL-12 EL 1816 ± 999 4141 ± 2780 6261 ± 3734 8265 ± 4928

pool de plasm 3618 ± 1595 6455 ± 2419 7896 ± 2643 9074 ± 3730

114

Tabela 12. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos cultivados em meio de cultura ou meio de cultura com Lc14 ou Lc18 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com um pool de plasmídeos, e desafiados com promastigotas de L. chagasi




5 dias


Meio de cultura

Lc14 (0,1 µg/mL)

Lc14 (1 µg/mL)


Salina EL 2790 ± 1631 9118 ± 3832 10410 ± 3864

pBK-CMV EL 2113 ± 1089 5642 ± 2759 7891 ± 1262

pool plasm EL 2477 ± 1661 7511 ± 5387 7430 ± 3329

pool plasm + pIL-12 EL 1830 ± 1555 7145 ± 2897 8328 ± 3132

pool de plasm 3448 ± 1594 7953 ± 1787 11340 ± 4304


5 dias


Meio de cultura

Lc18 (0,1 µg/mL)

Lc18 (1 µg/mL)


Salina EL 2179 ± 1241 4037 ± 1799 1193 ± 544

pBK-CMV EL 989 ± 629 2889 ± 1593 1386 ± 569

pool plasm EL 2491 ± 1859 4391 ± 5314 1221 ± 506

pool plasm + pIL-12 EL 1275 ± 922 2682 ± 1359 1019 ± 529

pool de plasm 2459 ± 1593 4599 ± 2264 1346 ± 360

115

Figura 19. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc14 recombinante. Camundongos BALB/c (5 a 6 animais/grupo), foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos, acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg) por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Um grupo de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação. Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, cada grupo, exceto 6 animais do grupo Salina (salina EL s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi por via intraperitonial. A proliferação celular (A e B) e a produção de IFN-γ (C) foram avaliadas cerca de 60 dias após a infecção. Esplenócitos foram cultivados com Lc14 nas concentrações de 1µg/mL (A) ou 0,1 µg/mL (B). Para a avaliação de proliferação celular, o cultivo foi realizado por 5 dias. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), sobrenadantes das culturas de células, incubadas na presença de 1 µg/mL de Lc14, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey (p < 0,05) em relação ao grupo injetado com salina, sem infecção e ao grupo injetado com pBK-CMV vazio, infectado. Os símbolos (A e B) representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas ± SD de cada grupo (C).

0.0

12.5

25.0

B

0.0

12.5

25.0A

Salina

EL s/

infe

c

Salina

EL

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L

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0

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24

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IFN

- γγ γγ(n

g/m

L)

Ìndi

ce d

e P

rolif

eraç

ão

116

Figura 20. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de camundongos, previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes e desafiados pela injeção de promastigotas de L. chagasi, na presença de Lc18 recombinante. Camundongos BALB/c (5 a 6 animais/grupo), foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos, acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg) por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Um grupo de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação. Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, cada grupo, exceto 6 animais do grupo Salina (salina EL s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi por via intraperitonial. A proliferação celular (A e B) e a produção de IFN-γ (C) foram avaliadas cerca de 60 dias após a infecção. Esplenócitos foram cultivados em meio de cultura apenas ou em meio de cultura contendo Lc18 nas concentrações de 1µg/mL (A) ou 0,1 µg/mL(B). Para a avaliação de proliferação celular, o cultivo foi realizado por 5 dias. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), sobrenadantes das culturas de células, incubadas na presença de 1 µg/mL de Lc18, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA. Os símbolos (A e B) representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas ± SD de cada grupo (C).

0

10

20B

0

10

20A

Salina

EL

s/ in

f

Salina

EL

pBK-C

MV EL

pool

plas

m E

L

pool

plas

m+p

IL-1

2 EL

pool

plas

m

0

10

20C

IFN

- γγ γγ(n

g/m

L)

Ìndi

ce d

e P

rolif

eraç

ão

117

5.2.5. Avaliação de proteção contra infecção por L. chagasi

Os resultados da avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por L.

chagasi, realizada por diluição limitante cerca de oito semanas após a infecção, estão descritos

abaixo.

A injeção de uma mistura de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-

Lc14 e pBK-CMV-Lc18), quer seja com ou sem eletroporação, na presença ou na ausência de

pcDNA3.1-scmu-IL-12, não induziu diminuição da carga parasitária total no baço de

camundongos, após desafio com promastigotas de L. chagasi. (Figura 21A). No entanto, a

comparação entre as médias indicou diferença entre os grupos (ANOVA, p = 0,026).

Comparação adicional mostrou que esta diferença ocorreu entre a média obtida para o grupo

injetado com pool de plasmídeos associado à pIL-12 e a média do grupo injetado previamente

apenas com salina (Tukey, p < 0,05), revelando um ligeiro aumento na carga parasitária mesmo

na presença de IL-12. Contudo, não houve alteração significativa relacionada ao tamanho do baço

dos animais em nenhum dos grupos infectados (Figura 21B).

Um mapa qualitativo da resposta imune murina aos diferentes imunógenos utilizados para

injeção adminsitrados como um pool de plasmídeos, antes e após o desafio com L. chagasi, está

apresentado no Apêndice C.

118

Figura 21. Avaliação da capacidade de proteção e/ou controle da infecção por L. chagasi. em animais previamente injetados com um pool de plasmídeos recombinantes. Camundongos BALB/c (5 a 6 animais/grupo), foram submetidos a três séries de injeções com salina ou com 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio ou com 200 µg de um pool de plasmídeos (pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18) acrescido ou não de plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12 (50 µg) por via intramuscular seguida de eletroporação (EL). Um grupo de animais foi injetado apenas com o pool de plasmídeos, sem eletroporação. Aproximadamente 30 dias após a terceira série de injeção, cada grupo, exceto 6 animais do grupo Salina (salina EL s/ inf), recebeu uma injeção de 1 x 107 promastigotas de L. chagasi por via intraperitonial. Após aproximadamente 60 dias, os animais foram sacrificados e o baço foi utilizado para determinação da carga parasitária por ensaio de diluição limitante, como descrito em Material e Métodos. (A) carga parasitária total (log 10). (B) peso do baço em relação ao peso corporal (valores em %). Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey (p < 0,05) em relação ao grupo Salina infectado.

Salin

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/ infe

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Salin

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0

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4

6

8

10*A

119

5.3. Avaliação da resposta imune em camundongos injetados DNA plasmideal seguido por

proteína recombinante – DNA primer/proteína booster


Os resultados da avaliação da produção de anticorpos específicos, realizada por ELISA,

em amostras de soro obtidas 10 dias após três séries de injeção de plasmídeo estão descritos

abaixo.

O grupo de camundongos injetado com pBK-CMV-Lc9 nas duas primeiras séries de injeções

seguida pela administração de Lc9 associada a saponina na última dose produziu anticorpos da classe

IgG reativos com o extrato bruto de antígenos de L. chagasi. O valor de densidade óptica (X ± SD),

correspondente à mensuração para este grupo, foi de 0,287 ± 0,031. A produção de anticorpos

específicos também foi observada para os grupos de animais injetados com Lc9 associada à

saponina ou injetados somente com pBK-CMV-Lc9 nas três séries de injeções, cujos valores de

densidade óptica foram de 0,381 ± 0,035 e 0,137 ± 0,042 (Figura 22). A comparação das médias

dos valores de densidade óptica revelou diferença estatisticamente significante entre os grupos

(ANOVA, p < 0,0001) e apresentou a seguinte relação: Lc9/saponina > pBK-CMV-Lc9/Lc9 saponina

> pBK-CMV-Lc9 > pBK-CMV = Saponina = Salina (Tukey, p<0,001).

Posteriormente, foram realizados ensaios para mensuração de anticorpos das subclasses

IgG2a e IgG1 reativos a extrato bruto de antígenos. Anticorpos de ambas subclasses foram

detectadas em amostras obtidas do grupo Lc9/saponina e do grupo pBK-CMV-Lc9/Lc9 sap

(Figura 22). A comparação das médias de densidade óptica, correspondentes à mensuração de IgG2a

revelou diferença estatisticamente significativa entre os grupos (ANOVA, p < 0,0001). Comparação

adicional entre cada dois grupos mostrou a seguinte relação: Lc9/saponina = pBK-CMV-Lc9/Lc9

saponina > pBK-CMV-Lc9 > pBK-CMV = Saponina = Salina (Tukey, p < 0,05). Finalmente, a

comparação das médias de densidade óptica, correspondentes à mensuração de IgG1, também revelou

diferença estatisticamente significativa entre os grupos (ANOVA p < 0,0001) e a seguinte relação foi

encontrada entre os grupos: Lc9/saponina > pBK-CMV-Lc9/Lc9 saponina > pBK-CMV-Lc9 = pBK-

CMV = Saponina = Salina (Tukey, p < 0,001). A proporção da média de densidade óptica,

relacionada à mensuração de IgG2a e de IgG1, para o grupo injetado com Lc9 associada à saponina,

foi de 0,65 ± 0,14 enquanto que para o grupo injetado com pBK-CMV-Lc9 apenas ou com pBK-

CMV-Lc9 seguido de Lc9/saponina foi de 2,71± 2,0 e 2,27± 1,77; respectivamente.

120

Figura 22. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1, reativos a extrato bruto de antígenos de L. chagasi, de animais injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9. Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram submetidos a três séries de injeções com salina ou 100 µg de saponina, 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, 100 µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina ou 50 µg de pBK-CMV-Lc9. Um outro grupo experimental foi injetado com 50 µg de pBK-CMV-Lc9 nas duas primeiras séries de injeção e 100 µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina na última dose. As injeções com saponina ou Lc9/saponina foram administradas por via subcutânea. As injeções de salina ou DNA plasmideal foram administradas por via intramuscular seguida por eletroporação (EL). Amostras de soro, obtidas 10 dias após a terceira série de injeção, foram diluídas de 1:200 para a detecção de anticorpos IgG e diluídas de 1:500 para a detecção de anticorpos IgG1 e IgG2a e avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL de extrato total de antígenos de L. chagasi a 10 µg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores de densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação aos grupos controles.

Den

sid

ade

Óp

tica

(45

0 n

m)

0.0

0.4

0.8

1.2*

**

0.0

0.4

0.8

1.2*

*

0.0

0.4

0.8

1.2

*

**

IgG

IgG2a

IgG1

Salina EL

pBK-CMV EL

pBK-CMV-Lc9 EL

Saponina

pBK-CMV-L

c9 EL

+ Lc9/saponina

Lc9/saponina

121

No ensaio para avaliação de anticorpos da classe IgG reativos a Lc9, os grupos de animais

injetados com Lc9/saponina, pBK-CMV-Lc9 seguido de Lc9/saponina ou pBK-CMV-Lc9

exibiram valores de densidade óptica significativamente maiores (2,447 ± 0,212; 2,531 ± 0,114,

1,881 ± 0,331, respectivamente) que os grupos de animais que receberam salina, saponina ou

pBK-CMV vazio (Figura 23). A comparação das médias dos valores de densidade óptica revelou

diferença estatisticamente significativa entre os grupos e apresentou a seguinte relação:

Lc9/saponina = pBK-CMV-Lc9/Lc9 saponina > pBK-CMV-Lc9 > pBK-CMV = Saponina =

Salina (ANOVA: p<0,0001, pós-teste de Tukey: p<0,001).

Como na diluição previamente avaliada não foi possível discriminar entre os valores de

densidade óptica obtidos para os grupos injetados com Lc9/saponina e pBK-CMV-Lc9 seguido

de Lc9/sap, uma curva de diluição foi realizada entre 1:200 e 1:125.000. Assim, os valores de

densidade óptica (X ± SD) obtidos na leitura realizada a partir da diluição de 1:5000 foram

comparados por ANOVA seguido de pós-teste de Tukey. Os valores de densidade óptica

encontrados para o grupo injetado com Lc9/saponina (2,105 ± 0,226) foi superior aos valores

encontrados para o grupo injetado com pBK-CMV-Lc9 seguido de Lc9/saponina (1,757 ± 0,299)

e aos valores encontrados para o grupo injetado somente com pBK-CMV-Lc9 (0,378 ± 0,238,

ANOVA, p < 0,0001 e Tukey, p < 0,05, dados não mostrados).

Adicionalmente, a mensuração de anticorpos das subclasses IgG2a e IgG1 específicos

para Lc9 mostrou que, na diluição avaliada, o único grupo a apresentar anticorpos de ambas

subclasses foi o grupo injetado com Lc9/saponina, apresentando valores de densidade óptica (X ±

SD) de 0,355 ± 0,172 e 1,183 ± 0,270, respectivamente (Figura 23). A comparação das médias

obtidas revelou diferença significante entre os grupos, tanto para IgG2a como para IgG1

(ANOVA, p < 0,0001 e p<0,001, respectivamente). A comparação adicional, usando pós-teste de

Tukey, apresentou a seguinte relação entre os grupos: Lc9/saponina = pBK-CMV-Lc9/Lc9

saponina > pBK-CMV-Lc9 = pBK-CMV = Saponina = Salina (IgG2a, p < 0,001) e Lc9/saponina

> pBK-CMV-Lc9/Lc9 = pBK-CMV-Lc9 = pBK-CMV = Saponina = Salina (IgG1, p < 0,001).

Finalmente, a proporção entre os valores de densidade óptica obtidos para IgG2a e IgG1

encontrada para o grupo injetado com Lc9/saponina foi de 0,29 ± 0,10 enquanto que para o grupo

injetado com pBK-CMV-Lc9 seguido de Lc9/saponina foi de 1,54 ± 0,81.

122

Figura 23. Avaliação da produção de anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG2a e IgG1, reativos a Lc9, de animais injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9. Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram submetidos a três séries de injeções com salina ou 100 µg de saponina, 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, 100 µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina ou 50 µg de pBK-CMV-Lc9. Um outro grupo experimental foi injetado com 50 µg de pBK-CMV-Lc9 nas duas primeiras séries de injeções e 100 µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina na última dose. As injeções com saponina ou Lc9/saponina foram administradas por via subcutânea. As injeções de salina ou DNA plasmideal foram administradas por via intramuscular seguida por eletroporação (EL). Amostras de soro, obtidas 10 dias após a terceira série de injeção, foram diluídas de 1:200 para a detecção de anticorpos IgG e diluídas de 1:350.000 para a detecção de anticorpos IgG1 e IgG2a e avaliadas, em duplicata, em placas de microtitulação de 96 poços pré-sensibilizadas com 100 µL Lc9 a 5 µg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas dos valores de densidade óptica. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação aos grupos controles.

0

1

2*

0

1

2

* *

0

1

2

3 **

*IgG

IgG2a

IgG1

Salina EL

pBK-CMV EL

pBK-CMV-L

c9 EL

Saponina

pBK-CMV-Lc9 EL

+ Lc9/saponina

Lc9/saponina

Den

sid

ade

Óp

tica

(45

0 n

m)

123



foram avaliadas após estimulação in vitro com um mitógeno, Con A, ou com o antígeno Lc9 cerca de

3 a 4 semanas após as séries de injeções realizadas.

