THALES FONTENELE MORAES PINHEIRO€¦ · A epilepsia é uma doença neurológica que afeta...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

CAMPUS DE SOBRAL

THALES FONTENELE MORAES PINHEIRO

ESTUDO DOS EFEITOS NEUROPROTETORES

DA TRIMETAZIDINA NO MODELO DE CONVULSÃO INDUZIDA

POR PILOCARPINA EM CAMUNDONGOS

SOBRAL – CE

2013

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ESTUDO DOS EFEITOS NEUROPROTETORES DA TRIMETAZIDINA NO MODELO DE

CONVULSÃO INDUZIDA POR PILOCARPINA EM CAMUNDONGOS

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa dePós-Graduação em Biotecnologia – Curso de Medicina,da Universidade Federal do Ceará – Campus de Sobral,como requisito parcial para obtenção do Título de Mestreem Biotecnologia.Área de concentração: Macromoléculas.

Orientador: Prof. Dr. Gerado Cristino Filho

Sobral – CE

2013

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Dados Internacionais de Catalogação na PublicaçãoUniversidade Federal do Ceará

Biblioteca Curso de Medicina de Sobral

P722e Pinheiro, Thales Fontenele Moraes.Estudos dos efeitos neuroprotetores da trimetazidina no modelo de convulsão induzida por

pilocarpina em camundongos. / Thales Fontenele Moraes Pinheiro. – 2013.89 f. : il. color., enc. ; 30 cm.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Curso de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Sobral, 2013.

Área de Concentração: Macromoléculas. Orientação:Prof. Dr. Gerardo Cristino Filho.Coorietanção: Profa. Dra. Lissiana Magna Vasconcelos Aguiar

1. Trimetazidina. 2. Fernobarbital 3. Pilocarpina . I. Título.

CDD 616.853

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ESTUDO DOS EFEITOS NEUROPROTETORES DA TRIMETAZIDINA NO MODELO DE

CONVULSÃO INDUZIDA POR PILOCARPINA EM CAMUNDONGOS

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programade Pós-Graduação em Biotecnologia daUniversidade Federal do Ceará – Campus deSobral, como requisito parcial para obtenção doTítulo de Mestre em Biotecnologia.Área de concentração: Macromoléculas.

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________________

Prof. Dr. Gerardo Cristino Filho (Orientador)

Universidade Federal do Ceará (UFC) – Campus Sobral

___________________________________________________

Profa. Dra. Silvânia Maria Mendes de Vasconcelos

Universidade Federal do Ceará (UFC)

___________________________________________________

Profa. Dra. Danielle Silveira Macêdo

Universidade Federal do Ceará (UFC)

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AGRADECIMENTOS

À minha esposa Lissiana, pelo amor, carinho, dedicação e companheirismo, no apoio ecompreensão nos momentos de ausência.

À minha filha Lícia, pelo sorriso e abraço de todos os dias que me dão forças para continuar, epor tudo o que tem me ensinado desde que veio ao mundo.

Aos meus pais, Tália e João Eudes, meus irmãos, Luciano e Eudes, pelo apoio durante todos osmomentos da minha vida.

Ao professor Dr. Gerardo Cristino Filho, pela orientação e ensinamentos que permitiram aelaboração desse trabalho.

À Professora Dra. Mirna Marques Bezerra, cujo apoio foi fundamental neste projeto.Ao corpo docente do programa de Biotecnologia, pela oportunidade de receber conhecimentos

que permitiram meu crescimento pessoal e profissional, pelos momentos de reflexões e críticasconstrutivas.

Aos alunos de iniciação científica, Jonatas, Luziana, Emanuel, Tarcísio e Rayane, que, foramfundamentais para a realização dos experimentos.

À amiga doutoranda Emmanuelle Noronha, pela amizade verdadeira e apoio nos experimentos.Aos colegas de mestrado pelo apoio nas disciplinas, em especial, Alexandre, Anita e Ricardo

(doutorando), que me incentivaram em todos os momentos difíceis.À equipe de apoio do laboratório e hospedaria de animais, por sempre garantir que os

experimentos sempre tivessem sucesso.À equipe de Laboratório de Farmacologia da UFC Fortaleza, pelo apoio nas análises de

Cromatografia.À Universidade Federal do Ceará (UFC) – Campus Sobral, e ao Programa de Pós-Graduação em

Biotecnologia, pela oportunidade de realização de um Curso de Mestrado.Aos animais de experimentação, que sacrificam a vida no altar da ciência e garantem um mundo

melhor para nós humanos.

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RESUMO

A epilepsia é uma doença neurológica que afeta aproximadamente 1% da população no mundotodo. Atualmente, as drogas antiepilépticas convencionais disponíveis promovem o controle das crises ea melhora de apenas cerca de 75 - 80% dos pacientes. A maior limitação para o uso prolongado dessesagentes está relacionada aos inúmeros efeitos adversos que apresentam. Portanto, o desenvolvimento denovos agentes antiepilépticos com melhor eficácia e menos efeitos adversos é de suma importância parapesquisa médica. Os íons cálcio desempenham um importante papel na gênese da crise convulsiva. Atrimetazidina utilizada no tratamento de doenças isquêmicas preserva o funcionamento das bombasiônicas e o fluxo transmembrana de cálcio, sódio e potássio, mantendo a homeostase celular. A literaturatem demonstrado que a trimetazidina apresenta propriedades antioxidantes e antiinflamatórias em váriosmodelos experimentais em animais. Muitos estudos mostraram que a trimetazidina apresenta efeitoprotetor em lesões isquêmicas não apenas no coração, mas também no cérebro, pulmão, rim, intestino efígado. O presente trabalho tem como objetivo estudar os efeitos da trimetazidina sozinha ou associadaao fenobarbital no modelo de convulsão induzida por pilocarpina e determinar seus efeitos sobre aneurodegeneração envolvida na fisiopatologia dessa doença. Os animais (camundongos Swiss adultosmachos, 20-30g) receberam injeções de trimetazidina (5, 10 e 20 mg/kg, i.p.), fenobarbital (10 e 30mg/Kg, i.p.), clonazepam (0,5 mg/Kg, i.p.) ou solução salina - NaCl 0,9%, i.p. durante sete dias. Após60 minutos da última injeção das drogas em estudo ou veículo, foi administrada pilocarpina na dose 400mg/Kg, i.p. ou 320 mg/kg, i.p. depois os animais foram submetidos aos testes comportamentais e emseguida foram sacrificados e seus cérebros dissecados para realização das análises neuroquímicas. Aadministração de TMZ reduziu o número de mortes em todas as doses testadas, todavia a maior dose (20mg/Kg) mostrou melhor efeito, aumentou a latência de convulsão em 41% (11,76±0,75) comparado aocontrole (8,36±0,41), levou à ausência de convulsões em 10% dos animais; reduziu a ocorrência deestado epiléptico em 10% e protegeu 29% dos animais da morte. Foi verificado um aumento dasconcentrações de MDA no hipocampo dos animais tratados com pilocarpina (Controle = 98,8 ± 5,5;PILO = 336,5 ± 25,2), esse efeito foi parcialmente revertido com o pré-tratamento com TMZ nas dosesde 10 e 20 mg/kg (TMZ5 = 284,6 ± 19,7; TMZ10 = 171,3 ± 20,1; TMZ20 = 175,3 ± 20,1). A associaçãodo TMZ na menor dose (5 mg/kg) com a dose sub-anticonvulsivante de FEN (10 mg/kg) promoveuredução dos níveis de MDA em 48% (TMZ5+FEN10 = 174,6 ± 23,0) quando comparado com o grupocontrole. Resultados semelhantes foram observados com a determinação das concentrações denitrito/nitrato. Além disso, o TMZ foi capaz de reverter as alterações produzidas por pilocarpina nosníveis de GABA e glutamato. Os resultados deste estudo sugerem que a trimetazidina possui atividadeanticonvulsivante no modelo de convulsão induzida por pilocarpina em camundongos, possivelmentedevido a sua ação modulatória nos canais de cálcio.

Palavras-chave: Trimetazidina. Fenobarbital. Antioxidante. Pilocarpina. Convulsões.

7

ABSTRAT

Epilepsy is a neurological disease that affects approximately 1% of the population worldwide.Currently, the conventional antiepileptic drugs available promote seizure control and improvement ofonly about 75-80% of patients. The biggest limitation to the prolonged use of these agents is related tonumerous adverse effects they present. Therefore, the development of new antiepileptic drugs withbetter efficacy and fewer adverse effects is of paramount importance for medical research. Calcium ionsplay an important role in the genesis of seizures. Trimetazidine used in the treatment of ischemicdiseases preserves the operation of ionic pumps and transmembrane flux of calcium, sodium andpotassium while maintaining cellular homeostasis. The literature has shown that trimetazidine anti-inflammatory and antioxidant properties in several experimental animal models. Many studies haveshown that trimetazidine had a protective effect on ischemic injury not only in the heart but also in thebrain, lung, kidney, intestine and liver. The present work aims to study the effects of trimetazidine aloneor associated with phenobarbital on seizure model induced by pilocarpine and determine their effects onneurodegeneration involved in the pathophysiology of this disease. The animals (adult male Swiss mice,20-30g) were injected with trimetazidine (5, 10 and 20 mg / kg, ip), phenobarbital (10 and 30 mg / kg,ip), clonazepam (0.5 mg / kg ip) or saline - 0.9% NaCl ip for seven days. 60 minutes after the lastinjection of vehicle or drug under study was administered at a dose pilocarpine 400 mg / kg, ip or 320mg / kg, i.p. after the animals were subjected to behavioral tests and were then sacrificed and their brainsdissected for neurochemical analysis performance. TMZ administration reduced the number of deaths atall doses tested, but the highest dose (20 mg / kg) showed better effect, increased the latency of seizuresin 41% (11.76 ± 0.75) compared to control ( 8.36 ± 0.41) led to absence seizures in 10% of animals,reduced the occurrence of status epilepticus in 10% and 29% of animals protected from death. Therewas an increase of MDA concentration in the hippocampus of animals treated with pilocarpine (Control= 98.8 ± 5.5, 336.5 ± 25.2 = PILO), this effect was partially reversed by pretreatment with the TMZDoses of 10 and 20 mg / kg (TMZ5 = 284.6 ± 19.7; TMZ10 = 171.3 ± 20.1; TMZ20 = 175.3 ± 20.1).The combination of TMZ at the lowest dose (5 mg / kg) with anticonvulsant dose of sub-PHE (10 mg /kg) caused a reduction in the levels of MDA by 48% (TMZ5 FEN10 + = 174.6 ± 23.0) when comparedwith the control group. Similar results were observed with the determination of the concentrations ofnitrite / nitrate. Also, the TMZ was able to reverse the changes produced by pilocarpine in the levels ofglutamate and GABA. The results of this study suggest that trimetazidine possesses anticonvulsantactivity in the model of pilocarpine-induced seizures in mice, possibly due to its modulatory action oncalcium channels.

Keywords: Trimetazidine. Phenobarbital. Antioxidant. Pilocarpine. Seizures.

8

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Modelos experimentais de epilepsia 20

Quadro 2 - Fármacos antiepilépticos 27

Quadro 3 - Estrutura química da trimetazidina 29

Quadro 1 - Protocolo de Tratamento Experimental do Tratamento dos Animais 32

Quadro 2 - Parâmetros comportamentais observados após a injeção de

pilocarpina

33

Quadro 3 - Escala de Racine para intensidade de respostas motoras dos animaisà injeção de pilocarpina

34

9

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Efeitos da trimetazidina (TMZ) sozinha e/ou em associação comfenobarbital (FEN) nas alterações comportamentais e convulsõesinduzidas por PILO em camundongos........................................... 41

Tabela 2- Efeitos da trimetazidina (TMZ) sozinha e/ou em associação comfenobarbital (FEN) na escala de Racine utilizando modelo deconvulsão induzido por pilocarpina em camundongos...................

45

10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Potencialização da atividade anticonvulsivante do Fenobarbital (FEN

10mg/Kg) pela associação com Trimetazidina (TMZ 5mg/kg)

42

Figura 2 - Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com

FEN, FEN ou CNZP sobre a produção de substâncias ácidas reativas

com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em hipocampo de camundongos

tratados com PILO (320mg/kg, i.p.)

47



com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em núcleos da base de

camundongos tratados com PILO (320mg/kg, i.p.)

49



com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em córtex pré-frontal tratados

com PILO (320mg/kg, i.p.)

51


FEN, FEN ou CNZP sobre a produção de nitrito e nitrato em

hipocampo de camundongos submetidos ao modelo de convulsão

com pilocarpina (320mg/kg, i.p.)

53


FEN, FEN ou CNZP sobre a produção de nitrito/nitrato em núcleos

da base de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com

pilocarpina (320mg/kg, i.p.)

55


FEN, FEN ou CNZP sobre a produção de nitrito/nitrato em córtex

pré-frontal de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com

57

11

pilocarpina (320mg/kg, i.p.)


FEN, sobre os níveis de GSH em hipocampo de camundongos

submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina (320mg/kg, i.p.)

59


FEN, sobre os níveis de GSH nos núcleos da base de camundongos


61


FEN, sobre os níveis de GSH em córtex pré-frontal de camundongos


63


FEN, FEN ou CNZP sobre os níveis de MPO em hipocampo de

camundongos submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina

(320mg/kg, i.p.)

65


FEN na concentração do GLU em hipocampo de camundongos


67


FEN na concentração do GABA em hipocampo de camundongos


69

12

LISTA DE ABREVIATURAS

Ach - Acetilcolina

ANOVA - Analise de variancia

ATP - Adenosina tri-fosfato

CEPA - comitê de ética em pesquisa animal

CNZP - Clonazepam

CPF - córtex pré-frontal

DTNB 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico)

EPM - Erro padrao da media

ERO - Especies reativas do oxigenio

FEN - Fenobarbital

GABA - Acido gama-amino butirico

GSH - Glutationa Reduzida

HC - hipocampo

HPLC - Cromatografia liquida de alto desempenho

MDA - Malonildialdeido ou malondialdeido

MPO - Mieloperoxidase

MTT - 3-( 4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio

NB - Núcleos da Base

nm - nanômetro

NMDA - N-metil-D-aspartato

PILO - Pilocarpina

ROS - espécie reativa de oxigênio

SCP - Sinais colinérgicos periféricos

SLN - Salina

SNC - Sistema Nervoso Central

TBA - Acido tiobarbitúrico

TBARS - Substancias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TMZ - Trimetazidina

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 15

1.1. Epilepsia 15

1.2. Histórico 16

1.3. Definição e classificação das crises epilépticas 17

1.4. Modelos animais de epilepsia 19

1.4.1. Modelo de Convulsões Induzidas por Pilocarpina 22

1.5. Epilepsia e estresse oxidativo 23

1.6. Drogas antiepilépticas 26

1.6.1. Trimetazidina 28

2. OBJETIVOS 30

2.1. Gerais 30

2.2. Específicos 30

3. METODOLOGIA 31

3.1. Animais 31

3.2. Drogas utilizadas nos tratamentos 31

3.3. Protocolo de tratamento dos grupos experimentais 31

3.4. Estudo comportamental 33

3.5. Determinação da atividade dos sistemas antioxidantes 34

3.5.1. Determinação da concentração da glutationa reduzida (GSH) 34

3.6. Determinação do índice de peroxidação lipídica e produção de nitrito 35

3.6.1. Determinação do índice de peroxidação lipídica (TBARS) 35

3.6.2. Determinação do conteúdo de nitrito 36

14

3.7. Determinação das concentrações de aminoácidos com HPLC 36

3.8. Determinação da Mieloperoxidase (MPO) 37

4. ANÁLISE ESTATÍSTICA 38

5. RESULTADOS 39

5.1. ESTUDO COMPORTAMENTAL 39

5.1.1 Alterações comportamentais induzidas por pilocarpina em camundongos pré-

tratados ou não com trimetazidina (TMZ), sozinha ou em associação com

fenobarbital (TMZ+FEN), fenobarbital (FEN) ou clonazepam (CNZP).

