Relatório final

Título do projeto: Látex do Avelós (Euphorbia tirucalli) e da Janaúba

(Himathanthus drasticus) modificam a expressão de proteínas

intracelulares nas células de Carcinoma Pulmonar de Lewis in vitro

Aluno (a): Ketsia Oliveira Sousa

Orientador: Profa. Dra. Elaine Conceição de Oliveira

Coordenadoria de Sistemas Biomédicos

ABRIL/2018

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Sumário

Resumo 04

1. Introdução e Justificativa 05

2. Revisão bibliográfica

2.1 Câncer 07

2.2 Princípios ativos de plantas 11

2.3 Avelós (Euphorbia tirucalli) 13

2.4 Janaúba (Himatanthus drasticus) 15

3. Objetivo

3.1 Objetivos gerais 17

3.2 Objetivos específicos 17

4. Materiais e métodos

4.1 Extração do látex 18

4.2 Preparo de diferentes concentrações de avelós e janaúba para os

ensaios in vitro 18

4.3 Linhagem tumoral 20

4.4 Cultivo celular 20

4.5 Contagem das células 21

4.6 Ensaio in vitro e tratamento com os princípios ativos 21

4.7 Ensaio de viabilidade celular pelo método de MTT 24

4.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS- PAGE 25

4.9 Western Bloting 28

4.9.1 Bloqueio 29

4.9.2 Bloting com anticorpos específicos 30

4.9.3 Striping da membrana de nitrocelulose 31

5. Resultados e discussão

5.1 Aspectos morfológicos das células 3LL após tratamento com o

avelós e a janaúba in vitro 33

3

5.2 Avaliação da citotoxicidade das 3LL tratadas com janaúba e avelós

pelo teste do MT 37

5.3 Diminuição na síntese de proteínas pelas 3LL tratadas com avelós e

janaúba: avaliação do gel de poliacrilamida 41

5.4 Tratamento das células 3LL com avelós e janaúba diminui a

expressão de proteínas intracelulares 43

6. Discussão 46

7. Conclusões 52

8. Referências 53

9. Outras atividades 58

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Resumo

Atualmente diversas pesquisas têm sido conduzidas com o objetivo de

demonstrar o potencial medicinal de muitas plantas nativas ou não da flora

brasileira. O Avelós e a Janaúba são conhecidas popularmente como o leite

que cura o câncer. Pacientes relatam que a diluição do látex obtido do caule ou

das folhas destas plantas pode curar diversos tipos de câncer como o de

mama, estômago, de pele, entre outros. Porém, pouco ainda se conhece sobre

os seus efeitos sobre culturas celulares in vitro. O objetivo deste estudo foi

verificar o efeito destes látex diluídos em água sobre a linhagem de carcinoma

pulmonar de Lewis (3LL). As soluções foram preparadas de acordo com o

relato de pacientes que fizeram ou fazem uso dos látex para o tratamento de

diferentes tipos de tumores. As células 3LL foram cultivadas em RPMI 1640

suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de antibiótico, 1% de

glutamina, 1% de aminoácido mínimo essencial (MEM) e 0,5% de piruvato.

Após a adesão das células as mesmas foram tratadas com as soluções de

avelós e de janaúba em diferentes concentrações e avaliadas após 24h (1

dose), 48h (2 doses) e 72h (3 doses). A viabilidade celular foi avaliada pelo

método de MTT e a expressão de proteínas intracelulares por western blot. Os

resultados obtidos demonstraram que diferentes diluições do látex de avelós e

janaúba diminuem a viabilidade das células 3LL in vitro, além de modificar a

expressão das proteínas de sinalização intracelulares como AKT, mTOR, ERK

1/2 e S6 quinase. Proteínas estas envolvidas em rotas metabólicas que

envolvem processos de sobrevivência, crescimento, proliferação e apoptose

nas células tumorais. Os efeitos estão relacionados ao tempo de tratamento e o

número de doses empregadas. Outro dado importante é que verificou-se que

algumas concentrações de janaúba (50 e 25%) estimulam o crescimento e a

proliferação das 3LL in vitro, o que trás um alerta de qual a concentração

correta a se utilizar.

Palavras-chave: Avelós, Janaúba, Câncer, Sinalização intracelular

5

1. Introdução e Justificativa

O território brasileiro tem uma das mais ricas biodiversidades do planeta,

com milhares de espécies presentes em toda a sua fauna e flora com

possibilidade da utilização dessas plantas não só como alimento, mas também

como fonte terapêutica. Estudos recentes demonstram que diferentes tipos de

plantas medicinais estão sendo usadas no tratamento de diversas patologias

como o diabetes, doenças cardiovasculares, doenças do fígado e do sistema

nervoso como o mal de Alzheimer (GIOVANNINI et al., 2016; SCHNEIDER et

al., 2016; KAUFMANN et al., 2016). Mas em muitos casos, estas são utilizadas

de forma errada, podendo ocasionar maiores riscos do que benefícios à saúde

(BEZERRA, et al., 2014).

O processo que transforma a planta medicinal em medicamento sempre

passa pela droga vegetal e seu preparo, que na fitoterapia moderna

normalmente é o extrato (SANTOS e FONSECAS, 2012). Os extratos devem

ser testados para qualificar a ação dos seus ativos, para um possível uso no

tratamento de doenças. Este deve representar as características particulares

da planta medicinal no que se refere a sua composição química e estrutural.

A sabedoria popular atribui a cura de diversas doenças ao uso das plantas

medicinais, a utilização de chás, unguentos e soluções são os mais citados. No

entanto, a literatura ainda é carente de dados científicos que comprovem a sua

eficácia terapêutica, a dose ideal de aplicação, bem como os seus efeitos

citotóxicos (FARIA, et al., 2013). Atualmente diversas pesquisas têm sido

conduzidas com o objetivo de demonstrar o potencial medicinal de muitas

plantas, porém devido a nossa grande biodiversidade a utilização de muitas

delas está ligada as raízes culturais de um determinado povo ou região. Muitas

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destas plantas são tóxicas, mas os efeitos colaterais na maioria das vezes não

são relacionados com os sintomas apresentados pelo paciente, principalmente

pelo seu uso não ser revelado ao profissional de saúde.

A exemplo disso temos o Avelós (Euphorbia tirucalli) e a Janaúba

(Himatanthus drasticus), estas duas plantas são conhecidas popularmente

como o leite que cura o câncer. Pacientes relatam que a diluição do látex

obtido do caule ou das folhas destas plantas podem curar diversos tipos de

câncer como o de mama, estômago, de pele, entre outros. Em uma pesquisa

na internet (google e youtube), foi possível constatar um número grande de

indivíduos que atribuem a sua cura a ingestão do leite de uma destas plantas

diluído em água, porém cada um apresenta um protocolo diferente do outro

principalmente relacionado ao número de gotas ou a frequência diária de

ingestão. Entre os problemas mais comuns enfrentados por estes indivíduos

durante o “tratamento” estão os problemas gástricos e a toxicidade devido ao

uso prolongado. Dado o número de pessoas que relatam terem sido curadas

por uma destas plantas, não se descarta seus possíveis efeitos antitumorais,

no entanto ainda não há evidências científicas que comprove esta eficácia ou

mesmo para que tipo de neoplasia se aplique.

Recentemente (maio de 2016) conseguimos implantar o laboratório de

cultura de células financiado pela FAPESP (Processo 2009/18512-2) na

FATEC- Sorocaba. Desta forma pudemos dar início as pesquisas na unidade

com o envolvimento de alunos de graduação e também com ex-alunos que

estão desenvolvendo trabalhos de mestrado ou doutorado. Iniciamos a linha de

pesquisa em Imunologia de Tumores estudando os efeitos dos nanotubos de

carbono sobre a resposta imune antitumoral. Atualmente estamos testando

7

ativos extraídos de plantas como um potencial fitoterápico para o tratamento de

tumores e feridas.

A formulação desta pergunta está baseada nos relatos sobre o avelós e a

janaúba no tratamento de tumores. As principais características destas plantas

demonstram que as mesmas já são utilizadas por boa parte da população,

onde os benefícios são relatados, mas não se conhece a dose ou a frequência

destes tratamentos, e muito pouco dos efeitos sobre a saúde. Dois trabalhos

serão realizados neste mesmo modelo, que serão estudos in vitro e in vivo

utilizando o carcinoma pulmonar de Lewis (3LL) tratados com o leite destas

plantas. A resposta imune antitumoral frente a este tratamento será tema do

Trabalho de Graduação da aluna Heloísa Sales do curso de Sistemas

Biomédicos, enquanto que o metabolismo destes mesmos animais será

avaliado neste estudo. Estes dados nos permitirão entender melhor os efeitos

deste tratamento sobre o metabolismo energético de células in vitro e de

animais com câncer.

2. Revisão bibliográfica

2.1 Câncer

O câncer é uma patologia com crescimento e proliferação desordenada de

células anormais, desenvolvida a partir de uma alteração genética, gerando

como produto final uma massa de tecido anormal ou mais conhecida como

tumor (ZITVOGEL, et al., 2006; BLAYLOCK, 2015; ONUCHIC, et al., 2010).