A comparação das médias dos valores de índice de proliferação de cada um dos grupos,

obtidos a partir da estimulação com Con A por 3 dias, não apresentou diferença significativa. (Figura

24A). Os valores de cpm obtidos para esta avaliação estão descritos na Tabela 13. Da mesma forma,

a comparação das médias dos valores de concentração de IFN-γ não apresentou diferença

significativa em nenhum dos grupos testados. Todos os grupos foram capazes de produzir IL-4 e IL-5

após estimulação com Con A, contudo, em alguns grupos a concentração encontrada para estas

citocinas foi muito próxima ao limite de detecção do ensaio. (Figura 24C e D). As concentrações de

IFN-γ, IL-4 ou IL-5 de células mantidas em meio de cultura por 48 horas ficaram abaixo do nível de

detecção dos ensaios (0,1 ng/mL; 20 pg/mL e 40 pg/mL, respectivamente).

Tabela 13. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos cultivados com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9.

Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (6 animais/grupo). Esplenócitos foram obtidos entre três a quatro semanas após as injeções e cultivados a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e Métodos.


3 dias


Meio de cultura

Con A (0,75 µg/mL)

Salina EL 493 ± 175 3755 ± 2599

Saponina 432 ± 122 3470 ± 1728

pBK-CMV EL 605 ± 172 3791 ± 2038

Lc9/saponina 492 ± 280 3429 ± 1355

pBK-CMV-Lc9 EL 359 ± 94 6691 ± 1312

pBK-CMV-Lc9 EL/ Lc9/sap 946 ± 662 5513 ± 1281

124

0

10

20

30

40A

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10

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160

200

240D

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- γγ γγ(n

g/m

L)

IL-4

(pg

/mL

) IL

-5 (

pg/m

L)

125

Figura 24. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de camundongos, injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9, após cultivo com concanavalina A (Con A). Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram submetidos a três séries de injeções com salina ou 100 µg de saponina, 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, 100 µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina ou 50 µg de pBK-CMV-Lc9. Um outro grupo experimental foi injetado com 50 µg de pBK-CMV-Lc9 nas duas primeiras séries de injeções e 100 µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina na última dose. As injeções com saponina ou Lc9/saponina foram administradas por via subcutânea. As injeções de salina ou DNA plasmideal foram administradas por via intramuscular seguida por eletroporação (EL). A avaliação da proliferação celular (A) e da produção de citocinas IFN-γ (B), IL-4 (C) e IL-5 (D) foram realizadas entre 3 e 4 quatro semanas do término das injeções. Esplenócitos foram cultivados com Con A (0,75 µg/mL) por 3 dias a 37o C e 5% de CO2 em atmosfera úmida para avaliação de proliferação celular. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), IL-4 e IL-5 (pool), sobrenadantes das culturas de células, incubadas nas mesmas condições descritas acima, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA. Os gráficos mostram valores de índice de proliferação (A), concentração de IFN-γ em ng/mL (B), IL-4 (C) e IL-5 (D) em pg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas.

126

Para avaliação da resposta imune específica, foram avaliadas a resposta proliferativa e a

produção de citocinas por esplenócitos estimulados in vitro com Lc9 por um período de 5 dias e de 48

horas, respectivamente.

Os valores de cpm (X ± SD) encontrados quando as células esplênicas foram cultivadas em

meio de cultura ou meio de cultura contendo Lc9 nas concentrações de 0,1 µg/mL, 1 µg/mL ou 10

µg/mL estão apresentados na Tabela 14. Os valores de índice de proliferação encontrados, em

esplenócitos estimulados com Lc9 na concentração de 0,1 µg/mL, para os grupos injetados com

Lc9/saponina (6,7 ± 2,3) ou com pBK-CMV-Lc9 seguido de Lc9/saponina (3,6 ± 1,4) foram

superiores aos valores encontrados para os demais grupos (relação entre os grupos: Lc9/saponina >

pBK-CMV-Lc9/Lc9 saponina > pBK-CMV-Lc9 = pBK-CMV = Saponina = Salina, ANOVA, p <

0,0001 e Tukey, p < 0,05), Figura 25C. Houve também uma diferença significativa entre os

grupos quando os valores de índice de proliferação obtidos a partir do cultivo de células

esplênicas com 1 µg/mL ou 10 µg/mL de Lc9 foram comparados (ANOVA, p < 0.0003 e p <

0,0001, respectivamente). A comparação adicional pelo pós-teste de Tukey revelou a seguinte

relação entre os grupos: pBK-CMV-Lc9/Lc9 sap = Lc9/sap > pBK-CMV-Lc9 saponina = pBK-

CMV = Saponina = Salina (para 10 µg/mL de Lc9, p < 0,01) e Lc9/saponina > pBK-CMV-

Lc9/Lc9 saponina = pBK-CMV-Lc9 = pBK-CMV = Saponina = Salina (para 10 µg/mL de Lc9, p

< 0,05), Figura 25A e B.

127

Tabela 14. Valores de cpm correspondentes à incorporação de timidina radioativa por esplenócitos cultivados com Lc9 em diferentes concentrações, obtidos de grupos de camundongos submetidos a três séries de injeções com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9.

Os valores apresentados representam X ± SD dos valores obtidos para cada grupo (6 animais/grupo). Esplenócitos foram obtidos entre três a quatro semanas após as injeções e cultivados a 3 x 105 células por poço, em triplicata, em volume de 200 µL, como descrito em Material e Métodos. A média da concentração de IFN-γ do grupo de animais injetado com Lc9/saponina (13,9

± 12,76 ng/mL) foi superior às médias obtidas para o grupo pBK-CMV-Lc9 (1,2 ± 0,9 ng/mL) e

pBK-CMV-Lc9/Lc9 saponina (1,9 ± 0,9 ng/mL). A comparação das médias da concentração de

IFN-γ entre os grupos mostrou a seguinte relação: Lc9/saponina > pBK-CMV-Lc9/Lc9 saponina =

pBK-CMV-Lc9 = pBK-CMV = Saponina = Salina (ANOVA, p < 0,0005, pós-teste de Tukey, p <

0,01, Figura 25D). Os valores de concentração de IFN-γ dos animais dos grupos controles Salina.

Saponina e pBK-CMV vazio ficaram abaixo do nível de detecção do ensaio (0,1 ng/mL). As

concentrações de IL-4 e IL-5 foram avaliadas apenas no pool de sobrenadantes de células

cultivadas na presença de Lc9. A produção de IL-4 e de IL-5 foi detectada no sobrenadante das

células dos animais do grupo injetado com Lc9/saponina (29 pg/mL e 549 pg/mL,

respectivamente) enquanto que para os demais grupos os valores estiveram sempre abaixo do

limite de detecção do ensaio, 20 pg/mL e 40 pg/mL, respectivamente (Figura 25E e F).

Um mapa qualitativo da resposta imune murina à rLc9, administrada em diferentes

preparações, está apresentado no Apêndice C.


5 dias


Meio de cultura

Lc9 (0,1 µg/mL)

Lc9 (1 µg/mL)

Lc9 (10 µg/mL)

Salina EL 784 ± 322 839 ± 427 1099 ± 652 1420 ± 628

Saponina

964 ± 275 962 ± 299 1142 ± 515 1034 ± 552

pBK-CMV EL 770 ± 254 1015 ± 487 1482 ± 958 999 ± 294

Lc9/saponina 910 ± 388 5655 ± 1959 8400 ± 4507 10192 ± 4766

pBK-CMV-Lc9 EL 651 ± 349 919 ± 408 1131 ± 621 2183 ± 1283

pBK-CMV-Lc9 EL/ Lc9/sap 786 ± 626 2153 ± 621 2440 ± 1020 5205 ± 2295

128

Figura 25. Avaliação de proliferação celular e produção de citocinas por células esplênicas de camundongos, injetados com DNA plasmideal e proteína recombinante Lc9, após cultivo com Lc9. Camundongos BALB/c (6 animais/grupo) foram submetidos a três séries de injeções com salina ou 100 µg de saponina, 50 µg de plasmídeo pBK-CMV vazio, 100 µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina ou 50 µg de pBK-CMV-Lc9. Um outro grupo experimental foi injetado com 50 µg de pBK-CMV-Lc9 nas duas primeiras séries de injeções e 100 µg de Lc9 associada a 100 µg de saponina na última dose. As injeções com saponina ou Lc9/saponina foram administradas por via subcutânea. As injeções de salina ou DNA plasmideal foram administradas por via intramuscular seguida por eletroporação (EL). A avaliação da proliferação celular (A, B e C) e da produção de citocinas IFN-γ (D), IL-4 (E) e IL-5 (F) foi realizada entre 3 e 4 quatro semanas do término das injeções. Esplenócitos foram cultivados em meio de cultura ou meio de cultura contendo Lc9 a 10µg/mL (A, D, E e F), 1µg/mL (B) ou 0,1µg/mL (C). Para a avaliação de proliferação, o cultivo foi realizado por 5 dias a 37o C e 5% de CO2 em atmosfera úmida. Após este período, 1 µCi de timidina tritiada foi adicionada por poço e as células foram incubadas por mais 18 horas. Para a dosagem de IFN-γ (amostras individuais), IL-4 e IL-5 (pool), sobrenadantes das culturas de células, incubadas na presença de 10µg/mL de Lc9, foram coletados após 48 horas de incubação e utilizados em ELISA, como descrito em Material e Métodos. Os gráficos (A, B e C) mostram valores de índice de proliferação e concentração de IFN-γ em ng/mL (D), IL-4 (E) e IL-5 (F) em pg/mL. Os símbolos representam valores individuais e as barras representam médias aritméticas. * ANOVA seguido de pós-teste de Tukey, p < 0,05; comparação em relação aos grupos controles.

Salin

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Sapon

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L

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c9 E

L

pBK-CMV-L

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40E

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IFN

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g/m

L)

IL-4

(pg

/mL

) IL

-5 (

pg/m

L)

129

6. DISCUSSÃO

A leishmaniose visceral é, ainda, um grave problema em saúde pública e em medicina

veterinária ocorrendo principalmente em países em desenvolvimento (WHO, 2002). As medidas

adotadas pelos órgãos públicos de saúde para o controle da doença têm-se mostrado ineficazes ao

longo dos anos, de modo que a leishmaniose visceral apresenta-se em elevada expansão em todo

mundo, inclusive no Brasil. Isso ocorre, em parte, porque tais medidas são frequentemente

descontinuadas e de difícil execução. Uma alternativa para o controle da leishmaniose visceral

humana é o controle da infecção no cão, principal hospedeiro reservatório do parasito. Assim, o

desenvolvimento de uma vacina efetiva contra leishmaniose visceral canina, que vise à

interrupção do ciclo de transmissão do parasito, é um dos objetivos pelo qual nosso grupo de

pesquisa vem trabalhando nos últimos anos.

No presente trabalho, o efeito de diferentes protocolos de imunização, em camundongos,

usando moléculas candidatas a componentes de uma vacina contra leishmaniose visceral canina,

foi avaliado com a finalidade de se identificar uma estratégia de imunização que favorecesse a

indução de uma resposta imune celular predominantemente do tipo Th1. Assim, a utilização de

plasmídeos como vetor de expressão de DNA foi a base deste trabalho. Os protocolos utilizados

consistiram da injeção de plasmídeos capazes de levar à expressão in vivo de cDNAs

codificadores de proteínas de formas amastigotas de L. chagasi. Estes plasmídeos foram

administrados isoladamente por injeção intramuscular seguida de eletroporação, ou como uma

mistura de plasmídeos, associados ou não a plasmídeo capaz de levar à expressão de IL-12

murina, ou, ainda, pela administração inicial de DNA plasmideal e posterior reforço com a

proteína recombinante correspondente. A resposta imune foi caracterizada nas duas vertentes,

humoral e celular. A produção de anticorpos específicos e a reatividade de esplenócitos pré-

sensibilizados ao extrato bruto de antígenos de promastigotas de L. infantum/chagasi, bem como,

com cada uma das proteínas recombinantes, foram avaliadas. Dessa forma, o perfil de resposta

imune obtido seguindo-se os protocolos utilizados foi determinado. Adicionalmente, os animais

foram expostos ao agente etiológico da leishmaniose visceral por infecção experimental com

promastigotas de L. chagasi. Assim, a capacidade de responder ao estímulo antigênico natural foi

também avaliada.

130

Embora não completamente esclarecida, a resposta imune capaz de conferir proteção

contra a leishmaniose visceral no cão é dita ser predominantemente celular com produção de

citocinas por células T CD4+ do tipo Th1 (PINELLI et al., 1995; RHALEM et al., 1999). Dessa

forma, a base para o desenvolvimento de uma vacina contra leishmaniose visceral canina implica

em induzir uma resposta imune com tais características previamente à exposição ao agente

causal.

O modelo murino apresenta algumas vantagens em relação ao uso do cão para uma

análise inicial de antígenos candidatos a componente de uma vacina. Este é um modelo de fácil

manipulação e, principalmente, tem comercialmente disponível os reagentes necessários para

análise da resposta imune. Usando este modelo, a indução de uma resposta imune específica foi

avaliada após a injeção de rLc9 em salina, ou associada a cinco diferentes adjuvantes incluindo

adjuvante de Freund, saponina, hidróxido de alumínio, óleo de amendoim e IL-12 codificada por

um vetor plasmideal. Resultados obtidos em nosso laboratório mostraram que a injeção de rLc9

em camundongos, apenas preparada em salina, leva à indução de uma resposta imune com

elevada produção de anticorpos, ausência de resposta proliferativa e indução da produção de

citocinas produzidas apenas por células do tipo Th2, como demonstrado pela detecção de IL-5 e

ausência de IFN-γ. Esta resposta só foi parcialmente revertida quando rLc9 foi administrada

associada à saponina. A injeção de camundongos utilizando esta combinação foi a única a induzir

uma resposta imune celular específica com proliferação de células esplênicas e produção de IFN-

γ, mantendo, no entanto, a produção de IL-5 além de uma intensa resposta imune humoral

específica na qual houve um predomínio de anticorpos IgG da subclasse IgG1 (FRAGA, 2007).

Estes achados estão de acordo com dados da literatura, os quais mostram que saponina é capaz de

estimular ambos os tipos de células T CD4+ Th1 e Th2 (BOMFORD et al., 1992) e apresenta-se

como um dos mais potentes adjuvantes para gerar uma significante resposta imune mediada por

células e anticorpos (BOMFORD et al., 1980). Resultado semelhante foi obtido neste trabalho,

no qual um grupo de camundongos imunizado com rLc9/saponina foi utilizado para comparação

com outros protocolos de imunização, discutido posteriormente.