39

5.1.2 Alterações comportamentais induzidas por pilocarpina em camundongos pré-

tratados ou não com trimetazidina (TMZ), sozinha ou em associação com

fenobarbital (TMZ+FEN), fenobarbital (FEN) ou clonazepam (CNZP) na escala de

Racine

43

5.2. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS ANTIOXIDANTES DO PRÉ-

TRATAMENTO COM TRIMETAZIDINA, FENOBARBITAL OU

CLONAZEPAM NO MODELO DE CONVULSÕES INDUZIDAS POR

PILOCARPINA

46

5.2.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN ou

CNZP sobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico

(TBARS) no modelo de convulsão induzido por pilocarpina

46

5.2.1.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN

ou CNZP sobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico

(TBARS) em hipocampo de camundongos tratados com PILO.

46



(TBARS) em núcleos da base de camundongos tratados com PILO.

48



(TBARS) em córtex pré-frontal de camundongos tratados com PILO.

50

15


CNZP sobre a produção de nitrito e nitrato no modelo de convulsão induzido por

pilocarpina

52


ou CNZP sobre a produção de nitrito e nitrato em hipocampo de camundongos

submetidos à convulsão com PILO

52


ou CNZP sobre a produção de nitrito e nitrato em núcleos da base de camundongos


54


ou CNZP sobre a produção de nitrito e nitrato em córtex pré-frontal de

camundongos submetidos ao modelo de convulsão com PILO

56

5.3. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM

TRIMETAZIDINA, FENOBARBITAL OU CLONAZEPAM NAS

CONCENTRAÇÕES DE GLUTATIONA NO MODELO DE CONVULSÕES

INDUZIDAS POR PILOCARPINA

58

5.3.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN sobre os

níveis de glutationa (GSH) no hipocampo de camundongos submetidos ao modelo

de convulsão com PILO

58


níveis de glutationa (GSH) nos núcleos da base de camundongos submetidos ao

modelo de convulsão com PILO

60


níveis de glutationa (GSH) no córtex pré-frontal de camundongos submetidos ao

modelo de convulsão com PILO

62

5.4 DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS ANTIINFLAMATÓRIOS DO PRÉ-

TRATAMENTO COM TRIMETAZIDINA NO MODELO DE CONVULSÕES

64

16



CNZP sobre os níveis de mieloperoxidase (MPO) em hipocampo de camundongos


64

5.5. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM

TRIMETAZIDINA E/OU FENOBARBITAL NA CONCENTRAÇÃO DOS

AMINOÁCIDOS NEUROTRANSMISSORES EM HIPOCAMPO DE

CAMUNDONGOS SUBMETIDOS AO MODELO DE CONVULSÕES


66

5.5.1 Efeitos do pré-tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN na

concentração do aminoácido excitatório glutamato (GLU) em hipocampo de

camundongos submetidos à convulsão com PILO

66

5.5.2 Efeitos do pré-tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN na

concentração do aminoácido inibitório GABA em hipocampo de camundongos


68

6. DISCUSSÃO 70

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS 74

8. CONCLUSÃO 76

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 77

17

1. INTRODUÇÃO

1.1. Epilepsia

A epilepsia, transtorno cerebral mais freqüente na população geral, é uma síndrome complexa, de

etiologia diversa e caracteriza-se por alterações crônicas, recorrentes e paroxísticas na função neuronal,

decorrentes de anormalidades na atividade elétrica cerebral. A disfunção neurológica na sua fase aguda é

chamada de crise epiléptica, e pode se manifestar através de alterações sensitivas, emocionais ou

cognitivas (QUINTANS-JUNIOR et al., 2007; BUCKMASTER & HANEY, 2012).

As causas de epilepsia compreendem a predisposição genética, lesões cerebrais, intoxicação e

tumores. A incidência e a prevalência da epilepsia são mais elevadas nos países da America Latina em

relação aos países do hemisfério Norte. Estima-se que, no Brasil, cerca de três milhões de pessoas

apresentem alguma forma de epilepsia e, aproximadamente, cem mil novos casos somam-se a cada ano

(BURNEO et al., 2005).

Sabe-se que atividade convulsiva está associada a mudanças bioquímicas em algumas áreas

cerebrais e afeta diversos neurotransmissores: dopamina, glutamato, serotonina, ácido γ-aminobutírico

(GABA) (CAVALHEIRO et al., 1994); o metabolismo dos carboidratos; os sistemas de segundos

mensageiros e a expressão gênica, processos envolvidos na fisiopatologia das alterações neuronais

(SIMONIC et al., 2000; VEZZANI et al., 2013).

A epilepsia é um dos distúrbios neurológicos graves mais comuns em todo o mundo (HIRTZ et

al., 2007). Estima-se que cerca de 3% das pessoas serão diagnosticadas com epilepsia em algum

momento de suas vidas (SANDER, 2003). Sua prevalência é de 1% da população mundial, ou seja,

cerca de 60 milhões de pessoas, somando-se a cada ano aproximadamente três milhões de novos casos.

Pelo menos 50% dos casos começam na infância ou adolescência, provavelmente devido a maior

vulnerabilidade a infecções no sistema nervoso central (meningite), acidentes (traumatismos cranianos)

e doenças como varicela, caxumba e sarampo, cujas complicações podem levar a crises epilépticas.

18

Outra faixa etária com maior prevalência de crises epilépticas são os idosos, principalmente devido ao

próprio processo de envelhecimento e suas complicações vasculares (LEONARD et al., 1994).

Estima-se que cerca de cinquenta milhões de pessoas sofrem de epilepsia com crises ativas

necessitando de tratamentos, e 30% desses pacientes apresentam crises refratárias (sem resposta) ao

tratamento medicamentoso disponível no mercado (WHO, 2010). Cerca de 90% dos casos de epilepsia

ocorrem em países em desenvolvimento. Na Índia, por exemplo, estima-se um custo de 0,5% do PIB

para tratar pacientes com epilepsia (~5 milhões); na Europa esse valor é de 20 bilhões de Euros (WHO,

2010). No Brasil, embora os estudos epidemiológicos sejam escassos, estima-se que a epilepsia atinja

2% a 4% da população, correspondendo a aproximadamente três milhões de pessoas em diferentes

idades e classes sociais (FERNANDES et al., 2013).

1.2 Histórico

Existem relatos sobre crises epilépticas em textos de origem babilônica que datam de 2000 a.C.

O termo "epilepsia", no entanto só foi referido pela primeira vez na Grécia antiga, com o significado de

"ser tomado, atacado, possuído", provavelmente fazendo alusão ao que ocorre durante uma crise

epiléptica. Na antiguidade, a epilepsia era considerada como fruto de possessão por entidades espirituais,

e a falta de conhecimento levou diversos povos como gregos, romanos, hebreus, árabes e outros a

criarem estigmas e crenças associando a epilepsia ao misticismo, e essa concepção perdurou ao longo

dos tempos, mantendo-se ainda nos dias atuais (FERNANDES, 2013).

Apesar dos relatos de Hipócrates (400 a.C.) e Galeno (175 d.C.) sugerindo que a epilepsia era

decorrente de anomalias no cérebro, o comportamento ou pensamento popular daquela época, não

mudou, chegando a extremos por exemplo durante a Idade Média, onde a Santa Inquisição perseguiu e

condenou à morte muitos epilépticos considerados loucos e hereges (MOREIRA, 2004).

Somente com os progressos na área de neurofisiologia, no século XIX, é que a epilepsia passou a

ser encarada pela comunidade científica como uma doença com base cerebral. Um dos pioneiros nessa

área foi John Hughlings Jackson, um neurologista britânico, que propôs uma base anatômica e

fisiológica organizada para a hierarquia e localização das funções cerebrais (FERNANDES, 2013).

Então, a partir do século XX, os avanços nos conhecimentos neurofisiológicos comprovaram que a

epilepsia tinha origem cerebral e devia ser encarada como uma doença a ser tratada e dessa forma os

cientistas finalmente entraram em um consenso. A descoberta do neurônio e dos mecanismos de

19

transmissão neuronal ocorrida nos séculos XVIII e XIX foi fundamental para que a epilepsia pudesse ser

compreendida (MOREIRA, 2004). Os avanços científicos mais recentes contribuíram para um maior

entendimento sobre os mecanismos envolvidos com a geração das crises epilépticas e hoje um dos

maiores desafios para os pesquisadores é fazer com que essas informações cheguem ao maior número de

pessoas possível para que os pacientes deixem de ser discriminados ou estigmatizados e possam ser

diagnosticados e tratados adequadamente.

1.3 Definição e classificação das Crises Epilépticas

Epilepsia é considerada um distúrbio cerebral causado pela predisposição permanente do cérebro

em gerar crises epilépticas espontâneas, recorrentes, acompanhadas de consequências neurobiológicas,

cognitivas e sociais (FISHER et al, 2005). As crises epilépticas são definidas como manifestações

clínicas que refletem disfunção temporária de um conjunto de neurônios, geralmente atividade excessiva

e/ou hipersincrônica, autolimitada ou não. Dependendo da localização, as crises podem ser focais, ou

seja, com início em uma região restrita do encéfalo, ou generalizada, quando as descargas se originam

concomitantemente nos dois hemisférios. As crises focais podem ser simples, quando há preservação da

consciência durante o ictus (crise epiléptica), ou complexas, quando há perda de consciência

(FERNANDES et al., 2013).

As crises devem ser avaliadas juntamente com outros dados do paciente, como idade, análise de

imagem e eletroencefalograma, exame físico para definir o diagnóstico sindrômico fundamental para

elaboração de uma programação terapêutica (YACUBIAN, 2002).

As síndromes epilépticas idiopáticas são aquelas com provável predisposição genética que se

apresentam sem substrato lesional detectável por exames de imagem. As crises geralmente são bem

controladas por tratamentos. As síndromes epilépticas sintomáticas são aquelas cujas crises são

decorrentes de lesão estrutural em áreas do sistema nervoso central, e as síndromes provavelmente

sintomáticas são aquelas em que a lesão presumida não pode ser demonstrada com exames disponíveis

(FERNANDES et al., 2013).

20

As crises epilépticas podem se manifestar com graus diferentes de envolvimento muscular, onde

o evento motor consiste de um aumento ou diminuição da contração muscular. O aumento da contração

muscular pode ser do tipo tônico (significando contração muscular mantida durante segundos ou

minutos), clônico (contrações musculares, seguidas de relaxamentos gerando abalos musculares

sucessivos) ou mioclônico (contrações musculares muito breves, semelhantes a choques). A diminuição

da contração muscular caracteriza as mioclonias negativas e as crises atônicas (ENGEL, 2001).

As chamadas crises parciais ou focais são caracterizadas, clínica e eletrencefalograficamente,

pela ativação de uma parte do cérebro, sendo subdividas em crises parciais simples, quando há

preservação da consciência e crises parciais complexas, quando há comprometimento da mesma. As

crises generalizadas são aquelas em que há envolvimento, desde o início, de amplas áreas de ambos os

hemisférios cerebrais. São consideras não classificáveis, as crises que não se enquadram nos dois

subtipos acima (OLIVEIRA, 2010).

- Crises epilépticas parciais

- Crises epilépticas parciais simples: Caracterizadas pelo fato de o paciente ficar consciente durante a

crise. As mais freqüentes são as motoras, que podem se manifestar como abalos musculares das mãos,

pés ou face; estas crises podem progredir para um lado todo do corpo e podem desenvolver uma crise

generalizada do tipo tônico-clônica.

- Crises epilépticas parciais complexas: estão associadas a uma alteração da consciência. O sinal

transmitido antes da crise pode ser uma sensação de sonho, de medo, opressão no estômago que sobe

para a garganta, e ainda um quadro de alucinações, tais como: ouvir sons, sentir cheiros e gostos

estranhos. Associadas as essas sensações ocorre perda de contato com o meio ambiente, aumento da

salivação, movimentos de mastigação, de marcha e/ou movimentos estereotipados com as mãos. Podem

ser seguidas de crises tônico-clônicas.

- Crises epilépticas generalizadas

- Crises tônico-clônicas: que podem se iniciar com um grito acompanhado de perda da consciência com

queda ao solo, endurecimento do corpo e abalos musculares generalizados. Pode ocorrer perda de saliva

com sangue devido à mordedura da língua, coloração arroxeada dos lábios, respiração ruidosa, às vezes

21

ocorre também aumento da micção. A duração é de poucos minutos e após a crise há sonolência,

podendo acordar com vômitos, dor de cabeça e dores musculares.

- Crises tônicas: ocorre perda da consciência, queda ao solo, o corpo fica endurecido, com a respiração

irregular, aumento da salivação, coloração arroxeada da pele.

- Crises miclônicas: tem como característica principal ser de curta duração e manifestar-se

principalmente após o despertar, com movimentos bruscos de todo o corpo, semelhantes a um choque ou

susto, principalmente nos membros superiores.

- Crises de ausência: a crise pode se manifestar como um desligamento com o ambiente externo ocorre

interrupção da fala e das atividades motoras por alguns segundos, voltando logo a seguir à atividade que

estava realizando antes da crise. Essas crises podem se repetir várias vezes ao dia, ocorrendo perda de

consciência de forma parcial ou completa.

- Crises atípicas de ausência: caracterizada pela ocorrência de ataques com aparecimento e término mais

rápidos do que o habitual para as crises de ausência, associados a um EEG mais heterogêneo.

- Crises atônicas: caracterizada pela perda do tônus postural, com inclinação da cabeça e queda devido à

perda do equilíbrio.

1.4. Modelos Animais de Epilepsia

A fisiopatologia da epilepsia ainda não está completamente definida. Os modelos de convulsão

em animais reproduzem alterações comportamentais e eletroencefalográficas que são semelhantes à

epilepsia em humanos (BEM-ARI et al., 1981; VEZZANI et al., 2013). Estes modelos são utilizados

para estudar o envolvimento dos sistemas de neurotransmissores como moduladores da epileptogênese,

como também permitem observar as alterações comportamentais, histopatológicas, e outros dados

neuroquímicos relacionados ao processo convulsivo (COSTA-LOTUFO et al., 2002; SCHOLL et al.,

2013).

Desde a década de 1960, os modelos experimentais servem como screening farmacológico de

drogas antiepilépticas (WHITE, 1997), contribuindo, paralelamente, com informações a respeito dos

22

mecanismos envolvidos na gênese e manutenção das crises. De um modo geral, dois fatores são cruciais

em estudos desta natureza: a escolha do modelo experimental e as drogas a serem estudadas

(WOLFENSOHN et al., 2013).

Nas décadas de 1980 e 1990, dois modelos foram extensamente utilizados: o modelo da

pilocarpina e o modelo do ácido caínico, e ambos replicam características fenomenológicas das

epilepsias humanas do lobo temporal (TURSKI et al., 1989). A administração local ou sistêmica desses

compostos resulta em um padrão de crise límbica duradoura bastante característica (status epilepticus),

que após um período conhecido como silencioso (de 3 a 14 dias), leva o animal a apresentar crises

espontâneas e recorrentes. A lesão cerebral induzida pelo status epilepticus nesses modelos pode ser

considerada como equivalente a um evento epileptogênico no ser humano, como, por exemplo, uma

convulsão febril (TURSKI et al., 1989).

Quadro 1 – Modelos experimentais de epilepsia

MODELO

EXPERIMENTAL

TIPO DE EPILEPSIA CARACTERÍSTICAS

Estimulação química

Estricnina

(Descrito em 1900)

Crises com foco

cortical

Agudo. Extensões tônicas. Antagonismo

competitivo da glicina. Excitabilidade reflexa da

medula aumentada.

Pentilenotetrazol (PTZ)

(Descrito em 1960)

Pequeno mal e crises

generalizadas

Agudo. Crises generalizadas de ausência ou

mioclônicas e crises tônico-clônicas. Inibição de

canais de cloreto associados ao GABAA.

Picrotoxina

(Descrito em 1960)

Epilepsia do lobo

temporal (quando

aplicada na amígdala)

Agudo e crônico. Epilepsia focal recorrente.

Crises parciais ou de ausência. Antagonismo dos

receptores GABAérgicos.