O câncer pode surgir por fatores genéticos, idade ou fatores de risco

externo e hábitos de vida (INCA, 2018; PRADO, 2014), porém, o

desenvolvimento do câncer é totalmente baseado na pré-disposição que o

8

corpo tem para desenvolver a patologia. Fatores externos como o tabagismo,

álcool, dieta, infecções, obesidade ou sedentarismo, agente químicos, luz

ultravioleta e radiação, são os fatores externos mais envolvidos que possam

levar a mutações ou alterações dos genes das células (PRADO, 2014; INCA,

2018;). Segundo Prado (2014), as células cancerígenas podem se originar de

duas formas, pelo descontrole sobre a divisão celular, onde ocorre a perda da

capacidade de responder aos controles de fatores de crescimento e hormônios,

e a capacidade das células cancerígenas invadirem tecidos vizinhos por

mecanismos de metástase. As metástases se originam de tumores primários,

onde células tumorais conseguem se desprender abrindo caminho pela

circulação linfática em direção aos vasos sanguíneos, através da circulação

estas células conseguem invadir novos tecidos por meio de expressão de

proteínas que permite a interação entre a célula e o tecido, secretando sinais

químicos que provocam o crescimento de vasos sanguíneos para aquele local,

assim, a célula cancerígena consegue os nutrientes para a manutenção da sua

vida e proliferação (KENNECKE et al., 2010; SLEEBOOM et al., 2018).

Estudos mostram que todo este processo é orquestrado pelo

desenvolvimento da massa tumoral conhecido como microambiente tumoral

(MT). O MT tem propriedades que o diferem dos tecidos normais, modificando

até mesmo o metabolismo para propiciar seu desenvolvimento (WEIS, et al.,

2011). Características como pH ácido, regiões de hipóxia e homeostase

diferente aos tecidos normais, são encontradas no MT.

Lopes et al., (2013) classifica sete principais alterações que ocorrem numa

célula tumoral: autossuficiência aos sinais de proliferação, insensibilidade a

sinais antiproliferativos, evasão a morte celular programada, capacidade

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replicativa ilimitada, angiogênese sustentada e invasão tecidual, metástase e

alteração do metabolismo celular. As células tumorais também são capazes de

produzir energia tanto na presença quanto na ausência de oxigênio (GATENBY

e GILLIES, 2004; ALFAROUK, et al., 2004).

O câncer de pulmão é um câncer com maior índice de mortalidade e

está envolvido com o fator externo do tabagismo (LOPES, 2013). O câncer de

pulmão é um tumor maligno com maior taxa de desenvolvimento em homens

seguido das mulheres que vem aumentando o numero de ocorrências nos

últimos anos. Esta patologia mata pouco mais de 1 milhão de pessoas no

mundo, pois a maior taxa do diagnostico ocorre quando o câncer está em fases

avançadas, diminuindo os tratamentos possíveis para o combate do mesmo

(LOPES, 2013; NOVAES et al., 2008).

A grande maioria dos cânceres pode ter cura se forem diagnosticados em

seu primeiro estágio, o diagnóstico precoce aumenta as chances de o

tratamento ter uma maior efetividade sobre as massas tumorais. Há muitas

técnicas e exames utilizados hoje em dia para diagnosticar o câncer, entre elas

estão às biópsias, radiografias, mamografia, exame de próstata, Papanicolau,

punções para retirada de células de órgãos suspeitos entre outras técnicas

(PRADO, 2014). Após o diagnóstico, alguns tratamentos são indicados como a

cirurgia, radioterapia e quimioterapia, para o tratamento da maioria dos tipos de

câncer estas modalidades podem ser combinadas. A cirurgia consiste na

remoção da massa tumoral e em áreas ao redor atingidas pelo câncer, a

radioterapia são aplicações de doses de radiação para destruir células

cancerígenas, enquanto que a quimioterapia se utiliza de substâncias químicas

capazes de matar ou impedir o crescimento do tumor (KERSUL, 2014;

10

PRADO, 2014). Além das terapias tradicionais, há ainda os tratamentos

empregados para cada tipo de câncer, tais tratamentos consistem em

imunoterapia, onde anticorpos específicos contra um determinado receptor são

infundidos por via intravenosa, drogas injetáveis ou comprimidos que

estimulam o próprio sistema imune a combater a doença. A hormonioterapia é

outro recurso utilizado para conter o desenvolvimento tumoral, este tipo de

terapia tem a função de bloquear a ação de hormônios que ajudam as células

cancerígenas se expandirem, a exemplo disso temos o câncer de mama e o de

próstata (SANTANA et al., 2015). Os tratamentos podem ser ministrados

individualmente ou por combinação entre estes e sua utilidade deve ser

orientado por um médico oncologista. Apesar de estes tratamentos terem

grande valor terapêutico, a maioria deles causam efeitos colaterais como o

cansaço, perda de apetite, dores, queda de cabelo, náuseas, inchaço,

debilidade e possíveis sangramentos. Além dos tratamentos convencionais, há

os tratamentos difundidos pela medicina popular, que fazem uso de plantas

medicinais sem comprovações científicas, baseando-se apenas nos

conhecimentos adquiridos muitas vezes por raizeiros, esta prática é bem

empregada no norte e nordeste do Brasil.

O emprego de plantas medicinais para o tratamento de doenças vem

desde os primórdios da humanidade até evoluir para a fabricação industrial de

medicamentos. Para muitos povos a recuperação da saúde estava na

manipulação de diferentes plantas e em preparações caseiras como chás,

garrafadas, tinturas e pós que tinham propriedades benéficas para o

organismo, resultando em melhora na saúde. Porém, com o tempo muitas

substâncias foram isoladas destas plantas e foram transformadas em

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comprimidos, gotas, pomadas ou cápsulas pela indústria farmacêutica e são

denominados produtos fitoterápicos. O segredo desta tecnologia é conseguir

identificar e isolar uma substância ou um conjunto delas que tenha uma

determinada atividade biológica, esta denominada princípio ativo (OLIVEIRA E

LEHN, 2015).

A Organização Mundial da Saúde (OMS) tem estimulado pesquisas e

levantamentos de plantas utilizadas na medicina popular, objetivando sua

identificação botânica, comprovação de sua eficácia como medicamento,

estimular o uso daquelas que tiverem sua eficácia e segurança comprovadas, e

por fim, desaconselhar práticas da medicina popular que se mostrem inúteis ou

prejudiciais para a saúde (MACHADO, et al., 2014). Apesar disso, a prática do

uso de plantas para curar doenças ainda acontece de forma indiscriminada,

principalmente quando se tratam de doenças graves como o diabetes, doenças

autoimunes, degenerativas e o câncer.

2.2 Princípios ativos de plantas

Desde os primórdios da humanidade as plantas desenvolvem papel

fundamental e funcional na vida dos seres humanos. O conhecimento

envolvendo o uso de plantas como medicamento, vem principalmente da

cultura popular, mas o entendimento dos princípios ativos contidos nestas

plantas veio através de estudos da farmacologia.

Os pesquisadores se utilizam do conhecimento popular referente às

plantas em busca de novas respostas, ou até mesmo confirmações quanto a

sua eficácia terapêutica (COSTA, 2011, SANTOS et al., 2011). Esta prática

permitiu por parte da indústria farmacêutica o descobrimento de um vasto

12

número de moléculas potencialmente ativas extraídas de milhares de plantas

diferentes com capacidade para tratar doenças. Para extrair e caracterizar os

princípios ativos de uma planta e para definir seus compostos terapêuticos é

necessário um trabalho multidisciplinar, realizado muitas vezes por

farmacêuticos, químicos e botânicos, que se baseiam no conhecimento popular

(FILHO e YUNES et al. 1998; COSTA, 2011).

O Brasil possui 22% de toda a biodiversidade vegetal do planeta, porém

a maioria dela é pouco conhecida no meio científico. Neste sentido, há um

grande interesse em encontrar nas plantas, moléculas biologicamente ativas

que darão origem a novos fármacos para o tratamento de doenças como o

diabetes, cardiopatias e os diferentes tipos de câncer (ARAÚJO, et al., 2014).

No entanto, milhares de plantas são consumidas pela população baseado em

dados empíricos ou por serem consideradas pelos mesmos como um potente

medicamento fitoterápico capaz de curá-lo de qualquer mal, e são utilizadas de

maneiras distintas por diferentes povos.

A fitoterapia é uma modalidade que está presente na medicina popular,

onde diversas partes de uma planta (raiz, caule e folhas) são utilizadas na

preparação de chás, unguentos e pomadas. Estima-se que uma grande parcela

da população (acima de 70%) faz ou já fez uso de alguma planta com fins

terapêuticos, porém o maior problema disso está na falta de conhecimento

sobre os efeitos da maioria das plantas no organismo. Diversas reações como

alergia, toxicidade, problemas gastrointestinais e cefaleias já foram

relacionadas ao uso de muitas plantas como medicamento, na maioria das

vezes o paciente não acredita nesta possibilidade por ser um produto “natural”.

Outro agravante se dá pela descrença do paciente nos tratamentos usuais,

13

principalmente para as doenças mais graves e crônicas, fazendo com que o

mesmo assuma a responsabilidade pelo o seu processo de cura passando a

utilizar algumas plantas milagrosas.

Este fato vem de encontro ao que temos levantado quanto aos pacientes

com câncer, um grande número de indivíduos tem revelado que utilizam ou já

utilizaram o leite que cura o câncer, extraído do Avelós ou Janaúba. A maioria

faz uso baseado no relato de outro paciente que se “diz” curado com o

tratamento. O avelós apresenta dados na literatura de possíveis efeitos

antiproliferativos em alguns tipos de células tumorais (DUTRA, et al., 2012;

MACHADO,et al., 2016), mas sobre a janaúba pouco foi estudado.

