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Cincia Animal Brasileira v. 6, n. 1, p. 41-47, jan./mar. 2005 41

A UTILIZAO DA IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA NO DIAGNSTICODE ROTINA DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA E SUAS IMPLICAES

NO CONTROLE DA DOENA

LDIASILVADEOLIVEIRA, FREDDASILVAJULIO, VERENAMARIAMENDESDESOUZA, DANIELASOUZAFREITAS, BRBARAMARIAPARANDASILVASOUZA, BRUNOJEANADRIENPAULE, PAULOHENRIQUE

PALISAGUIAR4, STELLAMARIABARROUINMELO4 ECARLOSROBERTOFRANKE5

1. Graduanda da Escola de Medicina Veterinria da Universidade Federal da Bahia (EMV/UFBA, Bahia, BA.2. Aluno do curso de Mestrado em Medicina Veterinria Tropical da EMV/UFBA.

3. Doutorando do Instituto de Cincias da Sade UFBA.4. Professores Assistentes do Departamento de Patologia e Clnicas da EMV/UFBA.

5. Professor Adjunto de Departamento de Produo Animal da EMV/UFBA.

RESUMO

Neste trabalho foram analisados, por enzyme-linkedimmunosorbent assay (ELISA) e imunofluorescnciaindireta (IFI), 101 soros caninos provenientes da RegioMetropolitana de Salvador, Bahia, sendo 30 soros de cescom resultado parasitolgico positivo para Leishmaniachagasi em cultura esplnica e 71 soros de ces clini-camente sadios. Dez soros de ces com cultivo positivo ecom resultados sorolgicos concordantes ou no entre ostestes ELISA e IFI foram testados pela tcnica de Western-Blotting (WB). Das 30 amostras de soro com resultadopositivo em cultura, o ELISA detectou 27 amostras positivas

e o IFI mostrou resultado positivo em 12. Das 71 amostrasde soro de ces clinicamente sadios, todas apresentaramresultados negativos no ELISA e uma apresentou resultado

positivo no IFI. A sensibilidade e a especificidade foram de90% e 100% para o ELISA e 40% e 98,6% para IFI,respectivamente. O ndice de concordncia Kappa entre ostestes foi considerado moderado (0,53), e os resultados doWB apresentaram maior concordncia com o ELISA. Esteestudo demonstra a possibilidade de falha no teste IFI nadeteco de ces infectados e discute a sua implicao nocontrole da doena em reas endmicas.

PALAVRAS-CHAVE: Ces, ELISA, IFI, Leishmania chagasi, Western-Blotting.

ABSTRACT

THE USE OF INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCEASSAY AS ROUTINE DIAGNOSIS METHOD FOR VISCERALCANINE LEISHMANIASIS AND ITS IMPLICATIONS IN DISEASE CONTROL

In this study, 101 canine sera from the MetropolitanArea of Salvador, Bahia were tested by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and indirectimmunofluorescence assay (IFA) forLeishmaniareactingimmunoglobulins. Thirty sera came from dogs living in anendemic area, with positive splenic culture forLeishmaniachagasiand were used as positive standard. The other 71sera came from healthy dogs, domiciliated in a non-endemicarea. From the thirty dogs with positive culture, 27 were

seropositive by ELISA and 12 by IFA. All 71 sera of healthydogs were negative by ELISA and one had a positive result

by IFA. The sensitivity and specificity of ELISA were 90%and 100% and of IFI were 40% and 98,6%. The observedconcordance index Kappa among the tests was moderated(0,53). Sera from ten positive culture dogs, concordant ordiscordant among the serotests were analysed by Western

blotting, whose results gave better agreement with ELISA.These results evidenced a potential low sensitivity of IFAin detecting infected dogs withL. chagasiand its implicationson the visceral leishmaniasis control in endemic areas are

commented.

KEY WORDS: Dogs, ELISA, IFA,Leishmania chagasi, Western-Blotting.

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42 OLIVEIRA, L. S. de et al. A utilizao da imunofluorescncia indireta no diagnstico ...

INTRODUO

A leishmaniose visceral (LV) uma zoonose

importante pela morbimortalidade a ela associada eem virtude da sua rpida expanso geogrficaregistrada nas ltimas dcadas, resultando noestabelecimento de novas reas endmicas, a exemplodo demonstrado nos estados da Bahia (FRANKEet al., 2002a) e Maranho (MENDES et al., 2002)situados na Regio Nordeste do Brasil. As medidasde controle da LV preconizadas pela OrganizaoMundial de Sade constam do diagnstico precocee tratamento dos casos humanos, e do controle dosvetores e realizao de inquritos sorolgicos nas

populaes caninas seguidos da eliminao dosanimais soropositivos (WHO, 1988). Nos ltimosanos, alguns autores tm observado que a eliminaode ces soropositivos no tem contribudosignificativamente para a reduo da incidncia dadoena na populao humana (RACHAMIM et al.,1991; EVANS et al., 1992; DYE, 1996;PARANHOS-SILVA et al., 1998).