Bicuculina

(Descrito em 1970)

Epilepsia de longa

duração (quando

aplicada na amígdala)

Agudo e crônico. Epilepsia de longa duração.

Antagonismo dos receptores GABAA.

Substâncias

colinomiméticas

Epilepsias focais e do

lobo temporal

Agudo e crônico.

Administração sistêmica de pilocarpina pode

23

(Descrito em 1949) desenvolver status epilepticus. Mimetiza a

epilepsia do lobo temporal nos achados

histopatológicos, eletrográficos, manifestações

comportamentais e padrão de resposta

terapêutica.

Modelos com

predisposição genética

Crise audiogênica em

camundongos

(Descrito em 1924)

Crises tônico-clônicas Agudo. Alterações bioquímicas presentes na

maioria das epilepsias. Convulsões conduzidas

por intensas estimulações auditivas.

Fotossensibilidade

genética

(Descrito em 1966)

Crises

centro-encefálicas

Agudo. O babuíno senegalês Papio papio

apresenta atividade paroxística e motora em

resposta a estimulação luminosa intermitente.

Mimetiza crises de origem centro-encefálica no

homem.

Estimulação elétrica

Eletrochoque

(Descrito em 1870)

Epilepsia focal

Crises tônico-clônicas

Agudo.

Muito usado na triagem de antiepilépticos.

Estimulação por pulsos elétricos repetitivos.

Kindling

(Descrito em 1969)

Crises parciais e

generalizadas, pequeno

mal e auras

Agudo e crônico.

Estimulações elétricas (ou administrações de

PTZ) contínuas, em limiares subconvulsivantes

resultam que quadro progressivo de convulsões.

Desencadeiam-se convulsões espontâneas. Avalia

a epilepsia e a epileptogênese.

Neurotoxinas

Ácido caínico

(Descrito em 1970)

Epilepsia do lobo

temporal

Agudo e crônico.

Injeção intraventricular produz crise

comportamental, acompanhada por lesão cerebral

semelhante a da epilepsia temporal.

Fonte: Adaptado de Oliveira, 2010

24

1.4.1. Modelo de Convulsões Induzidas por Pilocarpina

A epilepsia do lobo temporal humana é uma desordem crônica, frequentemente associada a um

estímulo inicial precipitante como estado epiléptico, trauma e convulsões febris prolongadas (ENGEL;

PEDLEY, 1997). É um dos distúrbios neurológicos mais comuns, apresentando taxa de prevalência de

5% (DELORENZO et al., 2001). Este tipo de epilepsia é particularmente resistente a medicamentos

anticonvulsivantes, representando um grande problema na terapêutica (TURSKI et al., 1987; TEJADA

et al., 2013).

A Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) é um tipo de epilepsia focal que apresenta grande

relevância clínica devido a sua alta incidência e gravidade. Os pacientes com ELT apresentam crises

focais simples ou complexas que se originam em estruturas mesiais do lobo temporal, geralmente

precedidas por auras. A auras correspondem a manifestações sensitivo-sensoriais, vegetativas ou

psíquicas puramente subjetivas e que ocorrem em 20% a 90% dos pacientes com epilepsia do lobo

temporal. Em geral são de curta duração, não excedendo 1 ou 2 minutos. São exemplos: aura epigástrica

(sensação de náusea, mal-estar); medo; depressão e angústia (frequentemente ocorre no período

interictal mas pode ocorrer antes da crise); déjà-vu, jamais vu; e pensamento forçado (impressão de estar

vivenciando algo que já aconteceu antes - déjà-vu, ou que parece totalmente estranho - jamais vu, ou

pensamento que ocorre repetidamente mesmo quando se tenta concentrar em outro fato); alucinações

gustativas, olfativas, auditivas, somestésicas e visuais.

O modelo de convulsões decorrentes da administração do agonista muscarínico pilocarpina em

roedores assemelha-se, em muitos aspectos, à epilepsia “lobo-temporal”, “psicomotora” ou “límbica”,

como, por exemplo, nos padrões eletroencefalográficos, comportamento e sequelas morfológicas

(LEITE et al., 1990; CAVALHEIRO et al., 1991; OLIVEIRA et al., 2007; VEZZANI et al., 2013).

De uma maneira geral, as convulsões induzidas por pilocarpina podem produzir danos neuronais

em diversas áreas e, especialmente, nas estruturas límbicas, causando perda neuronal no hipocampo,

amígdala, córtex piriforme, córtex entorrinal, septum lateral, tálamo, neocórtex e substância negra,

sugerindo o envolvimento de diferentes áreas durante o estabelecimento do processo epiléptico

(TURSKI et al., 1987; HONCHAR et al., 1990; BORELLI et al., 2002; SCHOLL et al., 2013).

25

O hipocampo tem sido sugerido como sendo o sítio de origem da atividade convulsiva induzida

por pilocarpina (TURSKI et al.,1983a,b). Outros achados sugerem como sítio inicial dessas convulsões,

o pálido ventral ou nucleo accumbens (CLIFFORD et al., 1987). Estudos eletroencefalográficos e

autoradiográficos realizados posteriormente sugeriram ambas as áreas como locais de início das

convulsões (LABANDEIRA-GARCIA et al., 1994; KULKARNI; GEORGE, 1995). O corpo estriado,

além de ser uma das áreas mais acometidas, pode estar relacionado de forma importante aos mecanismos

de propagação e manutenção (epileptogênese) da convulsão (MARINHO et al., 1998).

O modelo de epilepsia com pilocarpina tem sido extensivamente analisado, uma vez que exibe

convulsões recorrentes espontâneas e pode esclarecer muitas das alterações vistas na epilepsia do lobo

temporal. As mudanças histopatológicas observadas no hipocampo reproduzem muitas alterações

observadas em humanos, incluindo perda neuronal e remoção do tecido de sustentação do sistema

nervoso (MARINHO et al., 1997; TEJADA et al., 2013).

1.5. Epilepsia e Estresse Oxidativo

O estresse oxidativo foi definido por Sies (1991) como ״uma perturbação do equilíbrio: pró-

oxidante – antioxidante, em favor do primeiro, a qual é potencialmente capaz de causar dano celular״. O

estresse oxidativo é causado principalmente por radicais livres que são moléculas que possuem um ou

mais elétrons desemparelhados. Em geral, são instáveis e têm vida muito curta devido à natureza livre de

seus elétrons que são capazes de reagir com diversos compostos ou alvos celulares, causando danos

teciduais por interagirem com carboidratos, ácidos nucléicos (DNA), proteínas e lipídios. Uma

conseqüência desse desequilíbrio é a oxidação dos lipídios da membrana celular, processo denominado

de lipoperoxidação que pode comprometer a estrutura da membrana e até mesmo levar a morte celular

(MOSLEY et al., 2006; NAKAMURA; LIPTON, 2009; TEJADA et al., 2013).

Os radicais livres são moléculas altamente reativas que podem interagir e formar várias espécies

reativas, como as espécies reativas do oxigênio (ROS) e se não neutralizadas podem levar ao estresse

oxidativo, exacerbar a inflamação e promover dano tecidual. Os radicais livres incluem as espécies

reativas do oxigênio (ROS) como o superóxido (O2·-), o radical hidroxila (OH·), radical peróxido

26

(ROO·), o peróxido de hidrogênio (H2O2), bem como as espécies reativas do nitrogênio (RNS), como o

óxido nítrico (NO) e o peroxinitrito (ONOO·) e espécies reativas do cloro (RCS) como o ácido

hipocloroso (HOCl) (Mosley et al., 2006).

Essas espécies químicas são abundantes na natureza, produzidas normalmente no metabolismo

celular e encontradas no meio ambiente, facilmente formadas com exposição excessiva a luz solar,

poluição, álcool, inseticidas, radiação, exercício intenso, etc. Existem mecanismos antioxidantes que

neutralizam os radicais livres, como a superóxido dismutase (SOD), a catalase, a glutationa, glutationa

peroxidase e redutase, a vitamina E, a vitamina C, e outras substancias capazes de inativar ou reduzir a

formação dos radicais livres (TEJADA et al., 2013).

O dano oxidativo ocorre devido ao desequilíbrio entre a produção dos radicais livres e as defesas

antioxidantes celulares. Através da respiração celular normal ou da respiração mitocondrial desregulada,

grandes quantidades de ROS podem ser produzidos e desencadearem efeitos deletérios no delicado

equilíbrio neuronal do SNC. O estresse oxidativo está realmente implicado como sendo a principal causa

da injúria neuronal em várias doenças neurológicas, incluindo a epilepsia (AGUIAR et al., 2008;

FOLBERGROVÁ et al., 2013).

Um dos processos oxidativos mais amplamente estudados é aquele onde ocorre a quebra dos

lipídios das membranas celulares e a formação do radical peroxil (LOO). Este processo chamado de

peroxidação lipídica é extremamente complexo e lesivo, porque uma vez iniciado, ele pode ser

propagado, já que o radical peroxil formado pode reiniciar o processo, que pode ocorrer indefinidamente

(NAKAMURA; LIPTON, 2009).

A membrana celular é um dos componentes mais suscetíveis à ação das ROS, que provocam

alterações na estrutura e na permeabilidade das membranas celulares levando a perda da seletividade na

troca iônica e liberação do conteúdo de organelas, como as enzimas hidrolíticas dos lisossomas, e

formação de produtos citotóxicos (como o malonaldeído), culminando com a morte celular. A

peroxidação lipídica também pode estar associada aos mecanismos de envelhecimento, de câncer, de

doenças neurodegenerativas e de epilepsia.

27

Nem sempre os processos de peroxidação lipídica são prejudiciais, pois seus produtos são

importantes na reação em cascata a partir do ácido aracdônico (formação de prostaglandinas) e, portanto,

na resposta inflamatória. Todavia, o excesso de tais produtos pode ser lesivo (NAKAMURA; LIPTON,

2009).

Vários estudos já comprovaram que as ROS podem estar envolvidas na causa ou conseqüência

de doenças humanas associadas ao estresse oxidativo. Por isso, antioxidantes naturais e sintéticos têm

sido recomendados para o alívio dos sinais e sintomas destas doenças e, mesmo, para bloquear sua

evolução (NAKAMURA; LIPTON, 2009).

Os antioxidantes podem atuar em diferentes aspectos na proteção dos organismos contra os

radicais livres. O primeiro mecanismo de defesa contra os radicais livres é impedir a sua geração,

principalmente através da inibição das reações em cadeia com os íons metálicos (ferro e cobre). Os

antioxidantes devem ser substancias capazes de inativar os radicais livres gerados pelo metabolismo

celular ou por fontes exógenas, impedindo o dano aos lipídios, proteínas, ácidos graxos e DNA, evitando

assim as lesões aos constituintes celulares e a consequente morte celular. Outro mecanismo de proteção

é promover o reparo das lesões produzidas pelos radicais livres. Esse processo está relacionado com o

reparo da molécula do DNA e a reconstituição das membranas celulares danificadas. Em algumas

situações pode ocorrer uma adaptação do organismo em resposta a geração desses radicais livres com o

aumento da síntese das enzimas antioxidantes (FOLBERGROVÁ et al., 2013).

O cérebro é mais vulnerável ao estresse oxidativo do que outros tecidos, por que contém uma

grande quantidade de lipídios e metais oxidáveis, e tem, em relação aos outros tecidos, menos

mecanismos antioxidantes (WALZ et al., 2000). O estresse oxidativo pode alterar dramaticamente a

função celular e modificar a liberação e/ou síntese de outros compostos que podem estar relacionados

com a morte neuronal induzida pela convulsão. Por isso, tem sido implicado em uma variedade de

condições neurológicas agudas e crônicas, incluindo a epilepsia (SHIN et al., 2008; FOLBERGROVÁ et

al., 2013).

Foi sugerido que o dano neuronal após o estado epiléptico induzido por pilocarpina seria

resultante da produção exagerada de peróxido de hidrogênio, radical hidroxil e superóxido decorrentes

28

da disfunção mitocondrial (SKAPER et al., 1998; KUTLUHAN et al., 2009; FOLBERGROVÁ et al.,

2013). A ligação entre disfunção mitocondrial e epilepsia é reforçada pelo fato de que alguns pacientes

com epilepsia do lobo temporal apresentam deficiência mitocondrial no foco das convulsões (KUNZ et

al., 2000; HUBBARD et al., 2013; ROWLEY & PATEL, 2013). Apesar dessas evidências, o

envolvimento das ROS no mecanismo das convulsões epilépticas ainda não está bem esclarecido.

1.6. Drogas Antiepilépticas

Substâncias com propriedades anticonvulsivantes têm sido exaustivamente estudadas na tentativa

de se conhecer drogas com eficácia para tipos específicos de convulsão, bem como os mecanismos

controladores do aparecimento dessas convulsões (TURSKI et al., 1989). Na fase aguda das convulsões

induzidas por pilocarpina podem ser identificados compostos com eficácia no tratamento da epilepsia

refratária e/ou neuroproteção contra danos induzidos por convulsões sustentadas (QUEIROZ et al.,

2002).

A descoberta do fenobarbital em 1912 marcou o início da farmacoterapia moderna da epilepsia.

Nos 70 anos seguintes, fenitoína, carbamazepina, valproato de sódio e uma série de benzodiazepínicos

tornaram-se disponíveis e efetivaram-se como drogas antiepilépticas consagradas (BRODIE; DICHTER,

1996).

Atualmente, existem muitas opções de drogas antiepilépticas que podem ser utilizadas na clínica,

no entanto, estima-se que cerca de 30% dos pacientes não conseguem uma resposta terapêutica

adequada e, além disso, seu uso prolongado acarreta efeitos adversos e risco de toxicidade. As drogas

antiepilépticas de primeira geração (fenobarbital, fenitoína, carbamazepina, diazepam e valproato de

sódio), segunda geração (lamotrigina, vigabatrina, tiagabina, topiramato, gabapentin e levetiragetam) e

terceira geração foram, inicialmente, estudadas em modelos animais (SMITH et al., 2007) (Quadro 2).

Embora os mecanismos de ação das drogas antiepilépticas comercializadas atualmente ainda não

sejam completamente entendidos, de modo geral, envolvem alteração no balanço entre excitação e

inibição neuronais. Em nível celular, são conhecidos três mecanismos básicos: modulação de canais

iônicos dependentes de voltagem (Na+, Ca++, K+); aumento da neurotransmissão inibitória mediada pelo

29

GABA; e atenuação da neurotransmissão excitatória, particularmente a mediada pelo glutamato

(CZAPINSKI et al., 2005).

Quadro 2 – Fármacos antiepilépticos

Antiepiléptico Mecanismo de Ação Efeitos Adversos

Carbamazepina Atua principalmente por

bloqueio uso-dependente dos

canais de sódio

Sedação, ataxia, náuseas e distúrbios visuais

(relacionados a dose), retenção hídrica, redução

de granulócitos, anemia aplástica.

Fenitoína Atua principalmente por


canais de sódio

Confusão, hiperplasia gengival, erupções

cutâneas, anemia, teratogênese. São comuns

interações medicamentosas.

Valproato Causa inibição fraca da GABA

transaminase, tb efeito sobre

canais de sódio e cálcio tipo T

Tremor, náuseas, vômito, calvície,

teratogenicidade, lesão hepática (rara, mas

grave)

Etossuximida Atua bloqueando canais de

cálcio tipo T

Náuseas e vômitos, dores de estômago, soluço,

anorexia

Lamotrigina Atua sobre canais de sódio e

cálcio e inibe liberação de

aminoácidos excitatórios

Erupções cutâneas

Fenobarbital Atua principalmente por


canais de sódio, potencializa a

ação do GABA em receptores

GABAA

Sedação, anemia megaloblástica, reações de

hipersensibilidade.

Benzodiazepínicos

(clonazepam e

diazepam)

Atua em receptores GABAA

potencializando a ação do

GABA

Sedação

Outros agentes: vigabatrina, felbamato, gabapentina, pregabalina, tiagabina, topiramato,

levetiracetam, zonisamida, rufinamida, estiripentol.

Fonte: Rang & Dale, 2011.