Atualmente, a vacinação com DNA plasmideal tem se apresentado como uma estratégia

promissora para o desenvolvimento de vacinas contra diversos tipos de infecções, principalmente

aquelas que envolvem a indução de resposta imune contra patógenos intracelulares. Muitas são as

vantagens para o uso de plasmídeos e/ou outras moléculas de DNA como vetores de expressão de

131

antígenos in vivo. Ao contrário dos métodos convencionais de vacinação, os quais muitas vezes

se utilizam patógenos inativados ou vivos e atenuados, a reprodutibilidade e padronização lote-a-

lote do material utilizado, além de questões relacionadas à segurança podem ser contornados.

Além disso, um adjuvante capaz de induzir preferencialmente uma resposta celular deve ser

utilizado para obtenção de uma resposta imune que realmente seja eficiente no controle de

infecções intracelulares. O uso de DNA como vetor de expressão de antígenos recombinantes

atende a algumas dessas necessidades.

Como descrito neste trabalho, a injeção de plasmídeos capazes de levar à expressão in

vivo de cDNAs codificadores de proteínas recombinantes de formas amastigotas de L.

infantum/chagasi, administrados isoladamente, resultou na indução de resposta imune humoral

específica para três de quatro plasmídeos utilizados. Esta resposta foi identificada frente a

reatividade de anticorpos com proteínas do extrato bruto de promastigotas (após a injeção de

pBK-CMV-Lc9 ou pBK-CMV-Lc14) e contra as proteínas recombinantes (após a injeção de

pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-Lc14 ou pBK-CMV-Lc18).

A diferente reatividade ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi encontrada entre os

grupos injetados com diferentes plasmídeos pode ser explicada pela representatividade, maior ou

menor, de cada uma das proteínas de L. chagasi presentes no extrato bruto de antígenos e que

correspondem às proteínas recombinantes Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18. Vale ressaltar que os

plasmídeos utilizados para a injeção codificam proteínas da forma amastigota de Leishmania.

Como existe uma grande variabilidade antigênica entre as diferentes formas do parasito (FONG

& CHANG, 1982; HANDMAN et al., 1984) não podemos descartar a possibilidade de ausência

ou baixa expressão das proteínas correspondentes à Lc13 e Lc18 em promastigotas. Uma

avaliação complementar pode ser feita por Western blotting, na qual extrato bruto de antígenos

das formas amastigota e promastigota de L. chagasi seria previamente fracionado por SDS-

PAGE. Dessa forma, a reatividade dos anticorpos induzidos pela injeção de plasmídeos poderia

ser avaliada em um ensaio de maior sensibilidade e especificidade.

A ausência de reatividade de anticorpos específicos para Lc13 ou para Lc18 à antígenos

presentes no extrato bruto de promastigotas pode também estar relacionada a intensidade da

resposta imune humoral induzida após a injeção de pBK-CMV-Lc13 ou pBK-CMV-Lc18. Foi

observado, em ELISA para detecção de anticorpos específicos para Lc13 ou Lc18 utilizando-se

proteínas recombinantes purificadas para sensibilização das placas, que a medida de densidade

132

óptica encontrada foi semelhante a dos grupos controles ou extremamente baixa, em amostras de

animais injetados com pBK-CMV-Lc13 ou pBK-CMV-Lc18, respectivamente, indicando que

não houve produção de anticorpos específicos como a observada para as injeções de pBK-CMV-

Lc9 ou pBK-CMV-Lc14. A intensidade da resposta imune, por sua vez, depende de fatores como

a imunogenicidade inerente a cada proteína, a quantidade de proteína produzida e que vai

estimular o sistema imune ou mesmo, como é o caso, de características próprias da imunização

com plasmídeo.

As proteínas Lc9, Lc13, Lc14 e Lc18 são naturalmente imunogênicas para o cão. Estas

proteínas foram selecionadas a partir de uma biblioteca de cDNA de formas amastigotas de L.

chagasi, com base na reatividade de cada clone a uma mistura de soro de cães naturalmente

infectados (TEIXEIRA et al., 2007). A imunogenicidade de Lc13 recombinante foi demonstrada

em experimentos anteriores realizados em nosso laboratório, onde a injeção de Lc13,

administrada como emulsão em adjuvante de Freund ou em combinação à saponina, induziu uma

resposta imune humoral de forte intensidade tanto em camundongos como em cães,

respectivamente (PENHA FILHO, 2003; SANTOS, 2007). Já em relação a Lc18 recombinante,

existe a possibilidade de que a pouca intensidade da resposta imune humoral obtida nos animais

injetados com pBK-CMV-Lc18 esteja relacionada a baixa imunogenicidade desta proteína.

A ausência ou fraca indução de resposta imune humoral não é uma característica

incomum após injeções com DNA, a qual tende a favorecer uma resposta imune celular

(IBORRA et al., 2003; RAFATI et al., 2005). Este fato pode estar relacionado a características

imunológicas estabelecidas após a injeção de moléculas de DNA plasmideal. A ativação

completa de linfócitos B, frente à exposição a antígenos T dependentes, e sua diferenciação para

plasmócitos depende diretamente do micro ambiente onde este tipo de linfócito foi ativado e de

interações com células T auxiliares que secretam principalment e as citocinas IL-4 e IL-5,

potentes moduladoras da produção de anticorpos. No entanto, frequentemente, injeções com

DNA ativam células T auxiliares do tipo Th1, principais produtoras de IFN-γ (LECLERC et al.,

1997). Esta característica, intrínsica a moléculas de DNA plasmideal, está associada à presença

de seqüências imunomodulatórias, dinucleotídeos CpG não metilados, os quais influenciam

diretamente a produção de citocinas como IFN-γ e IL-12 (KLINMAN et al., 1996; LECLERC et

al., 1997). No entanto, a produção de IL-6 também é induzida por estas seqüências

imunomodulatórias, e esta citocina, que é capaz de promover a ativação e secreção de anticorpos

133

por células B diferenciadas (KLINMAN et al., 1996; MURAGUCHI et al., 1988) pode

contribuir, pelo menos num momento inicial de ativação, para a indução da produção de

anticorpos.

Outros pontos que precisam ser mencionados estão relacionados à quantidade de proteína

necessária para a indução de uma resposta imune em associação à sua localização celular.

Quando comparamos a intensidade da resposta imune humoral específica para Lc9 de grupos de

animais injetados com Lc9 associada à saponina, administrada a 100 µg/dose, ou injetados com

pBK-CMV-Lc9 a diferença entre os grupos foi da ordem de 40 vezes. Ao contrário da exposição

de grande quantidade de rLc9 exposta ao sistema imune após injeção em associação a saponina, a

produção das proteínas recombinantes de L. chagasi pelo vetor de expressão pBK-CMV é

intracelular e não há em nenhuma das cadeias polipeptídicas um sinal para a secreção das

proteínas. Esta condição pode, inclusive, favorecer o estabelecimento de uma resposta imune

celular, de interesse para o nosso trabalho (TORRES et al., 1999, DREW et al., 2000).

Paralelamente à avaliação da injeção de plasmídeos recombinantes administrados

isoladamente, uma preparação multicomponente foi utilizada para injeção de camundongos, na

qual uma mistura em partes iguais de cada um dos plasmídeos, pBK-CMV-Lc9, pBK-CMV-

Lc13, pBK-CMV-Lc14 e pBK-CMV-Lc18, foi administrada em três diferentes condições:

injeção intramuscular seguida ou não de eletroporação ou ainda, associada ao plasmídeo

pcDNA3.1A-scmu-IL-12, também seguida de eletroporação. A partir destes experimentos, foi

observado que houve reatividade de anticorpos ao extrato bruto de antígenos de promastigotas de

L infantum/L. chagasi nas três condições de tratamento utilizadas. No entanto, existe uma forte

possibilidade de que esta reação tenha ocorrido, como visto anteriormente, decorrente da

interação de anticorpos específicos para Lc9 e Lc14, produzidos em maior intensidade após

injeção isolada de pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14, respectivamente.

Uma das vantagens em se utilizar a imunização com DNA plasmideal para a indução de

resposta imune é a possibilidade de combinar vários plasmídeos codificando antígenos de

diferentes estágios ou linhagens de um mesmo patógeno com diferentes alvos antigênicos ou

ainda, de patógenos diferentes, em uma única vacina. Uma vacina multicomponente pode ser

mais abrangente na cobertura contra infecções e dessa forma mais eficiente. Relatos anteriores

mostram que imunizações com uma mistura de proteína ou de polissacarídeos têm levado a uma

diminuição da resposta aos componentes individuais da mistura (HUNT et al., 1994; FATTOM et

134

al., 1999). Ao contrário, a combinação de moléculas de plasmídeos recombinantes, como em

avaliações realizadas no modelo murino de malária e tuberculose, não implica em

competitividade de antígenos, mas sim em aumento da resposta imune e de proteção (DOOLAN

et al., 1996; MORRIS et al., 2000; GRIFANTINI et al., 1998).

A compatibilidade de plasmídeos e antígenos deve ser avaliada, caso a caso, porque

diferentes combinações podem comportar-se diferentemente (SEDEGAH et al., 2004). Como a

medida da reatividade dos anticorpos ao extrato bruto de antígenos de L. chagasi foi semelhante

àquela observada quando os plasmídeos pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14 foram administrados

separadamente, não parece ter havido uma incompatibilidade de componentes nesta preparação.

No entanto, quanto à resposta imune celular apenas a estimulação in vitro com Lc9 resultou em

produção de IFN-γ, enquanto que, a resposta linfoproliferativa vista anteriormente para Lc14 não

foi observada. De qualquer forma, diante dos resultados obtidos pela injeção isolada de

plasmídeos, uma nova combinação de plasmídeos, que inclua outros antígenos mais

imunogênicos, pode ser uma alternativa para obtenção de uma resposta imune protetora no

modelo murino de leishmaniose visceral.

A administração dos plasmídeos quer seja isoladamente ou em combinação, foi realizada

por meio de injeções intramusculares seguida de eletroporação. A eletroporação in vivo é uma

estratégia utilizada para aumentar a eficiência de transfecção e os níveis de expressão de

polipeptídeos após injeção de DNA plasmideal (RIZZUT0 et al., 1999). Esta técnica permite um

aumento no nível de expressão de polipeptídeos exógenos, em função do aumento no número de

células transfectadas e, provavelmente, pelo aumento no número de cópias de plasmídeo

recombinante introduzido em cada célula muscular (AIHARA & MIYAZAKI, 1998). Isso

ocorre, em parte, devido à uma rápida desestruturação da membrana celular e abertura de poros

que permitem a passagem de grandes moléculas (SOMIARI et al., 2000).

Como apresentado neste trabalho, o uso de eletroporação não induziu um aumento

significativo na intensidade da resposta imune como têm sido descrito em diversos outros

trabalhos (WIDERA et al., 2000, KADOWAKI et al., 2000 , ZUCCHELLI et al., 2000). Em

experimentos anteriores realizados em nosso laboratório, o uso de eletroporação levou a um

aumento significativo na expressão do cDNA que codifica IL-12 murina após a injeção do

plasmídeo pcDNA3.1A-scmu-IL-12 comparada a administração do mesmo plasmídeo sem

eletroporação. Este aumento na produção de IL-12 murina foi demonstrado indiretamente pela

135

detecção de IFN-γ em níveis elevados apenas no soro dos animais submetidos a eletroporação em

relação aos animais que não foram submetidos ao tratamento com choque elétrico (BARROUIN-

MELLO et al., dados não publicados). Os plasmídeos utilizados neste trabalho, pBK-CMV

(Stratagene) e pcDNA3.1 (Invitrogen), possuem as características apropriadas para a produção de

proteína recombinante in vivo em células de mamíferos, como por exemplo a presença de uma

forte região promotora para expressão em células eucarióticas (PASLEAU et al., 1985; XIA et

al., 2006).

A produção de anticorpos específicos que ocorre naturalmente na infecção por

Leishmania, parece ter pouca, ou mesmo, nenhuma importância na proteção contra a infecção

quer seja em seres humanos ou em cães (BEHFOROUZ et al., 1983; GALVÃO-CASTRO et al.,

1984; INIESTIA et al., 2005; REIS et al., 2006). Apesar disso, a avaliação da produção de

anticorpos pode fornecer informações gerais a respeito da imunogenicidade de diferentes

candidatos a vacina. No modelo murino, a produção de anticorpos das diferentes subclasses de

IgG, específicas para o antígeno, é uma medida conveniente para a avaliação da regulação de

uma resposta imune mediada por células Th1 ou Th2.

A resposta imune humoral que foi induzida pela administração de plasmídeos capazes de

codificar proteínas de formas amastigotas de L. chagasi, quer seja administrados isoladamente ou

como uma mistura de plasmídeos, apresentou-se predominantemente com produção de anticorpos

de isotipo IgG2a. Em camundongos, a produção de IFN-γ, um marcador da resposta imune

celular do tipo Th1, induz a acumulação de RNA mensageiro para cadeia pesada de

imunoglobulina gama 2a em células B e correlaciona-se diretamente com uma elevada produção

de anticorpos de isotipo IgG2a (SNAPPER et al., 1987). Por outro lado, na presença de IL-4 e/ou

IL-5 a produção de anticorpos de isotipo IgG1 é favorecida (SNAPPER et al., 1987;

PURKERSON & ISACKSON, 1992). Em todas as avaliações realizadas neste trabalho, na qual

plasmídeo foi utilizado para injeção de camundongos, a medida de densidade óptica para

detecção de anticorpos de isotipo IgG2a foi maior que a medida de anticorpos de isotipo IgG1.

Vale ressaltar que a avaliação da proporção de anticorpos IgG2a/IgG1 é relativa uma vez que

para determinação de cada uma destas subclasses se utilizam ensaios imunoenzimáticos distintos.

Nossa observação diante de repetidas avaliações é que a relação IgG2a > IgG1 se mantém para

injeções com DNA e, torna-se inversa para imunização com proteína, assim como verificado

utilizando-se soro de camundongos infectados com L. chagasi (dados não mostrados). Assim,

136

diante do predomínio de anticorpos de isotipo IgG2a, uma resposta imune celular do tipo Th1,

com produção de IFN-γ, foi esperada para os animais injetados com plasmídeos recombinantes.

O uso de plasmídeo como vetor de expressão de antígenos recombinantes foi utilizado no

presente trabalho visando à identificação de um protocolo de imunização capaz de favorecer a

indução de uma resposta imune celular do tipo Th1, contra antígenos de L. chagasi. A indução de

resposta imune celular específica, após as séries de injeções de plasmídeos recombinantes

capazes de codificar antígenos de L. chagasi, ocorreu em apenas um grupo de animais os quais

foram injetados com pool de plasmídeos associado ao plasmídeo pcDNA3.1-scmu-IL-12. As

células esplênicas destes animais produziram IFN-γ in vitro apenas após cultivo com Lc9

recombinante e esta produção foi estatisticamente significante em relação aos demais grupos. A

produção de IFN-γ após a série de injeções com um pool de plasmídeos associado a pcDNA3.1-

scmu-IL-12 foi de pouca intensidade, mas consistente, pois manteve-se após a infecção com

promastigotas de L. chagasi. Após a infecção foi possível detectar a indução de resposta imune

celular específica em células de animais injetados com pBK-CMV-Lc9, com produção

estatisticamente significante de IFN-γ, e em células de animais injetados com pBK-CMV-Lc14,

com resposta proliferativa.