Uma das explicaes possveis para a reduzidaeficincia da eliminao de ces soropositivos na

reduo da incidncia de casos humanos seria a baixasensibilidade do teste de imunofluorescncia indireto(IFI) utilizado oficialmente nos inquritos sorolgicoscaninos para controle da leishmaniose visceral noterritrio brasileiro (BERRAHAL et al., 1996). Adeteco apenas parcial dos casos caninos em umadeterminada regio resultaria na permanncia de cesinfectados, contribuindo para a continuidade do ciclode transmisso do parasito nas populaes caninase humanas locais (COURTENAY et al., 2002).

Outros testes sorolgicos, tais como ELISA, DOT-ELISA ou Western-Blotting(WB), para a detecode anticorpos antileishmania foram descritos naliteratura (RACHAMIM et al., 1991; DIETZE et al.,1995; MANCIATI et al., 1996; BADAR et al.,1996; VERCAMMEN et al., 1997).

Comparativamente ao teste de IFI, o testeELISA tem vrias vantagens, como um procedimentomais simples e rpido, necessita apenas uma diluiode soro e considerado mais sensvel(PARANHOS-SILVA et al., 1996; CABRAL et al.,1998). A caracterstica do teste WB de reconhecerantgenos especficos do parasito o torna mais

especfico e sensvel que o IFI e o ELISA(BERRAHAL et al., 1996). Este trabalho teve comoobjetivo analisar amostras de soros caninos

provenientes da Regio Metropolitana de Salvador,avaliando comparativamente a capacidadediagnstica dos testes de ImunofluorescnciaIndireta, ELISA e Western-Blotting.

MATERIAL E MTODOS

Animais

Foram analisados, pelos testes ELISA e IFI,101 soros caninos provenientes da Regio Metro-

politana de Salvador (RMS), Bahia, sendo 30 amos-tras de soros obtidas de ces comprovadamente

positivos em cultivo esplnico paraL. chagasie 71de ces clinicamente sadios. Os soros dos ces po-sitivos foram obtidos em inqurito domiciliar na ci-dade de Camaari, RMS. Os 71 soros de ces sa-dios foram oriundos do canil do Hospital de Medi-cina Veterinria da Universidade Federal da Bahia(18), de clnicas veterinrias particulares de Salva-dor (20) e de campanhas de vacinao realizadas

na cidade de Salvador (28). Dez soros de ces comcultivo positivo e com resultados sorolgicos con-cordantes ou no entre os testes ELISA e IFI fo-ram testados pela tcnica de Western-Blotting(WB).

Preparao do antgeno (Leishmania chagasiisolada de co) para ELISA e Western-Blotting

AL. chagasifoi isolada pela inoculao de

tecido esplnico canino em meio de cultivo com-posto por 5ml de gar sangue (Blood Agar Base Sigma, USA) com 5% de sangue de carneirodesfibrinado estril e 3ml de meio Schneider (Sigma,USA), contendo 20% de soro fetal bovino e 50g/ml de gentamicina. Os parasitos isolados foram

posteriormente inoculados por via intraperitoneal emtrs hamsters.

Aps a apresentao dos sinais clnicos deleishmaniose, os hamstersforam necropsiados, e omacerado de bao e fgado foi colocado em 1 ml demeio Schneider e posteriormente transferido parauma garrafa de cultivo contendo este mesmo meio.

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Aps a segunda ou terceira passagem, aspromastigotas de fase log foram centrifugadas a2.500 x g, por 10 minutos a 4oC em tubo plstico

de 15ml, lavadas trs vezes com soluo salina es-tril. Em seguida, as promastigotas foramressuspensas em soluo salina com inibidor de

proteases e lisadas por meio de ultra-som. Apssonicao, a preparao foi centrifugada a 10.000x g, durante 30 minutos a 5C. O sobrenadante foicoletado, aliquotado e estocado a -20C at a suautilizao.