30

1.6.1. Trimetazidina (Vastarel®)

O principal objetivo das pesquisas sobre novas drogas antiepilépticas é o desenvolvimento de

fármacos mais eficazes, específicos para cada tipo de epilepsia e com menos efeitos colaterais. Os

agentes antiepilépticos comercializados atualmente afetam principalmente o transporte de íons através

da membrana celular eou modulam a neurotransmissão inibitória ou excitatória (LIBROWSKI et al.,

2007). A grande quantidade de efeitos adversos associados a esses agentes representa a maior limitação

para seu uso prolongado (GUPTA; MALHOTRA, 2000). Portanto, o desenvolvimento de novos agentes

antiepilépticos com melhor eficácia e efeitos adversos míninos é de suma importância.

O íon cálcio exerce um importante papel durante a epileptogênese. Vários estudos comprovaram

que o aumento do influxo de cálcio na célula está implicado na atividade convulsivante nos neurônios

(BADING; HILMAR, 1999). Recentemente foi demonstrado que bloqueadores de canais de cálcio,

particularmente as diidropiridinas sozinhas ou associadas a drogas antiepilépticas convencionais,

reduzem a incidência de convulsões em vários modelos experimentais de epilepsia (GUPTA et al., 2003;

JAIN et al., 2010).

A trimetazidina é um derivado lipofílico da piperazina, um anti-helmíntico que possui vários

derivados importantes, de grande interesse nas doenças isquêmicas (Quadro 3). A trimetazidina

preserva o metabolismo energético da célula exposta à hipoxia ou à isquemia, evitando a queda das

taxas intracelulares de ATP. Preserva, também, o funcionamento das bombas iônicas e o fluxo

transmembrana de sódio e potássio, mantendo a homeostase celular. Estudos demonstraram que a

trimetazidina melhora os sintomas e reduz a freqüência da angina através da manutenção da homeostase

do cálcio nas células (ISKESEN et al., 2006). Na cardiomiopatia isquêmica a trimetazidina pode inibir o

acúmulo de cálcio nas células regulando a passagem de íons através da membrana (BELARDINELLI,

2002).

A literatura tem demonstrado que a trimetazidina apresenta propriedades antioxidantes,

antiinflamatórias, antinociceptivas e gastroprotetoras em vários modelos experimentais com animais

(ABDEL-SALAM; EL-BATRAN, 2005). Muitos estudos mostraram que a trimetazidina apresenta

efeito protetor em lesões isquêmicas não apenas no coração (BELARDINELLI, 2002), mas também no

31

cérebro (IQBAL et al., 2002; DHOTE; BALARAMAN, 2008), pulmão (INCI et al., 2001), rim

(CHANDER et al., 2003), intestino (TETIK et al., 1999) e fígado (SETTAF; MORIN, 1999).

Quadro 3 – Estrutura química da trimetazidina

Piperazina Trimetazidina

Fonte: Index Merck, 11ª Edição.

O desenvolvimento de novos agentes antiepilépticos com melhor eficácia e menos efeitos

adversos é de suma importância para pesquisa médica. Os íons cálcio desempenham um importante

papel na gênese da crise convulsiva. A trimetazidina (TMZ) utilizada no tratamento de doenças

isquêmicas preserva o metabolismo energético da célula exposta à hipóxia ou à isquemia, evitando a

queda das taxas intracelulares de ATP. Preserva também o funcionamento das bombas iônicas e o fluxo

transmembrana de cálcio, sódio e potássio, mantendo a homeostase celular. A literatura tem

demonstrado que a trimetazidina apresenta propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias,

antinociceptivas e gastroprotetoras em vários modelos experimentais com animais (ABDEL-SALAM;

EL-BATRAN, 2005).

Jain e colaboradores (2010) sugeriram que a trimetazidina apresenta atividade anticonvulsivante

no modelo de convulsão induzida por eletrochoque em camundongos. Portanto, diante desses indícios

pode haver a possibilidade da trimetazidina exercer efeitos benéficos sobre a convulsão, o que poderia

representar uma opção terapêutica como adjuvante no tratamento da epilepsia.

32

2. OBJETIVOS

2.1 Geral

Estudar os efeitos neuroprotetores da trimetazidina sozinha ou em associação com fenobarbital

no modelo de convulsão induzida por pilocarpina em camundongos, realizando, ainda, estudo

comparativo com agente antiepiléptico clássico eficaz no modelo de convulsões em estudo

(clonazepam).

2.2 Específicos

- Realizar estudo comportamental dos animais pré-tratados com trimetazidina sozinha e/ou em

associação com fenobarbital no modelo de convulsão induzida por pilocarpina em camundongos;

- Determinar os efeitos da trimetazidina sozinha e/ou em associação com fenobarbital sobre a

peroxidação lipídica, formação de nitrito-nitrato e concentração de glutationa reduzida (GSH) em

cérebro de camundongos após as convulsões induzidas por pilocarpina;

- Analisar os efeitos da trimetazidina sozinha e/ou em associação com fenobarbital sobre as

alterações nas concentrações dos neurotransmissores GABA e glutamato em cérebro de

camundongos após as convulsões induzidas por pilocarpina;

- Investigar os efeitos da trimetazidina sozinha e/ou em associação com fenobarbital sobre o

processo inflamatório envolvido no modelo de epilepsia estudado, através da análise das

concentrações de mieloperoxidase (MPO) em cérebro de camundongos após as convulsões

induzidas por pilocarpina.

.

33

3. METODOLOGIA

3.1. Animais

Foram utilizados camundongos Swiss adultos machos (20-30g). Durante todos os experimentos,

os animais foram mantidos em gaiolas plásticas com no máximo 20 animais, em condições ambientais

semelhantes, com ciclo claro / escuro alternado de 12 horas, com luzes acesas às 06:00h, recebendo

ração padrão tipo Purina e água ad libitum. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em

Experimentação Animal da UFC (Protocolo N-59/07).

3.2. Drogas Utilizadas nos Tratamentos

- Trimetazidina (Vastarel®), comprimidos 20mg (Servier);

- Fenobarbital (Gardenal®), comprimidos 50mg (Sanofi);

- Clonazepam (Rivotril®), comprimidos 0,5mg (Roche);

- Cloridrato de pilocarpina (Sigma Chemical Co., USA).

Os reagentes usados no preparo dos tampões e demais soluções foram de grau analítico.

3.3. Protocolo de Tratamento dos Grupos Experimentais

Os experimentos foram conduzidos entre 8:00 e 10:00 horas. Os animais receberam injeções de

trimetazidina (5, 10 e 20 mg/kg, i.p.), fenobarbital (10 e 30 mg/kg, i.p.), clonazepam (0,5 mg/kg, i.p.) ou

solução salina - NaCl 0,9%, i.p. [a pilocarpina foi dissolvida em solução salina e as demais drogas foram

dissolvidas em solução de 1% de Tween 80] durante sete dias. Após 60 minutos da última injeção das

drogas em estudo ou veículo, foi administrada pilocarpina na dose 400 mg/kg, i.p. (P400) para os

estudos comportamentais iniciais com tempo de observação dos animais de 1 hora. Depois foi utilizada

apenas pilocarpina na dose de 320 mg/kg, i.p. precedida de metil-escopolamina (1 mg/kg, i.p.) para a

determinação da escala de Racine (observação dos animais durante 2 horas) em todos os experimentos

seguintes. A metil-escopolamina (1 mg/kg, i.p.) foi administrada 30 minutos antes da administração da

34

pilo, para inibir a ação colinérgica da pilo em nível periférico, permitindo dessa forma, a ação da droga

somente no sistema nervoso central, mais especificamente nos receptores muscarínicos e possibilitando

um maior tempo de observação do comportamento dos animais. As crises convulsivas motoras e

límbicas iniciaram cerca de 15-25 minutos após a injeção de Pilo. Outros quatro grupos receberam

apenas trimetazidina (10 e 20 mg/kg, i.p.), fenobarbital (10 e 30 mg/kg, i.p.), clonazepam (0,5 mg/kg,

i.p.) ou solução salina, i.p.

Quadro 4 – Protocolo de Tratamento Experimental do Tratamento dos Animais

GRUPOS TRATAMENTO

1 Trimetazidina (5 mg/kg, i.p.) + PILO



4 Trimetazidina (5 mg/kg, i.p.) + Fenobarbital (10 mg/kg, i.p.) + PILO

5 Fenobarbital (10 mg/Kg, i.p.) + PILO

6 Fenobarbital (30 mg/Kg, i.p.) + PILO

7 Clonazepam (0,5 mg/Kg, i.p.) + PILO

8 Solução salina - NaCl 0,9% + PILO

9 Solução salina - NaCl 0,9%

Após a injeção de pilocarpina, os animais tratados e controles foram colocados em ambiente

reservado para observação dos grupos pelo período de 1h (P400) ou 2h (P320) para o estudo

comportamental. Os animais que não receberem pilocarpina foram observados por igual período. Os

animais que não sobreviveram até o final do período de observação foram decaptados logo após a morte

e os sobreviventes foram sacrificados por deslocamento cervical e decapitados logo após estudo

comportamental. Hipocampo, corpo estriado e córtex pré-frontal foram imediatamente isolados,

removidos sobre gelo e armazenados à -80°C para a realização dos estudos neuroquímicos.

35

3.4. Estudo Comportamental

Alterações Comportamentais Após Indução de Convulsões e Estado Epiléptico por Administração

de Pilocarpina.

Os animais tratados e controles foram divididos em gaiolas contendo 6 a 10 animais e colocados

em ambiente reservado, sendo feita a observação direta. Os seguintes parâmetros foram observados:

presença de sinais colinérgicos periféricos, convulsões motoras, instalação de estado epiléptico, número

de mortes, latência de convulsão e latência de morte em cada grupo. Estas observações foram

acompanhadas por um observador experiente durante 120 minutos e classificadas de acordo com a

escala de Racine (Racine, 1972). O Quadro 2 apresenta estes parâmetros juntamente com suas

características. O Quadro 3 mostra os parâmetros da escala de Racine. O nível de intensidade da crise

na fase aguda da injeção sistêmica de pilocarpina é graduado de 1 a 5 (quanto maior o grau maior a

intensidade da crise).

Quadro 5 - Parâmetros Comportamentais Observados após a Injeção de Pilocarpina

PARÂMETROS CARACTERÍSTICAS

1. Sinais colinérgicos periféricos (SCP) Tremores, miose, cromodacriorréia,

piloereção, diarréia, salivação

2. Convulsão Tônico / clônica

3. Estado epiléptico Convulsões intermitentes

4. No de mortes Determinado durante o período de 1 hora

depois da última administração realizada

5. Latência de convulsão Intervalo de tempo em minutos entre a

última injeção e o aparecimento da primeira

convulsão

6. Latência de morte Intervalo de tempo em minutos entre a

última injeção e a morte do animal

Fonte: Adaptado de Turski et al., 1983a.

36

Quadro 6 - Escala de Racine para intensidade de respostas motoras dos animais à injeção depilocarpina.

Escore Comportamento

0 Normal (sem convulsão) – imobilidade

ConvulsãoLímbica

1 Automatismos Faciais - Movimentos faciais (focinho),hiperatividade, coçar, cheirar (sniffing,), grooming, wet dog shakes

2 Mioclonias de cabeça e pescoço - Balançar a cabeça, olhar fixo,tremor

ConvulsãoMotora

3 Clonias de patas anteriores - Contração e extensão das patasanteriores

4 Clonias de patas posteriores, rearing e salivação

5 Elevação e queda - estado epiléptico

(Racine, 1972)

3.5. Determinação da Atividade dos Sistemas Antioxidantes

3.5.1. Método da Determinação da Concentração da Glutationa Reduzida (GSH)

A determinação da concentração da GSH baseia-se na reação do reagente de Ellman, o 5,5'-

ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) com o tiol livre originando um dissulfeto misto mais ácido 2-

nitro-5-tiobenzóico. A medida do produto de reação formado foi feita por leitura da absorbância a 412

nm. Foram preparados homogenatos a 10% das áreas cerebrais a serem estudadas, em EDTA 0,02 M,

em seguida foram retirados 400 μL desse homogenato e adicionados 320 μL de água destilada e mais 80

μL de ácido tricloroacético a 50%. O material foi agitado e centrifugado a 3000rpm por 15 min. Em

seguida foi recolhido 400 μL do sobrenadante e acrescido 800 μL de tampão Tris-HCl 0,4M, pH 8,9 e

mais 20 μL de DTNB 0,01M e após 1 minuto da reação foi feita a leitura da coloração em 412 nm,

através de um espectrofotômetro. A concentração da glutationa reduzida foi expressa em nanograma de

GSH / g de tecido.

37

Curva padrão de Glutationa Reduzida (GSH)

A partir da solução padrão de GSH (1mg/mL), foi preparado 4mL (em triplicata) de soluções a

6,25; 12,5; 25; 50 e 100 μg/mL. O branco foi feito com água destilada (4 mL) e a cada tudo das soluções

de GSH foi acrescentado de 4 mL de tampão Tris HCl 0,4M (pH 8,9). Foi adicionado ainda a cada tubo

0,1 mL de DTNB (0,01M) e feita a leitura da absorbância a 412 nm após 1 min da adição do DTNB, e

foi determinada a equação da curva padrão de GSH.

3.6. Determinação do Índice de Peroxidação Lipídica e Produção de Nitrito/Nitrato

3.6.1. Método da Determinação da Peroxidação Lipídica (TBARS)

O grau de lipoperoxidação nas áreas cerebrais foi medido através da determinação dos níveis de

TBARS, conforme o método de Huong et al (1998), seguindo o protocolo a seguir.

Foi preparado o homogenato das áreas cerebrais a 10% em solução de cloreto de potássio (KCl)

0,15 M. 0,25 mL do homogeneizado foram colocados em tubos de ensaio, adicionados 0,5 mL de

tampão fosfato de potássio monobásico 50 mM, pH 7,4 e 0,25 mL do sistema catalisador da formação de

radicais livres. Após incubação dessa mistura a 37º C, por 30 minutos, a reação foi interrompida pela

adição de 0,5 mL de solução de ácido tricloroacético a 10%. Em seguida, a mistura foi submetida à

centrifugação a 3000 rpm por 15 minutos e o sobrenadante separado e acrescido de 0,5 mL de solução

de ácido tiobarbitúrico 0,8%. Após a agitação, essa mistura foi mantida em um banho de água fervente

(95-100°C) por 15 min., a seguir resfriada em banho de gelo por alguns minutos e posteriormente

tomada para leitura em espectrofotômetro a 532 nm.

Curva-padrão de malonildialdeído (MDA)

A partir da solução padrão de MDA (6mols), foram preparadas as soluções a 0,627; 1,247; 2,463;

4,8; 9,16 e 16,77μmol. O branco foi feito com água destilada. A leitura da absorbância foi feita a 532nm

para determinação da equação da curva-padrão de MDA.

38

3.6.2. Determinação do Conteúdo de Nitrito

Preparação da Curva Padrão:

Foram pesados 7mg de NaNO2 e dissolvidos em 10 mL de água destilada (estoque-10mM) foi

feita as diluições em série (10 e 20x), ficando 1mM, 100M, 10M, 5M, 2,5M, 1,25M, 0,625M,

0,312M. Foi feita uma equação da reta para o cálculo das concentrações do teste (GREEN et al. 1981).

Método:

Em um tubo branco foi adicionado 500L do reagente mais 500L de água destilada, em um

outro tubo teste foi adicionado 500L do reagente mais 500ul do homogenato de tecido a 10% em água

destilada. Foi feita a leitura em espectrofotômetro a 560nm.

3.7. Determinação das concentrações dos aminoácidos GABA e Glutamato com HPLC

- Método

Para determinação das concentrações dos aminoácidos, foi utilizado o equipamento de

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) com detector de fluorescência. A espectroscopia de

fluorescência pode ser usada como método de detecção específica, e é um dos mais sensíveis para

compostos que fluorescem. Fluorescência pode ser desenvolvida em compostos não fluorescentes por

reações de derivatização realizadas pré ou pós-coluna.

