Microbiologia Clnica

Teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA):Uma das tarefas executadas pelo laboratrio de microbiologia,Finalidade: orientar a escolha da terapia antimicrobiana mais adequada, o TSA representa uma importante ferramenta no monitoramento da evoluo da resistncia bacteriana e age tambm como um mtodo auxiliar na implantao de medidas de controle que evitem a disseminao de bactrias multirresistentes.

O TSA deve ser sempre realizado na avaliao das seguintes bactrias: 1. Enterobactrias; 2. Pseudomonas spp., 3. Acinetobacter spp.; 4. Staphylococcus spp.; 5. Enterococcus spp.; 6. Streptococcus pneumoniae; 7. Streptococcus do grupo viridans e beta-hemoltico; 8. Haemophilus influenzae; 9. Complexo Burkholderia cepacia; 10. Stenotrophomonas maltophilia; 11. Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis. O TSA pode no ser necessrio em situaes nas quais a sensibilidade pode ser predita pela realizao de outros testes, por exemplo, a deteco de beta-lactamases para predizer a sensibilidade ou resistncia das amostras de Moraxella catarrhalis ampicilina.

Todas as etapas envolvidas na realizao dos TSA, desde a seleo dos antimicrobianos a serem testados at a interpretao dos resultados, so padronizadas por organizaes especializadas como:Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, EUA); British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC, Reino Unido); Comit de LAntibiogramme de la Socit Franaise de Microbiologie (CA-SFM, Frana). Geralmente, as amostras da coleo americana, que so denominadas American Type Culture Collection (ATCC), so utilizadas como cepas-controle.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos1. 2. 3. 4. 5. 6.

Macrodiluio; Microdiluio; gar diluio; Etest; Disco difuso e Automao.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos1.a. b. c.

MacrodiluioTipicamente, oito ou mais concentraes do agente antimicrobiano so preparadas em um volume final de 1 a 2 mL por tubo. Os tubos contendo antimicrobianos so, ento, inoculados com uma suspenso bacteriana padronizada em torno de 5 x 105 unidades formadoras de colnias (UFC) por mL. Aps o perodo de incubao de 16 a 20 horas, a 352C, dependendo do gnero bacteriano e do antimicrobiano testado, os tubos so inspecionados visualmente para evidenciar o crescimento bacteriano que se traduz em um aumento da turbidez. Um tubo lmpido demonstra que no houve crescimento bacteriano e representa a concentrao inibitria mnima (CIM), ou seja, a menor concentrao de antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano. A CIM , geralmente, expressa em microgramas / mL.

d.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 1. MacrodiluioA CIM para este antimicrobiano de 32 g/mL, ou seja, a menor concentrao onde no se observa crescimento bacteriano. Aps as diluies de 8, 16, 32 e 64 g/mL serem inoculadas, respectivamente, nas placas de gar A, B, C e D e incubadas por 16 horas, no houve crescimento de colnias na placa D, determinando-se que a concentrao bactericida mnima (CBM) de 64 g /mL.

Mtodo Macrodiluio

Vantagem 1. A determinao de resultado quantitativo, a CIM.

Desvantagem 1. A quantidade de reagentes utilizada; 2. O espao necessrio para o armazenamento dos tubos; 3. A possibilidade da ocorrncia de erros durante a preparao das concentraes antimicrobianas e, 4. O trabalho manual dispendioso na preparao do teste.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos2.

Microdiluio A tcnica de microdiluio em caldo corresponde miniaturizao da tcnica de macrodiluio. As placas de microdiluio podem conter o antimicrobiano liofilizado ou congelado, e so inoculadas com o auxlio de um dispositivo plstico com o propsito de obter-se uma concentrao bacteriana final de aproximadamente 5 x 104 - 105 UFC/mL por poo da placa de microdiluio. Os painis de microdiluio devem permanecer incubados a 352C por 16 a 20 horas (dependendo do gnero bacteriano e do antimicrobiano testado). Aps a incubao, a leitura da placa, com a determinao da CIM, ser realizada visualmente, de preferncia com o auxlio de um espelho parablico, que amplifica a imagem e facilita a leitura.

a.

b.

c.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos2.