Protocolo de Elisa

As microplacas foram sensibilizadasovernighta 4C com o antgeno na concentraode 10 mg de protenas por poo diludas em 100mlde tampo carbonato bicarbonato 0,05M, pH 9,6.O bloqueio foi feito utilizando-se 200ml de PBS,contendo 0,05% de tween20 (PBS-T) com 5% deleite em p desnatado e incubado temperaturaambiente durante uma hora. Os soros foram anali-sados utilizando-se 100ml por poo na diluio de1/400 em PBS-T com 5% de leite em p desnata-

do, incubando-se durante uma hora temperaturaambiente. Posteriormente, 100ml de conjugado anti-IgG de ces /Peroxidase (Sigma, USA), na concen-trao de 1/25.000, diludo em PBS-T com 5% deleite em p desnatado, foram acrescentados e incu-

bados durante uma hora temperatura ambiente.Quatro lavagens com 200ml de PBS-T foram reali-zadas aps cada perodo de incubao. A revela-o foi feita com perxido de hidrognio e OPD emtampo citrato-fosfato, e a reao foi interrompida

com 50ml de cido sulfrico 4M por poo, sendo aplaca lida imediatamente em filtro 490nm. O clculo

do ponto de corte foi estabelecido em trabalhos an-teriores como descrito por GREINER et al. (1994).

Os soros em estudo foram enviados para um

laboratrio autorizado da rede de sade pblica daBahia, responsvel pelo exame sorolgico das amos-tras coletadas nos inquritos caninos realizados ofi-cialmente no estado, sendo que cada amostra de sorofoi avaliada pelo teste IFI duas vezes.

Protocolo do Western-Blotting

As protenas do antgeno utilizado para oELISA foram separadas por SDS-PAGE com umgel de poliacrilamida de 12% e transferidas para umamembrana de nitrocelulose (marca MILLIPORE,EUA). As membranas foram bloqueadas em PBS-Tcom 5% de leite em p desnatado overnighta 5C.As tiras foram incubadas durante uma hora a 37Ccom os soros diludos 1/50 em PBS-T com 1% deleite em p desnatado. Em seguida, elas foram lava-das cinco vezes em tampo PBS-T e incubadas umahora com um conjugado anti-IgG de co/peroxidase(Sigma, EUA) na diluio de 1/200. A revelao foifeita com o cromgeno 4-cloro-a-Naftol e perxido

de hidrognio e a reao interrompida com gua des-tilada.

RESULTADOS

Os resultados comparativos dos testes deELISA e IFI esto apresentados na Tabela 1. Das30 amostras de soro com resultado positivo em cul-tura, o ELISA detectou 27 amostras positivas, e oIFI mostrou resultado positivo em 12. Das 71 amos-

tras de soro de ces clinicamente sadios, todas apre-sentaram resultados negativos no ELISA e uma apre-

TABELA 1.Resultados sorolgicos dos testes ELISA e IFI das 30 amostras de ces infectados com Leishmaniae 71amostras de ces clinicamente sadios.

ELISA IFI Positivo Negativo Positivo Negativo

N % N % N % N %

Ces positivos (a) 27 90,0 3 10,0 12 40,0 18 60,0

Ces negativos 0 0 71 100,0 1 1,4 70 98,6

(a) = ces com cultura de bipsia de bao positiva.

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DISCUSSO

A leishmaniose visceral vem apresentando umaclara tendncia de expanso geogrfica nas ltimasdcadas como foi demonstrado por FRANKE et al.(2002a), na Bahia, e MENDES et al. (2002), noMaranho, e sua reemergncia tem sido observadaem vrias regies (ARIAS et al., 1996; SILVA etal., 2001). Fatores como fenmenos climticos,implantao de projetos agroindustriais, rpidocrescimento das cidades agravado pela falta de

planejamento urbano, impactos ambientais e umaprogressiva de ter ior iza o da condiosocioeconmica de ampla parcela das populaes

urbanas tm sido citados como responsveis pela

expanso e reemergncia da LV em vrios pases(DESJEUX, 1996; FRANKE et al., 2002b).

Dentre as medidas de controle preconizadaspela Organizao Mundial de Sade, a realizaode inquritos sorolgicos na populao canina dereas endmicas, seguidos da eliminao dos cesinfectados, tem apresentado resultados discordantesquanto a sua eficincia em reduzir a incidncia decasos humanos da LV (TESH, 1995; DIETZE etal., 1997; ASHFORD et al., 1998; PALATNIK-

DE-SOUSA et al., 2001). Dentre as causas destadiscordncia, especial ateno recai sobre asensibilidade do teste diagnstico utilizado nos

sentou resultado positivo no IFI. A sensibilidade e aespecificidade foram de 90% e 100% para o ELISAe 40% e 98,6% para IFI, respectivamente. Os valo-

res preditivos positivos e negativos foram de 100%e 95,9% para o ELISA e 92,3% e 79,5% para oteste IFI.