- Procedimento Experimental

Os animais foram decaptados logo após a realização do teste comportamental e,

imediatamente, tiveram seus cérebros dissecados sobre o gelo. O hipocampo foi utilizado para preparar

homogenatos a 10 %. Os tecidos cerebrais foram sonicados em ácido perclórico (HCLO4) por 30

segundos e centrifugados por 15 minutos em centrífuga refrigerada a 15.000 rpm. O sobrenadante foi

39

separado e filtrado através de uma membrana (Millipore- 0,2 μm) e posteriormente associado a uma

solução de derivatização pré-coluna, para obtenção de fluorescência, em uma proporção de 1:1. Um

minuto depois do início dessa associação uma alíquota de 20 μl foi retirada e injetada no equipamento de

HPLC para análise química.

Para a determinação das concentrações dos aminoácidos, uma coluna de fase-reversa C18

(Shimadzu, Japão), foi utilizada. A fase móvel composta de duas fases: A (pH 6,95)- acetato de sódio

(0,1 M), metanol (6 %, v/v) e tetrahidrofurano (1,5 %); B- Metanol puro (100 %), correu em um fluxo

de 1,0 ml/min em um gradiente de 30 min de duração (MASSIEU; TAPIA, 1997). GABA e Glutamato

(GLU) foram detectados usando um detector de fluorescência (Modelo RF-535 da Shimadzu, Japão)

com comprimento de ondas excitação e emissão de 370 e 450 nm, respectivamente. Os cromatogramas

foram registrados e quantificados por um computador usando um software da Shimadzu®. As

concentrações dos aminoácidos foram determinadas por comparação com os padrões injetados no HPLC

no dia do experimento e foram expressos em μmol/g de tecido.

3.8. Determinação da Mieloperoxidase (MPO)

Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima presente nos grânulos de neutrófilos. Essa enzima pode

ser utilizada, portanto, como marcador para o conteúdo de neutrófilos dos tecidos. A ação da MPO está

explicada abaixo:

Neste ensaio, a H2O2 é clivada por meio da MPO liberada das amostras de tecido por

homogeneização com tampão HTAB (detergente). O radical oxigênio (O_) resultante se combina com

diidrocloreto de ɵ-dianisidina, o doador de hidrogênio (AH2), que é convertido a um composto colorido

(A). O aparecimento deste composto, ao longo do tempo, é medido por espectrofotômetro (460nm) para

determinar o conteúdo de MPO do ensaio.

H2O2 H2O + O_

O_ + AH H2O + A

40

4. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os resultados obtidos nos

diferentes grupos foi utilizado o teste t-Student (comparação entre duas médias) ou análise de variância

seguida do teste de Tukey (post hoc). As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas

quando P<0,05. Os valores foram expressos como Média ± EPM.

41

5. RESULTADOS

5.1. ESTUDO COMPORTAMENTAL

5.1.1 Alterações comportamentais induzidas por pilocarpina em camundongos pré-tratados ou

não com trimetazidina (TMZ), sozinha ou em associação com fenobarbital (TMZ+FEN),

fenobarbital (FEN) ou clonazepam (CNZP).

Após a administração de pilocarpina, 400mg/Kg, i.p. (P400) os animais mostraram sinais

colinérgicos periféricos (miose, piloereção, cromodacriorréia, diarréia, tremores), e movimentos

estereotipados, seguidos por convulsões motoras límbicas em 100% (40/40) dos animais tratados. O

processo convulsivo persistiu e progrediu para status epilepticus (estado epiléptico) em 94% (27/29)

desses camundongos, levando à morte de 98% (28/29) dos animais (Tabela 1).

A administração de TMZ, i.p., durante sete dias e no último dia de tratamento 60 min antes de

P400, aumentou a latência de convulsão em todas as doses testadas, de forma dose-dependente, todavia,

a dose de 20 mg/kg, foi a que mostrou melhor efeito quando comparada às demais doses (p < 0,001).

Aumentou a latência de convulsão em 94% comparado ao controle, levou à ausência de convulsões em

15% (04/24) dos animais; reduziu a ocorrência de estado epiléptico em 16% (05/24) e protegeu 31%

(08/24) dos animais da morte (Tabela 1).

A administração da associação de TMZ+FEN, i.p., durante sete dias e no último dia de

tratamento 60 min antes de P400, aumentou a latência de convulsão em 125% quando comparada ao

controle (p < 0,001), levou à ausência de convulsões em 23% (05/21) dos animais; reduziu a ocorrência

de estado epiléptico em 38% (08/21) e protegeu 48% (10/21) dos animais da morte (Tabela 1 e Figura

1).

A administração de FEN, i.p., durante sete dias e no último dia de tratamento 60 min antes de

P400, aumentou a latência de convulsão nas duas doses testadas, todavia, a dose de 30 mg/kg, foi a que

mostrou um aumento mais expressivo nas latências de convulsão quando comparada à dose de 10mg/kg

(p < 0,005). Aumentou a latência de convulsão em 146% comparado ao controle, levou à ausência de

42

convulsões em 40% (09/21) dos animais; reduziu a ocorrência de estado epiléptico em 56% (12/21) e

protegeu 58% (13/21) dos animais da morte (Tabela 1).

A administração de CNZP, i.p., durante sete dias e no último dia de tratamento 60 min antes de

P400, aumentou a latência de convulsão. O efeito protetor demonstrado pelo clonazepam foi

determinado anteriormente por outros membros do nosso grupo testando-se três doses, 0,25, 0,5 e

1mg/kg, i.p. Na ocasião não foi observado o efeito de forma dose-dependente, e a dose de 0,5mg/kg, que

foi selecionada para as análises seguintes, mostrou um aumento mais expressivo nas latências de

convulsão quando comparada às demais doses (OLIVEIRA et al., 2010). O clonazepam na dose de

0,5mg/kg aumentou a latência de convulsão em 187% comparado ao controle, levou à ausência de

convulsões em 63% (12/19) dos animais; reduziu a ocorrência de estado epiléptico em 86% (16/19) e

protegeu 73% (14/19) dos animais da morte (Tabela 1).

Sinais colinérgicos periféricos e movimentos estereotipados permaneceram inalterados em todos

os grupos pré-tratados com as drogas testadas. Nenhum animal, dos grupos que receberam apenas salina

isotônica, apenas TMZ, FEN ou CNPZ apresentou atividade convulsiva.

43

Tabela 1- Efeitos da trimetazidina (TMZ) sozinha e/ou em associação com fenobarbital (FEN) nasalterações comportamentais e convulsões induzidas por PILO em camundongos

GRUPO N Convulsão(%)

Latência deconvulsão

(min)

StatusEpilepticus

(%)

Morte(%)

Controle 29 100 8,2±0,35 94 98

TMZ5 24 94 10,8±0,5 80 73

TMZ10 20 94 13,5±0,86 85 73

TMZ20 24 85 15,9±2,1a 84 69

TMZ5+FEN10 21 77 18,5±1,7a,b 62 52

FEN10 24 82 13,6±0,9a 57 53

FEN30 21 60 20,2±1,2a,b,c,f 44 42

CNZP 0,5 19 37 23,6±1,87a,b,c,d,f 14 27

Camundongos Swiss, machos, receberam salina 0,9% (controles) ou trimetazidina (5, 10 e 20 mg/kg,i.p.), sozinha e/ou associada ao fenobarbital (TMZ 5mg/kg + FEN 10mg/kg, i.p.), fenobarbital (10 e 30mg/kg, i.p.) e clonazepam (0,5mg/kg, i.p.) durante 7 dias, no sétimo dia, 60 minutos após a últimaadministração foi administrada pilocarpina (400 mg/kg, i.p.). Os animais foram observados durante 1hora após a injeção de P400. a vs controle, b vs TMZ5, c vs TMZ10, d vs TMZ20, e vs TMZ5+FEN10, fvs FEN10, com p<0,05 (ANOVA seguido por teste de Tukey).

44

Figura 1. Potencialização da atividade anticonvulsivante do Fenobarbital (FEN 10mg/Kg) pela

associação com Trimetazidina (TMZ 5mg/kg). Camundongos Swiss, machos, receberam salina ou as

drogas testadas, i.p., durante 7 dias, no sétimo dia, 60 minutos antes de P400 (pilocarpina, 400mg/Kg,

i.p.). Média + EPM, n=20. * p < 0,05 comparado ao grupo controle; ** p < 0,001 comparado aos demais

grupos (ANOVA e Tukey).

PILO

*

**

45

5.1.2 Alterações comportamentais induzidas por pilocarpina em camundongos pré-tratados ou

não com trimetazidina (TMZ), sozinha e/ou em associação com fenobarbital (TMZ+FEN),

fenobarbital (FEN) ou clonazepam (CNZP) na escala de Racine

Após a administração de pilocarpina, 320mg/Kg, i.p. (PILO) os animais apresentaram as

manifestações do comportamento pré-convulsivo (acinesia, tremor, automatismos oroalimentares,

salivação, coçar a cabeça) entre 12,2±1,38 minutos seguidos por convulsões motoras límbicas em 96 %

(48/50) dos animais tratados. O processo convulsivo persistiu e progrediu para status epilepticus (estado

epiléptico) em 88% (12/50) desses camundongos. Essas convulsões ocorreram após um período de

latência de 18,2±1,9 minutos e atingiram o escore da escala de Racine 4,8±0,5 (Tabela 2).

O pré-tratamento com TMZ, i.p., durante sete dias, aumentou a latência do comportamento pré-

convulsivo e a latência da primeira convulsão em todas as doses testadas, de forma dose-dependente,

todavia, a dose de 20 mg/kg, foi a que mostrou um aumento significativo nesses parâmetros quando

comparada às demais doses (p < 0,001). Aumentou a latência do comportamento pré-convulsivo em 46

%, a latência da primeira convulsão em 42 % comparado ao controle, e reduziu os escores da escala de

racine em 33 % (Tabela 2).

O pré-tratamento com a associação de TMZ+FEN, i.p., durante sete dias aumentou a latência do

comportamento pré-convulsivo em 100 %, a latência da primeira convulsão em 50 %, e reduziu os

escores da escala de Racine em 33 %, quando comparada ao controle (p < 0,001) (Tabela 2).

O pré-tratamento com FEN, i.p., durante sete dias na dose de 10 mg/kg não alterou os parâmetros

comportamentais, mas na dose de 30 mg/kg promoveu aumento da latência do comportamento pré-

convulsivo em 69 %, da latência da primeira convulsão em 38 %, e reduziu os escores da escala de

Racine em 31 %, quando comparada ao controle (p < 0,005) (Tabela 2).

O pré-tratamento com clonazepam (CNZP, i.p.) durante sete dias praticamente dobrou a latência

do comportamento pré-convulsivo, aumentou a latência da primeira convulsão em 90 %, e reduziu os

escores da escala de Racine em 62 %, quando comparado ao controle (p<0,001) (Tabela 2). O efeito

protetor demonstrado pelo clonazepam foi determinado anteriormente testando-se três doses, 0,25, 0,5 e

46

1mg/kg, i.p. Na ocasião não foi observado o efeito de forma dose-dependente, e a dose de 0,5mg/kg, que

foi selecionada para as análises seguintes, mostrou um aumento mais expressivo nas latências de

convulsão quando comparada às demais doses (p < 0,001).

Nenhum animal, dos grupos que receberam apenas salina isotônica ou apenas TMZ, FEN ou

CNPZ sem a administração de pilocarpina apresentou atividade convulsiva.

47

Tabela 2- Efeitos da trimetazidina (TMZ) sozinha e/ou em associação com fenobarbital (FEN) naescala de Racine utilizando modelo de convulsão induzido por pilocarpina em camundongos

GRUPO ComportamentoPré-convulsivo

(min)

Latência daprimeira

convulsão (min)

Escore da Escalade Racine

Controle 12,2±1,38 18,2±1,9 4,8±0,5

TMZ5 13,4±1,6 20,8±2,5 3,6±0,3

TMZ10 15,1±2,1 23,5±3,1 4,1±0,4

TMZ20 17,8±2,2 a 25,9±3,1a 3,2±0,3 a

TMZ5+FEN10 24,4±3,2a,b,c 28,5±3,7a,b 2,4±0,4 a,b

FEN10 11,6±1,22e 21,6±2,9 3,9±0,5

FEN30 20,7±1,6a,b,c,f 25,2±3,2a,b 3,3±0,2

CNZP 0,5 33,8±4,1a,b,c,d,f 34,6±4,7a,b,c,d,f 1,8±0,2 a,b,c,d,f

Camundongos Swiss, machos, receberam salina 0,9% (controles) ou trimetazidina (5, 10 e 20 mg/kg,i.p.), sozinha e/ou associada ao fenobarbital (TMZ 5mg/kg + FEN 10mg/kg, i.p.), fenobarbital (10 e 30mg/kg, i.p.) e clonazepam (0,5mg/kg, i.p.) durante 7 dias, no sétimo dia, 60 minutos após a últimaadministração foi administrada metil-escopolamina (1 mg/Kg, i.p.) e 30 min depois foi administradapilocarpina (320 mg/kg, i.p.). Os animais foram observados durante 1 hora após a injeção de P320. a vscontrole, b vs TMZ5, c vs TMZ10, d vs TMZ20, e vs TMZ5+FEN10, f vs FEN10, com p<0,05(ANOVA seguido por teste de Tukey).

48

5.2. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS ANTIOXIDANTES DO PRÉ-TRATAMENTO COM

TRIMETAZIDINA, FENOBARBITAL OU CLONAZEPAM NO MODELO DE CONVULSÕES


5.2.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZP sobre

a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) no modelo de

convulsão induzido por pilocarpina.

Os resultados da análise da produção de substâncias reativas com o ácido tiobarbitúrico

(TBARS) em hipocampo, núcleos da base e córtex pré-frontal dos diferentes grupos de tratamento foram

expressos em μg de MDA (malonildialdeído)/ mg de proteína (Figuras 2, 3 e 4).

5.2.1.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN ou CNZP sobre

a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em hipocampo de

camundongos tratados com PILO.

Um aumento significativo na concentração de MDA em relação aos demais grupos foi

evidenciado no hipocampo dos animais tratados com PILO (p<0,01) em relação aos controles (tratados

apenas com salina - SLN). O TMZ apenas nas doses de 10 e 20 foi capaz de reverter a elevação dos

níveis de MDA induzida por Pilo. Quando administrado isoladamente TMZ não alterou os níveis de

MDA na área cerebral estudada. Embora o TMZ na dose de 5 mg/kg e FEN na dose de 10 mg/kg

sozinhos não tenham alterado a elevação dos níveis de MDA provocada por Pilo, a associação dessas

duas drogas promoveu uma redução significativa dos níveis de MDA quando comparada ao grupo

tratado com P320 (SLN+PILO) (Figura 2). Hipocampo: Controle = 98,8 ± 5,5 (8); PILO = 336,5 ±

25,2 (8); TMZ5 = 284,6 ± 19,7 (8); TMZ10 = 171,3 ± 20,1 (8); TMZ20 = 175,3 ± 20,1 (8);

TMZ5+FEN10 = 174,6 ± 23,0 (8); FEN10 = 265,1 ± 19,8 (8); FEN30 = 279,5 ± 24,5 (8); CNZP0,5 =

245,2 ± 9,2 (8).

49

Figura 2. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) emhipocampo de camundongos tratados com PILO (320mg/kg). Foi determinada a ocorrência delipoperoxidação, com base na concentração de MDA. Os valores representam a média ± EPM, n=08. avs SLN, b vs SLN+PILO, c vs TMZ5, d vs TMZ10, e vs TMZ20, f vs TMZ+FEN; com p<0,05(ANOVA e Teste de Tukey).

