Trabalho n 1

7/25/2019 Trabalho n 1

http://slidepdf.com/reader/full/trabalho-n-1 1/7

Trabalho nº 1

Determinação de Constantes Cinéticas naActividade da Invertase de Células de

Saccharomyces bayanus

Laboratórios de Engenharia Biológica I

2014-2015



2

Objectivo

Este trabalho tem por objectivo a determinação dos parâmetros cinéticos da

hidrólise da sacarose pela enzima invertase de células de Saccharomyces

bayanus.

invertase

SACAROSE GLUCOSE + FRUTOSE

+ H2O

Pretende-se determinar os parâmetros cinéticos desta reacção à

temperatura de 45ºC.

Introdução

As enzimas são biocatalisadores de natureza proteica que participamnas reacções químicas que ocorrem nos seres vivos. São muito específicos e

capazes de alterar o seu estado de actividade (reguláveis).

Aproveitados desde a antiguidade, as enzimas, uma vez conhecidos a

sua natureza e mecanismos de acção, têm sido progressivamente utilizadas

nas indústrias alimentar, têxtil e farmacêutica.

A cinética de reacções catalisadas por enzimas pode ser descrita pelaequação de Michaelis-Menten, que corresponde à equação :

om

omáxo

S K

S v

.

em que o é a velocidade inicial da reacção, So a concentração inicial de

substrato e máx e K m as constantes cinéticas ( Figura 1), sendo máx

proporcional `a concentração total de enzima.



3

K m So

vo

vmáx

vmáx

2

Figura 1. Representação gráfica da equação de Michaelis-Menten

Os valores de máx e K m podem ser determinados através da medição

das velocidades iniciais da reacção a diferentes concentrações iniciais desubstrato. Geralmente, recorre-se à representação gráfica de Lineweaver-

Burk, baseada num rearranjo da equação de Michaelis-Menten:

máxomáx

m

o S

K

11.

1

Esta equação representa uma recta e as constantes cinéticas retiram-se dosvalores do declive e da ordenada na origem ( Figura 2).



4

-1/K m

1/vmáx

1/So

1/vo

Figura 2 - Representação gráfica de Lineweaver-Burk

para determinação de parâmetros cinéticos.

Parte Experimental

A reacção será conduzida a 45ºC. As soluções de substrato (sacarose) são

preparadas em tampão acetato 20 mM pH 4,5, contendo 1% (p/v) de cloreto

de cálcio. Serão previamente preparadas todas as soluções necessárias.

Concentração de sacarose a usar:

10, 15, 25, 35, 45, 55, 70, 100 g/L

1. Suspensão de células

Preparar uma suspensão a 1% (p/v) da levedura S. bayanus em água destilada.



5

2. Ensaios

2.1. Para cada concentração de substrato, medir 25 ml de solução de sacarose

(contendo 1% (p/v) de cloreto de cálcio) para o reactor, e termostatizá-la a

45ºC (cerca de 5 minutos), com agitação. Executar os ensaios por ordemcrescente de concentração.

2.2 Retirar uma amostra de 0,5 ml, correspondente ao tempo zero.

2.3 Adicionar 0,5 ml de suspensão de células marcando simultaneamente o

início da contagem do tempo.

2.4 Retirar amostras de 0,5 ml de 1 em 1 minuto até se completarem 9 minutos

de reacção.

3. Determinação de açúcares redutores

Determinar a concentração de açúcares redutores (glucose+frutose) nasamostras pelo método do DNS (apêndice I).

Tratamento de Resultados

1. Determinar as velocidades iniciais de reacção, para cada concentração

inicial de sacarose.

2. Calcular as constantes cinéticas, através da representação gráfica de

Lineweaver-Burk e por ajuste directo à equação de Michaelis-Menten.



6

Referências

Taipa, M.A., Gama, F.M. (2003) Estrutura e Função de Enzimas. Em

“Engenharia Enzimática”, Gama, M., Aires-Barros, M.R., Cabral, J.M.S.(Eds), Lidel-Edições Técnicas, Cap. 2, pp. 13-67.

Laidler, K.J. e Bunting, P.S. (1973) “The Chemical Kinetics of Enzyme

Action”, 2nd Ed., Clarendon Press, Oxford, UK

Shuler, M.L. e Kargi, F. (1992) “Bioprocess Engineering - Basic Concepts”,

Prentice hall Inc, USA



7

APÊNDICE I

Determinação de açúcares redutores pelo método do DNS

Este método baseia-se na formação de um complexo acastanhado, porredução do ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS) a 3-amino-5-nitrossalicílico,

que pode ser doseado colorimetricamente.

Método

Medir 0,5 ml do reagente de DNS para um tubo de ensaio.Adicionar-lhe 0,5 ml da amostra a analisar. Cobrir o tubo com uma tampametálica e colocá-lo durante 5 minutos num banho de água a 100ºC. Arrefecer

o tubo com água fria e adicionar-lhe 5 ml de água destilada, agitando de

seguida num vórtex. Ler a densidade óptica desta solução a 540 nm, contra aamostra do tempo zero que sofreu o mesmo tratamento.

Curva de calibração

A curva de calibração é obtida com soluções-padrão de glucose, com

concentrações até 1 g/l, que sofrem o mesmo tratamento das amostras.

Trabalho n 1

Documents

Transcript of Trabalho n 1