Apesar de pouco intensa, a resposta imune induzida após as injeções de plasmídeos foi

predominantemente do tipo Th1. Em nenhum momento a produção de IL-4 ou de IL-5 foi

detectada no sobrenadante das culturas, exceto após estimulação com concanavalina A,

mostrando que as células eram capazes de produzir tais citocinas. No entanto, não podemos

descartar a possibilidade de que tenha ocorrido a indução da produção destas citocinas após

estimulação in vitro. As dosagens de IL-4 e IL-5 no sobrenadante de cultura de células precisam

ser avaliadas de forma cautelosa, uma vez que o consumo destas citocinas por células estimuladas

pode levar a uma medida subestimada e interpretações pouco confiáveis quanto ao tipo de

resposta imune que está sendo avaliada (EWEN & BACA-ESTRADA, 2001). Vários autores têm

demonstrado que a expressão do receptor de IL-4, tanto em sua forma solúvel como ligado à

membrana, pode ser induzida durante diversas condições de estímulo in vitro, incluindo o uso de

mitógenos de células T, concanavalina A ou anticorpos anti-CD3, além de IL-4, levando ao

consumo da citocina ainda em cultura (RENZ et al., 1991; CHILTON et al., 1993; BLUM et al.,

1996). Assim, outras técnicas para avaliação de IL-4 e IL-5, rotineiramente utilizadas por

137

diversos laboratórios, precisam ser consideradas tal como o uso de RT-PCR ou ELISPOT, por

exemplo.

O papel da IL-12 na potencialização da resposta imune foi apenas modestamente

observado tanto para resposta imune humoral como para resposta imune celular. Esta é uma

citocina conhecida pelo seu papel em promover a diferenciação e expansão de células do tipo Th1

a antígenos co-administrados, principalmente por induzir a produção de IFN-γ (TRINCHIERI,

2003). A resposta imune humoral também é influenciada pela ação da IL-12, indiretamente,

mediado também por IFN-γ, na indução de troca de isotipo de anticorpos para IgG2a (MORRIS

et al., 1994; METZGER et al., 1996). Foi observado neste trabalho que houve um aumento

estatisticamente significativo na produção de anticorpos quando os camundongos foram injetados

com plasmídeocodificando IL-12 murina associado ao pool de plasmídeos recombinantes. Além

disso, a intensidade de reatividade de anticorpos IgG2a não foi diferente da produção induzida no

grupo que não recebeu IL-12. Da mesma forma, em relação a resposta imune celular, não foi

observada linfoproliferação frente ao cultivo com qualquer uma das proteínas recombinantes. Já a

produção de IFN-γ foi detectada no grupo injetado com pool de plasmídeos associado à IL-12

murina (plasmídeo) mas apenas quando o estímulo in vitro utilizado foi Lc9 recombinante.

Ainda assim, a concentração de IFN-γ neste grupo de animais foi menor que a concentração

obtida com células de animais injetados apenas com pBK-CMV-Lc9 sem a associação a IL-12

murina.

A IL-12 pode regular negativamente a resposta imune, na dependência da quantidade em

que ela é administrada (KURZAWA et al., 1998; LASARTE et al., 1999; CHEN, et al., 2001).

Neste trabalho foram utilizadas três séries de injeções de pcDNA3.1-scmu-IL-12 seguida de

eletroporação. Assim, existe a possibilidade de, ao invés de contribuir para a diferenciação e

potencialização da resposta imune, a IL-12 tenha proporcionado efeitos tóxicos que conduziram

para o comprometimento do desenvolvimento de uma resposta imune eficiente. De fato, em

experimentos realizados paralelamente por nosso grupo, foi observado que, em diferentes

linhagens de camundongos, mesmo doses menores de plasmídeo codificando IL-12 após injeção

intramuscular seguida por eletroporação levaram a um aumento no tamanho do fígado e dos

linfonodos drenantes e a uma intensa esplenomegalia, com alterações histológicas na polpa

vermelha caracterizada pela presença de corpos apoptóticos e macrófagos vacuolares (SANTOS,

2007; PINHEIRO et al., dados não publicados).

138

No modelo murino experimental de leishmaniose visceral, o uso de IL-12

concomitantemente a injeção de antígenos purificados, como a fração FML e o antígeno

recombinante rHASPB1, quer seja administrada como proteína recombinante ou sob a forma de

plasmídeo, não foi capaz de induzir qualquer alteração nos níveis de proteção obtidos em sua

ausência (SANTOS et al., 1999; STAGER et al., 2000). Já a indução de resposta imune

específica para o antígeno recombinante ORFF na presença de IL-12, codificada in vivo após a

injeção de um vetor plasmideal, apresenta resultados extremamente satisfatórios, inclusive com

significativo aumento na capacidade de controle da infecção após desafio dos animais

imunizados (TEWARY et al., 2006).

Alguns resultados obtidos a partir da injeção de IL-12, para uso como adjuvante, no cão

também são aparentemente contraditórios. Recentemente, nosso grupo de pesquisa e outros

grupos, demostraram que células de animais com leishmaniose visceral são capazes de responder

ao estímulo in vitro com IL-12 canina, resultando principalmente em produção de IFN-γ e

proliferação celular, caracterizando a indução de uma resposta imune Th1 (SANTOS et al., 2004;

STRAUSS-AYALI et al., 2005; SALDARRIAGA et al., 2006b). No entanto, a resposta imune

induzida em cães injetados com uma preparação multivalente de plasmídeos capazes de codificar

antígenos recombinantes de Leishmania não sofreu qualquer alteração pela administração

concomitante com um plasmídeocodificando IL-12 canina (SALDARRIAGA et al., 2006a).

Assim, as condições de uso desta citocina como um adjuvante em uma vacina para o cão

precisam ser ainda criteriosamente avaliadas.

A ausência ou baixa intensidade de resposta imune induzida após a injeção de plasmídeos

capazes de codificar proteínas de formas amastigotas de L. chagasi pode explicar a incapacidade

de controle da infecção após o desafio. Ainda assim, existe a possibilidade de que as proteínas

Lc9 e Lc14 apresentem algum potencial na indução de resposta imune protetora uma vez que

após a infecção com promastigotas de L. chagasi, houve resposta imune específica contra estas

proteínas. Além disso, em dois de seis animais injetados previamente com pBK-CMV-Lc9 não

foi detectada a presença de promastigotas de L. chagasi na primeira diluição do macerado de

baço quando realizada a avaliação de carga parasitária. Este pode ser um resultado fortuito, mas

há necessidade de se averiguar a possibilidade de indução de imunidade protetora a partir da

injeção com Lc9 com a realização de novos experimentos.

139

É sabido que a produção de IFN-γ é essencial para que ocorra proteção no modelo murino

de leishmaniose visceral, no entanto, parece que citocinas do tipo Th2 podem ter algum papel nas

etapas iniciais de indução da resposta imune. Há publicações que relatam que mesmo na presença

de uma forte resposta imune celular tipo Th1, obtida pela administração de plasmídeos capazes

de codificar o gene LACK, o controle da infecção por L. donovani ou L. infantum/chagasi em

camundongos não foi obtido (MELBY et al., 2001; MARQUES-DA SILVA et al., 2005). Estes

autores discutem sobre o papel de IL-4 na ativação de células T CD8+ específicas para antígenos

de parasitos intracelulares, como recentemente demonstrado por Stager et al., 2003 e Morrot et

al., 2005. No entanto, pelo menos até o momento, não há dados da literatura que façam este tipo

de associação para células caninas, ao contrário, IL-4 tem sido detectada em animais infectados e

com sinais de leishmaniose visceral, embora também sua participação na patogênese da doença

também não esteja esclarecida (QUINELL et al., 2001; CHAMIZZO et al., 2005).

Diante dos resultados obtidos pela administração de plasmídeos, quer seja isoladamente

ou como uma mistura de DNA, realizamos experimentos visando aumentar a intensidade da

resposta imune específica contra Lc9, uma das proteínas recombinantes aparentemente mais

promissoras, mantendo o padrão de resposta obtido após a injeção de plasmídeo. Como descrito

anteriormente, a resposta imune murina frente ao estímulo com rLc9 associada a diferentes

adjuvantes foi avaliada previamente em nosso laboratório. O resultado obtido a partir desta

análise inicial foi que a injeção de Lc9 associada à saponina foi a única combinação capaz de

induzir uma resposta imune bastante intensa apresentando, no entanto, um padrão misto de

resposta tipo Th1/Th2 (FRAGA, 2007). Então, fizemos uso de uma estratégia de imunização

heteróloga tipo DNA primer/proteína booster, uma metodologia capaz de aumentar a resposta de

célula T à vacinação e que vem sendo utilizada para gerar imunizações efetivas contra malária e

uma variedade de parasitos, principalmente em animais de grande porte (RAMSHAW &

RAMSAY, 2000; JONES et al., 2001; DUNACHIE & HILL, et al., 2004; COBAN et al., 2004).

A administração de plasmídeo pBK-CMV-Lc9 e posterior reforço com a proteína rLc9

purificada levou a um aumento moderado na intensidade da resposta imune humoral e celular

frente ao estímulo antigênico específico. Observamos que (i) o padrão da produção de anticorpos,

IgG2a > IgG1 foi mantido mesmo após a injeção de rLc9 associada à saponina; (ii) uma resposta

proliferativa, antes não observada após as injeções com pBK-CMV-Lc9, foi evidente e (iii) ao

contrário da injeção somente com a proteína, apenas IFN-γ foi produzido enquanto IL-4 e IL-5

140

estavam ausentes. Entretanto, como a produção de IL-10 pode ser fortemente induzida na

presença de saponina, como demonstrado inicialmente tanto para administração de ovalbumina

como para um antígeno específico de Tripanosoma cruzi (TADOKORO et al., 1996), ensaios

para detecção desta citocina devem ser realizados para avaliar se, utilizando este protocolo de

imunização, uma resposta imune exclusivamente do tipo Th1 pode ser obtida. A avaliação da

produção de IL-10 faz-se necessária, uma vez que esta citocina apresenta um importante papel na

regulação da resposta imune na leishmaniose visceral humana e murina, e, provavelmente

também no cão (MURRAY et al., 2002).

A possibilidade de que a resposta imune induzida a partir da imunização inicial com pBK-

CMV-Lc9 e posterior reforço com rLc9/saponina seja capaz de conferir proteção contra infecção

por Leishmania precisa ser futuramente avaliada, assim como, após a injeção de rLc9 associada à

saponina. Neste trabalho, os resultados obtidos após a utilização de Lc9 sob a forma de proteína

em associação à saponina para a indução de resposta imune confirmam os dados previamente

obtidos em nosso grupo. Como demonstrado recentemente, mesmo uma resposta imune

específica com características Th1/Th2 pode levar ao controle da infecção por L. chagasi, como

observado para a proteína recombinante A2 (GHOSH et al., 2002). Estes dados nos encoraja

ainda mais para a obtenção de informações a cerca da real efetividade de uma resposta imune

gerada contra Lc9 no controle da infecção por L. chagasi.

Outras combinações de rLc9, ou outras proteínas recombinantes, com adjuvantes que

sejam compatíveis com o uso em cães devem ainda ser avaliadas, quer seja para imunização com

proteínas apenas ou para combinação com um vetor de expressão de DNA. Possibilidades

alternativas seriam a combinação com oligonucleotídeos CpG, o uso de Montanide 720, muramil

dipeptídeo (MDP), e ISCOMS como um novo sistema de liberação de antígenos entre outros

adjuvantes comercialmente disponíveis que tendem a favorecer uma resposta celular (KLINMAN

et al., 1997; ARAÚJO & MOREIN, 1991; BIRKETT et al., 2002). Em cães, resultados

promissores foram observados na avaliação da combinação de antígenos de L. infantum com

MDP quanto à indução de imunidade protetora contra infecção natural em uma área endêmica

para leishmaniose visceral no sul da França (LEMERSE et al., 2007).

Além disso, nosso grupo vem ao longo dos anos ampliando o painel de citocinas caninas

recombinantes que podem ser avaliadas quanto à capacidade de aumentar a intensidade da

resposta imune a antígenos co-administrados, direcionar e manter uma resposta celular tipo Th1

141

e/ou que seja capaz de induzir células de memória eficientemente. Além da obtenção de novas

citocinas, como IL-7 e IL-15, avaliações recentes, realizadas em nosso grupo de pesquisa,

mostram que a associação de IL-12 e IL-2 promovem um efeito sinérgico na produção de IFN-γ e

esta pode ser uma estratégia alternativa na modulação da resposta à antígenos co-administrados

(PEREIRA, 2006).

A partir deste e de outros trabalhos paralelos, foi possível iniciar em nosso grupo de

pesquisa o estabelecimento de um conjunto de metodologias e informações úteis para a avaliação

de antígenos candidatos à uma vacina, a partir do domínio de estratégias de imunização e de

avaliação da resposta imune murina. Com base em nossos achados, a indução de resposta imune

contra Lc9 e também contra Lc14 a partir da injeção de plasmídeos recombinantes é uma

metodologia viável para a obtenção de resposta imune celular. Embora algumas manipulações

precisem ser feitas, esquemas de imunização em cães a partir da injeção inicial de DNA devem

ser retomadas. Além disso, novos experimentos serão realizados a fim de explorar a capacidade

protetora induzida por Lc9, neste e em outros esquemas de imunização.

142

7. CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos neste trabalho, podemos concluir que:

1. O uso dos plasmídeos pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14 para injeção em camundongos,

permite a indução de resposta imune contra as proteínas Lc9 e Lc14 de L. chagasi.

2. A resposta imune obtida a partir do uso de pBK-CMV-Lc9 e pBK-CMV-Lc14,

administrados isoladamente ou como parte de uma combinação de plasmídeos,

caracteriza-se como uma resposta tipo Th1 de pouca intensidade.

3. A indução de uma potente resposta imune humoral e celular mista Th1/Th2 específica

para Lc9 é obtida após a injeção de rLc9 associada à saponina, confirmando dados

previamente obtidos por nosso grupo.

4. A utilização de um protocolo de imunização do tipo DNA primer/proteína booster, em

que o sistema imune é estimulado inicialmente pela administração de plasmídeo (pBK-

CMV-Lc9) e, posteriormente, pela proteína recombinante (Lc9) aumenta a intensidade da

resposta imune específica e apresenta o mesmo padrão de resposta obtido pela injeção

com DNA apenas.