50

5.2.1.2 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZP

sobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em núcleos

da base de camundongos tratados com PILO.


evidenciado no núcleo da base dos animais tratados com PILO (p<0,01) em relação aos controles

(tratados apenas com salina - SLN). O TMZ em todas as doses testadas foi capaz de reverter a elevação

dos níveis de MDA induzida por PILO (320mg/kg, i.p.). Quando administrado isoladamente TMZ não

alterou os níveis de MDA na área cerebral estudada. Embora o FEN sozinho nas dose de 10 e 30 mg/kg

não tenha alterado a elevação dos níveis de MDA provocada por PILO, a associação TMZ5+FEN10

promoveu uma redução significativa dos níveis de MDA quando comparada ao grupo tratado com P400

(SLN+PILO) (Figura 3). Núcleos da base: Controle = 155,2 ± 8,3 (8); PILO = 369,5 ± 19,3 (8); TMZ5

= 227,8 ± 16 (8); TMZ10 = 201,7 ± 22,6 (8); TMZ20 = 173,7 ± 15,9 (8); TMZ5+FEN10 = 199,0 ± 25,1

(8); FEN10 = 252,1 ± 21,2 (8); FEN30 = 314,5 ± 11,4 (8); CNZP0,5 = 219,4 ± 12,7 (8).

51

Figura 3. Efeitos do tratamento com TMZ sozinho ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em núcleosda base de camundongos tratados com PILO (320mg/kg). Foi determinada a ocorrência delipoperoxidação, com base na concentração de MDA. Os valores representam a média ± EPM, n=08. avs SLN, b vs SLN+PILO, c vs TMZ5, d vs TMZ10, e vs TMZ20, f vs TMZ+FEN; com p<0,05(ANOVA e Teste de Tukey).

52


sobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em córtex

pré-frontal de camundongos tratados com PILO.



(tratados apenas com salina - SLN). O TMZ nas doses de 10 e 20 foi capaz de reverter a elevação dos

níveis de MDA induzida por PILO. Quando administrado isoladamente TMZ não alterou os níveis de

MDA na área cerebral estudada. Embora o FEN sozinho nas dose de 10 e 30 mg/kg não tenha alterado a

elevação dos níveis de MDA provocada por PILO, a associação TMZ5+FEN10 promoveu uma redução

significativa dos níveis de MDA quando comparada ao grupo tratado com PILO (SLN+PILO) (Figura

4). Núcleos da base: Controle = 173,2 ± 7,8 (8); PILO = 332,1 ± 112,2 (8); TMZ5 = 277,8 ± 22,1 (8);

TMZ10 = 183 ± 11,3 (8); TMZ20 = 167,2 ± 18,3 (8); TMZ5+FEN10 = 153,1 ± 20,4 (8); FEN10 = 271,8

± 10,5 (8); FEN30 = 315,2 ± 21,4 (7); CNZP0,5 = 221,4 ± 11,4 (7).

53

Figura 4. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre a produção de substâncias ácidas reativas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em córtexpré-frontal tratados com PILO (320mg/kg). Foi determinada a ocorrência de lipoperoxidação, combase na concentração de MDA. Os valores representam a média ± EPM, n=08. a vs SLN, b vsSLN+PILO, c vs TMZ5, d vs TMZ10, e vs TMZ20, f vs TMZ+FEN; com p<0,05 (ANOVA e Teste deTukey).

PILO

54


a produção de nitrito e nitrato no modelo de convulsão induzido por pilocarpina


sobre a produção de nitrito e nitrato em hipocampo de camundongos submetidos à convulsão com

PILO

Um aumento significativo na concentração de nitrito e nitrato em relação aos demais grupos foi


apenas com salina - SLN). O TMZ apenas nas doses de 5 e 10 foi capaz de reverter a elevação dos níveis

de nitrito e nitrato induzida por PILO. Na ausência da PILO, administrado isoladamente TMZ não

alterou os níveis de nitrito e nitrato na área cerebral estudada. Embora o FEN na dose de 10 mg/kg

sozinho não tenha alterado a elevação dos níveis de nitrito e nitrato provocada por PILO, a associação

com TMZ promoveu uma redução significativa dos níveis de nitrito e nitrato quando comparada ao

grupo controle (SLN+PILO) (Figura 5). Hipocampo: Controle = 14,37 ± 1,6 (6); PILO = 29,06 ± 3,0

(6); TMZ5 = 10,94 ± 13,9 (6); TMZ10 = 17,44 ± 1,7 (5); TMZ20 = 18,4 ± 1,7 (5); TMZ5+FEN10 =

15,68 ± 1,9 (6); FEN10 = 31,11 ± 3,8 (5); FEN30 = 16,72 ± 2,3 (6); CNZP0,5 = 18,95 ± 2,29 (6).

55

Figura 5. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre a produção de nitrito e nitrato em hipocampo de camundongos submetidos ao modelo deconvulsão com pilocarpina (320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=5-6. a vs SLN, bvs SLN+PILO, c vs TMZ5, d vs TMZ10, e vs TMZ20, f vs TMZ+FEN; com p<0,05 (ANOVA e Testede Tukey).

PILO

SLN

SLN+P400

TMZ5

TMZ10

TMZ20

TMZ5+FEN10

FEN10

FEN30CNZP

Nitr

itoe

nitr

ato

(M

/gde

teci

do)

56


sobre a produção de nitrito e nitrato em núcleos da base de camundongos submetidos à convulsão

com PILO



(tratados apenas com salina - SLN). O TMZ em todas as doses testadas foi capaz de reverter a elevação

dos níveis de nitrito e nitrato induzida por PILO. Quando administrado isoladamente, na ausência de

PILO, TMZ não alterou os níveis de nitrito e nitrato na área cerebral estudada. FEN sozinho na dose de

10 mg/kg e em associação com o TMZ não alterou a elevação dos níveis de nitrito e nitrato provocada

por PILO, no entanto FEN sozinho na maior dose promoveu uma redução significativa dos níveis de

nitrito e nitrato quando comparado ao grupo tratado com PILO (SLN+PILO) (Figura 6). Núcleos da

base: Controle = 14,75 ± 1,1 (6); PILO = 36,52 ± 4,9 (6); TMZ5 = 16,61 ± 1,5 (6); TMZ10 = 20,19 ±

2,3 (6); TMZ20 = 17,16 ± 0,52 (5); TMZ5+FEN10 = 30,28 ± 2,7 (5); FEN10 = 30,75 ± 4,1 (6); FEN30

= 20,81 ± 1,1 (6); CNZP0,5 = 31,22 ± 3,88 (6).

57

Figura 6. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre a produção de nitrito/nitrato em núcleos da base de camundongos submetidos ao modelo deconvulsão com pilocarpina (320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=5-6. a vs SLN, bvs SLN+PILO, c vs TMZ5, d vs TMZ10, e vs TMZ20, f vs TMZ+FEN; com p<0,01 (ANOVA e Testede Tukey).

PILO

NB

SLN

SLN+P40

0TMZ5

TMZ10

TMZ20

TMZ5+FEN10

FEN10

FEN30CNZP

0

10

20

30

40

50a

bb

b

a a,c

b

a

58


sobre a produção de nitrito e nitrato em córtex pré-frontal de camundongos submetidos ao modelo

de convulsão com PILO


evidenciado no córtex pré-frontal dos animais tratados com PILO (p<0,001) em relação aos controles

(tratados apenas com salina - SLN). O TMZ nas doses de 5 e 10 foi capaz de reverter a elevação dos

níveis de nitrito e nitrato induzida por PILO. Quando administrado isoladamente, na ausência de PILO,

TMZ não alterou os níveis de nitrito e nitrato na área cerebral estudada. Embora o FEN sozinho nas

doses de 10 e 30 mg/kg não tenha alterado a elevação dos níveis de nitrito e nitrato provocada por PILO,

a associação TMZ5+FEN10 promoveu uma redução significativa dos níveis de nitrito e nitrato quando

comparada ao grupo tratado com PILO (SLN+P320) (Figura 7). Córtex pré-frontal: Controle = 17,42 ±

1,9 (6); PILO = 36,28 ± 4,4 (6); TMZ5 = 20,3 ± 1,2 (6); TMZ10 = 19,88 ± 1,7 (6); TMZ20 = 26,8 ±

1,89 (6); TMZ5+FEN10 = 14,01 ± 2,6 (6); FEN10 = 56,74 ± 5,3 (6); FEN30 = 25,94 ± 2,6 (6);

CNZP0,5 = 18,94 ± 2,1 (6).

59

Figura 7. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre a produção de nitrito/nitrato em córtex pré-frontal de camundongos submetidos ao modelode convulsão com pilocarpina (320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=5-6. a vs SLN,b vs SLN+PILO, c vs TMZ5, d vs TMZ10, e vs TMZ20, f vs TMZ+FEN; com p<0,01 (ANOVA e Testede Tukey).

PILO

CPF

SLN

SLN+P400

TMZ5

TMZ10

TMZ20

TMZ5+FEN10

FEN10

FEN30CNZP

0

20

40

60

80

a

b bb

a,b,d,f

b

60

5.3. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM TRIMETAZIDINA,

SOZINHA E/OU EM ASSOCIAÇÃO COM FENOBARBITAL, CLONAZEPAM NAS

CONCENTRAÇÕES DE GLUTATIONA NO MODELO DE CONVULSÕES INDUZIDAS POR

PILOCARPINA

5.3.1 Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN sobre os níveis de

glutationa (GSH) no hipocampo de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com PILO

Uma redução significativa na concentração de GSH foi observada no hipocampo dos animais

tratados com PILO (p<0,01) em relação aos controles (tratados apenas com salina - SLN). O TMZ

sozinho na dose de 5mg/kg não foi capaz de reverter a redução dos níveis de GSH induzida por PILO.

Embora o FEN na dose de 10 mg/kg sozinho também não tenha alterado os níveis de GSH, a associação

com TMZ5 promoveu uma recuperação parcial dos níveis de GSH provocada por PILO (SLN+PILO)

(Figura 8). Hipocampo: Controle = 117,8 ± 12,1 (6); PILO = 44,34 ± 4,3 (8); TMZ5 = 65,75 ± 9,3 (8);

FEN10 = 66,5 ± 8,2 (7); TMZ5+FEN10 = 112,6 ± 7,5 (8).

61

Figura 8. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, sobre os níveis deGSH em hipocampo de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina(320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=6-8. a vs SLN, b vs SLN+PILO, c vs TMZ5, dvs FEN10; com p<0,01 (ANOVA e Teste de Tukey).

PILO

HC

SLN

SLN+PILOTMZ5

TMZ10

TMZ20

TMZ5+FEN10

FEN10

FEN300

50

100

150

a

b,c,d

a a a,fa,f

b

62


glutationa (GSH) nos núcleos da base de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com

PILO

Houve uma redução na concentração de GSH nos núcleos da base dos animais tratados com

PILO (p<0,005) em relação aos controles (tratados apenas com salina - SLN). O TMZ sozinho na dose

de 5mg/kg não foi capaz de reverter a redução dos níveis de GSH induzida por PILO. FEN na dose de

10 mg/kg sozinho também não alterou a elevação dos níveis de GSH provocada por PILO, mas a

associação FEN com TMZ5 promoveu uma recuperação os níveis de GSH a níveis próximos dos

controles (SLN) (Figura 9). Hipocampo: Controle = 143,2 ± 6,8 (7); PILO = 48,41 ± 3,3 (8); TMZ5 =

88,27 ± 7,6 (8); FEN10 = 91,10 ± 7,4 (7); TMZ5+FEN10 = 132,3 ± 10,1 (8).

63

Figura 9. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, sobre os níveis deGSH nos núcleos da base de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina(320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=7-8. a vs SLN, b vs SLN+PILO, c vs TMZ5, dvs FEN10, f vs TMZ5+FEN10; com p<0,005 (ANOVA e Teste de Tukey).

PILO

64


glutationa (GSH) no córtex pré-frontal de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com

PILO

Houve redução na concentração de GSH no córtex pré-frontal dos animais tratados com PILO

(p<0,001) em relação aos controles (tratados apenas com salina - SLN). O TMZ sozinho na dose de

5mg/kg assim como o FEN sozinho na dose de 10 mg/kg não foram capazes de reverter a elevação dos

níveis de GSH induzida por PILO. Todavia a associação TMZ5+FEN10 promoveu uma recuperação dos

níveis de GSH (Figura 10). Hipocampo: Controle = 137,7 ± 9,6 (7); PILO = 83,73 ± 8,3 (8); TMZ5 =

77,97 ± 15,5 (8); FEN10 = 86,71 ± 6,7 (7); TMZ5+FEN10 = 124,6 ± 5,3 (8).

65

Figura 10. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, sobre os níveisde GSH em córtex pré-frontal de camundongos submetidos ao modelo de convulsão compilocarpina (320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=7-8. a vs SLN, b vs SLN+PILO, cvs TMZ5; com p<0,001 (ANOVA e Teste de Tukey).

PILO

66

5.4. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS ANTIINFLAMATÓRIOS DO PRÉ-TRATAMENTO

COM TRIMETAZIDINA NO MODELO DE CONVULSÕES INDUZIDAS POR PILOCARPINA


os níveis de mieloperoxidase (MPO) em hipocampo de camundongos submetidos à convulsão com

PILO

Um aumento significativo na concentração de MPO em relação aos demais grupos foi


apenas com salina - SLN). O TMZ apenas na dose de 20 foi capaz de reverter a elevação dos níveis de

MPO induzida por PILO. Na ausência da PILO, administrado isoladamente TMZ não alterou os níveis

de MPO na área cerebral estudada. Embora o FEN sozinho em todas as doses testadas não tenha alterado

a elevação dos níveis de MPO provocada por PILO, a dose de 10mg/kg em associação com TMZ

promoveu uma redução significativa dos níveis de MPO quando comparada ao grupo controle

(SLN+PILO) (Figura 7). Hipocampo: Controle = 1,68 ± 0,2 (6); PILO = 4,77 ± 0,52 (6); TMZ5 = 3,38

± 0,22 (6); TMZ10 = 3,16 ± 0,26 (6); TMZ20 = 2,85 ± 0,25 (6); TMZ5+FEN10 = 2,46 ± 0,32 (6);

FEN10 = 3,65 ± 0,45 (6); FEN30 = 3,2 ± 0,5 (6); CNZP0,5 = 2,1 ± 0,25 (6).

67

Figura 11. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN, FEN ou CNZPsobre os níveis de MPO em hipocampo de camundongos submetidos ao modelo de convulsão compilocarpina (320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=06. a vs SLN, b vs SLN+PILO;com p<0,05 (ANOVA e Teste de Tukey).

SLN

SLN+PILOTMZ5

TMZ10

TMZ20

TMZ5+FEN10

FEN10

FEN30CNZP

Uni

dade

sde

MPO

/mg

dete

cido

PILO

68

5.5. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM TRIMETAZIDINA

E/OU FENOBARBITAL NA CONCENTRAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS GABA E

GLUTAMATO EM HIPOCAMPO DE CAMUNDONGOS SUBMETIDOS AO MODELO DE

CONVULSÕES INDUZIDAS POR PILOCARPINA

5.5.1 Efeitos do pré-tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN na concentração

do aminoácido excitatório glutamato (GLU) em hipocampo de camundongos submetidos à

convulsão com PILO

Foi observado um aumento de 168% na concentração de GLU no hipocampo dos animais

tratados com PILO (p<0,05) em relação aos controles (tratados apenas com salina - SLN). O TMZ

apenas na dose de 20 apresentou uma tendência a reverter a elevação dos níveis de GLU induzida por

PILO. Embora o FEN sozinho não tenha alterado a elevação dos níveis de GLU provocada por PILO, a

associação com TMZ promoveu uma redução significativa (32%) dos níveis de GLU quando comparada

ao grupo controle (SLN+PILO) (Figura 12). Hipocampo: Controle = 33,27 ± 5,2 (5); PILO = 89,38 ±

5,96 (4); TMZ5 = 65,72 ± 7,14 (5); TMZ10 = 69,75 ± 6,12 (4); TMZ20 = 61,23 ± 5,19 (3);

TMZ5+FEN10 = 60,32 ± 6,26 (5); FEN10 = 72,15 ± 6,18 (4).

69

Figura 12. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN na concentraçãodo GLU em hipocampo de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina(320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=3-5. a vs SLN, b vs SLN+PILO; com p<0,05(ANOVA e Teste de Tukey).

PILO

70

5.5.2 Efeitos do pré-tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN na concentração

do aminoácido inibitório GABA em hipocampo de camundongos submetidos à convulsão com

PILO

Foi observado um aumento de 2x na concentração de GABA no hipocampo dos animais tratados

com PILO (p<0,05) em relação aos controles (tratados apenas com salina - SLN). O TMZ apenas na

dose de 20 apresentou uma tendência a reverter a elevação dos níveis de GABA induzida por PILO. Não

foram observadas diferenças significativas entre os grupos tratados (Figura 13). Hipocampo: Controle =

25,24 ± 2,1 (5); PILO = 76,40 ± 8,4 (4); TMZ5 = 65,90 ± 7,4 (5); TMZ10 = 71,43 ± 8,6 (4); TMZ20 =

49,78 ± 6,5 (4); TMZ5+FEN10 = 56,38 ± 7,5 (5); FEN10 = 82,02 ± 7,66 (5).

71

Figura 13. Efeitos do tratamento com TMZ sozinha e/ou em associação com FEN na concentraçãodo GABA em hipocampo de camundongos submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina(320mg/kg). Os valores representam a média ± EPM, n=4-5. a vs SLN; com p<0,05 (ANOVA e Testede Tukey).

PILO

72

6. DISCUSSÃO

O presente estudo testou a trimetazidina nas doses de 5, 10 e 20mg/kg e em associação com o

fenobarbital no modelo de convulsões induzidas por pilocarpina em camundongos. Os resultados

demonstraram que, para os grupos tratados com trimetazidina, ocorreu maior atividade protetora contra

convulsões e status epilepticus. O percentual de morte foi reduzido proporcionalmente ao aumento das

doses nos grupos tratados com timetazidina quando comparados ao grupo controle, porém o grupo que

associava a trimetazidina ao fenobarbital sofreu redução ainda maior. A latência de convulsão aumentou

proporcionalmente nos grupos TMZ10, TMZ20 e TMZ5+FEN10 quando comparados ao grupo controle.

Houve aumento da latência do comportamento pré-convulsivo e da latência da primeira

convulsão proporcionalmente ao aumento das doses nos grupos tratados com timetazidina quando

comparados ao grupo controle, porém o grupo que associava a trimetazidina ao fenobarbital sofreu

aumento superior. Também foi observada uma redução dos escores da escala de Racine dos animais pré-

tratados com TMZ quando comparados ao grupo controle. Esses resultados demonstram que o pré-

tratamento com TMZ reduziu a intensidade e a severidade das convulsões induzidas por pilocarpina,

provavelmente devido as suas ações modulatórias nos canais iônicos, através da redução do estresse

oxidativo e dos seus efeitos antiinflamatórios.

O modelo de convulsões decorrentes da administração do agonista muscarínico pilocarpina em

roedores assemelha-se, em muitos aspectos, à epilepsia “lobo-temporal”, “psicomotora” ou “límbica”,

como, por exemplo, nos padrões eletroencefalográficos, comportamento e sequelas morfológicas

(LEITE et al., 1990; CAVALHEIRO et al., 1991; OLIVEIRA et al., 2005). De uma maneira geral, as

convulsões induzidas por pilocarpina podem produzir danos neuronais em diversas áreas e,

especialmente, nas estruturas límbicas, causando perda neuronal no hipocampo, amígdala, córtex

piriforme, córtex entorrinal, septum lateral, tálamo, neocórtex e substância negra, sugerindo o

envolvimento de diferentes áreas durante o estabelecimento do processo epiléptico (TURSKI et al.,

1987; HONCHAR et al., 1990; BORELLI et al., 2002; SCHOLL et al., 2013).

O hipocampo tem sido sugerido como sendo o sítio de origem da atividade convulsiva induzida

por pilocarpina (TURSKI et al.,1983a,b). Outros achados sugerem como sítio inicial dessas convulsões,

o pálido ventral ou nucleo accumbens (CLIFFORD et al., 1987). Estudos eletroencefalográficos e

73

autoradiográficos realizados posteriormente sugeriram ambas as áreas como locais de início das

convulsões (LABANDEIRA-GARCIA et al., 1994; KULKARNI; GEORGE, 1995; BUCKMASTER &

HANEY, 2012; SCHOLL et al., 2013).

Evidências indicam desequilíbrio entre a geração de radicais livres e os sistemas antioxidantes,

além disso, as espécies reativas do oxigênio (ROS) têm sido implicadas no desenvolvimento das

convulsões e da neurodegeneração induzida pelo processo convulsivo. Estudos sugerem que as

convulsões induzidas por pilocarpina estão relacionadas com o aumento do estresse oxidativo (TALFIK,

2011).

O estresse oxidativo foi definido por Sies (1991) como uma pertubação do equilíbrio: pró-

oxidante – antioxidante, em favor do primeiro, a qual é potencialmente capaz de causar dano celular.

Uma conseqüência desse desequilíbrio é a oxidação de ácidos graxos poliinsaturados da membrana

celular, processo denominado de lipoperoxidação. A ocorrência da lipoperoxidação pode comprometer a

estrutura da membrana, danificando-a ou eventualmente causar completa destruição culminando com a

morte celular (MOSLEY et al., 2006; NAKAMURA; LIPTON, 2009; ROWLEY & PATEL, 2013).

Os nossos resultados demonstram que o estresse oxidativo realmente aumenta durante as

convulsões induzidas por pilocarpina, indicando que o dano cerebral induzido pelo processo oxidativo

desempenha um papel crucial na fisiopatologia das convulsões. Foi observado um aumento das

concentrações de MDA e nitrito/nitrato em todas as áreas estudadas dos animais submetidos a convulsão

induzida por pilocarpina.

Foi observada a elevação da concentração de MDA no hipocampo, núcleos da base e córtex pré-

frontal dos animais tratados com PILO em relação aos controles. Nos grupos tratados TMZ10 e TMZ20

houve redução da concentração de MDA. Embora o FEN sozinho não tenha alterado a elevação dos

níveis de MDA provocada por PILO, a associação TMZ5+FEN10 promoveu uma redução significativa

desses níveis quando comparada ao grupo controle, demonstrando que uma possível associação dessas

drogas pode ter um efeito satisfatório mesmo utilizando subdoses, promovendo assim a redução dos

efeitos colaterais.

74

Foi observada a elevação dos níveis de nitrito e nitrato no hipocampo, núcleos da base e córtex

pré-frontal dos animais tratados com PILO em relação aos controles. Nos grupos tratados TMZ5,

TMZ10 e TMZ20 houve reversão da elevação dos níveis de nitrito e nitrato. Embora o FEN sozinho na

menor dose (dose subanticonvulsivante) não tenha alterado a elevação dos níveis de nitrito e nitrato, a

associação TMZ5+FEN10 promoveu uma redução significativa desses níveis quando comparada ao

grupo controle, demonstrando que uma possível associação dessas drogas pode ter um efeito satisfatório

mesmo utilizando subdoses, promovendo assim a redução dos efeitos colaterais.

Os resultados obtidos demonstraram que o pré-tratamento com TMZ na menor dose (5 mg/kg)

apresentou um efeito menor quando comparado com as maiores doses, assim como FEN na subdose (10

mg/kg) também não apresentou efeitos significativos nos parâmetros analisados, porém a associação da

TMZ com FEN nas menores doses apresentaram melhores efeitos, com redução da severidade das

convulsões, recuperação dos níveis de nitrito e nitrato, recuperação dos níveis de glutationa e efeito anti-

inflamatório com a redução das concentrações de MPO. Além disso, a associação também promoveu

recuperação dos níveis de glutamato e houve uma tendência a recuperação também dos níveis de

GABA.

A proteção demonstrada pela TMZ no presente estudo está de acordo com estudos anteriores que

observaram que drogas bloqueadoras de canais de cálcio apresentaram efeito protetor em vários modelos

de convulsão em animai (LUSZCZKI, 2007; JAIN et al., 2010).

A trimetazidina também apresenta ação bloqueadora de canais de cálcio e pode reduzir o

conteúdo de cálcio intracelular. Já é bem conhecido na literatura que alguns anticonvulsivantes agem

interferindo com canais de cálcio, reduzindo a excitabilidade neuronal (JAIN et al., 2010). No presente

estudo a dose subanticonvulsivante de TMZ foi associada com uma dose subanticonvulsivante de

fenobarbital. Essa associação apresentou efeitos benéficos revertendo boa parte das alterações induzidas

pela pilocarpina e reduzindo a severidade das convulsões. Esses resultados são comparáveis com alguns

dos efeitos obtidos com TMZ sozinha nas maiores doses (10 e 20 mg/kg) e com a dose

anticonvulsivante do fenobarbital (30 mg/kg).

75

Esses resultados sugerem que a trimetazidina apresenta atividade anticonvulsivante e

neuroprotetora no modelo de convulsão induzida por pilocarpina, possivelmente devido a modulação

dos canais de cálcio, reduzindo o estresse oxidativo e o processo inflamatório, consequentemente o dano

neuronal. No entanto, são necessários mais estudos, utilizando inclusive tratamento crônico e outras

análises neuroquímicas para esclarecer o exato mecanismo de ação da trimetazidina na epilepsia.

76

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

- A administração de TMZ, durante sete dias e no último dia de tratamento 60 min antes da pilocarpina,

aumentou a latência de convulsão em todas as doses testadas, de forma dose-dependente, todavia, a dose

de 20 mg/kg, foi a que mostrou melhor efeito quando comparada às demais doses;

- Enquanto TMZ e FEN sozinhos nas menores doses praticamente não apresentaram efeitos benéficos

nesse modelo, a associação de TMZ na menor dose com FEN na dose subanticonvulsivante aumentou a

latência de convulsão em 125%, levou à ausência de convulsões em 23% dos animais; reduziu a

ocorrência de estado epiléptico em 38% e protegeu 48% dos animais da morte, mostrando uma possível

potenciação de efeitos, com resultados semelhantes aqueles observados com o FEN sozinho na dose

anticonvulsivante (30 mg/kg);

- O TMZ na maior dose reduziu a severidade das convulsões, assim como a associação das subdoses

TMZ+FEN, com resultados semelhantes aos obtidos com FEN na dose anticonvulsivante, mostrando

que o TMZ é capaz de proteger contra os episódios convulsivos induzidos por PILO;

- A pilocarpina causou aumento no conteúdo de MDA e nitrito/nitrato no CPF, HC e CE, demonstrando

que o estresse oxidativo tem um papel importante no mecanismo de lesão induzida por PILO e essas

alterações foram parcialmente revertidas com o pré-tratamento com TMZ, principalmente nas maiores

doses e mais uma vez, a associação das subdoses de TMZ+FEN apresentou efeito semelhante a TMZ na

maior dose e ao FEN na dose anticonvulsivante, comprovando o efeito antioxidante da TMZ e a

potenciação dos efeitos do FEN;

- A associação das subdoses de TMZ+FEN reverteu os efeitos da pilocarpina nos níveis de glutationa

reduzida em todas as áreas testadas, embora a administração dessas mesmas doses sozinhas não tenha

promovido qualquer alteração, mostrando mais uma vez a potencialização dos efeitos do FEN mediada

pela TMZ;

- O TMZ apenas na dose de 20 foi capaz de reverter a elevação dos níveis de MPO induzida por PILO.

Embora o FEN sozinho em todas as doses testadas não tenha alterado a elevação dos níveis de MPO

77

provocada por PILO, a dose de 10mg/kg em associação com TMZ promoveu uma redução significativa

dos níveis de MPO, mostrando que a TMZ provavelmente apresentou efeitos anti-inflamatórios nesse

modelo;

- As concentrações dos aminoácidos neurotransmissores GABA e glutamato aumentaram

significativamente no hipocampo dos animais controle (PILO) e essas concentrações foram parcialmente

recuperadas nos animais pré-tratados com a associação TMZ+FEN.

78

8. CONCLUSÃO

A análise dos resultados apresentados neste trabalho nos permitiu concluir que a trimetazidina

apresentou efeitos neuroprotetores no modelo de convulsão induzida por pilocarpina, sendo necessários

mais estudos para elucidação dos mecanismos envolvidos nesta neuroproteção.

Os dados revelaram ainda um estudo inédito e que abre possibilidades para o aprofundamento de

novas pesquisas sobre o uso da trimetazidina como adjuvante no tratamento da epilepsia com efeito de

potencializar as ações do fenobarbital, que é um anticonvulsivante padrão, permitindo uma redução da

dose deste e com isso redução dos seus efeitos colaterais.

79

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABDEL-SALAM OME, EL-BATRAN S. Pharmacological investigation of trimetazidine in models of

inflammation, pain and gastric injury in rodents. Pharmacology v. 75, p. 122–32, 2005.

AGUIAR, L. M.; MACÊDO, D. S.; VASCONCELOS, S. M.; OLIVEIRA, A. A.; DE SOUSA, F. C.;

VIANA, G. S. CSC, an adenosine A(2A) receptor antagonist and MAO B inhibitor, reverses behavior,

monoamine neurotransmission, and amino acid alterations in the 6-OHDA-lesioned rats. Brain Res., v.

1191, p. 192-199, 2008.

ASTASHKIN EI, GLEZER MG, GRACHEV SV. Trimetazidine selectively inhibits SOC channels in

plasma membranes of human HL-60 cells and does not affect the intracellular Ca2+ stores. Dokl Biol

Sci v. 424, p. 86–9, 2009.

BADING N, HILMAR M. Nuclear calcium-activated gene expression: possible roles in neuronal

plasticity and epileptogenesis. Epilepsy Res v. 36, p. 225–31, 1999.

BARONE, P., PALMA, V., DEBARTOLOMEIS, A., TEDESCHI, E., MUSCETTOLA, G.,

CAMPANELLA, G. Dopamine D1 e D2 receptors mediate opposite functions in seizures induced by

lithium-pilocarpine. European Journal of Pharmacology, v. 195, p. 157-162, 1991.

BELARDINELLI, R. Trimetazidine and the contractile response of dysfunctional myocardium in

ischaemic cardiomyopathy. Rev Port Cardiol v. 19, p. 35–9, 2002.

BURNEO, J. G.; TELLEZ-ZENTENO, J. WIEBE, S. Understading the burden of epilepsy in Latin

America: a systematic review of its prevalence and incidence. Epilepsy Research, v. 66, p. 63-74, 2005.

BEN-ARI, Y., TREMBLAY, E., RICHE, D., GHILINI, G., NAQUET, R. Electrographic, clinical and

pathological alterations following systemic administration of kainic acid, bicuculdeoxyglucose or

pentylenetetrazole: metabolite mapping using the deoxyglucose method with special reference to the

pathology of epilepsy. Neuroscience, v. 6, p. 1361-1391, 1981.

80

BORELLI, E., BOZZI, Y. Dopamine D2 receptor signaling controls neuronal cell death induced by

muscarinic and glutamtergic drugs. Molecular and Cellular Neuroscience, v. 19, p. 263-271, 2002.

BRODIE, M.J., DICHTER, M.A. Antiepileptic drugs. N. Engl. J. Med, v.334, p. 168-175, 1996.

BUCKMASTER PS, HANEY MM. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse

model of temporal lobe epilepsy Epilepsy Research, v.102, p.153-159, 2012.

CAVALHEIRO, E.A., LEITE, J.P., BORTOLOTTO, Z.A., TURSKI, W.A., IKONOMIDOU, C.,

TURSKI, L. Long-term effects of pilocarpine in rats: structural damage of the brain triggers kindling

and spontaneous recurrent seizures. Epilepsia, v. 32, p. 778-782, 1991.

CAVALHEIRO, E.A., BELLÍSSIMO, M.I., NAFFAH-MAZZACORATTI, M.G. Profile of

prostaglandin levels in the rat hippocampus in pilocarpine model of epilepsy. Neurochemical, v. 27, n. 6,

p. 461-466, 1995.

CLIFFORD, D.B., OLNEY, J.W., MANIOTIS, A., COLLINS, R.C., ZORUMSKI, C.F. The functional

anatomy and pathology of lithium-pilocarpine and high-dose pilocarpine seizures. Neuroscience, v. 23,

p. 953-968, 1987.

COSTA-LOTUFO, L.V., FONTELES, M.M.F., LIMA, I.S.P., OLIVEIRA, A.A., NASCIMENTO, V.S.,

BRUIN, V.M.S., VIANA, G. S.B. Attenuating effects of melatonin on pilocarpine-induced seizures in

rats. Comparative Biochemistry and Physiology Part C, v. 131, p. 521-529, 2002.

CHANDER V, SINGH D, CHOPRA K. Attenuation of glycerol-induced acute renal failure in rats by

trimetazidine and deferoxamine. Pharmacology v. 67, p. 41–8, 2003.

CZAPINSKI, P., BLASZCZYK, B., CZUCZWAR, S.J. Mechanisms of action of antiepileptic drugs.

Curr. Top. Med. Chem. v. 5, p. 3-14, 2005.

81

DAYANITHI G, GILLES D, TRAVO C, CHABBERT C, SANS A. Trimetazidine modulates

AMPA/kainate receptors in rat vestibular ganglion neurons. Eur J Pharmacol v. 574, p. 8–14, 2007.

DeLORENZO, R..J., RAZA, M., PAL, S., RAFIQ, A. Long-term alteration of calcium homeostastic

mechanisms in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Brain Research, v. 903, p. 1-12, 2001.

DHOTE V, BALARAMAN R. Anti-oxidant activity mediated neuroprotective potential of trimetazidine

on focal cerebral ischaemia–reperfusion injury in rats. Clin Exp Pharmacol Physiol, v.35, p. 630–7,

2008.

ENGEL, J., PEDLEY, T.A. Epilepsy: A comprehenisve text-book. Lippincott-Raven, Philadelphia,

1997.

ENGEL, J.JR. ILAE COMMISSION REPORT. A proposed diagnostic scheme for people with epileptic

seizures and with epilepsy: report of the ILAE Task Force on Classification and Terminology. Epilepsia,

v. 42, n. 6, p. 796-80, 2001.

FERNANDES, M.J.S. Epilepsia do lobo temporal: mecanismos e perspectivas. Estud. av., São Paulo ,

v. 27, n. 77, 2013 .

FISHER, R. S. et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the international League

Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia, v.46, n.4, p.470-2,

2005.

FOLBERGROVÁ J, JEŠINA P, NŮSKOVÁ H, HOUŠTĚK J. Antioxidant enzymes in cerebral cortex

of immature rats following experimentally-induced seizures: upregulation of mitochondrial MnSOD

(SOD2) International Journal of Developmental Neuroscience, v. 31, p. 123-130, 2013.

GREEN, LC, TANNENBAUM, SR, GOLDMAN, P. Nitrate synthesis in the germfree and conventional

rat. Science, v. 212, p. 56-58, 1981.

82

GUPTA YK, MALHOTRA J. Antiepileptic drug therapy in the twenty first century. Indian J Physiol

Pharmacol v.4, p. 8–23, 2000.

GUPTA MC, GARG SK, DAS BP, BHARGAVA VK. Effect of nimodipine, a dihydropyridine calcium

channel antagonist on the pharmacokinetics of carbamazepine in rhesus monkey. Indian J Physiol

Pharmacol. v. 47, p. 347–51, 2003.

HIRTZ D, THURMAN DJ, GWINN-HARDY K, MOHAMED M, CHAUDHURI AR, ZALUTSKY R.

How common are the 'common' neurologic disorders? Neurology 68 (5): 326–37, 2007.

HONCHAR, M.P., VOGLER, G.P., GISH, B.G., SHERMAN, W.R. Evidence that phosphoinositide

metabolism in rat cerebral cortex stimulated by pilocarpine, physostigmine, and pargyline in vivo is not

changed by chronic lithium treatment. Journal Neurochemical, v. 55, p. 172-180, 1990.

HUONG, N. T., MATSUMOTO, K., KASAI, R., YAMASAKI, K., WATANABE, H. In vitro

antioxidant activity of vietnamese ginseng saponin and its components. Biol. Pharm. Bull, v. 21, p. 978-

981, 1998.

HUBBARD JA, HSU MS, FIACCO TA, BINDER, DK. Glial cell changes in epilepsy: Overview of the

clinical problem and therapeutic opportunities Neurochemistry International, In Press, Corrected Proof,

Available online 1 February 2013.

INCI I, DUTLY A, ROUSSON V, BOCHLER A, WEDER W. Trimetazidine protects the energy status

after ischemia and reduces reperfusion injury in a rat single lung transplant model. J Thorac Cardiovasc

Surg v. 122, p. 1155-61, 2001.

IQBAL S, BAZIANY A, HUSSAIN M, JAMES S, WRIGHT S, HEMMINGS S, et al. Trimetazidine as

a potential neuroprotection in transient global ischemia in gerbils: a behavioral and histological study.

Brain Res, v. 928, p. 1-7, 2002.

83

ISKESEN I, SARIBULBUL O, CERRAHOGLU M, VAR A, NAZIL Y, SIRIN H. Trimetazidine

reduces oxidative stress in cardiac surgery. Circ v. 70, p. 1169-73, J 2006.

JAIN, S.; BHARAL, N., MEDIRATTA, P. K., SHARMA, K. K. Trimetazidine exerts protection against

increasing current electroshock seizure test in mice. Seizure, v.19, p. 300-302, 2010.

KULKARNI, S.K., GEORGE, B. Lithium-pilocarpine neurotoxicity: a potential model of status

epilepticus. Meth Fin Exp.Clin Pharmacol., v. 17, n. 8, p. 551-567, 1995.

KULAK W, SOBANIEC W. Anticonvulsant effects of calcium antagonists in the experimental seizures

in the rat. Neurosci Jpn v. 19, p.107-12, 1993.

KUNZ, W.S., KUDIN, A.P., VIELHABER, S., BLUMEKE, J., ZESCHRATTER, W., SCHRAMM, J.,

BECK, H., ELGER, C.F. Mitochondrial complex I deficiency in the epileptic focus of patients with

temporal lobe epilepsy. Ann. Neurol., v. 48. p. 766-773, 2000.

KUTLUHAN S, NAZIROĞLU M, ÇELIK O, YILMAZ M. Effects of selenium and topiramate on

lipidperoxidation and antioxidant vitamin levels in blood of pentylentetrazol-induced epileptic rats. Biol

Trace Elem Res v. 129, p. 181-9, 2009.

KWAN, P., BRODIE, M.J. Early identification of refractory epilepsy. N. Engl. J. Med., v. 342, p. 314-

319, 2000.

LABANDEIRA-GARCIA, J.L., TOBIO, J.P., GUERRA, M.J. Comparison between normal developing

striatum and developing striatal grafts using drug-induced Fos expression and neuron-specific enolase

immunohistochemistry. Neuroscience, v. 60, n. 2, p. 399-415, 1994.

LEITE, J.P., BORTOLOTTO, Z.A., CAVALHEIRO, E.A. Spontaneous recurrent seizures in rats: an

experimental model of partial epilepsy. Neurosci. Biobehav. Rev., v. 14, p. 511-517, 1990.

84

LIBROWSKI T, KUBACKA M, MEUSEL M, SCOLARI S, MULLER CE, GUTSCHOW M.

Evaluation of anticonvulsant and analgesic effects of benzyl- and benzyhydryl ureides. Eur J Pharmacol

v. 559, p. 138-49, 2007.

LOWRY, O.H., ROSEBROUGH, N.J., FARR, A.L., RANDAL, R.J. Protein measurement with follin

phenol reagent. J. Biol. Chem., v. 193, p. 265-275, 1951.

LUSZCZKI JJ, TROJNAR MK, TROJNAR MP, TROJNAR ZK, SZOSTAKIEWICZ B,

ZADROZNIAK A, et al. Effects of three calcium channel antagonists (amlodipine, diltiazem and

verapamil) on the protective action of lamotrigine in the mouse maximal electroshock-induced seizure

model. Pharmacol Rep v. 59, p. 672-82, 2007.

MARINHO, M.M.F., SOUSA, F.C.F., BRUIN, V.M.S., AGUIAR, L.M.V., PINHO, R.S.N., VIANA,

G.S.B. Inhibitory action of a calcium channel blocker (nimodipine) on seizures and brain damage

induced by pilocarpine and lithium-pilocarpine in rats. Neuroscience Letters, v. 235, p. 13-16, 1997.

MARINHO, M.M.F., SOUSA, F.C.F., BRUIN, V.M.S., VALE, M.R., VIANA, G.S.B. Effects of

lithium, alone or associated with pilocarpine, on muscarinic and dopaminergic receptors and on

phosphoinositide metabolism in rat hippocampus and striatum. Neurochemisty International, v. 33, p.

299-306, 1998.

MELLO, L., BORTOLOTTO, Z.A., CAVALHEIRO, E.A. Modelos experimentais de epilepsia: uma

revisão. Neurobiol, v. 49, p.231-268, 1986.

MIRONOVAN OP, ZARUBINA IV, KRIVORUCHKO BJ, SMIRNOV AV. Antioxidant effects of

amtizol and trimetazidine in brain ischemia. Patol Fiziol Eksp Ter v. 7, p. 13–6, 2001.

MOREIRA, R. G. M. Epilepsia: concepção histórica, aspectos conceituais, diagnóstico e tratamento.

Mental, Barbacena, ano II, n.3, p.107-22, 2004.

85

MOSLEY RL, BENNER EJ, KADIU I, THOMAS M, BOSKA MD, HASAN K, LAURIE C,

GENDELMEN HE. Neuroinflamation, oxidative stress and pathogenesis os Parkinson’s disease. Clin

Neurosci Res. v.6, p. 291-311, 2006.

NAKAMURA, T., LIPTON, S. A. Cell death: protein misfolding and neurodegenerative diseases.

Apoptoses, v. 14, p. 455-468, 2009.

OLIVEIRA, A.A., NOGUEIRA, C.R.A., NASCIMENTO, V.S., AGUIAR, L.M.V., FREITAS, R.M.,

SOUSA, F.C.F., VIANA, G.S.B., FONTELES, M.M.F. Evaluation of levetiracetam effects on

pilocarpine-induced seizures: Cholinergic muscarinic system involvement. Neuroscience Letters, in

press, 2005.

OLIVEIRA, A. A. Novos aspectos da ação de drogas antiepilépticas: efeitos antioxidantes e modulação

dos sistemas colinérgico e dopaminérgico. Tese de Doutorado/UFC/Fortaleza-CE, 2010.

PAXINOS, G., WATSON, C. The rat brain in stereotaxie coordenates. Academic Press, New York,

1986.

QUEIROZ, C., LEITE, J., MELLO, L.E. Modelos experimentais em epilepsias. Cérebro e Mente, nº 04,

Web, Internet, disponível em http://www.comciencia.br, 2002.

QUINTANS-JÚNIOR, L.J., LIMA, J. T., ALMEIDA, J. R. G. S., BEDOR, C. N. G., JUNIOR, R. G. C.

S. Animal models evaluation employed anticonvulsant drugs: a review. Ver. Bras. Farm, v. 88, p. 163-

166, 2007.

RACINE, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II Motor seizure. Eletroenceph

Clin Neurophysiol, 32(3): 281-294, 1972.

RANG & DALE, Farmacologia . 7ª. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2011.

ROWLEY S, PATEL M. Mitochondrial involvement and oxidative stress in temporal lobe epilepsy Free

Radical Biology and Medicine, v. 62, p. 121-131, 2013.

86

SANDER JW. The epidemiology of epilepsy revisited. Curr Opin Neurol 16 (2): 165–70, 2003.

SCHOLL EA, DUDEK FE, EKSTRAND JJ. Neuronal degeneration is observed in multiple regions

outside the hippocampus after lithium pilocarpine-induced status epilepticus in the immature rat

Neuroscience, In Press, Uncorrected Proof, 2013.

SETTAF A, MORIN D, LAMCHOURI F, ELIMADI A, CHERRAH Y, TILLEMENT JP.

Trimetazidine ameliorates the hepatic injury associated with ischemia–reperfusion in rats. Pharmacol

Res. v. 39, p. 211-6, 1999.

SIES, H. Oxidative stress: introduction. In: Oxidative stress: oxidants and antioxidants. New York:

Academic Press, p. 15-22, 1991.

SHIN, E. J., KO, K. H., KIM, W. K., CHAE, J. S., YEN, T. P. H., KIM, H. J., et al. Role of

glutathione peroxidase in the ontogeny of hippocampal oxidative stress and kainate seizure sensitivity in

the genetically epilepsy prone rats. Neurochem Int v. 52, p. 1134-47, 2008.

SIMONIC, A., LAGINJA, J., VARLJEN, J., ZUPAN, G., ERAKOVIC, V. Lithium plus pilocarpine

induced status epilepticus – biochemical changes. Neuroscience Research, v. 36, p. 157-166, 2000.

SKAPER, S. D., ANCONA, B., FACCI, L., FRANCESCHINI, D., GIUST, P. Melatonin prevents the

delayed death of hippocampal neurons induced by enhanced excitatory neurotransmission and the

nitridergic pathway. FEBS J, v. 12, p. 725-31, 1998.

SMITH, M., WILCOX, K. S., WHITE, H. S. Discovery of antiepileptic drugs. Neurotherapeutics, v. 4,

p. 12-17, 2007.

TEJADA J, COSTA KM, BERTTI P, GARCIA-CAIRASCO N. The epilepsies: Complex challenges

needing complex solutions. Epilepsy & Behavior, v. 26, p. 212-228, 2013.

87

TETIK C, OZDEN A, CALLI N, BILGIHAN A, BOSTANCI B, YIS O, et al. Cytoprotective effect of

trimetazidine on 60 min of intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Transpl Int v. 12, p. 108-12,

1999.

TURSKI, W.A., CAVALHEIRO, E.A., SCHWARTZ, M., CZUCZWAR, S.J., KLEINROK, Z.,

TURSKI, L. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: a behavioural, electroencephalographic

and neuropathological study. Behav. Brain Res., v. 9, p. 315-335, 1983a.

TURSKI, W.A., CZUCZWAR, S.J., KLEINROK, Z., TURSKI, L. Cholinomimetics produce seizures

and brain damage in rats. Experientia, v. 39, p. 1408-1411, 1983b.

TURSKI, W.A., CAVALHEIRO, E.A., TURSKY, L., KLEINROK, Z. Intrahippocampal bethanechol in

rats: behavoural, electroencephalographic and neuropathological correlates. Behav. Brain Res., v. 7, p.

361-370, 1983c.

TURSKI, W.A., CAVALHEIRO, E.A., COIMBRA, C., BERZAGHI, M.P., IKONOMIDOU-TURSKI,

C.I., TURSKI, L. Only certain antiepileptic drugs prevent seizures induced by pilocarpine. Brain Res.

Reviews, v.12, p. 281-305, 1987.

TURSKI, L., IKONOMIDOU, C., TURSKI, W. A., BORTOLOTTO, Z. A., CAVALHEIRO, E. A.

Cholinergic mechanisms and epileptogenesis. The seizures induced by pilocarpine: a novel experimental

model of intractable epilepsy. Synapse, v. 3, p. 154-171, 1989.

VEZZANI A, FRIEDMAN A, DINGLEDINE RJ The role of inflammation in epileptogenesis

Neuropharmacology, v. 69, p. 16-24, 2013.

WALZ, R., MOREIRA, J.C.F., BENFATO, M.S., QUEVEDO, J., SCHORER, N., VIANNA, M.M.R.,

KLAMT, F., DAL-PIZZOL, F. Lipid peroxidation in hippocampus early and late after status epilepticus

induced by pilocarpina of kainic acid in Wistar rats. Neurosci. Lett., v. 291, p. 179-182, 2000.

88

WHITE, H. S. Clinical significance of animal seizure models and mechanism of action studies of

potential antiepileptic drugs. Epilepsia, v. 38, p. 9-17, 1997.

WOLFENSOHN S, HAWKINS P, LILLEY E, ANTHONY D, CHAMBERS C, LANE S, LAWTON

M, ROBINSON S, VOIPIO HM, WOODHALL G. Reducing suffering in animal models and procedures

involving seizures, convulsions and epilepsy Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, v.

67, p. 9-15, 2013.

THALES FONTENELE MORAES PINHEIRO€¦ · A epilepsia é uma doença neurológica que afeta...

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