O ndice de concordncia Kappa entre os tes-tes foi considerado moderado (0,53). Os resultadoscomparativos das amostras testadas pelo WB,ELISA e IFI esto apresentados na Tabela 2. O WBapresenta melhor concordncia com os resultadosdo ELISA nas dez amostras analisadas, sendo que,dos nove soros de ces ELISA positivo, oito foramconsiderados WB positivo, ao passo que trs sorosnegativos por IFI e positivos por ELISA foram con-firmados positivos por WB. A tcnica de WB de-tectou no conjunto das doze amostras analisadas

TABELA 2.Resultados sorolgicos comparativos de cescom cultura positiva.

Animais IFI ELISA WB

I - - -J - + +K - + +L - + +O + + +P + + +Q + + +R + + +S + + -T + + +

aproximadamente quinze bandas imunorreativas,sendo as bandas de 14, 16, 30, 32, 54, 62, 68 e 72kDA consideradas imunodominantes (Tabela 3).

TABELA 3.Percentagem de reatividade de bandas reconhecidas por soros de ces considerados positivos por WesternBlotting.

Peso J K L M N O P Q R S T % de reco-(kDa) nhecimento

14 + + + - + + + + + - + 82

16 + + + - + + + + + - + 8228 + + - + - + + - - + + 6430 + + + + + + - + + - + 8232 + + + + + + - - + - + 7354 + + + + + - + + + + + 9162 + + + + + + + - + - + 8268 + + + + + + - - + - + 7372 + + + + + + + + + + + 100122 + - - + - + - + - - + 45

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inquritos sorolgicos e a eficincia na retirada dosces infectados das reas endmicas, fatores quecontribuem para a permanncia de ces infectados

na rea, viabilizando a continuidade do ciclo detransmisso do parasito nas populaes caninas ehumanas (COURTENAY et al., 2002).

A sensibilidade do teste IFI obtido em nossoestudo comparativo com o ELISA foi consideradamuito baixa, ficando aqum do que normalmente citado na literatura (PARANHOS-SILVA et al.,1996; CABRAL et al., 1998), e discordando dealguns autores que afirmam a semelhana dedesempenho destes dois testes (MANCIANTI etal., 1995; SCALONE et al., 2002; VERCAMMENet al., 2002). No entanto, os dados sobre odesempenho do IFI disponveis na literaturanormalmente foram obtidos em laboratrios de

pesquisa e referem-se a um nmero reduzido deamostras de soro canino examinadas. Essascondies ideais de execuo da tcnica nem sempre

podem ser reproduzidas na rotina dos laboratriosda rede pblica de sade, em virtude do fornecimentoirregular de materiais de consumo, da dificuldade narealizao da tcnica em laboratrios muitas vezes

inadequados e da subjetividade na interpretao dosresultados do IFI, freqentemente agravada pelaurgncia no processamento de um nmero elevadode amostras coletadas durante os inquritossorolgicos caninos nas reas endmicas.

Os resultados de ELISA e WB soconcordantes e confirmam a baixa sensibilidade doIFI neste estudo. Esta concordncia era previsvelem virtude de os dois testes terem sido realizadosnum mesmo laboratrio e com o mesmo antgeno.

As bandas imunorreativas detectadas pelo WB emnosso estudo corroboram com algumas previamentedescritas: 14 e 16 kDa (BERRAHAL et al., 1996),30 e 68 kDa (VERCAMMEN et al., 2002), 32 eaproximadamente 120 kDa (MANCIANTI et al.,1995).

CONCLUSES

Neste trabalho foi demonstrado que o testeIFI pode eventualmente apresentar grave reduoem sua sensibilidade, ocasionando uma detecoapenas parcial dos ces infectados comLeishmania

chagasi . Em vista deste fato e considerando que oIFI amplamente utilizado pelos rgos de sade

pblica, compreensvel a limitada eficincia da

eliminao de ces soropositivos como medida decontrole da LV. A peridica validao do IFI,comparando-o com testes mais sensveis, ou aadoo do teste de ELISA na rotina diagnstica daleishmaniose canina recomendao vlida comvistas otimizao das aes de controle emonitoramento dessa zoonose em suas reas deocorrncia endmica.

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de DesenvolvimentoCientfico e Tecnolgico (CNPq), pelo apoio na for-ma de bolsas de iniciao cientfica para asgraduandas Ldia Silva de Oliveira, Daniela SouzaFreitas e Brbara Maria Paran da Silva Souza.

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4 8 ALVES, L. M. et al. Avaliao de iniciadores e protocolo para o diagnstico ...

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