Tópicos em Tópicos em bioquímica: DNA E bioquímica: DNA E CROMOSSOMOSCROMOSSOMOS

CROMOSSOMOS E CROMOSSOMOS E SUBDOMÍNIOS SUBDOMÍNIOS

CROMOSSOMICOS CROMOSSOMICOS CONSTITUEM UNIDADES CONSTITUEM UNIDADES DISTINTAS NO NÚCLEO DISTINTAS NO NÚCLEO

INTERFÁSICOINTERFÁSICO

INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO Os cromossomos formam territórios Os cromossomos formam territórios

distintos no núcleo interfásico, distintos no núcleo interfásico, delimitando domínios formados pelos delimitando domínios formados pelos seus braçosseus braços

Recentemente, relações espaciais e Recentemente, relações espaciais e funcionais tem sido descritas entre funcionais tem sido descritas entre domínios e territórios cromossômicos domínios e territórios cromossômicos (fábricas de DNA e RNA, fatores de (fábricas de DNA e RNA, fatores de splicing, etc)splicing, etc)

Territórios Territórios cromossômicos e seus cromossômicos e seus domínios:domínios:

Territórios cromossômicos

Domínios cromossômicos

Antes de fazer inferências entre Antes de fazer inferências entre estrutura e função da cromatina, estrutura e função da cromatina, deve-se então compreender como é a deve-se então compreender como é a organização espacial da cromatina.organização espacial da cromatina.

A QUESTÃO ENTÃO É: A QUESTÃO ENTÃO É:

OS CROMOSSOMOS NO NÚCLEO OS CROMOSSOMOS NO NÚCLEO INTERFÁSICO ESTÃO SOBREPOSTOS INTERFÁSICO ESTÃO SOBREPOSTOS OU FORMAM TERRITÓRIOS OU FORMAM TERRITÓRIOS MUTUAMENTE EXCLUSIVOS?MUTUAMENTE EXCLUSIVOS?

MATERIAL E MÉTODOS:MATERIAL E MÉTODOS:Cultura das células:Cultura das células:

As células das linhagens HA-1 e V79 foram As células das linhagens HA-1 e V79 foram incubadas em MEM com Sais de Hanks incubadas em MEM com Sais de Hanks contendo FCS, glutamina, penicilina, contendo FCS, glutamina, penicilina, streptomicina a 37 °C e 2% COstreptomicina a 37 °C e 2% CO22..

Marcação das células:Marcação das células:A replicação foi marcada com IdUrd (iodo-A replicação foi marcada com IdUrd (iodo-

desoxi-uridina) e com CldUrd (cloro-desoxi-uridina) e com CldUrd (cloro-desoxi-uridina) por meio de dois métodos:desoxi-uridina) por meio de dois métodos:

– FUSÃO DE NÚLCEOS FUSÃO DE NÚLCEOS – MARCAÇÃO SEQUENCIALMARCAÇÃO SEQUENCIAL

Timidinas Análogas:Timidinas Análogas:

Br

ClI

substituição

MÉTODO DE MARCAÇÃO I: FUSÃO DAS MÉTODO DE MARCAÇÃO I: FUSÃO DAS CÉLULASCÉLULAS

Consistiu em obter núcleos com diferentes Consistiu em obter núcleos com diferentes cromossomos marcados a partir da fusão cromossomos marcados a partir da fusão de núcleos de duas populações de células de núcleos de duas populações de células marcadas diferentementemarcadas diferentemente

IdUrd

CldUrd

Shake-off +fusão(das mitóticas)

Plaqueamento das células

Núcleo das células fundidas

MÉTODO DE MARCAÇÃO II: MARCAÇÃO MÉTODO DE MARCAÇÃO II: MARCAÇÃO SEQUENCIALSEQUENCIALNa 1ª fase S, IdUrd foi incorporadoNa 1ª fase S, IdUrd foi incorporadoAs células foram lavadas e cultivadas As células foram lavadas e cultivadas

durante uma 2ª fase S em meio contendo durante uma 2ª fase S em meio contendo CldUrd.CldUrd.

As células passaram por uma 3ª fase S As células passaram por uma 3ª fase S sem marcaçãosem marcação

Esquema da marcação Esquema da marcação seqüencial:seqüencial:

VERIFICAÇÃO DA REPLICAÇÃO VERIFICAÇÃO DA REPLICAÇÃO MARCADA:MARCADA:Os marcadores foram detectados por Os marcadores foram detectados por

anticorpos específicos (originalmente anticorpos específicos (originalmente para BrdUrd) e um anticorpo derivado de para BrdUrd) e um anticorpo derivado de ratorato

Coloração não-específica foi bloqueadaColoração não-específica foi bloqueada CONTROLE:CONTROLE:

As células foram comparadas com células As células foram comparadas com células não marcadas e coradas com o marcador não marcadas e coradas com o marcador de DNA TROPO-3de DNA TROPO-3

Detecção da marcação Detecção da marcação por por imunofluorescencia:imunofluorescencia:

Reconhecem os

marcadores

Reconhecem os anticorpos

VISUALIZAÇÃO E ANÁLISE:VISUALIZAÇÃO E ANÁLISE:Utilizou-se um microscópio de Utilizou-se um microscópio de

fluorescência e o registro foi feito com fluorescência e o registro foi feito com uma câmera CCDuma câmera CCD

Foram feitas imagens das fusões e Foram feitas imagens das fusões e marcações seqüenciais utilizando o marcações seqüenciais utilizando o CLSMCLSM

Para determinar se havia sobreposições Para determinar se havia sobreposições espaciais realizou-se a marcação com espaciais realizou-se a marcação com FICT e Texas Red e registrou-se e FICT e Texas Red e registrou-se e analisou-se as elevações cromáticasanalisou-se as elevações cromáticas

RESULTADOSRESULTADOS O experimento O experimento

controle mostrou que controle mostrou que a morfologia nuclear a morfologia nuclear e a estrutura da e a estrutura da cromatina não foi cromatina não foi alterada.alterada.