2.3 Avelós (Euphorbia tirucalli)

O avelós é uma planta, mais especificamente um vegetal da família

Euphorbiaceae que tem sido bastante estudada atualmente (DUTRA, et al.,

2012; MACHADO, et al., 2016). Uma planta de extrema beleza exótica e cor

verde vibrante (figura 1), de origem africana que habita em regiões quentes. O

seu tronco se distribui formando cilindros que caracterizam o arbusto formado

pelo todo, com altura de 7 a 8 metros, podendo apresentar raramente floração

(ALVES e NEPOMUCENO 2012; COSTA, 2011). A explicação de sua

disseminação geográfica se da pela mestria que a planta tem de se aclimatizar.

No Brasil, pelo o Nordeste ser uma região mais quente e tropical a chance de

se encontrar o avelós é ainda maior (WACZUK, 2014).

14

Figura 1- Avelós

Fonte: Sousa, KO. Foto tirada na Mandala da UNICAMP (2017).

O avelós é conhecido por muitos nomes populares, tais esses que às vezes

trás consigo o motivo da nomenclatura, como por exemplo, cega olho e coral-

verde (WACZUK, 2014). Outros nomes peculiares também são citados na

literatura como: dedo do diabo, espinho-de-judeu, arvore-de-são-sebastião,

entre muitos outros.

A planta possui um látex considerado cáustico e tóxico, mesmo assim se

faz uso indiscriminadamente para o tratamento de diversos tipos de doenças

envolvendo grandes quantidades por um longo período. Isto chamou a atenção

de cientistas que começaram a pesquisar ativos presentes no extrato alcoólico

do avelós, estes demonstraram ação antiviral e antiproliferativa. Neodini et al

(2015) mostrou que o extrato apresentou efeito sobre microambiente tumoral,

diminuindo a taxa de crescimento tumoral. Estes mesmos autores também

mostraram que em baixas concentrações o avelós possui efeito preventivo de

mutações.

15

2.4Janaúba (Himatanthus drasticus)

A família Apocynaceae abrange mais de centenas de gêneros e espécies,

disseminada em regiões tropicais e subtropicais (SOUSA, 2009; FRANÇA et

al., 2011; LINHARES e PINHEIRO, 2013). Dentre a família existe um gênero

cujo nome científico é Himatanthus da espécie drasticus, está planta apresenta

distribuição em estados brasileiros como Alagoas, Bahia, Ceará, Maranhão,

Minas gerais, Pará, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio Grande do Norte,

Roraima e Sergipe (AMARO, et al., 2006; SOUSA, 2009).

O H. drasticusobtém nomes populares que modificam a partir da região,

entre os nomes a Janaúba. A janaúba (figura 2) possui folhagem de tom verde

escura carregada nas extremidades de seus galhos, onde é extraído um látex

de cor branca com grandes propriedades terapêuticas segundo o

conhecimento popular (SOUSA, 2009).

Figura 2- Himatanthus drausticus

Fonte: Sousa, KO. Foto tirada na Mandala da UNICAMP (2017).

O látex que a janaúba dispõem é muito utilizada na medicina popular,

principalmente em regiões do nordeste. A comercialização do látex da janaúba

16

vira renda para feirantes e moradores destas regiões. Segundo Linhares e

Pinheiro (2013), o látex pode incluir vários tratamentos entre eles inflamações

uterinas, gastrites, uso veterinário, uso em emplastos, como fortificante e

complemento alimentar, acondicionando o tratamento do câncer. O látex é

conhecido popularmente como “o leite de janaguba” (Sousa, 2009) ou “leite de

janaúba” (Linhares e Pinheiro 2013). O nordeste apresenta uma longa atividade

na cura do câncer pelo látex desta planta, porém sem nenhuma confirmação

teórica na literatura (AMARO,et al., 2006; SOUSA, 2009). Segundo Macêdo et

al (2015) além de indicações terapêuticas para gastrite, úlceras, varizes, feridas

no estômago a planta pode ser usada no tratamento de neoplasias. Amaro et

al (2006), enfatiza um ponto muito importante onde expõem que é explorado o

uso da planta indiscriminadamente e cotidianamente.

A hipótese deste trabalho se baseia na prática popular de utilizar estas duas

plantas, o avelós e a janaúba, como tratamento para o câncer. Os pacientes

diluem o látex em água mineral e tomam diariamente com a promessa de curar

o seu câncer, sem saber se esta “eficácia” se aplica para aquele tipo de

neoplasia, se tem efeitos tóxicos para células saudáveis ou mesmo se vai

estimular a progressão tumoral e não suprimi-la.

17

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivos gerais

Avaliar os efeitos do Avelós (EuphorbiaTirucali) e da Janaúba

(HimatanthusDrasticus) sobre as células do carcinoma pulmonar de Lewis

(3LL).

3.2 Objetivos específicos

- Avaliar in vitro a viabilidade celular através da quantificação da atividade da

LDH extravasada para o meio de cultura e pelo ensaio de MTT;

- Analisar a morfologia das células da linhagem 3LL por técnicas de

microscopia;

- Verificar a quantidade de expressão de proteínas intracelulares;

- Comparar o uso dos fitoterápicos em relação ao desenvolvimento tumoral;

18

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Extração do látex

A escolha da concentração do avelós e da janaúba foi baseada em relatos

de pacientes que fizeram uso destas doses para o tratamento do câncer. Os

pacientes utilizam um determinado número de gotas para 1 litro de água, após

a diluição a solução deve permanecer na geladeira até o dia seguinte. As

doses diárias recomendadas são uma ou duas doses durante o dia, em torno

de 50 ml (um copo de café descartável) pela manhã e à noite. Neste trabalho

utilizamos o número de 16 gotas de avelós e 32 gotas de janaúba para um litro

de água.Antesde coletar o látex das plantas, foram separados de duas garrafas

de água 50 ml em dois falcons, para esterilizar, e para evitar atividade diferente

entre os ensaios padronizamos a nossa diluição com a água mineral Bonafont.

A extração foi feita a partir de um corte com o bisturi na planta, gotejando o

látex direto no falcon contendo a água mineral estéril. Sendo assim, para a

solução Janaúba, foram colhidos 16 gotas e para o avelós 8 gotas,

posteriormente o conteúdo do falcon foi devolvido a garrafa (para ficar 16

gostas de Janaúba em 500 ml de água e 8 gotas de avelós em 500 ml de

água), está diluição chamamos de solução mãe.

4.2 Preparo de diferentes concentrações de avelós e janaúba para os

ensaios in vitro

A solução mãe de janaúba e avelós foi dividida em alíquotas, parte desta

solução foi congelada e a outra dividida em solução de extrato natural e extrato

filtrado. A filtração das soluções tem por objetivo retirar o excesso de látex que

precipita após permanecerem na geladeira. Muitos pacientes relatam

19

problemas gástricos devido a ingestão da solução contendo látex, por isso

verificamos se a filtração poderia modificar o efeito das duas soluções sobre as

células tumorais. Uma alíquota de cada solução foi filtrada em papel filtro

qualitativo Whatman nº1 estéril em fluxo laminar, e foram assim classificadas

para realização dos experimentos: janaúba diluída em água (JN) e filtrada (JF),

enquanto que o avelós diluído em água (AN) e filtrado (AF).

Figura 3: Garrafas com soluções naturais e filtrada de Janaúba e Avelós.

Fonte: Sousa, KO (2018).

As garrafas que continham as soluções filtradas e não filtrada, sofreram

2 novas diluições posteriormente. Assim, se obteve concentrações diferentes,

para analisar as condições da célula sobre os tratamentos recebidos.

Assim,10ml do látex diluído das garrafas de filtrado e não filtrado de cada

planta foi colocado em um falcon, sendo esse considerado 100% da

concentração. Outros 2falcons, receberam 5ml de água mineral (Bonafont)

estéril, e a partir do falcon de 100%, seguiu-se uma diluição seriada, onde era

20

retirado da sua concentração 5ml e passados para um falcon que continha a

água, essa concentração ficou com 50%. Do falcon de 50%, eram tirados 5ml e

passados para um segundo falcon com água, sendo esta a concentração de

25%

Figura 4: Esquema da diluição seriada.

Fonte: Sousa, KO (2018).

4.3 Linhagem tumoral

A linhagem que foi utilizada neste estudo é o carcinoma pulmonar de Lewis

(3LL), esta linhagem foi gentilmente cedida pela Profa. Dra. Gisele Zenker

Justo (UNIFESP/Diadema). Esta linhagem também é específica de

camundongos C57BL/6, agressiva e metastática também é utilizada para testes

de agentes anti-tumorais.

4.4 Cultivo celular

A linhagem foi mantida em garrafa de cultura de 25 e 75 cm2(Jet Biofil-

China)até atingir total confluência. O meio de cultura contendo soro foi retirado

de cada garrafa e as células foram lavadas com tampão salino fosfato (PBS)

estéril. As células 3LL foram cultivadas e expandidas em meio RPMI 1640

21

(Gibco/Life Technologies-USA) suplementado com soro fetal bovino (Cultlab-

Brasil), 1% de glutamina (Gibco/Life Technologies-USA), 1% de antibiótico

(Gibco/Life Technologies-USA), 1% de piruvato (Gibco/Life Technologies-USA)

e 0,5 % de MEN (Gibco/Life Technologies-USA) e foi denominado meio

completo. Posteriormente para descolamento das células aderentes, cada

garrafa foi tripsinizada com 2ml de Tripsina+EDTA (Cultlab, Brasil) por 5

minutos. As células foram transferidas para um tubo falcon e centrifugadas por

10 minutos a 1.200 r.p.m.