5. A injeção de plasmídeos recombinantes capazes de codificar antígenos de amastigotas de

L. chagasi, administrados isoladamente ou como um pool de plasmídeos, não conferiu

controle do parasitismo esplênico no modelo murino de leishmaniose visceral, mesmo na

presença de uma aparente resposta imune do tipo Th1.

143

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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164

9. APÊNDICES

165

Salina ELb (18)c

pBKCMV vazio EL (12)

pBKCMV-Lc9 EL (12)

pBKCMV-Lc13 EL (12)

pBKCMV-Lc14 EL (12)

pBKCMV-Lc18 EL (12)

Salina EL (18)

pool plasmídeos sem EL (12)

pool plasmídeos + pIL-12m EL (12)

pool de plasmídeos EL (12)


Salina EL (6)

Saponina (6)d

pBKCMV vazio EL (6)

Lc9/saponina (6)d

pBKCMV-Lc9 EL (6)

pBKCMV-Lc9 (EL) + Lc9/saponina (6)d/e

APÊNDICE A – Desenho Experimental

camundongos BALB/c ♂ e ♀, 6 semanas de idade

PROTOCOLO 1 PROTOCOLO 2 PROTOCOLO 3

Resposta imune humoral

ELISA para detecção de Ac

IgG totalIgG: subclasses IgG1 e IgG2a

Resposta imune celular

Linfoproliferação (3 dias/5 dias)

Produção de citocinas (48 h) (IFNγ/IL4/IL5)

Injeção de promastigotasde L. infantum/chagasi

Análise de proteção

Determinação da carga parasitária

– Ensaio de Diluição Limitante

Avaliação do tamanho do baço


ELISA para detecção de anticorpos

anti-Lc9









Produção de citocinas (48 h)

(IFNγ/IL4/IL5)

a três injeções com intervalos de 3 semanas

por via intramuscularbEL – eletroporaçãoC no animais/grupod injeção subcutâneae 2 séries de injeções de DNA e 1 de proteína

Salina ELb (18)c


pBKCMV-Lc9 EL (12)

pBKCMV-Lc13 EL (12)

pBKCMV-Lc14 EL (12)

pBKCMV-Lc18 EL (12)

Salina ELb (18)c


pBKCMV-Lc9 EL (12)

pBKCMV-Lc13 EL (12)

pBKCMV-Lc14 EL (12)

pBKCMV-Lc18 EL (12)

Salina EL (18)





Salina EL (18)





Salina EL (6)

Saponina (6)d

pBKCMV vazio EL (6)

Lc9/saponina (6)d

pBKCMV-Lc9 EL (6)


Salina EL (6)

Saponina (6)d

pBKCMV vazio EL (6)

Lc9/saponina (6)d

pBKCMV-Lc9 EL (6)


APÊNDICE A – Desenho Experimental

camundongos BALB/c ♂ e ♀, 6 semanas de idade

PROTOCOLO 1 PROTOCOLO 2 PROTOCOLO 3







Injeção de promastigotasde L. infantum/chagasi

Análise de proteção

Determinação da carga parasitária

– Ensaio de Diluição Limitante

Avaliação do tamanho do baço


ELISA para detecção de anticorpos

anti-Lc9









Produção de citocinas (48 h)

(IFNγ/IL4/IL5)

a três injeções com intervalos de 3 semanas

por via intramuscularbEL – eletroporaçãoC no animais/grupod injeção subcutâneae 2 séries de injeções de DNA e 1 de proteína

166

APÊNDICE B – Foto do aparelho eletroporador

Eletrôdos

Ajuste de voltagemTempo de pulso (mseg)

Leitura da voltagem (x5)

Botão de disparo dos pulsos

Elaborado pelo Dr. Yuri Pepe – Departamento de Física - UFBA

APÊNDICE B – Foto do aparelho eletroporador

Eletrôdos

Ajuste de voltagemTempo de pulso (mseg)

Leitura da voltagem (x5)

Botão de disparo dos pulsos

Elaborado pelo Dr. Yuri Pepe – Departamento de Física - UFBA

167

APÊNDICE C – Mapa qualitativo das respostas imunes aos diferentes imunógenos em ensaios com e sem desafio com L. chagasi

Sem desafio Reatividade ao extrato bruto de L. chagasi Reatividade às proteínas homólogas aos

imunógenos Condições IgG IgG1 IgG2a Prolif IFNg IL4 IL5 IgG IgG1 IgG2a Prolif IFNg IL4 IL5

pBK-CMV-Lc9 EL pBK-CMV-Lc13 EL * * pBK-CMV-Lc14 EL pBK-CMV-Lc18 EL * * pool pBK-CMV Lc9-Lc18 * * * pool pBK-CMV Lc9-Lc18 EL * * * pool pBK-CMV Lc9-Lc18 + pIL-12 EL * * * pBK-CMV-Lc9 + Lc9/sap * * * * Lc9/sap * * * *

Após o desafio Reatividade ao extrato bruto de L. chagasi Reatividade às proteínas homólogas aos imunógenos Condições IgG IgG1 IgG2a Prolif IFNg IL4 IL5 IgG IgG1 IgG2a Prolif IFNg IL4 IL5

pBK-CMV-Lc9 EL * * pBK-CMV-Lc13 EL * * * * * * * pBK-CMV-Lc14 EL * * pBK-CMV-Lc18 EL * * * pool pBK-CMV Lc9-Lc18 * * * pool pBK-CMV Lc9-Lc18 EL * * * pool pBK-CMV Lc9-Lc18 + pIL-12 EL * * * pBK-CMV-Lc9 + Lc9/sap * * * * * * * * * * * * * * Lc9/sap * * * * * * * * * * * * * *

* Não avaliado

Positivo com p<0,05 em relação aos controles (ANOVA seguido de pós-teste de Tukey) Produção com p<0,05 usando teste t em relação aos controles negativo

168

APÊNDICE D – Manuscrito – primeira versão – a ser submetido posteriormente para publicação em revista científica indexada.

169

Title Evaluation of different protocols in the attempt to modulate the murine immune response towards

a new recombinant antigen candidate for a vaccine against canine visceral leishmaniasis

Authors

Lenita Ramires dos Santos1,2; Ricardo Evangelista Fraga1,2; Cristiane Garboggini de Melo

Pinheiro1,2; Márcio Silva Rodrigues1; Washington Luís Conrado dos Santos2, Lain Carlos Pontes-

de-Carvalho2; Geraldo Gileno de Sá Oliveira2*

1Programa de Pós-Graduação em Imunologia – PPGIm – Universidade Federal da Bahia –

UFBA. 2Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, BRAZIL

*Corresponding Author

Geraldo G S Oliveira

Mailing address: Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz,

Rua Waldemar Falcão, No. 121, Brotas. Salvador-Bahia, BRAZIL. CEP. 40295-001.

Tel: 55-71-3176-2262 or 55-71-3176-2290 - Fax: 55-71-3176-2326

e-mail: [email protected]

170

Abstract

Zoonotic visceral leishmaniasis is a progressive infectious disease and domestic dogs are

considered the major reservoir of the causal agent. In principle, a canine vaccine might block to

transmission cycle. Aiming to assess the potential of a new Leishmania chagasi/infantum

recombinant antigen (named rLc9) as a vaccine component, the murine immune response to rLc9

was studied. Groups of BALB/c mice were injected 3 times at 3-week intervals with i) rLc9 alone

or associated with Freund’s adjuvant, saponin, peanut oil, alum or a plasmid encoding single

chain murine IL-12 (pcDNA3.1-scmIL-12); (ii) rLc9-saponin associated with the administration

of a single dose of different amounts (from 0,4 to 50 µg) of pcDNA3.1-scmIL-12; iii) DNA

plasmid encoding Lc9 (pBK-CMV-Lc9) alone or pBK-CMV-Lc9 twice followed by rLc9.

Plasmid DNA was injected intramuscularly followed by electroporation. The mice that received

rLc9 or pBK-CMV-Lc9, in any association, developed specific IgG production. The animals

immunized rLc9-saponin or Lc9 associated with any amount of single doses pcDNA3.1-scmIL-

12 tested produced specific IgG2a and IgG1, while mice immunized with rLc9 alone or rLc9

associated with any of the other adjuvants, generated IgG1 but not IgG2a specific antibodies.

Mice injected with pBK-CMV-Lc9 followed by booster with rLc9, generated exclusively IgG2a

specific antibodies. The mice immunized with rLc9-saponin or with a initial injection of pBK-

CMV-Lc9/rLc9 showed specific lymphoproliferative response but IFN-γ production was

statistically significant related to the controls groups only in the first one. However, the groups

injected with pBK-CMV-Lc9 or pBK-CMV-Lc9/rLc9 do not produced IL-5 and the group

sensitized with rLc9-saponin/pcDNA3.1-scmIL-12 showed a reduced IL-5 concentration related

to rLc9-saponin injected group, after in vitro stimulation with Lc9. In conclusion, mice

immunized with the new recombinant antigen rLc9 develop a mild Th2 immune response. The

association of rLc9 and saponin in mice induced a strong mixed Th1/Th2 immune response

which was not modified to Th1 type by using mIL-12. Nevertheless, a cellular immune response

was generated after initial injection of pBK-CMV-Lc9 with proliferative response and only a

mild IFN- γ production.

Keywords: Visceral leishmaniasis; recombinant antigen, vaccine

171

1. Introduction

Visceral leishmaniasis (VL) is a progressive parasitic infection which is caused by at least

two different species of protozoan: Leishmania donovani and Leishmania infantum/chagasi

(Mauricio et al., 1999; WHO, 1990). Natural infection is transmitted by the bite of phlebotomine

sand fly insects of the family Psychodidae, subfamily Phlebotominae (Alexander, 2000; Killick-

Kendrick, 1990). L. infantum/chagasi, which is found mainly in the Mediterranean basin and

South America, is a zoonotic disease that frequently causes generalized disease in both people

and dogs that can be fatal (Abranches et al., 1991; Corredor et al., 1989; Deane and Deane,

1955). Dogs are considered the major reservoirs of L. infantum/chagasi and in endemic areas

canine infection rates often exceed 30 % (Ashford et al., 1995; Berrahal et al., 1996). Thus,

canine infection constitutes an important problem for controlling zoonotic VL because sick dogs,

and possibly asymptomatic animals, are the major reservoirs of the parasite (Corredor et al.,

1989; Lopes et al., 1984; Molina et al., 1994).

The evidence of acquired immunity and resistance to reinfection in natural Leishmania

hosts suggests that the vaccine design against VL is feasible. In dogs, protective immune

response against VL seems to be cellular of the so-called Th1 type (Pinelli et al., 1994), and the

predominant cytokine expressed after specific stimulation is interferon gamma (IFN-γ). Thus,

most of the studies aim to identify Leishmania antigens capable of stimulating a Th1 type

characteristic immune response. In fact, several antigens identified as candidates to vaccine

component showed a protective-associated immune response but with different organ-specific

protection degree in a murine experimental model of VL (reviewed in Khamesipour et al., 2006).

Surprisingly, murine experimental VL protection has been found also in a mixed specific

Th1/Th2 environment (Ghosh et al., 2001; Mazumdar et al., 2004) whereas an antigen highly

immunogenic and Th1 immune response inducer, rLACK, was not capable to induce a protective

immune response against neither L. donovani nor L. chagasi (Melby et al., 2001; Marques-da-

Silva et al., 2005). In spite of the fact that the clear Th1 versus Th2 dichotomy to be found in the

murine cutaneous leishmaniasis model caused by L. major, characterized by Th1 cytokines (IFN-

γ) associated with resistance/protection and Th2-type cytokines (IL-4) with disease

exacerbation/susceptibility, it is not so evident in experimental visceral leishmaniasis. It is also of

172

common sense that protection in visceral leishmaniasis is more difficult to obtain than the others

Leishmania models.

Traditionally experimentally used adjuvant such as Freund´s adjuvant and BCG can

modulate the strength, type and intensity immune response to Leishmania antigens (Champsi and

McMahon-Pratt, 1988; Kenney et al., 1999; Khalil et al., 2006). However, the use of this

adjuvants to use in dogs and in humans is not reccomended due several toxic effects. In the last

years, many others adjuvant formulations and new immunization protocols have been constantly

evaluated (Palatinik-de-Sousa et al., 1994, Ali and Afrin, 1998). Among different vaccination

protocols, the use of IL-12 in co-administration of parasite fractions or antigens (Afonso et al.,

1994; Tewary et al., 2006) and DNA-based immunization have driven, in same cases, the specific

cellular immune response to Th1-type without the induce local toxic effects (Watts and Kennedy,

1999), which plays an important role against intracellular parasites. Recently, the use of a

heterologous DNA primer-protein booster immunization strategy to induce potent cellular

immunity to Leishmania antigens and to promote control of infections is been susscefully

evaluated (Iborra et al., 2003; Tewary et al., 2005; Rafati et al, 2006).

In this study, we examined the immunogenic properties of a new Leishmania

infantum/chagasi recombinant antigen (rLc9) aimming to access the potential of this protein as a

vaccine component. This recombinant protein was identified in an amastigote form cDNA library

(Teixeira et al., 2007) and it was selected by antibody reactivity with pooled serum samples of

VL asymptomatic dogs. In addition, aiming to modulate efficiently the immune response to rLc9,

we evaluated and described here different immunization protocols in an attempt to induce a large

spectrum of murine specific immune response to rLc9 to find further a Leishmania protective-

associated immune response.

2. Material and Methods

2.1. Animals

Six to eight-week-old BALB/c mice (male and female) were obtained from the Gonçalo Moniz

Research Center Animal House and kept under appropriate conditions with free access to food

173

and water. The use of mice in this study (six/group) was approved by a national relevant

committee.

2.2. Plasmid preparation

Plasmid DNA (pBK-CMV-Lc9) was obtained from a cDNA library constructed with L. chagasi

RNA amastigotes in lambda phage (Stratagene). For prokaryotic protein expression and

purification, Lc9 cDNA was subcloned by transfering pBK-CMV-Lc9 to pRSET plasmid (latter

named pRSET-Lc9) by KpnI and BamHI enzymatic digestion and ligation. The plasmid encoding

a single-chain murine IL-12 (pCIneo-scmu-IL-12) was provided by Dra. Emmanuela Handman

(The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Australia), and was subcloned by PCR

to a plasmid ampicilin-resistance pcDNA3.1 (Invitrogen) and named pcDNA3.1-scmu-IL-12.

The plasmids used for mice injection (pBK-CMV-Lc9 and pBK-CMV vector without insert,

pcDNA3.1-scmu-IL-12 and pcDNA3.1 vector without insert) were prepared from overnight

cultures and purified by anion-exchange chromatography using a Qiagen Megaprep kit (Qiagen,

Hilden, Germany), according to the manufacturer’s instructions.