Microdiluio

Teste de microdiluio em caldo para polimixina B com concentraes de 16 g/mL (A) a 0.125 g/mL (G) cada coluna possui um microrganismo. Exemplo: coluna 11 - Pseudomonas aeruginosa com CIM 0,5 g/mL.

Mtodo Microdiluio

Vantagem 1. A economia de espao e de reagente; 2. A reprodutibilidade dos resultados devido possibilidade de preparao de grande quantidade de placas; 3. A gerao de um resultado quantitativo (CIM); 4. A convenincia de poder utilizar placas prfabricadas e sistemas computadorizados.

Desvantagem 1. A inflexibilidade na escolha dos antimicrobianos a serem testados quando se utilizam as placas prfabricadas; 2. O custo de cada placa de microdiluio.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 3. gar diluio;a.

Mltiplas placas so confeccionadas com a finalidade de avaliar diversos antimicrobianos em diferentes concentraes. Geralmente, 6 a 12 placas podem ser necessrias para avaliar a sensibilidade de um antimicrobiano. As amostras bacterianas so inoculadas simultaneamente sobre a superfcie do gar utilizando o multi-inoculador, o qual dispensa de 1 a 3 microlitros contendo aproximadamente o inculo final de 1 x 104 UFC/mL. O multi-inoculador possui de 32 a 96 pinos, permitindo que este nmero de amostras seja inoculado simultaneamente na placa de Petri de 90 e 150 mm, respectivamente. As placas inoculadas so incubadas por 16 a 20 horas, a 352C (dependendo do gnero bacteriano e do antimicrobiano testado). Aps este perodo, a CIM determinada como a concentrao que previne o crescimento macroscpico bacteriano.

b.

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e.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 3. gar diluio;

Teste de sensibilidade ao imipenem de amostras de P. aeruginosa pela tcnica de gar diluio.

Mtodo gar diluio

Vantagem 1. A habilidade de testar um grande nmero de amostras simultaneamente; 2. O custo relativamente baixo; 3. Permitir a determinao quantitativa da CIM; 4. Testar bactrias fastidiosas que no apresentam bom crescimento em caldo, como Neisseria gonorrhoeae e bactrias anaerbias.

Desvantagem 1. um mtodo muito trabalhoso tanto no que se refere preparao das placas como do inculo bacteriano. 2. Placas de gar contendo antimicrobianos devem ser preparadas preferencialmente no dia em que sero utilizadas.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 4. Etest uma fita plstica disponvel comercialmente, impregnada por concentraes crescentes de antimicrobiano na face ventral e marcada, na face dorsal, com a escala das concentraes testadas a fim de facilitar a leitura do resultado. Princpio:Baseia-se na difuso do gradiente antimicrobiano no gar para a determinao da sensibilidade da amostra bacteriana ao antimicrobiano testado.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 4. Etesta.

Com o auxlio de um swab, a amostra contendo 1 a 2 x 108 UFC/mL semeada sobre a superfcie da placa de gar; Aps 15 minutos, em mdia, as fitas de Etest so dispensadas sobre o gar. Em placas de 150 mm de dimetro, deve-se aplicar no mximo 5 fitas e, em placas de 90 mm, 2 fitas; Aps o perodo de incubao, a determinao da CIM lida como o ponto de interseco entre a fita de Etest e a zona de inibio do crescimento do microrganismo, a qual assume a forma elptica dando origem ao nome do teste, Episilometer test.

b.

c.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 4. Etest 1. Aps a incubao, proceder leitura das placas, 2. Remover a tampa da placa e determinar a CIM, a concentrao que se situa no ponto de interseco entre a zona de inibio do crescimento do microrganismo e a fita de Etest; 3. Caso haja dvida na leitura, ler uma concentrao acima. 4. Se no houver halo de inibio, reportar o resultado com a CIM superior ao valor marcado na fita (por exemplo, > 256 g/mL ou > 32 g/mL), se o halo de inibio estiver abaixo da primeira diluio, reportar a CIM como < 0,016 g/mL ou < 0,002 g/mL, por exemplo.