Todos os Todos os cromossomos foram cromossomos foram uniformemente uniformemente marcadosmarcados

Os núcleos fundidos Os núcleos fundidos apresentaram um apresentaram um mosaico de domínios mosaico de domínios com ou outro com ou outro marcador, com pouca marcador, com pouca sobreposição. sobreposição.

As bordas entre os As bordas entre os cromossomos estavam cromossomos estavam bem definidasbem definidas

Confirmando assim a Confirmando assim a discrição dos territórios discrição dos territórios e domíniose domínios

CldUrd

(em verde)

IdUrd (em vermelho)

A marcação seqüencial A marcação seqüencial revelou um mosaico de revelou um mosaico de domínios distintos contendo domínios distintos contendo exclusivamente IdUrd, exclusivamente IdUrd, CldUrd ou nenhuma CldUrd ou nenhuma marcação. marcação. Indicando Indicando também a idéia de unidades também a idéia de unidades discretasdiscretas

Revelou também Revelou também subdomínios formados por subdomínios formados por (SCEs) formando um (SCEs) formando um arlequimarlequim

+ IdUrd

1ª fase S

+ CldUrd

2ª fase S

3ª fase S

Os sinais utilizados para verificar o Os sinais utilizados para verificar o cruzamento da área de borda, mostrou cruzamento da área de borda, mostrou que havia limitada sobreposiçãoque havia limitada sobreposição

Para verificar se ocorria um erro na técnica Para verificar se ocorria um erro na técnica de visualização foi feito um experimento de visualização foi feito um experimento controle e visualização com linescancontrole e visualização com linescan

Comparações com Comparações com linescan:linescan:

Experimento: Controle:

Admitiu-se que Admitiu-se que houve uma houve uma pequena pequena sobreposição sobreposição

Sobreposição

A Cromatina A Cromatina apresentou regiões apresentou regiões semelhantes a fibras semelhantes a fibras que admitiam que admitiam disposições disposições irregulares e nunca irregulares e nunca contendo ambas as contendo ambas as marcações.marcações.

DISCUSSÃODISCUSSÃO Baseando-se nas duas abordagens Baseando-se nas duas abordagens

amostradas, os territórios amostradas, os territórios cromossômicos são estruturas distintas cromossômicos são estruturas distintas e contém subdomínios discretose contém subdomínios discretos

Os cromossomos podem penetrar em Os cromossomos podem penetrar em regiões de outros, mas sem se regiões de outros, mas sem se misturar, tomando formas irregularesmisturar, tomando formas irregulares

Não se pode, porem excluir a Não se pode, porem excluir a possibilidade alguma sobreposição, possibilidade alguma sobreposição, com pequena quantidade de DNA com pequena quantidade de DNA envolvidaenvolvida

Esta parece ser uma característica Esta parece ser uma característica comum a todos os eucariotoscomum a todos os eucariotos

Nos locais onde ocorreu as SCEs ocorreu Nos locais onde ocorreu as SCEs ocorreu súbita mudança de marcação indicando súbita mudança de marcação indicando que há um alto grau de que há um alto grau de compartimentalização nos territórioscompartimentalização nos territórios

Estruturas similares às fibras Estruturas similares às fibras observadas foram relatadas em estudos observadas foram relatadas em estudos in vivoin vivo. Onde especula-se que elas . Onde especula-se que elas possam corresponder a um alto grau de possam corresponder a um alto grau de dobramento da cromatinadobramento da cromatina

Não se pode, porem excluir a Não se pode, porem excluir a possibilidade alguma sobreposição, com possibilidade alguma sobreposição, com pequena quantidade de DNA envolvidapequena quantidade de DNA envolvida

Processos raros de mistura pode ocorrer Processos raros de mistura pode ocorrer em regiões de SCEs ou união de dois em regiões de SCEs ou união de dois domínios domínios

(ex: duas fábricas de cromossomos (ex: duas fábricas de cromossomos diferentes se unirem).diferentes se unirem).

União de domínios (raro)

Experimentos com vimentina Experimentos com vimentina corroboram com a idéia de corroboram com a idéia de territóriosterritórios

Experimentos com FISH não são tão Experimentos com FISH não são tão eficientes pois marcam apenas eficientes pois marcam apenas alguns cromossomosalguns cromossomos

No leptóteno da espermatogênese No leptóteno da espermatogênese poderia ocorrer mistura dos poderia ocorrer mistura dos domíniosdomínios

Por fim:Por fim: Uma questão sobre este tema ainda Uma questão sobre este tema ainda

permanece: permanece: Como as fibras estão Como as fibras estão organizadas dentro de um território?organizadas dentro de um território?– Cromatina dobrada e altamente misturadaCromatina dobrada e altamente misturada– Subdomínios não se sobrepõemSubdomínios não se sobrepõem– Teorias de organização funcional (não Teorias de organização funcional (não

espacial)espacial)

Os resultados do trabalho sugerem que Os resultados do trabalho sugerem que há uma organização estrita da há uma organização estrita da cromatina em unidades discretas, cromatina em unidades discretas, promovendo uma base para elucidar promovendo uma base para elucidar estudos de relações entre estrutura e estudos de relações entre estrutura e função.função.

MORAL DA HISTÓRIA:MORAL DA HISTÓRIA:

Sua visão de cromatina antes

da aula:

Sua visão de cromatina depois

da aula: