Carne in vitro

Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

Trabalho Interdisciplinar Orientado III (TIO-III)

Unesp-Araraquara | Setembro-2014

Nas apresentações anteriores...

(TIO-I e II)

Relevância de Demanda

Relevância Ambiental

Relevância Ambiental

(http://calmariatempestade.wordpress.com/2012/06/22/carne-de-laboratorio/)

Relevância Social

Etapas de Produção - Simplificado

Etapas de Produção - Diferenciação II

Tecido Muscular - Tipos

Miogênese

Tipos Celulares

• Células Tronco Embrionárias:– Vantagens:

• Em teoria, tem potencial ilimitado de proliferação; (esse potencial poderia ser limitado por mutações genéticas a longo prazo)

– Desvantagens:• Processo de diferenciação muito longo e complexo;

• Células Satélites:– Vantagens:

• Tem maior tendência à proliferação;

– Desvantagens:• Adicionam uma fase de diferenciação a mais no processo;• São escassas no tecido muscular;

• Mioblastos:– Vantagens:

• Já são diferenciadas;• São abundantes;

– Desvantagens:• Necessitam de engenharia genética para formarem colônias imortalizadas;• Proliferam-se mais lentamente;

Mecanismos de Regulação Gênica em Eucariotos

http://genmol.blogspot.com.br/2011/09/genetica-molecular-sinopse-do-controle.html

Diferenciação do Tecido MuscularIn Vitro

• Necessidade de Estímulos Químicos:– Proteínas reguladoras;

– Fatores de crescimento;

– Nutrientes e oxigênio;

• Necessidade de Estímulos Físicos:– Ancoramento das células;

– Alinhamento correto para a fusão dos Mioblastos;

– Contração das células para a formação dos Sarcômeros;

Meio de Cultura

Telas de Fixação

Meio de Cultura

• Deve conter:

– Nutrientes;

– Hormônios e proteínas de regulação gênica;

– Fator de crescimento;

– Carregadores de oxigênio;

• Desafio:

– Custo viável;

Fator de Crescimento

• Substâncias que controlam o ciclo celular (transição da fase G0 para G1);

• Soro fetal bovino => Implicações éticas inviabilizam o uso em escala

• Meios comerciais livres de soro (Ultroger G) => Caro

• Meios alternativos (extrato de cogumelo) => Necessita de mais pesquisas

Transportadores de Oxigênio

• Atuariam no lugar do sangue para manter concentrações adequadas no meio;

• Opções:

– Versões modificadas de hemoglobina (produzidas a partir de plantas e micro-organismos geneticamente alterados);

– Versões químicas inertes (produzidas artificialmente);

Suporte de Fixação

• Promove a ancoragem da célula;

• Deve possuir uma textura adequada para promover o alinhamento dos mioblastos;

• Poderia ser:– Comestível:

• Dispensa etapa de remoção do tecido;

• Pode incorporar qualidades ao produto;

• Biopolímeros: colágeno, alginato, quitosana etc

– Não comestível:• Etapa adicional de remoção das células

(biodegradação);

Mecanismos de Contração

• Necessários para a diferenciação celular;

• Poderiam ser:– Mecânicos;– Químicos (um material que contraísse com variações no

PH e Temperatura);– Elétricos (choques no tecido);

• Estudos sugerem que estímulos elétricos são a melhor opção, não sendo difíceis de reproduzir em escala industrial;

Espessamento do Tecido – Sistema Vascular Artificial

• Células começam a morrer por falta de nutrientes quando o tecido atinge de 2 a 3 mm de espessura;

• Para superar esse problema, é necessária a criação de um sistema vascular artificial (a partir de colágeno);

• Esse sistema foi possível por meio de processos de microfabricação, difíceis de reproduzir em escala industrial;

No TIO III...

Objetivos

• Geral: Estabelecer técnicas que possam contribuir com a viabilidade de produção de Carne In Vitro em escala laboratorial e comercial.

• Específicos:1) Estudar o efeito de diferentes composições de meios de

cultura na diferenciação e proliferação dos mioblastos, de modo a contribuir com o desenvolvimento de um meio economicamente viável para produção em escala;

2) Estabelecer protocolos básicos no cultivo de células animais, tais como composição e preparação do meio de cultura, avaliação e contagem de células, análise e separação de subprodutos metabólicos, etc;

Metodologia

1º - Isolamento das CS

• Biópsia do tecido muscular;

• Banho enzimático de colagenase tipo II, tripsina e DNAse, diluídas em meio de cultura DMEM pré-aquecido a 37 °C;

• CS encubadas em meio de cultura DMEM, a 37°C e 5% de CO;

2º - Caracterização das Células Satélites e Mioblastos

• Marcadores proteicos:– 14 proteínas características expressas na CS:

• MyoD, Myf-5, MNF, c-Met, M-cadherin, Pax7, Miogenina, PCNA, Ki-67, Sox-8, CD-34, c-sky, p-27kip, V-rsc

– Cada proteína está caracterizada de modo a permitir, além de identificar as CS, reconhecer processos metabólicos específicos de cada fase do ciclo celular• Exemplo:

p-27kip - Há uma relação inversa entre a capacidade proliferativa da CS e a abundancia da proteína pk27kip, podendo estar envolvida no crescimento e na hipertrofia muscular.