4.5 Contagem das células

Depois do termino da centrifugação, as células formam um pélet

(agrupamento de células em um único local, na porção mais estreita do tubo),o

sobrenadante foi descartado de uma só vez e as células foramressuspendidas

com 1 ml de meio completo para contagem. Para a contagem e determinação

da viabilidade celular as células foram diluídas 10x. Em um

microtubofoicolocado 90 μldemeio de cultura e 10 µl da célula. As células do

microtubo foram contadas na câmara de Neubauer. Para tanto, utilizou-se 20 µl

de célula do microtuboe 20 µl de azul de tripan (Gibco/Life Technologies-USA).

Nessa etapa, a câmara foi levada ao microscópio, e os quadrantes de uma

diagonal contendo células foram contados. As células que apresentavam

coloração azul foram excluídas, pois não se achavam viáveis.

4.6 Ensaio in vitro e tratamento com os princípios ativos

As células 3LL na concentração de 1x105 células/ml foram cultivadas em

placas de poços 96 poços (Jet Biofil- China) para os ensaios de viabilidade

celular com MTT e na placa de 24 poços (Jet Biofil- China) para quantificação

de proteínas e eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page). Após, a

22

aderência das células por volta de 24 horas as diferentes concentrações de

avelós e janaúba foram testados, ambos filtrados e naturais. Com o objetivo de

mimetizar in vitro a forma que os pacientes tomavam as soluções, diariamente

(24h, 48h e 72h) um volume pré-estabelecido era retirado de cada poço e

acrescentado o volume correspondente das diluições de Avelós e Janaúba,

filtrado e não filtrado, com suas respectivas concentrações: 100%; 50% e 25%.

Os poços que continha as células controle receberam somente água mineral.

Os ensaios foram realizados em triplicata nas placas de 96 poços e duplicata

nas de 24 e incubados por 72 horas. Após este período, o sobrenadante de

cada poço foiretirados e colocados em microtubos identificados para

quantificação de proteínas pelo método de Bradford, enquanto que as células

foram tripsinizadas, lavadas com PBS e congeladas a -20°C para posterior

análise.

23

Figura 5: Esquema de placas para quantificação de proteína e SDS.

Fonte: Sousa, KO (2018).

24

Figura 6: Esquema de placas para MTT.

Fonte: Sousa, KO (2018).

4.7 Ensaio de viabilidade celular pelo método de MTT

O método MTT consiste em um ensaio quantitativo usado para estimar a

proliferação e sobrevivência celular. Segundo Ferreira et al (2015), o teste

fundamenta-se na capacidade da succinato-desidrogenase, enzima ativa

encontrada na mitocôndria de células viáveis, em converter o MTT (composto

hidrossolúvel de cor amarela) em formazan (cristais insolúveis de cor azul

escura). Passado o período de 24, 48 e 72 horas da incubação das 3LL com

diferentes concentrações do avelós e janaúba filtrado e natural, o seguinte

procedimento foi realizado. Foi feito o preparo da solução de MTT, onde para

cada 1 ml de PBS, 5 mg do sal de MTT era diluído, após o preparo da solução

foi desprezado todo o meio de cultura dos poços, em seguida os mesmos

foram lavados com 200μl de PBS e adicionados 150μl de meio completo com

20μl da solução de MTT por poço, as placas foram levadas a estufa de CO2 por

25

1h. Após o tempo de incubação, foi retirado pela borda o meio com MTT e

adicionado aos poços 100μl de DMSO, um poço foi escolhido para receber só

DMSO e por fim as placas foram levadas ao leitor de ELISA (Multiskan, USA),

para fazer a leitura da viabilidade dos poços no comprimento de onda de 540

nm. A introdução de DMSO permite que os cristais de formazan sejam diluídos

e melhora o espectro de absorção da solução. Para indicação da porcentagem

de células vivas, as médias de viabilidade celular das 3LL com ou sem os

ativos foram subtraídas da absorbância do grupo branco (só DMSO). Quanto

maior a absorbância medida pelo aparelho, maior será o número de células

viáveis.

Figura 7: Ensaio MTT

Fonte: Sousa, KO (2018).

4.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS- PAGE

Todos os ensaios envolvendo gel de acrilamida e western blotting foi

realizado no Laboratório de Investigação Clínica de Resistência à Insulina

(LICRI) na Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp. Este laboratório é

coordenado pelo Prof. Dr. Mario José de Abdala Saad, médico e pesquisador

26

na instituição, que colocou a nossa disposição todo material de consumo e

equipamentos necessários para a sua realização. Para iniciar a corrida,

montamos o aparato para fazer o gel e fizemos duas pequenas marcações no

vidro para sabermos até onde dispensaríamos o gel de resolução (Resolving) e

o de empacotamento (Staking). Preparamos a solução para o gel de 10%

seguindo a sua receita, aplicamos o gel de resolução na estrutura até a

primeira marca e aguardamos a sua polimerização para assim podermos

colocar o segundo gel de empacotamento, logo em seguida foi colocado o

pente. Preparamos as amostras pelo Laemili onde para cada 400ul de amostra

são colocados 100ul de Laemili e o valor das amostras são multiplicados pela

constante do DTT 0,015. As amostras foram aquecidas e reservadas enquanto

o aparato para eletroforese era montado. Para a corrida do gel é necessário a

utilização de uma cuba de eletroforese vertical (Mini Protein II) e uma fonte de

voltagem (PowerPac Universal Power Supply) ambas da BIO-RAD, USA.Os

géis foram inseridos nas cubas e coberto com tampão de corrida, neste

momento retiramos o pente de cada gel para deixar livres as cavidades onde

as amostras seriam colocadas. Com o auxílio de uma pipeta introduzimos as

amostras nas lacunas entre os dentes do pente, colocando sempre o padrão

molecular no começo do gel (Figura 8). Todos os géis receberam além das

amostras um padrão de peso molecular, que pudesse indicar a massa

molecular das proteínas observadas nas amostras.

27

Figura 8: Exemplo da conformação das amostras no gel de Janaúba 100 %. Onde

N=natural e F=filtrado.

Fonte: Sousa, KO ( 2018).

Foi utilizado para o gel 10% o padrão Page Ruler Prestained Protein

Ladder (170 kDa a 10 kDa) e para o gel de 6,5% foi utilizado o Page Ruler

Prestained Protein Ladder Plus (250 kDa a 11 kDa), ambos da

ThermoScientifc, USA. Iniciamos a corrida subindo a voltagem gradativamente

a cada 10 minutos (40V, 60V e 80V), após este tempo as proteínas correram a

120V para uma melhor separação (Figuras 9).

Figura 9- Aparato de corrida para eletroforese.

Fonte: Sousa, KO (2018).

28

No final da corrida os géis foram retirados das placas de vidro com

cuidado, no primeiro experimento os géis foram corados com Comassie brilliant

blue (Sigma Aldrish-USA), sob agitação overnight (Figura 10). Este corante

azul se liga de forma irreversível as proteínas, fazendo com que as bandas

sejam reveladas no gel de acrilamida. Para melhor visualização o excesso de

corante foi retirado com uma solução composta de 45% de metanol e 10% de

ácido acético em água destilada. Após a verificação do padrão de bandas

reveladas nas células controles e nas células tratadas com avelós e janaúda,

dois novos géis (10% e 6,5%) foram feitos para marcação de algumas

proteínas de sinalização intracelular através do western blotting.

Figura 10: Coloração dos géis com Comassie Brilliant Blue sob agitação.

Fonte: Sousa, KO (2018).

4.9 Western Bloting

O Western blotting é uma técnica que consiste na detecção de proteínas

específicas em amostras de lisados celulares ou de tecidos. Os passos para

sua realização segue igual ao fracionamento das proteínas da amostra em um

29

gel de poliacrilamida descrito no item 4.9. O gel de poliacrilamida não permite

analisar proteínas individuais e separadas, assim, as bandas de proteínas

corridas no gel precisam ser transferidas para uma membrana, que no caso é a

de nitrocelulose. As proteínas blotadas na membrana darão a possibilidade

dos anticorpos específicos se ligarem de forma específica as regiões

denominadas bandas, ou seja, somente as proteínas de interesse que serão

analisadas. Os géis foram colocados individualmente em um cassete contendo

duas membranas isolantes (uma de cada lado) sobre um uma tira de papel

filtro cada gel depositado foi fechado e colocado na cuba de transferência. A

cuba foi preenchida até a metade com tampão para transferência, antes de

iniciar o procedimento, uma pequena cuba com gelo foi encaixada em frente ao

cassete do gel, para que durante o processo a alta temperatura não desnature

as proteínas que serão transferidas. Cada cuba contendo dois géis foi ligada a

fonte e iniciada a transferência na tensão de 120V por duas horas, durante o

período foi necessário trocar o gelo que derreteu pelo menos 5 vezes.

4.9.1 Bloqueio

Finalizada a transferência, as membranas foram transferidas para

caixinhas individuais, as ligações inespecíficas foram bloqueadas com uma

solução de caseína a 5% em solução basal por 1h, sob agitação constante.

Após este período, a caseína foi retirada e as membranas passaram por 3

lavagens de 10 minutos com solução basal, para retirada do excesso de

proteínas.