2.3. Expression of rLc9 in Escherichia coli and purification

For His-tagged rLc9 production, the Escherichia coli strain BL21(DE3)pLysS was transformed

with pRSET-Lc9 and grown following standard procedures in LB medium. After induction with

0,25 mM IPTG at an OD600 of 0.6 the cells were grown for a further 3 h and centrifuged. The

bacterial pellets were ressuspended in a lysis and ligation buffer (20 mM Na2HPO4, 500 mM

NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0) with 4 mg of deoxicholate acid/sediment weight (gr) and 1 mg

lisozyme/suspension volume, then followed by sonication and centrifugation at 17.000 g, 4° C,

for 15 minutes. The purification was done with soluble fraction using Chelating Sepharose Fast

Flow (Amersham). At the end, the bounded proteins were eluted with a buffer containing

Imidazole 0,5 M. The fractions containing the recombinant protein, as determined by SDS-

PAGE, were pooled and dialyzed against PBS. The purity of the recombinant protein was

checked by running it on SDS-PAGE gel followed by Comassie blue staining. Western blot was

performed for detecting rLc9 protein, using a mixture of dog´s serum with reactive antibodies

174

anti- L. chagasi and a mouse anti-His tag antibody, after transfer purified rLc9 to nitrocellulose

using a Bio-Rad transblot apparatus (Bio-Rad Laboratories).

2.4. Mammalian cell expression of rLc9

COS-7 cells were cultured in DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) medium

supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine (Life Technologies), 1%

non-essential amino-acid solution (Life Technologies) and 1% penicillin/streptomycin solution

(Life Technologies), from now on referred as supplemented DMEM, at 37° C and 5% CO2,

humidified atmosphere. The day before transfection, 106 cells were plated into 35 mm petri

dishes. Transfections were carried out with 1 µg of plasmid, either pBK-CMV-Lc9 or pBK-CMV

empty plasmid (the latter as the negative control), per petri dish, using lipofectamine (Life

Technologies), following the manufacturer's instructions. The day after transfection, the attached

cells on the petri dishes were washed once with 0.15 M phosphate buffered saline, pH 7.2 (PBS),

and cultured with fresh DMEM medium. After 48 hours, the cells were scraped out of plates and

ressuspended in SDS-PAGE (Laemmli, 1970) sample buffer. The rLc9 expression was

determined in transfected cells by Western blot analysis using a pool of serum of Leishmania

positive dogs. For Western blotting, transfected or untransfected cells were analysed as whole

cell lysate separately.

2.5. Immunization protocols

Immunizations experiments with the recombinant protein were performed injecting groups of six

mice with (i) 100 µg of rLc9 protein in saline or rLc9 associated with (ii) Freund’s adjuvant, (iii)

saponin, (iv) peanut oil or (v) alum, subcutaneously (s.c) in the dorsal region. Control mice

received the adjuvant alone. Boosters were given twice with the same antigen preparations at 3-

weeks intervals (table 1). For the experiments with DNA construction (pBK-CMV-Lc9), animals

were immunized by intramuscular (i.m) injection of 50 µg (in 50 µL) of plasmid DNA diluted in

saline in each hind leg quadriceps followed by electroporation, 100V with 5 pulses and 20 ms of

intervald. Control groups of mice were injected with sterile saline and with the vector pBK-CMV

devoid of insert. In a DNA primer/protein booster protocol, groups of mice were injected with

175

i.m. twice with plasmid DNA at 3-week intervals and boosted s.c. once with rLc9/saponin.

Additionally, fifty micrograms of plasmid encoding murine IL-12 (pcDNA3.1-mIL-12) was

administered (i.m. followed by electroporation) in groups of mice injected with rLc9, at 3-week

intervals, or a single dose of different amounts of the same plasmid DNA (50 µg, 10 µg, 2 µg and

0.4 µg pcDNA3.1-mIL-12) associated with rLc9-saponin were injected, followed by two

additional rLc9-saponin booster.

2.6. Determination of Ag-specific antibody response and isotypes

Serum samples were obtained at 2 weeks after the last injection dose by orbital plexus puncture.

Total IgG, IgG1 and IgG2a were measured in individual serum samples by ELISA against rLc9

and promastigote Leishmania antigens. Briefly, for the total specific IgG production, 96-well

microtiter plates were coated with 0,5 µg rLc9, overnight at 4oC, in a 100 µL volume of

carbonate-bicarbonate buffer pH 9,6. All incubations were carried out for 60 minutes at room

temperature except for the substrate-development step, and then the plates were washed thrice

after each incubation step with PBS containing 0,05% Tween-20 (PBST). After blocking with

10% skimmed milk in PBS, wells were incubated with a dilution of each sample (1:5.000)

followed by horseradish peroxidase (HRP)-conjugated-goat anti mouse IgG (Sigma) at 1:400

(protocol 1 and protocol 2) or other batch of anti mouse IgG at 1:4000 (protocol 3). Wells colors

reaction were developed at room temperature with TMB-H2O2 (Sigma) for 15 minutes and

stopped with H2SO4. Then, the absorbance at 450 nm was measured. To detect specific isotypes

to rLc9 and promastigote Leishmania antigens the plates were coated as described above. The

blocking stage and washes were done with 10% FBS in PBS only and with PBST, respectively.

After incubation of samples (diluted at 1:50.000 or 1:350.000), biotinylated monoclonal rat anti-

mouse IgG1 or IgG2a (Pharmingem) were added to the wells and incubated for two hours.

Avidin-peroxidase incubation followed by addition of substrate TMB-H2O2 was used to

development of color and measured at 450 nm as described before.

176

2.7. Splenocytes culture and proliferation assay

Spleens were removed aseptically from mice in each group 3 to 4-weeks after the last injection

dose. Single-cells suspensions were prepared by grinding the spleen with the disk bottom of the

plunger from 5-mL syringe. RPMI 1640 medium (10 mL) was added to the suspension, and then

the contents was mixed well it was centrifuged at 4oC by 100 x g for 30 seconds. The supernatant

was pipetted out slowly and the cells were pelleted by centrifugation at 4oC and 400 x g for 10

minutes. Supplemented RPMI medium (FBS 10%; 50 uM 2-ME 0,01M; HEPES 1mM pH 7,2;

glutamine 200mM) was used to ressuspend and adjuste the cells concentration to 3 x 106/mL. For

proliferation assay, 3 x 105 cells were plated in triplicate onto 96 well plates in a 100 uL volume

in the presence or absence of 2 µg/mL T-cell mitogen Concanavalin A (100 µL) or 10 µg/mL

rLc9 (100 µL) for 3 and 5 days at 37oC in 5% CO2, respectively. Proliferation was quantified by

measurement of the incorporation of 1 µCi of [3H]-labeled thymidine during additional 18 hours

of culture. Stimulation index (Si) were calculated as the ratios of [3H]-thymidine incorporation in

the presence of antigen versus the non-stimulated (medium alone) control.

2.8. Cytokine production assay

For cytokine production 300 µL of 9 x 105 cells, prepared as described above, were plated onto

24-wells plates and incubated in the presence or absence of 2 µg/mL Con A mitogen (300 µL) or

10 µg/mL of rLc9 (300 µL). After 48 hours of incubation at 37oC in 5% CO2, supernatants were

collected and cytokine concentrations were quantified by capture ELISA with biotinylated anti-

mouse IFN-gamma and anti-mouse IL-5 (BD Pharmingem) followed by incubation with avidin

conjugated to peroxidase (Sigma). The color reation development was done by the addition of

substrate buffer (TMB-H2O2). The reaction was stopped after 5-10 minutes with 50 µL of H2SO4

and the absorbance at 450 nm was measured. A standard curve was plotted using recombinant

murine IFN-γ or IL-5 in the same assay and the limit of detection was 0,110 ng/mL and 40

pg/mL, respectively

2.9. Statistical analysis

177

Comparison of the level of antibody induction, spleen cells proliferation and cytokine production

between the groups were determined by one-way ANOVA test followed by Tukey’s post-test

using “GraphPad Prism” software (version 4.0). The reported P-values < 0.05 were regarded as

statistically significant.

3. Results

3.1. In vitro expression of rLc9

The rLc9 protein was produced in a prokaryotic expression system in attempt to obtain a

high production and purification facility process. A high level expression of rLc9 recombinant

protein was achieved when BL21(DE3)pLysS E. coli lineage was used. A band of approximately

39 kDa was observed in E. coli lysate transformed with pRSET-Lc9 and cultured for 3 hours after

IPTG induction by 12% SDS-PAGE. A similar band was not observed when a negative control

plasmid was used to transform E. coli and the lysate was subjected to SDS-PAGE, neither before

nor after IPTG induction. The rLc9 preparation, purified as described in Material and Methods

did not show relevant contaminating proteins bands on the SDS-PAGE gel (Figure 1A). The

expression of the recombinant L. chagasi antigen was confirmed by using Western blot assay

which showed a reaction between anti-Leishmania dog’s serum and an anti-His tag antibody with

the corresponding band (Figure 1B).

Plasmid pBK-CMV-Lc9, used to animal injections, was tested for their ability to express

rLc9 by transient transfection of COS-7 cells. The Western blot analysis of rLc9 protein levels 48

h after transfection with Lc9 gene is shown in Figure 1C. As is seen, only the extract of cells

transfected with pBK-CMV-Lc9 showed the presence of a protein identified after incubation with

a mixture of serum of dogs with positive response to L. chagasi. The control plasmid-transfected

cells did not show any band upon incubation with anti-Leishmania antibodies. A little band of

low molecular weight was also recognized in the pBK-CMV-Lc9/COS-7 transfected cells.

178

3.2. Generation of specific rLc9 immune responses with Th2 characteristics

To evaluate antigen-specific immune response primed by rLc9, humoral response was

assessed in all tested groups. BALB/c mice that were injected three times with rLc9 only or with

different adjuvants were capable to produce a specific IgG antibody response (Figure 2). The

specific Lc9 humoral immune response intensity was higher in the group that were injected with

rLc9 in association with saponin than in the others groups (ANOVA, p < 0.0001; Tukey, p<0,05)

and similar to the response induced by rLc9 administration with Freund´s adjuvant. The relation

between the groups were rLc9/sap > rLc9/alum = rLc9/Freund´Adj = rLc9/peanut oil > rLc9

alone = rLc9/pcDNA3.1-scmuIL-12 > saline (p < 0.05). Because of the antibody isotype provides

a convenient surrogate marker for the induction of Th1 and Th2 CD4+ T cell differentiation, we

determined the relationship between IgG2a and IgG1 production, respectively. All the groups

showed an elevated IgG1 specific antibody production after rLc9 administration (Figure 2) with

only a minor difference between the groups that were injected with rLc9 alone or associated to p-

IL-12 and the others (ANOVA, p<0.0001; Tukey, p < 0.001). However, IgG2a specific Lc9

antibody production was observed only when saponin was used as adjuvant (Figure 2; 3 out of 3

experiments, ANOVA, p < 0.0001; Tukey, p < 0.001). The injection of rLc9 in association with

saponin gives the highest IgG2a/IgG1 ratio with (X ± SD, 0.77 ± 0.09) and by additional

statistical comparison a relation between the groups were rLc9/sap > rLc9/alum =

rLc9/Freund´Adj = rLc9/peanut oil = rLc9 alone = rLc9/pcDNA3.1-scmuIL-12 (data not shown,

ANOVA p < 0.0001 and Tukey p < 0.05).

Cellular immune response was evaluated by the determination of immune response

phenotype elicited by rLc9 injection alone or in combination of different adjuvant. Suspensions

of splenocytes from injected rLc9 mice were restimulated in vitro with rLc9 and tested for the

proliferation and cytokine production. A significant cell mediated response was evident only in

mice that were injected with rLc9 in association to saponin. As shown in Fig 2, immunization

with this protein preparation resulted in splenocyte proliferation (2 out of 3 experiments) in vitro

response to 0,1 µg/mL rLc9 stimulation (ANOVA, p < 0.0014; Tukey, p < 0.01). Others rLc9

concentrations used in the in vitro culture also induced statistically significant cell proliferation

(10 µg/mL, 1 out of 3 experiments and 1 µg/mL, 2 out of 3 experiments, data not shown).

179

However, all the other groups tested did not show significant splenocyte proliferation when

compared to the saline control group.

The cytokine production by splenocyte of mice that were injected with rLc9 showed a

predominant Th2 immune response profile. No IFN-gamma production was induced in response

to rLc9 protein injection administered with saline alone or in combination with Freund´s

adjuvant, peanut oil, alum or murine IL-12 plasmid DNA in contrast to production detected after

rLc9/saponin administration (Figure 2, ANOVA, p< 0.0005; Tukey, p < 0.01). All groups, with

exception of Freund´s adjuvant and peanut oil, showed a high IL-5 level production (Figure 2).

Interestingly, the association of rLc9 with saponin was the only one that induced IFN-gamma

production (3 out of 3 experiments) with concomitant IL-5 production (3 out of 3 experiments).

Then, an exclusively Th2 characteristic immune response induced by rLc9 protein could be

modified to a mixed Th1/Th2 type when Lc9 recombinant protein is administered in association

with saponin.

3.3. Specific rLc9 immune response in mice injected with different amounts of plasmid encoding

murine IL-12

In order to modify to Th1 type the specific immune response generated to rLc9 protein, a

plasmid encoding a murine single-chain IL-12 was co-administrated with rLc9 in mice. However,

as seen before, no change was observed with this combination. Posterior experiments showed that

a high dose of pcDNA3.1-scmur-IL-12 (50 µg) in different lineages of mice caused a significant

increase in the liver, spleen and draining lymph node size of the injected animals so that it could

be compromised the immune system (data not shown). Then, a single dose of different amounts

of pcDNA3.1-scmu-IL-12 were used in association with rLc9 protein and saponin (rLc9/sap)

preparation to verify if a in vivo lower concentration of IL-12 was capable to drive the rLc9

immune response to a Th1 type.

A high intensity specific humoral immune response was observed to rLc9 protein in all

conditions tested except to the controls groups injected with saline or saponin (Figure 3A,

ANOVA, p < 0.0001; Tukey, p < 0.001 all groups compared to the control groups). No difference

occurred when the recombinant protein was administered only with saponin or with DNA

plasmid (either pcDNA3.1 empty or four different amounts of pcDNA3.1-scmu-IL-12).

180

However, even so all the groups that received rLc9 showed the same intensity of a specific IgG1

production (Figure 3), a small difference was observed in the level of IgG2a production when

rLc9 was co-administrated with 50 µg of pcDNA3.1-scmu-IL-12 in a single dose of injection

(Figure 3). This difference was statistically significant (ANOVA, p < 0.0001; Tukey, p < 0.05)

compared to rLc9/sap injection only or the lower IL-12 DNA plasmid quantity co-administration

[pcDNA3.1-scmu-IL-12 (0.4 µg)]. The other two concentrations of IL-12 DNA plasmid, as well

as pcDNA3.1 empty, induced IgG2a specific antibody but with no statistically difference

compared to rLc9/sap response. The highest IgG2a/IgG1 ratio was observed in immunized mice

co-injected with 50 µg of pcDNA3.1-scmu-IL-12, with X ± SD of 0,81 ± 0,14, but with no

statistical difference compared to the others groups.