2º - Caracterização das Células Satélites e Mioblastos

• A sequencia de aminoácidos, tamanho da cadeia, peso molecular e outras informações sobre cada proteína pode ser obtida no site da “RCSB ProteinData Bank” (http://www.rcsb.org/)

2º - Caracterização das Células Satélites e Mioblastos

• Para identificar os marcadores proteicos na cultura celular => Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)

2º - Caracterização das Células Satélites e Mioblastos

• Para garantir que a banda é realmente da proteína de interesse => Western blotting seguido por sondagem com anti-corpos marcados.

3° - Proliferação da Cultura Primária

• Encubação a 37°C;• Alta concentração de fatores de crescimento;• Controle de pH:

– O controle é feito por indicador no meio de cultura, de coloração vermelha em pH neutro e laranja ~ amarelo em pH ácido;

• Controle da pressão osmótica:– Atmosfera de CO2 e umidade– Diminui o stress das células, diminuindo a evaporação do meio

de cultura

• Troca parcial periódica do meio de cultura:– Diminuir a concentração de metabólitos (ácido lácteo e

amônia);– Reposição de nutrientes;

Determinação da Concentração de Glicose

• Método de Bergmeyer e Bernt (1974):

– A primeira reação é catalisada pela glucose-oxidase (GOD) e a segunda por peroxidase (POD).

– O o-dianisidina atua como corante, e é reduzido por peróxido de hidrogénio a um produto que tem uma cor-de-rosa na presença de ácido sulfúrico (reação 3) e é medido colorimetricamente a 540 nm.

I) D-glicose + H2O + O2 -> Ácido D-glucónico + H2O2

II) H2O2 + o-dianisidina reduzida -> 2H2O + o-dianisidina oxidada (castanho)

III) o-dianisidina oxidada (castanho) + H2SO4 + -> o-dianisidina oxidada (rosa)

YSI Industrial Analyzer

• Análise automatizada de várias alíquotas em simultâneo;

• Permite quantificação de glicose, ácido lácteo, amido, glicina etc;

• Baseado em métodos amperimétricos

Contagem das células

• Hemocitômetro ou contador de partículas eletrônico;

• Fases de crescimento da cultura:

4° - Proliferação em escala

• Biorreator adequado para cultura de células animais:– Controle automatizado dos parâmetros;

– Sistema de aeração que não cause o cisalhamento das células;

• Microcarreadores para células dependentes de ancoragem:– Microesferas de colágeno;

• Fator limitante do tamanho do biorreator:– Baixa capacidade de diluição de O2 no meio de cultura;

Cisalhamento em Biorreatores com Aeração Direta

5° - Diferenciação do Tecido Muscular

• As células são semeadas nos suportes;

• Dois grupos de ensaios:– Suportes de Colágeno;

– Suportes de Alginato;

• Os suportes vão para um biorreator especialmente concebido para este fim;

• A concentração dos fatores de crescimento é diminuída no meio, o que desencadeia o processo de diferenciação;

Biorreator para a Diferenciação

Biorreator de Fibra Oca Adaptado

• Objetivo: maximizar a produção contornando as limitações de oxigenação e fornecimento de nutrientes, que limitam o desenvolvimento máximo do tecido à espessura de 2~3 mm.

Biorreator de Fibra Oca Adaptado

• Dois meios de cultura:

– Extracapilar: moléculas grandes;

– Intracapilar: moléculas pequenas e alta concentração de O2; fluxo mais intenso;

• Os capilares seriam confeccionados com o biomaterial comestível do suporte;

– Ensaios para avaliar a capacidade dessa confecção (plasticidade, elasticidade, permeabilidade, afinidade com as células etc)

Perspectivas do TIO

• Conhecer melhor cada etapa do processo de produção da carne in vitro, e os conceitos práticos e teóricos relacionados;

• Contribuir de alguma forma para o desenvolvimento de novas tecnologias;

O trabalho que será desenvolvido nos próximos 5 semestres em TIO é de natureza teórica, mas sempre

visado uma aplicabilidade prática.

Referências Bibliográficas• BHAT et all, “Prospects for In Vitro Cultured Meat – A Future Harvest”, Principles of Tissue Engineering (cap. 79), 4ª ed, 2014.

• POST et all, “Principles of Tissue Engenering for Food”, Principles of Tissue Engineering (cap. 78), 4ª ed, 2014.

• BUTLER, Michael. Animal Cell Culture and Technology, 2ª ed, 2004;

• FOSCHINI et all. “Células Satélites Musculares”, Arq Bras Oftalmol. 2004; 67(4):681-7;

• SANTIAGO et all, “Performance of a vortex flow bioreactor for cultivation of CHO-K1 cells on microcarriers”, Process Biochemistry vol. 46, Jan/2011

• DRURY et all. “Mooney Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications Biomaterials”, 24 (2003), pp. 4337–4351;

• ALBERTS et all. “Biologia Molecular da Célula”, 5ª edição, 2008;

• DATAR et all. “Possibilities for an in vitro meat production system”, IFSET – Innovative Food Science and Emerging Tecnologies, n° 11, 2010;

• POST et all. “Cultured meat from stem cells: Challenges and prospects” , Meat Science, n° 92, 2012;

• TAVARES, Adriana Alexandre dos Santos. “Análise dos Efeitos Terapêuticos dos Electrões de Auger em Culturas de Células”, Tese de Mestrado em Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, Julho de 2008;

• “Inside the Meat Lab”, Revista Scientific American, n° 108, Junho de 2011;

Grupo

• Caio Ricardo

• Camile Pedrosa

• Euclides Formica

• Larissa Gomes

• Lucas Nakamura

• Lucas Zamian

• Lucas Henares

• Murilo Oliveira

Unesp Araraquara

Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

3° Semestre - 2014