30

4.9.2 Bloting com anticorpos específicos.

Após estes procedimentos, as membranas estavam prontas para serem

incubadas com os anticorpos específicos. Cabe ressaltar que o procedimento

descrito a seguir, permite a marcação de uma só proteína a cada vez, sendo

assim é necessário dois dias para blotar e revelar uma proteína. Os anticorpos

escolhidos permitem verificar a expressão de proteínas intracelulares nas

células tumorais implicadas no processo de sobrevivência, crescimento e

progressão tumoral, são elas: AKT (Cell-USA #9272 Rabbit); ERK ½ (Cee-USA

#SC-93 Rabbit); mTOR (Cell-USA #2972 Rabbit); S6 RibossomalProtein (Cell-

USA #2217 Rabbit); α-Tubulina (SC-8035 Mouse) como proteína controle. O

anticorpo primário foi diluído em uma solução de 3% de BSA (Soro albumina

bovina- Sigma,USA), na concentração foi de 1:1000. Cada membrana recebeu

10mL desta solução e foi incubado em câmara fria (4°C) sob agitação

“overnight”. No dia seguinte, o anticorpo primário foi retirado e as membranas

lavadas 3X com solução basal por 10 minutos. O anticorpo secundário, a

IgGRabbit marcada com peroxidase, foi também diluída em caseína 3% e

10mL desta solução foi adicionada a cada membrana. As caixinhas com as

membranas foram incubadas a temperatura ambiente por 2h sob agitação

constante, com baixa luminosidade. Após a incubação o segundo anticorpo foi

descartado e o procedimento de lavagem, já descrito foi realizado. As

membranas foram reveladas pela mistura de duas substâncias, o ClarityTM

Western ECL Substrate composto da solução de peroxidase

(PeroxidaseSolution) e pelo Luminol (Luminol/enhancersolution) ambas da BIO-

RAD-USA (Figura). A leitura das amostras foi feita no fotodocumentador Gel

31

DocTM XR+ Gel Documentation System (BIO-RAD, USA). As imagens foram

analisadas no site Image Lab6 (BIO-RAD, USA).

Figura 11: Revelação do western blot no Laboratório de Investigação Clínica de

Resistência a Insulina (LICRI)

Fonte: O autor, 2018.

4.9.3 Striping da membrana de nitrocelulose

O striping da membrana de nitrocelulose tem por objetivo retirar o anticorpo

primário e secundário após a revelação do blot para que outro possa ser

marcado. O procedimento é simples mas necessário para que não se obtenha

falsos resultados. Após revelar a membrana com luminol e fazer a leitura no

foto documentador, as membranas são lavadas 3X com solução basal por 10

minutos cada lavagem. Após a última lavada toda a solução foi retirada, 10mL

do tampão de striping (Western BlotStripping Buffer- Termo Scientific, USA) foi

adicionado a cada membrana, que foram incubadas por 10 minutos em

32

agitação constante. No final a solução de striping foi descartada e as

membranas lavadas novamente com solução basal, o que permitiu fazer uma

nova marcação com o anticorpo de interesse.

33

5. RESULTADOS

5.1 Aspectos morfológicos das células 3LL após tratamento com o

avelós e a janaúba in vitro

Este ensaio foi realizado com o objetivo de observarmos o

comportamento das células tumorais expostas às soluções de janaúba e

avelós, em sua forma natural e filtrada.Os resultados apresentados nas figuras

1A e 1B demonstram o aspecto das células 3LL após receber a dose de 100μl

de cada diluição por poço. Para uma melhor avaliação deixamos as células em

cultura por 72h, as imagens foram geradas em microscópio óptico invertido

(NIKON, Japão).

As imagens mostram que em ambas as placas e em todas

concentrações (100%, 50% e 25%) se observa uma mudança expressiva na

morfologia destas células, quando comparado ao grupo controle. A microscopia

feita, apresentou um aspecto de inconfluência em quase todo os poços.Em

72h,as células se encontravam concentradas no centro do poço e ao seu redor

só encontrava pequenas quantidades espalhadas, este detalhe foi melhor

observado na placa do Ávelós com grande potencial nos poços onde se

encontrava o tratamento filtrado, entre eles o mais característico era o poço

que foi tratado com a concentração de 25%.

É possível constatar que a administração de doses das concentraçõesfez

com que as células diminuíssem a sua capacidade de proliferação, porém,

possivelmente assumiramum aspecto de controle para si mesmo, quando

manteve as células concentradas em um lugar só, este mecanismo é bem

difundido em células tumorais para uma depender da outra e continuar sua

proliferação por vias de escape. O mesmo aspecto de concentração de células

34

no centro do poço não foi observado com a mesma intensidade no tratamento

com as soluções de Janaúba (JN e JF), mesmo na maior concentração.Apesar

das imagens comporem somente os aspectos em 72h, nas primeiras 24h de

exposição aos tratamentos já era possível identificar este aspecto de

concentração em ambas as placas, com mais conformidade na placa que

recebeu o tratamento do avelós. Neste resultado, nenhum dos látex apresentou

real capacidade antiproliferativa sobre as células 3LL, porém, apresentou a

possibilidade do tratamento induzir a proliferação celular comparado ao

controle.

35

Figura- 1A. Avaliação morfológica das células 3LL in vitro após exposição a

diferentes concentrações da solução de janaúba natural e filtrada.

Fonte: Sousa, KO (2018).

36

Figura- 1B. Avaliação morfológica das células 3LL in vitro após exposição a

diferentes concentrações da solução de avelós natural e filtrada.

Fonte: Sousa, KO (2018).

.

37

5.2 Avaliação da citotoxicidade das 3LL tratadas com janaúba e avelós

pelo teste do MTT

Os resultados de viabilidade por MTT demonstraram que as células

expostas a diferentes concentrações de janaúba e avelós, afetam na maioria

das vezes positivamente o crescimento destas células a partir do período de

24h. O MTT nos permite verificar alguns aspectos metabólicos das células

estudadas, principalmente a viabilidade mitocondrial que está diretamente

ligada a sobrevivência da célula.

As figuras 2A e 2B apresentam gráficos que contem a média de 3 ensaios

em triplicata utilizando as duas soluções, o avelós comparado ao controle

apresentou novamente o melhor resultado em relação a diminuição da

viabilidade em todas as concentrações, mas a seu melhor desempenho foi na

concentração de 50% onde houve um decaimento em 24h da viabilidade

celular, porém, sem significância estatística. O caso das soluções de janaúba,

levantou uma discussão sobre a influência do látex da planta nas 3LL. A

janaúba apresentou um ótimo resultado em todo o período do experimento na

concentração de 100%,porém, os gráficos permitiram considerar que as

concentrações de 50% e 25% da Janaúba natural, tem um resultado negativo

em relação a sua viabilidade. A Janaúba natural nessas concentrações não

apresenta nenhuma diminuição na viabilidade celular, pelo contrario só

aumenta a medida que o período percorri. Por outro lado, o aspecto da

interação do látex de Janaúba filtrado com as células, muda totalmente de

figura e apresenta uma grande diminuição na capacidade da viabilidade

mitocondrial das células. Este fato levou a seguinte pergunta: quando o látex

da Janaúba é filtrado, a solução pode perder algum elemento, pois, há relatos

38

de pacientes que consumiram o látex da planta sem filtrar e tiveram

complicações posteriores como, problemas gástricos. Afinal a Janaúba filtrada

teve um melhor desempenho em relação a viabilidade celular.

39

Figura- 2A. Viabilidade celular pelo teste de MTT em células 3LL tratadas com diferentes concentrações de avelós natural e filtrado. Quantificação de células viáveis pela atividade mitocondrial pela transformação do sal insolúvel de formazan.

Avelós 100%

24h

48h

72h

0.0

0.5

1.0

1.5Control

Avelós 100%

Avelós F 100%

Cell v

iab

ilit

y (

%)

Avelós 50%

24h

48h

72h

0.0

0.5

1.0

1.5Control

Avelós 50%

Avelós F 50%

Cell v

iab

ilit

y (

%)

Avelós 25%

24h

48h

72h

0.0

0.5

1.0

1.5Control

Avelós 25%

Avelós F 25%

Cell v

iab

ilit

y (

%)

Fonte: Sousa, KO (2018)

40

Figura- 2B. Viabilidade celular pelo teste de MTT em células 3LL tratadas com diferentes concentrações de janaúba natural e filtrado. Quantificação de células viáveis pela atividade mitocondrial pela transformação do sal insolúvel de formazan.

Janaúba 100%

24h

48h

72h

0.0

0.5

1.0

1.5Control

Janaúba 100%

Janaúba F 100%

Cell v

iab

ilit

y (

%)

Janaúba 50%

24h

48h

72h

0.0

0.5

1.0

1.5Control

Janaúba 50%

Janaúba F 50%

Cell v

iab

ilit

y (

%)

Janaúba 25%

24h

48h

72h

0.0

0.5

1.0

1.5Control

Janaúba 25%

Janaúba F 25%

Cell v

iab

ilit

y (

%)

Fonte: Sousa, KO (2018)

41

5.3 Diminuição na síntese de proteínas pelas 3LL tratadas com avelós e

janaúba: avaliação do gel de poliacrilamida.

A expressão de proteínas sintetizadas pelas células 3LL quando estavam

em contato com as soluções de avelós e janaúba natural ou filtrada podem ser

observadas na figura 3A. A avaliação dos géis de avelós demonstram que as

células tratadas diminuem a expressão de diversas proteínas, principalmente

aquelas com massa molecular abaixo de 72kDa, este dado é observado

quando se compara o padrão de proteínas produzidos pelas células controles

(3LL sem tratamento) ao longo do gel. O avelós apresentou diferença em todas

as concentrações estudadas. Quando se avaliou os resultados referentes a

janaúba observou-se que havia uma diminuição mais discreta do padrão de

proteínas, além do que, as concentrações mais altas (100% e 50%)

demonstraram maior efetividade. Quanto à filtração que foi utilizada para retirar

o excesso de látex das soluções, demonstrou que as duas formas do avelós

(natural e filtrado) foram eficazes em modificar o padrão de proteínas

expressas pela 3LL. No entanto, a janaúba demonstrou que o filtrado é mais

eficaz que o natural. Estes resultados corroboram com aqueles mostrados pela

viabilidade celular, onde a concentração de 25% natural estimulou o

crescimento das células tumorais, enquanto que o filtrado teve efeito contrário

em todos os tempos de tratamento.