The cellular immune response induced using this immunization protocol was evidenced

only by cytokine production. No statistically significant splenocyte proliferation difference was

observed when all the groups were compared (Figure 3) but the IFN-gamma production was

detected in all the groups injected with rLc9. However, the group injected with the higher and the

lower murine IL-12 DNA plasmid concentration showed the a reduction in IFN-gamma level

(Figure 3). In addition, even IFN-gamma have been detected, statistical difference occurred only

between rLc9/saponin injected group and the controls groups injected with saline or saponin

(ANOVA, p < 0.0158; Tukey, p < 0.05). Interestingly, the IL-5 production observed after rLc9

administration was moderately diminished when 50 µg of DNA plasmid encoding murine IL-12

was used in a single dose injection co-administrated with the rLc9 to immunization (Figure 3)

and was kept lower also when 0.4 µg of DNA plasmid was used to injection. This latter result

may constitute a fortuitous result and need to be repeats to confirm the data.

3.4. Immune response to rLc9 after initial priming with plasmid DNA (pBK-CMV-Lc9)

DNA immunizations are known to promote a Th1-type immune response to encoded

proteins (Watts and Kennedy, 1999; Gurunathan et al., 2000). Thus, we examined the use of a

recombinant DNA plasmid injection to produce in vivo rLc9 protein and to try to induce a Th1-

type specific immune response in injected mice. Animals injected with pBK-CMV-Lc9 alone

were capable to respond specifically to rLc9 protein with IgG antibody production but with a

very lower intensity than the protein administration (Figure 4). However, this response is

181

predominantly of IgG2a isotype (2 out of 2 experiments) as seen clearly in others serum dilution

tested (data not shown). The cellular immune response was also very weak (2 out of 2

experiments) and not statistically significant when compared to controls groups (Figure 4).

A heterologous immunization strategy was used to try to increase the intensity of immune

response to the recombinant protein without revert the Th1 type characteristic. To do that, mice

were injected twice with pBK-CMV-Lc9 with 3-weeks intervals and boosted once with rLc9/sap

(table 1). As seen in Figure 4, a specific antibody production was also detected using this

immunization strategy. By statistical analysis, the mean optical density of the groups was

different and showed the relation: rLc9/sap > pBK-CMV-Lc9/rLc9/sap > pBK-CMV-Lc9 >

empty pBK-CMV = saponin = saline (ANOVA, p < 0.0001; Tukey, p < 0.001). Additionally,

while the IgG1 antibody production was higher in the group injected with rLc9 associated to

saponin the IgG1 production was not significantly detected using the DNA primer/protein booster

protocol of immunization (Figure 4, ANOVA, 0.0001; Tukey, p < 0.001 related to Lc9/saponin

compared to all the others groups). Finally, the IgG2a specific antibody production was not

statistically different between the two groups mentioned above (Figure 4). However, an

IgG2a/IgG1 ratio (X ± SD) of 0.29 ± 0.10 to rLc9/sap injection compared to 1.54 ± 0.8 to DNA

primer/protein booster (Student´s t test) is predicted of a Th1 differentiation to this latter group as

seen also to absent IgG1 production. Statistical comparison of the groups using the IgG2a/IgG1

ratio values showed the relation Lc9/sap < pBK-CMV-Lc9/rLc9/sap = pBK-CMV-Lc9 = empty

pBK-CMV = saponin = saline (ANOVA p < 0.0001 and Tukey p < 0.05).

After analysis of the cellular immune response, it was observed that a splenocyte

proliferation and Th1-type cytokine production were also induced by the DNA primer followed

by protein booster protocol (Figure 4). The proliferative response induced was statistically

different compared to the controls groups and the rLc9/saponin injected group (Saline = Saponin

= empty pBK-CMV = pBK-CMV-Lc9 < pBK-CMV-Lc9/Lc9 < Lc9/saponina; ANOVA, p <

0.0001; Tukey, p < 0.05). A more pronounced proliferation, but not statistically different when

compared to controls groups, was observed to DNA primer/protein booster injected group using

others concentrations of rLc9 used to culture in vitro (1 µg/mL and 10 µg/mL, data not shown).

Gamma-interferon production was detected in the culture supernatant at 13.9 ng/mL, 1.18 ng/mL

and 1.88 ng/mL to rLc9/sap, pBK-CMV-Lc9 or pBK-CMV-Lc9 followed by rLc9 booster,

respectively, but only the rLc9/saponin injected group showed a statiscally significant diference

182

related to all the others groups (ANOVA, p < 0.0005; Tukey, p < 0.01). Administration of rLc9

protein induced a IL-5 production (Figure 4) as seen before in other immunization protocol tested

(table 1, Figure 2 and 3). This IL-5 production was completely abrogated, with no production

detected, if rLc9 immune response is primed with pBK-CMV-Lc9 DNA plasmid (Figure 4).

4. Discussion

In this study, we evaluated the immunogenic properties of a new L. infantum/L. chagasi

recombinant antigen (rLc9) as a potential vaccine component candidate against canine visceral

leishmaniasis. Groups of BALB/c mice were used to the first evaluation of rLc9 injection as this

is an easy and useful model to manipulate and access the immune response to a specific antigen

and further to check the role of this response in an infection context. In an initial step, several

adjuvants were tested in association with recombinant protein. In addition, DNA-based

immunization was examined. All protocols used were done aiming to modulate as the specific

immune response type as the intensity to further evaluation of the effective role of the immune

response to Lc9 in an infection challenge with L. infantum/L. chagasi.

The rLc9 protein was successfully expressed both in a prokaryotic and eukaryotic

systems. The specificity of the recombinant protein (39 kDa approximately) was confirmed by

reactivity with positive pooled serum of dogs with visceral leishmaniasis and an anti-His-Tag

antibody to detect rLc9-(6) histidine-fusion protein produced in E. coli. It is possible that a band

of low molecular weight recognized by specific antibodies in the pBK-CMV-Lc9 transfected

COS-7 cells maybe rLc9 with partial degradation or mRNA anormally transcribed as sometimes

it is observed in prokaryotic expression (Schoemaker et al., 1985). A high purity degree

preparation of rLc9 was used to injection of mice, as seen in the SDS-PAGE analysis.

The immunogenic properties of the rLc9 were clearly observed. A specific antibody

production was induced by rLc9 administration. It must be emphasized that this response

presented a Th2-type characteristic pattern with exclusive IgG1 isotype and IL-5 production. No

proliferative response or IFN-γ production was observed. Early observations also have shown the

natural immunogenicity of this protein. The first one is that the screening of the cDNA library

was done with reactive dog´s serum to L. infantum/L. chagasi visceral leishmaniasis and latter by

183

the reactivity of human visceral leishmaniasis patient’s serum (unpublished data). Moreover,

initial experiments in our lab showed that the rLc9 induced a strong humoral specific response

but it wasn’t observed a proliferative cellular immune response in immunized dogs. Then, as

protection or resolution of infection in the dog’s visceral leishmaniasis it is associated to a potent

cellular immune response that result in IFN-γ production (Pinelli et al., 1994; Martinez-Moreno

et al., 1995; Rhalem et al., 1999), efforts to modulate the immune system response to rLc9 in the

murine model were done first by the use of several adjuvant association.

Our data demonstrate that among the tested adjuvant only one, the rLc9/saponin

association, was effective to change the rLc9 immune response. Using this preparation, a specific

cellular immune response was efficiently induced with only a minor difference, but statistically

significant, in relation to the intensity of the humoral response compared to the others adjuvant

association. However, even so a specific cellular proliferation has been observed, a mixed

Th1/Th2 pattern of cytokine production (IFN-γ and IL-5) and antibody isotype (IgG1 and IgG2)

was present. This result is in agreement with other work that show the consistent ability of

saponin in stimulate of both Th1 and Th2-type cells, with concomitant production of IFN-gamma

and IL-10 (Tadokoro et al., 1996). In addition, when compared with a panel of differents

adjuvants, associated to a purified glycoprotein from Trypanossoma cruzi, saponin also was the

only one to induce delayed-type hipersensitivity and partial protective immunity to a challenge

with live parasites (Scott et al., 1984). In the Leishmania models, the saponin as an adjuvant has

been susccessfully combined to the FML-antigen of L. donovani to induce strong specific

humoral and cellular immune response in immunized BALB/c mice after infection challenge and

with high degree protection (84.4%) in terms of the reduction of parasite liver burden (Palatinik-

de-Sousa et al., 1994 ). In an outbreed mice model, the FML-saponin preparation (or their

saponin fractions) also induced IgG2a specific antibodies production in the presence of IgG1

isotype with DTH reaction and IFN-gamma detected in the serum of immunized mice correlated

with protection (Santos et al., 2002). In our data reported here, the immune response pattern

induced by rLc9/saponin was consistently observed in two others posterior experiments.

Contrary to our expectations, the potent immunomodulatory activity of IL-12 was not

observed in the first realized experiments. The use of recombinant murine IL-12 to modulate the

immune response to soluble Leishmania major antigens (SLA) was clearly demonstrated prior by

Afonso et al., 1994 and recently, as IL-12 DNA plasmid injection given with a specific L.

184

donovani antigen rORFF (Tewary et al., 1996). We have presumption about ours results that a

toxic effect caused by IL-12 must be compromised the immune response as described by others

(Kurzawa et al., 1998; Lasarte et al., 1999; Chen et al., 2001). In another studies it was also

demonstrated that IL-12 administration was midly detrimental to spleen instead to contribute to

protection (Satger et al., 2000). In the present work, a high level of IL-12 in vivo expression

could be induced after DNA plasmid injection followed by electroporation technique as it is

showed to other proteins (Rizzuto et al., 1999; Yamashita et al., 2001). Moreover, initially it was

used an immunization protocol with 3 time injection of pcDNA3.1-scmu-IL-12. In previous

experiments realized in our laboratory, serum of BALB/c mice injected intramuscularly with

pcDNA3.1-scmu-IL-12 followed by electroporation showed high levels of IFN-gamma as a

consequence of IL-12 effects (Barrouin-Mello, unpublished data) and a evident splenomegaly

was also observed after IL-12 plasmid administration (data not shown). Thus, as showed in

posterior experiments in this study, a single dose injection of DNA plasmid encoding IL-12 was

capable to modulate moderately the specific immune response to rLc9 with a reduction of IL-5

production.

A Th1-type immune response was induced to rLc9 when initial DNA-based immunization

was done but at lower intensity than protein injection. However, the low or even absence of

humoral response seems to be frequently common for DNA vaccines, which favors cellular rather

than humoral response (Gurunathan et al., 2000; Mendez et al., 2001; Dumonteil et al., 2003;

Aguilar-Be et al., 2005). Thus, it is not easy to explain why the splenocyte proliferation and IFN-

gamma production was absent or was produced at not statistically significant level, respectively,

when only pBK-CMV-Lc9 was administered. We cannot exclude the possibility of a low protein

expression in vivo even using a plasmid with a potent promoter and with a high GC content

associated to transfection enhancer technique. There is need to consider the prokaryotic promoter

presence in the vector that can cause interference with the in vivo expression, as manufacturer

insctructions (Stratagene).

We demonstrated that an exclusive specific IgG2a production was detected in the serum

samples of initially pBK-CMV-Lc9 injected animals. As a clear correlation exist between the

antibody isotype switch and the cellular immune response pattern associated (Snapper et al.,

1987; Purkerson and Isackson, 1992) we speculated that IFN-γ producer cells were primed after

pBK-CMV-Lc9 injection. This Th2/Th1 change to rLc9 immune response was expected since

185

almost all of the DNA vaccines already tested in leishmaniasis experimental models resulted in

the development of a Th1-type response with varying degrees of protection (Xu and Liew, 1995;

Gurunathan et al., 1997; Walker et al., 1998; Sjolander et al., 1998; Méndez et al., 2001; Rafati et

al., 2001). In only one published study, a Th2-type specific response to a Leishmania

recombinant protein, the Meta 1 antigen, could not be reverted by the use of DNA injection

(Serezani et al., 2002) and the authors attributed this to the potent Th2-immunodominance of the

protein.

The intensity of the Th1-type response induced to rLc9 after DNA encoding plasmid

immunization could be moderatelly increased by the use of the heterologous DNA primer/protein

booster strategy. Moreover, in the induced rLc9 murine immune response after heterologous

DNA primer/protein booster, neither IgG1 antibodies nor IL-5 production was present at the

tested conditions. In other study, a lack of protection against L. major infection was observed

following a primer/booster immunization with rLIPO and the authors attributed this to the IgG1

specific antibody detection although splenocytes and lymph node cells from these mice produced

high levels of IFN-gamma when stimulated in vitro with rLIPO (Iborra et al., 2003). In spite of

the fact that there was no detection neither of IgG1 antibodies nor IL-5 in our model of

immunization with rLc9 in a DNA-based immunization and in a DNA primer/protein booster

strategy we cannot exclude that IL-10, a key role cytokine involved in susceptibility and/or

disease progression in human visceral leishmaniasis and in murine experimental model (Ghalib et

al., 1993; Bacellar et al., 2000; Murphy et al., 2001), it was produced after in vitro stimulation

with rLc9. This possibility needs to be evaluated in future experiments and to do this LPS

determination of purified rLc9 used to in vitro experiments should be tested to exclude the

possibility of induction of this and the others cytokines by contamination of this molecule (Huang

et al., 1999).

Even though the rLc9 protein has been selected by an amastigote form cDNA library this

protein is present in both the promastigote and amastigote forms of the parasite (data not shown).

It was demonstrated by antibody reactivity of immunized mice with L infantum/chagasi

promastigote total extract antigens. However, only a lower reaction was developed in the ELISA.

Thus, our data suggest that the Lc9 protein could be in a lower representation in the Leishmania

promastigote total extract antigens. Even so, when initial injection with pBK-CMV-Lc9 was

used, predominant IgG2a isotype reactive antibodies were observed in the anti-total antigens

186

ELISA after the complete immunization series. In addition, in a prior challenge experiment with

L. infantum/chagasi promastigotes, splenocytes of previous pBK-CMV-Lc9 injected group

produced high levels of IFN-gamma after in vitro stimulation with rLc9 which was statistically

different to the controls (ANOVA, p<0.001 and Tukey, p < 0.05) showing that in a recall

response the immunized animals were capable of reactive specific memory cells.

In summary, a mild Th2 immune response was induced in mice by the new recombinant

L. infantum/chagasi antigen, named rLc9. However, the use of saponin as adjuvant associated

with rLc9 antigen changed the response to a strong mixed Th1/Th2 pattern which was not

modified to Th1 type by using mIL-12. Nevertheless, initial injection of pBK-CMV-Lc9 induced

a predominantly Th1 immune response and heterologous DNA primer/protein booster is a useful

strategy to intensify this response. Our studies permitted us to obtain a broad range of rLc9

specific immune response in mice. Future directions are in order to analyze the protocols efficacy

in terms of protection against infection both in experimental murine visceral leishmaniasis as in

the dog, the outbreed model and target of the vaccine.