Mtodo ETEST

Vantagem 1. A flexibilidade na escolha dos agentes antimicrobianos a serem testados; 2. A fcil execuo e o fornecimento de um resultado quantitativo (CIM).

Desvantagem 1. O alto custo das fitas; 2. O nmero limitado de antibiticos testados por placa.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso Foi descrito em 1966 por Bauer e Kirby, um dos mtodos de sensibilidade mais simples e confiveis, Interpretar a categoria de sensibilidade de acordo com os critrios estabelecidos no documento do M100-S18 (CLSI, 2008).

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difusoa.

As placas so incubadas por 16 a 24 horas em ar ambiente ou a 5% de CO2 a 352 C (dependendo do gnero bacteriano e do antimicrobiano testado) antes dos resultados serem determinados. Os dimetros dos halos de inibio do crescimento bacteriano ao redor de cada disco so mensurados em milmetros. Estes so relacionados sensibilidade da amostra bacteriana e velocidade de difuso do antimicrobiano no gar. Quando os halos de inibio so correlacionados aos valores logartmicos da CIM pela anlise de regresso linear, encontra-se uma relao linear consistente demonstrando que o halo de inibio inversamente proporcional CIM daquele antimicrobiano.

b.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difusoc.

Na prtica, os resultados do teste de disco-difuso so interpretados comparando o valor do halo de inibio com os critrios publicados pelo CLSI. Desta maneira, as amostras bacterianas so categorizadas em sensveis, resistentes ou intermedirias. O teste no fornece um resultado quantitativo, mas sim qualitativo. Na maioria das situaes clnicas, o teste qualitativo suficiente para orientar a escolha teraputica.

d.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso Variveis que destacam-se: 1. O preparo dos meios de cultura; 2. O controle do pH do meio; 3. O tempo; 4. A temperatura e a atmosfera de incubao; 5. Concentrao do inculo; 6. O estoque adequado dos discos de sensibilidade; 7. O rigor na execuo da tcnica.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso Como realizar o TSA por disco difusoa. b. c. d. e. f. g.

Preparo do inculo bacteriano: Mtodo de crescimento: Mtodo da suspenso da colnia direta: Aplicao dos discos: Incubao das Placas: Leitura das placas; Interpretao dos resultados.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso Como realizar o TSA por disco difusoa.

Preparo do inculo bacteriano:i. Turvao correspondente a 0,5 da escala de McFarland (1,5 x 10 8 unidades formadoras de colnias (UFC)/mL), ii. A turbidez da suspenso bacteriana deve ser mensurada com o auxlio de um turbidmetro ou de um carto com listas.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso Como realizar o TSA por disco difuso b. Mtodo de crescimento: i. Com o auxlio de uma ala bacteriolgica ou swab, transferir 3 a 4 colnias com a mesma morfologia e inocul-las em 3 a 4 mL de caldo de Trypticase Soy Broth (TSB), soluo fisiolgica a 0,9%, ou caldo de Meller-Hinton; ii. Incubar a 352 C at a turbidez atingir 0,5 da escala de McFarland, o que geralmente ocorre aps 2 a 6 horas; iii. Esse mtodo habitualmente utilizado para cultura com mais de 24 horas de crescimento ou bactrias isoladas em meio seletivo.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso Como realizar o TSA por disco difuso c. Mtodo da suspenso da colnia direta: i. Com o auxlio de uma ala bacteriolgica ou swab, transferir 3 a 4 colnias com a mesma morfologia e inocul-las em 3 a 4 mL de caldo de TSB, soluo fisiolgica a 0,9%, ou caldo de Meller-Hinton; ii. Comparar o inculo com a escala 0,5 de McFarland; iii. Esse mtodo habitualmente utilizado para culturas com no mximo 24 horas de crescimento provenientes de meios no seletivos. iv.Esse mtodo recomendado para Haemophilus spp., Streptococcus spp., e Neisseria gonorrhoeae, podendo tambm ser utilizado para as bactrias de crescimento rpido como enterobactrias, estafilococos e enterococos.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso Como realizar o TSA por disco difuso d. Incubao das Placas: i. Dentro de 15 minutos aps o ajuste do inculo, proceder semeadura intoduzindo um swab estril na suspenso bacteriana ajustada a 0,5 da escala de McFarland, comprimir o swab contra a parede interna do tubo para retirar o excesso do inculo e semear a superfcie do gar em trs direes diferentes; ii. Deixar a placa semeada secar por 5 minutos temperatura ambiente, para que o inculo seja completamente absorvido pelo gar antes de aplicar os discos. No ultrapassar o perdo de 15 minutos entre a semeadura e a colocao dos discos. Caso o disco seja colocado com a placa ainda muito molhada, poder ocorrer o deslizamento deste no gar.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso

Deformao na zona de inibio do disco de ciprofloxacina, causada pelo deslizamento do disco no meio.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso Como realizar o TSA por disco difuso e. Aplicao dos discos: i. Placas de 150 mm: colocar no mximo 12 discos; ii. Placas de 90 mm: colocar 5 discos; iii.Para Haemophilus spp., Streptococcus spp. e Neisseria gonorrhoeae, colocar no mximo 9 discos nas placas de 150 mm, pois o dimetro dos halos de alguns antibiticos pode ser muito grande, podendo gerar confluncia dos halos de inibio e dificultar a leitura. iv. Retirar os discos da geladeira ou do congelador uma a duas horas antes da sua utilizao. v. Aps a colocao dos discos, pressionar levemente com um auxlio de uma pina a superfcie de cada disco. vi. Uma vez colocado o disco, no remover do lugar, pois a difuso da droga imediata.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso Como realizar o TSA por disco difuso f. Incubao das Placas: i. Incubar as placas invertidas no mximo 15 minutos aps a colocao dos discos; ii. A temperatura mxima da estufa deve ser 352C; iii. O tempo de incubao deve ser de 16 a 18 horas, com exceo da avaliao da sensibilidade oxacilina, vancomicina para Staphylococcus spp. e vancomicina para Enterococcus spp., que deve ser de 24 horas; iv. As bactrias so incubadas em estufa aerbia, com exceo de Haemophilus spp., Streptococcus spp.e Neisseria gonorrhoeae, que devem ser incubadas em estufa de 5% CO2.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso Como realizar o TSA por disco difuso g. Leitura das Placas: i. Aps o perodo de incubao, proceder leitura das placas; ii. Observar se h crescimento confluente, se so encontradas colnias individuais e se o inculo foi insuficiente, o teste deve ser repetido. iii. Placa de Mller-Hinton no suplementado, gar Medium (HTM) e gar GC devem ser lidas sobre uma superfcie Haemophilus Test escura com luz posicionada diretamente sob a placa. O dimetro de halo de inibio lido com auxlio de uma rgua ou halmetro sobre o fundo da placa;

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso Como realizar o TSA por disco difuso g. Leitura das Placas: iv. No gar Mller-Hinton sangue, abrir a placa e ler com o auxlio de uma rgua ou halmetro, mais prximo possvel do crescimento, utilizando uma fonte de luz sobre a placa; v. Cepas que apresentam hemlise, tomar cuidado para ler a inibio do crescimento e no a hemlise;

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso Como realizar o TSA por disco difuso g. Leitura das Placas: vi. A leitura de oxacilina e vancomicina para Staphylococcus spp. e vancomicina para Enterococcus spp. deve ser feita sob uma fonte transmitida. Colnias pequenas dentro dos halos devem ser verificadas se so clones resistentes ou eventual contaminao, antes de serem liberadas como cepas resistentes a estes antimicrobianos; vii. Considere os halos de inibio a partir do ponto, onde no foi observado o crescimento bacteriano a olho nu.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos 5. Disco difuso Como realizar o TSA por disco difuso h. Interpretao dos resultados Os halos de inibio para cada antimicrobiano testado devem ser interpretados nas categorias sensvel, intermedirio ou resistente, de acordo com os critrios estabelecidos pelo Clinical and Laboratory Standards Institute.

Mtodo Disco difuso

Vantagem 1. A fcil execuo; 2. A reprodutibilidade; 3. A utilizao de reagentes de baixo custo; 4. Resultados de fcil interpretao clnica; 5. Flexibilidade quanto escolha dos antimicrobianos e a no exigncia de equipamentos especiais.