42

Figura- 3A.Fotodocumentação de gel de SDS-PAGE corado com

Coomassie Brilliant blue das 3LL tratadas in vitro com diferentes

concentrações do látex de avelós e janaúba diluídos em água (AN e JN), os

extratos também foram filtrados (AF e JF) e comparados às células controle

sem tratamento (Crl). As células foram tratadas por 24h (1 dose), 48h (2

doses) e 72h (3 doses).

Fonte: Sousa, KO (2018)

43

5.4 Tratamento das células 3LL com avelós e janaúba diminui a

expressão de proteínas intracelulares

Este ensaio teve por objetivo avaliar algumas rotas metabólicas que

geralmente estão superexpressas em diferentes tumores. A expressão

aumentada de proteínas de sinalização como a AKT (quinase serina/treonina),

o receptor para rapamicina mTOR (Mammalian Target of Rapamycin), ERK ½

(quinase reguladora de sinal extracelular 1/2) e a proteínas ribossomal P70 S6

quinase estão envolvidas na progressão e crescimento tumoral. Os resultados

apresentados na figura 4A demonstram que diferentes concentrações de

janaúba e avelós diminuem a expressão principalmente de proteínas como a

AKT e a S6. Quanto a ERK se observa uma diminuição principalmente quando

as células são tratadas com avelós. No entanto observa-se a diminuição na

expressão de ERK somente nas células tratadas com janaúba 100% filtrada

(JF) após 72h. Quando se avaliou a mTor, observamos que nesta mesma

concentração, esta proteína praticamente não é expressa (Figura 4B). O avelós

também apresentou um efeito importante sobre a expressão do mTOR

praticamente em todas as concentrações, o 100% tanto natural quanto o

filtrado mostra uma diminuição em todos os tempos estudados, 72h, 48h e 24h

(Figura 4B).

44

Figura 4A- Níveis de AKT, ERK1/2 e de S6 proteína ribossomal foram

avaliadas nas 3LL in vitro tratadas com soluções de diferentes

concentrações de avelós e janaúba natural (AN e JN) e filtrada (AF e JF).

As proteínas foram separadas em gel de acrilamida a 10% e transferidos

para membrana de nitrocelulose, os anticorpos específicos foram testados.

Fonte: Sousa, KO (2018)

45

Figura 4B- Níveis de mTOR foi avaliado nas 3LL in vitro tratadas ou não com

soluções de diferentes concentrações de avelós e janaúba natural (AN e JN) e

filtrada (AF e JF). Esta proteína teve que ser avaliada em separado, pois

devido ao seu alto peso molecular (269 kDa), não foi possível separa-la no gel

10%, por isso a corrida foi em um gel a 6,5% e transferidos para membrana de

nitrocelulose, para o teste do anticorpo específico.

.

Fonte: Sousa, KO (2018)

46

6. DISCUSSÃO

Neste trabalho foi investigado se o látex de avelós e janaúba, que foi

preparado de acordo com relato de indivíduos que fizeram ou fazem uso destas

substâncias são eficazes para interferir no crescimento e desenvolvimento do

carcinoma pulmonar de Lewis (3LL) in vitro. Neste estudo, utilizamos três

concentrações que expressam a forma que a maioria dos pacientes fazem uso

destes látex. As soluções consistiram da diluição dos látex direto na água

mineral, como descrito na metodologia (NA e JN). Embora muitos relatassem

os benefícios da ingestão destas soluções, parte dos pacientes reclama de

problemas gástricos, possivelmente pela irritação do látex na parede do

estômago. Baseado nestes relatos, parte das soluções foram filtradas e os

seus efeitos foram estudados sobre as 3LL (AF e JF). Os primeiros resultados

obtidos foram bastante controversos, pois todas as concentrações do avelós

natural ou filtrado foram capazes de diminuir a viabilidade das 3LL (Figura 2A)

pela redução do formazan (teste do MTT), no entanto a janaúba nos deu um

sinal de alerta. A figura 2B apresenta os resultados de viabilidade com as

mesmas concentrações que o avelós, é possível observar que a concentração

de 100%, tem-se uma queda no número de células vivas após 24h para o

natural e 48h para o filtrado, é uma diminuição considerável quando se

compara as células controles tratadas somente com água mineral. Porém a

concentração de 50% natural apresentou efeito contrário, estimulando a

proliferação celular em todos os tempos (24h, 48h e 72h), o efeito benéfico foi

mantido no filtrado (figura 2B). Ainda na figura 2B, avaliamos a concentração

de janaúba 25%, ambas as soluções, natural e filtrado estimularam o

crescimento das 3LL. Como esperado, o efeito de inibição de cada experimento

47

foi melhor caracterizado após 72h, o que significa que a célula recebeu 3 doses

da solução. Isto mostra que é necessário mais de uma dose para se obter um

resultado favorável.

A gravidade e o prognóstico de um câncer estão diretamente ligados ao

tipo de tecido ou órgão afetado. O câncer de pulmão é um câncer que faz

muitas vítimas, devido ao seu diagnóstico tardio e a influencia de riscos

externos como o tabaco. A desregulação das funções das células normais

pelas células cancerígenas desenvolve um microambiente tumoral, para

fornecer nutrientes para continuar sua progressão e metástase, utilizando de

métodos que modifiquem vias metabólicas, vias de sinalização celular e

apoptose. As células respondem a muitos estímulos que são proporcionados o

tempo todo, receptores específicos em sua superfície recebem diferentes

comandos que estimulam seu crescimento ou suprimem esta ação. Os dados

de viabilidade celular sugerem que, o látex do avelós pode estimular uma

cascata de estímulos intracelulares que implicam na sobrevivência destas

células. Porém a janaúba contém substâncias em sua composição que em

altas concentrações, diminuem a viabilidade das 3LL, em concentrações

intermediária e baixa, estimulem mecanismos de sobrevivência e proliferação

celular (Figuras 2A e 2B).

O paço seguinte deste trabalho foi verificar como estava o consumo de

proteínas diluídas no meio em que se encontravam as células, ou se havia uma

maior produção de proteínas e eliminação no meio extracelular. Os testes

foram realizados no sobrenadante das 3LL tratadas ou não com as soluções

pelo método de Bradford para quantificação de proteínas. Estes resultados

foram inconclusivos, que não foram mostrados nos resultados. Em seguida,

48

buscamos observar o capacidade da célula sintetizar proteínas através da

técnica de eletroforese SDS-PAGE, em que colocamos um lisado de células

tratadas em um gel de poliacrilamida e observamos a separação das proteínas

neste gel. Os resultados que estão apresentados na figura 3 mostram que

novamente o avelós modifica o padrão de bandas de proteínas de forma

bastante superior a janaúba. As principais diferenças são observadas nas

proteínas em torno de 72 kDa para baixo, por isso que na sequência

estudamos algumas proteínas de rotas metabólicas de sinalização que estão

diretamente ligadas ao controle ou a progressão da maioria dos tumores.

As proteínas de sinalização intracelular estudadas aqui foram a AKT,

ERK1/2, S6, mTOR e a β-actina como proteína controle. A AKT quinase exerce

uma regulação crítica na homeostase celular, por estar envolvida na

sinalização de sobrevivência das células e alterações na sensibilidade à morte

celular. A via da AKT faz parte de uma via de sinalização diretamente envolvida

na gênese de tumores e no seu processo de disseminação, pois a sua

hiperativação está associada com a resistência a apoptose, aumento de

crescimento, proliferação celular e metástase (ROY et al., 2010). O mTOR é

considerado um centro integrador de crescimento celular pois funciona como

um importante regulador da homeostase dos processos biológicos, como a

sobrevivência e o crescimento celular, esta sinalização pode ser mediada por

sinais intracelulares e extracelulares, incluindo fatores de crescimento,

nutrientes, níveis de energia e estresse celular. Diferentes estudos apontam o

mTOR como uma das principais proteínas de sinalização responsável pela

progressão tumoral e o processo de metastatização através do estímulo a

tradução de proteínas, aumento do metabolismo glicêmico e lipídico e

49

sobrevida celular (XIE et al., 2018). A ERK é uma proteína extracelular, que

faz parte de uma via que transmite estímulos extracelulares como fatores de

crescimento, hormônios e outros por meio de receptores na superfície celular

para o controle do ciclo celular. Geralmente é um via que se encontra alterada

em canceres, com sua expressão aumentada também colabora com os

processos de desregulação da homeostase celular. As funções celulares da

ERK incluem regulação e proliferação do ciclo celular sobrevida, mitose,

migração entre outras (MARTINI, 2013). Por fim a S6, que é uma proteína

ribossomal, está associada com a estimulação na tradução de proteínas,

auxiliando no papel fundamental de sintetizar proteínas de acordo com as

instruções do RNAm. Embora ainda controverso, acredita-se que o mecanismo

mais reconhecido para a ativação do rpS6 é o fosforilação dependente de

mTOR (CHEN et al., 2014; BIEVERA et al., 2015, XIE et al., 2018). A falta de

controle destas proteínas de sinalização estão relacionados a ineficácia dos

tratamentos contra o câncer, muitos pesquisadores buscam medicamentos que

possam regular estas vias, diminuindo assim o crescimento do tumor (PARK et

al., 2018).

Os resultados apresentados nas figuras 4A e 4B, demonstram que os

tratamentos com o avelós e a janaúba interferem na expressão principalmente

da AKT, S6 e mTOR. A ERK a janaúba filtrada (JF) na concentração de 100%

apresentou uma diminuição importante da banda, quando comparado as

células controle. No geral, as proteínas mais afetadas pelos tratamentos foram

a S6 e a mTOR, estes resultados são representativos de uma linhagem tumoral

de camundongo. Porém, talvez tenhamos os primeiros indícios de como as

soluções funcionam no organismo, outros ensaios serão realizados como a

50

normalização das bandas, tendo como referência a β-actina. No entanto, é

necessário que os pacientes saibam que, algumas concentrações aumentaram

a expressão de proteínas como a AKT e a ERK, a ingestão de algumas

concentrações, principalmente de janaúba pode estimular a progressão tumoral

diminuindo as chances deste paciente de se curar (Figura 4A).

A necessidade que os pacientes têm de aliviar seu sofrimento mediante

a um prognóstico do câncer, os levam a fazer uso de novos recursos, para

tentar reverter a situação ou diminuir seus sintomas. Segundo Wani (2017) por

causa das poucas opções de tratamento para alguns cânceres, os pacientes

procuram outras formas de cura recorrendo a vários tipos de tratamentos,

porém, na maioria das vezes não é mencionado ao médico o uso destas

substâncias. O exemplo disso é o caso da “pílula que cura o câncer” a

Fosfoetanolamina, que gerou tanta polêmica entre médicos, pesquisadores e

os indivíduos mais afetados, os pacientes. Os pacientes tomaram esta pílula

por anos buscando a cura, pois as informações consideravam que este

tratamento poderia curar qualquer tipo de câncer, o mesmo se diz sobre o

avelós e a janaúba. Diferentes grupos no Brasil e no exterior estão fazendo

pesquisas utilizando a fosfoetanolamina como objetivo de descobrir como este

medicamento age no organismo e para que tipo de neoplasia seu uso será

recomendado. Porém pouco se encontra na literatura, trabalhos que

comprovem a sua eficácia (PAUMGARTTEN, 2017).

A IC da aluna nos permitiu iniciar um grande estudo envolvendo estas

plantas, outros testes serão realizados para compor estes resultados, como o

estudo de moléculas de superfície como o PDL-1, fator estimulador de

crescimento endotelial (VEGF), bem como outras proteínas de sinalização

51

fosforiladas. Ampliaremos também o estudo para outros tipos de células

tumorais como o de mama, de sistema nervoso (glioblastoma), de intestino e

de pele (melanoma). É nosso objetivo publicarmos um artigo com os resultados

obtidos.

A principal relevância deste estudo é que pacientes estão tomando o

látex destas duas plantas para tratar o seu câncer, mas a pergunta é: Todos

estão melhorando? Serve para todos os tipos de câncer? Por isso é que

estendemos, que a investigação para a utilização destes compostos naturais

para o tratamento de câncer se faz ainda mais necessário.

52

7. CONCLUSÃO

Os resultados apresentados sugerem que:

O látex de avelós e janaúba apresentaram efeito sobre a viabilidade

celular das 3LL;

O avelós foi mais eficaz em controlar o crescimento celular que a

janaúba;

O avelós e a janaúba modificam a expressão de proteínas como a AKT,

S6 e mTOR;

As concentrações de janaúba de 50% e 25% estimularam o crescimento

tumoral ao invés de suprimir.

53

8. REFERÊNCIAS

ALFAROUK K. O.; et al. Glycolysis, tumor metabolism, cancer growth and dissemination. A new pH-based etiopathogenic perspective and therapeutic approach to an old cancer question. Oncoscience. (1) 12, 2004.

ALVES, E. M.; NEUPOMUCENO, J. C. Avaliação do efeito anticarcinogênico do látex do avelós (Euphorbiatirucalli), por meio do teste para detecção de clones de tumor (warts) em Drosophilamelanogaster. Revista Perquirere, v. 9, n. 2, p. 125-140, 2012.

AMARO, M. S; FILHO, S. M; GUIMARÃES, R. M; TEÓFILO, E; MORFOLOGIA

DE FRUTOS, SEMENTES E DE PLÂNTULAS DE JANAGUBA

(Himatanthusdrasticus(MART.) PLUMEL. – APOCYNACEAE). Revista

Brasileira de Sementes, vol. 28, nº 1, p.63-71, 2006

ARAÚJO, C. R. F de*; de OLIVEIRA, J. O. D; RESENDE, J. C; BEZERRA, M. G. P; da COSTA, E. P; COUTINHO, M. de S. RAIZEIROS E RAIZEIRAS ENQUANTO MULTIPLICADORES DO CONHECIMENTO POPULAR: UM RESGATE NA LITERATURA. Revista Saúde E Ciência Online, 2014; 3(1), 35-43.

BEZERRA, W. K. T. et al. O uso de fitoterapia com ação anti-inflamatória que atuam no sistema gênito-urinário. InformativoTécnico do Semiárido, v. 8, n. 1, p. 24-36, 2014.

BIEVER A , VALJENT E , PUIGHERMANAL E. Proteína Ribossomal S6

Fosforilação no Sistema Nervoso: Da Regulação à Função. Frente Mol

Neurosci. 16 de dezembro de 2015; 8: 75

BLAYLOCK, R. L. Metholdological problems with population cancer studies: The forgotten confounding factors. SurgNeurol Int. 2015 May 29; 6: 93.

BRANDÃO, Lenise. OS ESTÁGIOS DO CÂNCER, TIPOS E CAUSAS. [2018].

Disponível em:

<http://www.lenisebrandao.psc.br/index.php?Mcorpo=art_0033>. Acesso em:

28 mar. 2018.

CHEN B , ZHANG W , GAO J , CHEN H , JIANG L , LIU D , CAO Y , ZHAO

S , QIU Z , ZENG J , ZHANG S , LI W . A regulação negativa da proteína

ribossômica S6 inibe o crescimento do câncer de pulmão de células não

pequenas por induzir a parada do ciclo celular, ao invés da apoptose. Cancer

Lett. 28 de novembro de 2014; 354 (2): 378-89.

COSTA, L. S. Estudo do uso do Avelóz (Euphorbiatirucalli) no tratamento de doenças humanas: uma revisão. 2011. 18 f. TCC (Graduação) - Curso de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Biológicas e de Saúde, Universidade Estadual da Paraíba, Paraíba, 2011.

54

DUTRA, R. C; SIMÃO da SILVA K. A; BENTO, A. F; MARCON, R; PASZCUK,

A. F; MEOTTI, F. C; PIANOWSKI, L. F; CALIXTO, J. B.Euphol, a tetracyclic

triterpene produces antinociceptive effects in inflammatory and neuropathic

pain: the involvement of cannabinoid system.Neuropharmacology. 2012

Sep;63(4):593-605

FARIA, M. F. de O.; TURRINI, R. N. T.. Repercussões do uso de fitoterápicos

no processo anestésico-cirúrgico: uma revisão integrativa. Rev. SOBECC, v.

18, n. 3, p. 49-58, 2013.

FILHO, C.V; YUNES, R. A. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre modificação estrutural para otimização da atividade*. Florianópolis – SC. Química Nova, 21 (1) (1998). FRANÇA, W. C. S. C; SOUZA, A. C. R. L. A; CORDEIRO, J. A; CURY, P. M; Análise da ação da Himatanthusdrasticus na progressão do câncer de pulmão induzido por uretana em camundongos. São José do Rio Preto (SP)Einstein. 2011; 9(3 Pt 1):350-3 FERREIRA, Carla Fontoura et al. DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DE NARINGINA E NARINGENINA NANOENCAPSULADAS. Disciplinarum Scientia: Série: Naturais e Tecnológicas, Santa Maria, v. 16, n. 2, p.285-299, 24 nov. 2015. ISSN 2176-462X. Disponível em: <https://www.periodicos.unifra.br/index.php/disciplinarumNT/article/view/1382/1313>. Acesso em: 18 jun. 2017. GATENBY, R. A; GILLIES, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis?.Nature. (4), 2004.

GIOVANNINI P, HOWES MR, EDWARDS SE. Data on medicinal plants used in Central America to manage diabetes and its sequelae (skin conditions, cardiovascular disease, kidney disease, urinary problems and vision loss). Data Brief. 2016 Apr6;7:1217-1220. INCA. Instituto Nacional do Câncer. Ministério da Saúde. Câncer: Prevenção e

fatores de riscos. 1998-2018. Gerenciado pelas divisões de Comunicação

Social e Tecnologia da Informação. Disponível em:

<http://www2.inca.gov.br/wps/wcm/connect/cancer/site/prevencao-fatores-de-

risco>. Acesso em: 28 mar. 2018.

KAUFMANN D, KAUR DOGRA A, TAHRANI A, HERRMANN F, WINK M. Extracts from Traditional Chinese Medicinal Plants Inhibit Acetylcholinesterase, a Known Alzheimer's Disease Target. Molecules. 2016 Aug31;21(9). KENNECKE H, YERUSHALMI R, WOODS R, CHEANG MC, VODUC D, SPEERS CH, NIELSEN TO, GELMON K.Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J ClinOncol. 2010 Jul 10;28(20):3271-7.