Acknowledgments

We thank Andréa Mendes, Patrícia Meira and Elivani Sacramento for helping us with

suggestions and/or experiments during the development of the work. Financial Support:

INOVABIO Program, MCT, Brazil, RENORBIO Program, MCT, Brazil, MILENIO VACINAS

Program, CNPq and FAPESB.

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191

FIGURE LEGENDS FIG 1. In vitro expression of rLc9. (A) Procaryotic expression system of rLc9 in E. coli

transformed with pRSET-Lc9 3 hours before (lane 4) and after (lane 5) IPTG induction was

evaluated after 12% SDS-PAGE. The rLc9 purified in a niquel column is showed at lane 6. The

negative control plasmid pRSET without insert did not show any band at the same region neither

before (lane 2) nor after (lane 3) IPTG induction. In (B) Western blot is showing the specificity

of rLc9 protein in E. coli identified by a pooled of dog´s serum with positive immune response to

L. infantum/L. chagasi (lane 4) and with a mouse anti-His tag antibody (lane 5) in a nitrocellulose

membrane blotted with rLc9 after a 10,5% SDS-PAGE. Serum of normal dog and mouse anti-

IgG were used as negative control (lanes 2 and 3, respectively). In (C) rLc9 eukaryotic expression

was demonstrated in transfected COS-7 cells. The pBK-CMV-Lc9 DNA plasmid (lane 4) and

pBK-CMV empty control (lane 3) were introduced in mammalian cells (COS-7 only, lane 2) by

lipofectamine treatment. Identification of rLc9 in the cell lysate was done after 10,5% SDS-

PAGE followed by transfer to nitrocellulose membrane. Reactivity with positive pooled serum

dog’s visceral leishmaniasis was detected only in lane 3. The rLc9 L. chagasi recombinant

protein is indicated by arrows to the right of the panel. The location and size (kDa) of the

molecular mass markers (Bio-Rad) are shown at the left and in lane 1.

FIG 2. Specific immune response in mice injected with rLc9 and different adjuvants.

BALB/c mice (six/group) were injected s.c.3 times at 3-week intervals with saline, 100 µg of

rLc9 alone or associated with Freund’s adjuvant, saponin, peanut oil, alum or 50 µg of a plasmid

encoding single chain murine IL-12 (pcDNA3.1-scmIL-12). Plasmid DNA was injected

intramuscularly followed by electroporation. Mice were bled 10 day following the final injections

and serum from the mice in each group was evaluated individually. For indirect ELISA, 96-well

microtiter plates were coated with 100 µL of rLc9 (5 µg/mL) by overnight incubation in 0,1M

carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6, by overnight incubation. For total IgG detection serum

samples were diluted 1:5000. Then, goat anti-mouse IgG-peroxidase was used. For measurement

of IgG1 and IgG2a, samples were diluted to 1:50.000 followed by biotin-conjugated rat anti-

mouse IgG1 or anti-mouse IgG2a and avidin-peroxidase incubation. Color development was

done with substrate buffer containing TMB-H2O2 and optical density at 450 nm was determined.

Each sample was examined in duplicate. Results are expressed as the mean ± SD. Cellular

192

immune response was evaluated with 4 weeks after the final injection. Individual spleen cell

suspension was obtained and cultured for lymphoproliferative response assay and cytokine

production measurement. For cell proliferation, 3 x 105 cells/well were cultured, in triplicate, in a

96-wells plate with supplemented culture medium alone or with rLc9 (0,1 µg/mL) for 5 days at

37oC in a humidified ambient with 5% CO2. Cell proliferation was measured by more 18 h

incubation of cells with 3H-thymidine. The results are presented as the mean of Stimulation

Index (SI) ± SD of each group. To cytokine production evaluation, splenocytes were cultured in a

24-wells, 9 x 105 cells/well, in the presence of rLc9 (10 µg/mL) for 48 h. Then, supernatants were

collected and used in a capture ELISA to detect IFN-gamma and IL-5. Individual samples were

tested to IFN-gamma and pooled samples to IL-5 measurement. The IFN-γ values are represented

as the mean ± SD of each group. * ANOVA and Tukey, p < 0.05 compared to control group.

FIG 3. Specific immune response in mice injected with rLc9 and different amounts of

murine IL-12 encoding DNA plasmid. BALB/c mice (six/group) were injected s.c.3 times at 3-

week intervals with 100 µg of rLc9/saponin (rLc9 sap). In the first dose of injection, a plasmid

encoding single chain murine IL-12 (pcDNA3.1-musc-IL-12) was administered in animals of

four groups at different quantities soon after rLc9 injection. Plasmid DNA intramuscular injection

was followed by electroporation. Saline, Saponin and pcDNA3.1 empty plasmid control groups

were included in the experiment. Mice were bled 10 day after the final injections and serum from

the mice in each group was evaluated individually. To indirect ELISA assay, 96-well microtiter

plates were coated with 100 µL of rLc9 (5 µg/mL) by overnight incubation in 0,1M carbonate-

bicarbonate buffer pH 9,6. For total IgG detection serum samples were diluted 1:5.000. Next,

goat anti-mouse IgG-peroxidase was used. For measurement of IgG1 and IgG2a antibodies,

samples were diluted to 1:350.000 followed by biotin-conjugated rat anti-mouse IgG1 or anti-

mouse IgG2a and avidin-peroxidase incubation. Color development was done with substrate

buffer containing TMB-H2O2 and optical density at 450 nm was determined. Each sample was

examined in duplicate. Results are expressed as the mean ± SD. Cellular immune response was

evaluated with 4 weeks after the final injection. Individual spleen cell suspension was obtained

and cultured for lymphoproliferative response assay and cytokine production measurement. For

cell proliferation (A), 3 x 105 cells/well were cultured, in triplicate, in a 96-wells plate with

supplemented culture medium alone or with rLc9 (0,1 µg/mL) for 5 days at 37oC in a humidified

193

ambient with 5% CO2. Cell proliferation was measured by more 18 h incubation of cells with 3H-

thymidine. The results are presented as the mean of Stimulation Index (SI) ± standard deviation

of each group. To cytokine production evaluation, splenocytes were cultured in a 24-wells, 9 x

105 cells/well, in the presence of rLc9 (10 µg/mL) for 48 h. Then, supernantants were collected

and used in a capture ELISA to detect IFN-gamma and IL-5 as described in Material and

Methods. Individual samples were tested to IFN-gamma and pooled samples to IL-5

measurement. The IFN-γ values are represented as the mean ± SD of each group. * ANOVA and

Tukey, p < 0.05 compared to controls groups.

FIG 4. Specific immune response in mice after Lc9 encoding DNA plasmid injection.

BALB/c mice (six/group) were injected s.c.3 times at 3-week intervals with saline, saponin, pBK-

CMV empty plasmid, rLc9/sap or pBK-CMV-Lc9. Another group received two initial injection

of pBK-CMV-Lc9 followed by a rLc9/sap booster at the third injection. Plasmid DNA was

injected intramuscularly followed by electroporation. Mice were bled 10 day following the final

injections and serum from the mice in each group was evaluated individually. For indirect ELISA

assay, 96-well microtiter plates were coated with 100 µL of rLc9 (5 µg/mL) by overnight

incubation in 0,1M carbonate-bicarbonate buffer pH 9,6. For total IgG detection serum samples

were diluted 1:5.000. Then, goat anti-mouse IgG-peroxidase was used. To measurement of IgG1

and IgG2a, samples were diluted to 1:350.000 followed by biotin-conjugated rat anti-mouse IgG1

or anti-mouse IgG2a and avidin-peroxidase incubation. Color development was done with

substrate buffer containing TMB-H2O2 and optical density at 450 nm was determined. Each

sample was examined in duplicate. Results are expressed as the mean ± standard deviation.

Cellular immune response was evaluated with 4 weeks after the final injection. Individual spleen

cell suspension was obtained and cultured for lymphoproliferative response assay and cytokine

production measurement. For cell proliferation (A), 3 x 105 cells/well were cultured, in triplicate,

in a 96-wells plate with supplemented culture medium alone or with rLc9 (0,1 µg/mL) for 5 days

at 37oC in a humidified ambient with 5% CO2. Cell proliferation was measured by more 18 h

incubation of cells with 3H-thymidine. The results are presented as the mean of Stimulation

Index (SI) ± SD of each group. To cytokine production evaluation, splenocytes were cultured in a

24-wells, 9 x 105 cells/well, in the presence of rLc9 (10 µg/mL) for 48 h. Then, supernatants were

collected and used in a capture ELISA to detect IFN-gamma and IL-5. Individual samples were

194

tested to IFN-gamma and pooled samples to IL-5 measurement. The IFN-γ values are represented

as the mean ± SD of each group. * ANOVA and Tukey, p < 0.05 compared to controls groups.

195

Table 1. Immunization protocols

Boost Immunization

protocol

Prime

Day 0 Day 21 Day 42 saline saline saline rLc9 rLc9 rLc9 rLc9 CFAa rLc9 IFAb rLc9 IFA rLc9 sapc rLc9 sap rLc9 sap rLc9 alum rLc9 alum rLc9 alum rLc9 peanut oil rLc9 peanut oil rLc9 peanut oil

1

rLc9 pIL-12 (50 µg) rLc9 pIL-12 rLc9 pIL-12 sap sap sap rLc9 sap rLc9 sap rLc9 sap rLc9 sap + pIL-12 (50 µg) rLc9 sap rLc9 sap rLc9 sap + pIL-12 (10 µg) rLc9 sap rLc9 sap rLc9 sap + pIL-12 (2 µg) rLc9 sap rLc9 sap

2

rLc9 sap + pIL-12 (0.4 µg) rLc9 sap rLc9 sap pBK-CMV empty pBK-CMV empty pBK-CMV empty pBK-CMV-Lc9 pBK-CMV-Lc9 pBK-CMV-Lc9

3

pBK-CMV-Lc9 pBK-CMV-Lc9 rLc9 sap Protocols used for BALB/c mice immunization. protocols followed for BALB/c mice. Animals

were primed by injecting s.c. with 100 µg of rLc9 in combination with different adjuvant or i.m.

with 50 µg of plasmid pBK-CMV-Lc9. The animals were boosted as indicated 21 or 42 day later.

The control group Saline was repeated in all the immunization protocols tested. Furthermore, the

saponin and rLc9 sap injected groups (included in the protocol number 2) were used as a control

group in immunization protocol 3. a Complete Freund´Adjunt b Incomplete Freund´Adjuvant c saponin (Quilaja bark-Sigma)

Santos, L.R.; Fraga, R.E; Pinheiro, C.G.M.; Rodrigues, M.; dos Santos, W.L.C.; Pontes-de-Carvalho, L.C.; Oliveira, G.G.S.

196

FIG 1 Santos, L.R.; Fraga, R.E; Pinheiro, C.G.M.; Rodrigues, M.; dos Santos, W.L.C.; Pontes-de-Carvalho, L.C.; Oliveira, G.G.S

200

11697,4

66

45

31

21,5

14,4

6,5

KDa

Lanes: 1 2 3 4 5 6

A CB

1 2 3 4 5 1 2 3 4

200

11697,4

66

45

29

KD a

200

11697,4

66

45

29

KD a

197

FIG 2. Santos, L.R.; Fraga, R.E; Pinheiro, C.G.M.; Rodrigues, M.; dos Santos, W.L.C.; Pontes-de-Carvalho, L.C.; Oliveira, G.G.S.

0

1

2*

** * *

*

0

1

2 *

Salin

e

Lc9

Lc9/F

reund’s adj.

Lc9/S

aponin

Lc9/P

eanutOil

Lc9/A

lum

Lc9/p

cDNA3.1-

Scm

u-IL-12 Salin

e

Lc9

Lc9/F

reund’s adj.

Lc9/S

aponin

Lc9/P

eanutOil

Lc9/A

lum

Lc9/p

cDNA3.1-

Scm

u-IL-12

0.0

2.0

4.0 *

0

1

2

*

*

*

*

*

*

Lymphoproliferationp<0,05

IFN-γ p<0,05

IL-5

Index

ng/m

Lng/m

L

Opticaldensity

(450 n

m)

IgG

IgG1

IgG2a p<0,05

0

20

40

60 *p<0,05

0.0

1.0

2.0

198

FIG 3. Santos, L.R.; Fraga, R.E; Pinheiro, C.G.M.; Rodrigues, M.; dos Santos, W.L.C.; Pontes-de-Carvalho, L.C.; Oliveira, G.G.S

Lymphoproliferation p<0,05

IFN-γ p<0,05

IL-5

Index

ng/m

Lng/m

L

Opticaldensity

(450 n

m)

IgG2a p<0,05

p<0,05

0

1

2

3 * * ** *

*

IgG p<0,05

0

1

2

*

**

** *

IgG1

0

1

2

*

*

**

0

20

40

60

0

4

8

12*

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Salin

eSaponin

Lc9/p

cDNA3.1 (50 µg)

Lc9/S

aponin

Lc9/p

cDNA3.1-S

cmu-IL-12 (50 µg)

Lc9/p

cDNA3.1-S

cmu-IL-12 (10 µg)

Lc9/p

cDNA3.1-S

cmu-IL-12 (2 µg)

Lc9/p

cDNA3.1-S

cmu-IL-12 (0,4 µg)

Salin

eSaponin

Lc9/p

cDNA3.1 (50 µg)

Lc9/S

aponin

Lc9/p

cDNA3.1-S

cmu-IL-12 (50 µg)

Lc9/p

cDNA3.1-S

cmu-IL-12 (10 µg)

Lc9/p

cDNA3.1-S

cmu-IL-12 (2 µg)

Lc9/p

cDNA3.1-S

cmu-IL-12 (0,4 µg)

199

FIG 4. Santos, L.R.; Fraga, R.E; Pinheiro, C.G.M.; Rodrigues, M.; dos Santos, W.L.C.; Pontes-de-Carvalho, L.C.; Oliveira, G.G.S.O.

Salin

eSalin

e/Saponin

pBK-C

MV

Lc9/S

aponin

pBK-C

MV-Lc9

pBK-C

MV-Lc9

/Lc9

Lymphoproliferation

*

p<0,05

IFN-γ*

p<0,05

IL-5

Index

ng/m

Lng/m

L

Opticaldensity

(450 n

m)

IgG

IgG1

IgG2a p<0,05

*

0

2

4

10

30

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Salin

eSalin

e/S

aponin

pBK-C

MV

Lc9/S

aponin

pBK-C

MV-Lc9

pBK-C

MV-Lc9

/Lc9

0

5

10

15

**

*

**

p<0,05

p<0,05

0

1

2 *

0

1

2

0

1

2

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