Desvantagem 1. A no-padronizao deste mtodo para algumas combinaes de microrganismos e agentes antimicrobianos (S. pneumoniae versus cefalosporinas e Acinetobacter spp. versus polimixinas, por exemplo); 2. Pode no ser adequado para a deteco de mecanismos de resistncia resultantes da produo de lactamases (enterococo versus ampicilina.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos6.

Automao.

Os sistemas automatizados mais utilizados para a realizao dos TSA so: a. Vitek; b. Vitek-2 (bioMrieux, Hazelwood, MO); c. Walk-Away (DADE, West Sacramento, CA); d. BD Phoenix.

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos6.

Automao. O uso desses instrumentos permite a execuo dos testes de sensibilidade com mais rapidez, pois estes aparelhos possuem sistemas de deteco ptica capazes de medir alteraes discretas do crescimento bacteriano. Os aparelhos Vitek, Vitek-2, Walk-Away e BD Phoenix so capazes, ainda, de realizar simultaneamente a identificao de bactrias Gram-positivas e Gramnegativas e unir os resultados de identificao e do TSA em um nico relatrio. Os resultados fornecidos por estes sistemas so semi-quantitativos e no substituem as informaes fornecidas pelos mtodos de sensibilidade que quantificam a CIM. (normalmente avaliam 2 a 4 diluies de cada antimicrobiano)

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos6.

Automao.

Interpretao dos TSA A sensibilidade a um antimicrobiano indica que h grande probabilidade de sucesso clnico, caso este antimicrobiano seja utilizado para tratamento, quando doses habituais deste antimicrobiano so utilizadas. Se a bactria considerada resistente, significa que ela no inibida pelas concentraes de antimicrobiano alcanadas pelas doses habituais e h maior chance de falha teraputica. Caso a bactria seja classificada como intermediria, ela pode ser erradicada, dependendo das concentraes antimicrobianas alcanadas no stio infeccioso.

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Automao.

Interpretao dos TSA A realizao de testes dilucionais para a determinao da CIM til em algumas situaes especficas, como: 1. Infeces localizadas em stios corpreos, onde a penetrao dos antimicrobianos baixa: endocardite, osteomielite e meningite; 2. Avaliao da sensibilidade penicilina e s cefalosporinas de terceira gerao (cefotaxima ou ceftriaxona) entre amostras de S. pneumoniae causadoras de meningite (no existe padronizao para interpretao dos resultados obtidos por disco-difuso);

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Automao.

Interpretao dos TSA 3. A realizao de testes dilucionais para a determinao da CIM til em algumas situaes especficas, como: 4. Avaliao da sensibilidade s polimixinas. O CLSI recomenda a realizao do teste de sensibilidade s polimixinas por disco difuso somente para Pseudomonas aeruginosa, para as demais no enterobacteriaceae a sensibilidade a este antimicrobiano deve ser avaliado por mtodos dilucionais de referncia; 5. Avaliao da sensibilidade a antimicrobianos entre bactrias Gram-negativas no Enterobacteriaceae;

Tcnicas para avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos6.

Automao.

Interpretao dos TSA

6. Infeces sistmicas causadas por bactrias multirresistentes; 7. Infeces em pacientes imunocomprometidos.

Mtodo Automao

Vantagem 1. Maior rapidez na emisso dos resultados; 2.Padronizao intra e interlaboratorial; 3. Disponibilidade de programas de computao adicionais como o Impact (Vitek) e o PharmLink (WalkAway), os quais permitem a reduo do trabalho manual e que os relatrios emitidos possam ser recebidos simultaneamente pela farmcia hospitalar. .

Desvantagem 1. Estes sistemas so onerosos, 2. No fornecem o resultado exato da CIM 3. Por apresentarem um perodo de incubao curto, as bactrias que possuem mecanismos de resistncia induzveis podem no ter o tempo suficiente para expressar o respectivo mecanismo de resistncia e serem interpretadas por estes sistemas como sensveis a um determinado antimicrobiano.