55

KERSUL, Alessandra Pereira. ENFRENTAMENTO DO CÂNCER: RISCOS E AGRAVOS. 2014. 41 f. TCC (Graduação) - Curso de Curso de Especialização em Atenção Básica em Saúde da Família, Universidade Federal de Minas Gerais, Campos Gerais-MG, 2014. LINHARES, J. F. P; PINHEIRO, C. U. B. Caracterização do sistema de extração de látex de janaúba (HimatanthusWilld. exSchult- Apocynaceae), no Município de Alcântara, Estado do Maranhão, Brasil*. Ver Pan-Amaz Saúde, volume 4, nº. 1, pág 23-31, março 2013.

LOPES, A; CHAMMAS, R; IYEYASU H. Alterações metabólicas envolvidas no desenvolvimento tumoral. In: São Paulo. Oncologia para graduação. ed 3, pg 142-149, 2013.

MACEDO, D. G; RIBEIRO, D. A; COUTINHO, H. D. M;MENEZES, I. R. A;

Souza, M. M. A. 2015. Práticas terapêuticas tradicionais: uso e conhecimento

de plantas do cerrado no estado de Pernambuco (Nordeste do Brasil).

BolLatinoam Caribe PlantMedAromat 14 (6): 491 – 508.

MACHADO, H.L.; MOURA, V.L.; GOUVEIA, N.M.; COSTA, G.A.; ESPINDOLA F S.; BOTELHO, F.V.Pesquisa e atividades de extensão em fitoterapia desenvolvidas pela Rede FitoCerrado: uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos por idosos em Uberlândia-MG. Rev. Bras. Pl. Med., Campinas, v.16, n.3, p.527-533, 2014.

MACHADO, M. M; de Oliveira, L.F; ZURAVSKI, L; de SOUZA, R.O; FISCHER, P; DUARTE, J. A; ROCHA, M. O; GÜEZ, C. M; BOLIGON, A. A; ATHAYDE, M. L.EvaluationofgenotoxicandcytotoxiceffectsofhydroalcoholicextractofEuphorbiatirucalli (Euphorbiaceae) in cellculturesofhumanleukocytes. AnAcadBrasCienc (2016) 88 (1):17-28. MARTINI, Simone de Leon. O potencial papel da cinase reguladora extracelular (ERK) na sobrevida de pacientes com adenocarcinoma de pulmão em estágios iniciais. 2013. 74 f. Tese (Doutorado) - Curso de Pós- Graduação em Ciências Pneumológicas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2013.

NEODINI, R. N. R; GASPI, F. O. G. Análise dos efeitos tóxicos da avelóz (EufhorbiatirucalliL). Revista científica da FHO/ Uniararas v. 3, n. 2/2015.

NOVAES, Fabiola Trocoli et al. Câncer de pulmão: histologia, estádio, tratamento e sobrevida. Jornal Brasileiro de Pneumologia, [s.l.], v. 34, n. 8, p.595-600, ago. 2008. FapUNIFESP (SciELO). http://dx.doi.org/10.1590/s1806-37132008000800009. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/jbpneu/v34n8/v34n8a09.pdf>. Acesso em: 27 mar. 2018.

OLIVEIRA FGS; LEHN CR. Riscos e Perspectivas na Utilização de Fitoterápicos no Brasil. Opará: Etnicidades, Movimentos Sociais e Educação, Paulo Afonso, v. 3, n. 4, p. 35-44, jan./dez. 2015.

56

ONUCHIC, A. C; CHAMMAS, R. Câncer e o microambiente tumoral. RevistaMédica, 2010 volume 89, pág 21-31.

PAUMGARTTEN, FJR. Ethical issues on the "synthetic" phosphoethanolamine

clinical trial. Rev Assoc Med Bras (1992). 2017 May;63(5):388-392

PRADO, Bernardete Bisi Franklin do. Influência dos hábitos de vida no

desenvolvimento do câncer. Câncer/artigos, São Paulo, v. 66, n. 1, p.21-24,

2014. Disponível em:

<http://cienciaecultura.bvs.br/pdf/cic/v66n1/a11v66n1.pdf>. Acesso em: 28 mar.

2018.

ROY, Sanjit K; SRIVASTAVA, Rakesh K; SHANKAR, Sharmila. Inhibition of PI3K/AKT and MAPK/ERK pathways causes activation of FOXO transcription factor, leading to cell cycle arrest and apoptosis in pancreatic cancer. Journal Of Molecular Signaling, [s.i], v. 10, n. 5, p.1-13, 2010.

SANTANA, P X S; BORGES, JNB; BARROS, AS M. Qualidade de Vida do

Paciente Portador de Câncer de Próstata em Hormonioterapia. Ciências

Biológicas e de Saúde Unit | Aracaju | v. 2 | n.3 | p. 111-128 | Março 2015

SANTOS M. G.; FONSECA S. G. C. Brasil. Ministerio da Saude. Secretaria de Atencão a Saude. Departamento de Atencão Basica. Praticas integrativas e complementares: plantas medicinais e fitoterapia na AtencãoBasica/Ministerio da Saude, p. 97-110. Brasilia: Ministerio da Saude, 2012.

SCHNEIDER M, EFFERTH T, ABDEL-AZIZ H. Anti-inflammatory Effects of Herbal Preparations STW5 and STW5-II in Cytokine-Challenged Normal Human Colon Cells.FrontPharmacol.2016 Oct26;7:393. SLEEBOOM JJF, ESLAMI AMIRABADI H, NAIR P, SAHLGREN CM, DEN TOONDER JMJ. Metastasis in context: modeling the tumor microenvironment with cancer-on-a-chip approaches. DisModelMech. 2018 Mar 16;11(3). SOUSA, E. L. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE

Himatanthusdrasticus (Mart.) Plumel- APOCYNACEAE (Janaguba). 2009. 93 f.

Dissertação (mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade Federal de

Pernambuco. CCS. Ciências farmacêuticas, 2009

WACZUK, E. P. AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DO EXTRATO AQUOSO DAS

RAMOS DE E. tirucalliL. IN VITRO. 2014. 78 p.Dissertação (mestrado em

Bioquímica) – Universidade federal do Pampa, 2014.

XIE, X et al. The mTOR–S6K pathway links growth signalling to DNA damage response by targeting RNF168. Nature Cell Biology, [s.l.], v. 20, n. 3, p.320-331, 5 fev. 2018. Springer Nature. http://dx.doi.org/10.1038/s41556-017-0033-8.

57

WANI NA, ZHANG B, TENG KY, BARAJAS JM, MOTIWALA T, HU P, YU

L, BRÜSCHWEILER R, GHOSHAL K, JACOB ST. Reprograming of Glucose

Metabolism by Zerumbone Suppresses Hepatocarcinogenesis. Mol Cancer

Res. 2018 Feb;16(2):256-268.

WEIS, S. M; CHERESH, D. A. Tumor angiogenesis: molecular pathwaysandtherapeutictargets. Nature Medicine. (17)11, 1359: 1370, 2011.

ZITVOGEL, L; TESNIERE, A; KROEMER. G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Immunology. Nature (6) 715:727, 2006.

58

9. OUTRAS ATIVIDADES

9.1 Treinamento em cultura de células ministrados para alunos do sexto

semestre de Sistemas Biomédicos (SBio) para realização dos Trabalhos de

Graduação.

9.2 Colaboração no desenvolvimento de três trabalhos de graduação de

alunos de SBio que foram apresentados em dezembro de 2017, são eles:

Título do trabalho: Efeito in vitro da nanopartícula de carbono

carreada com Casearia sylvestris(Guaçatonga) sobre células

tumorais.

Aluno (a): Vanessa Batista Fabri

Orientador: Profa. Dra. Elaine Conceição de Oliveira

Título do trabalho: Efeito Antiproliferativo de Óleos Essenciais Sobre

Linhagens Tumorais in vitro: Avaliação do Hidrogel de Acetato de

Celulose (HGAC)

Aluno (a): Julie Andressa Silva Melo

Orientador: Profa. Dra. Elaine Conceição

Título do trabalho: Potenciais efeitos genotóxicos de extratos de

plantas medicinais utilizadas em fitoterapia

Aluno (a): Lucas Fernandes Rêgo da Silva

Orientador: Profa. Dra. Silvia Pierre Irazusta

59

9.3 Apresentação de trabalhos

Os resultados obtidos através deste estudo serão apresentados na XVI

Semana de Fitoterapia como pode ser visto na cópia do e-mail:

“Boa tarde Ketsia e Elaine! Agradecemos muito pelo envio do seu trabalho Látex do Avelós (Euphorbiatirucalli) e da Janaúba (Himathanthusdrasticus) modificam a expressão de proteínas intracelulares nas células de Carcinoma Pulmonar de Lewis in vitro para a XVI Semana de Fitoterapia Walter Radamés Accorsi- Plantas medicinais: Saúde para o Bem-viver. Informamos que seu trabalho foi selecionado para APRESENTAÇÃO NA FORMA DE PÔSTER. As apresentações de pôster ocorrerão no dia 18 de abril as 13:00. Pedimos que os pôsteres sejam afixados no máximo até as 12:00 do dia 18 de abril. O formato do poster está descrito em NORMAS PARA APRESENTAÇÃO DO POSTER no link: http://semanadefitoterapia.wixsite.com/start-from-scratch/blank-fbl49 Para mais informações, acesse o site da Semana de Fitoterapia: http://semanadefitoterapia.wixsite.com/start-from-scratch” A aluna é co-autora de outro trabalho que será apresentado no mesmo evento.