Transformacao de Plantas

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  • ISSN 1517 - 5111

    Dezembro, 2003 102

    Transformao de Plantas

    Ministrio da Agricultura,

    Pecuria e Abastecimento

  • Documentos 102

    Transformao de Plantas

    Planaltina, DF2003

    ISSN 1517-5111

    Dezembro, 2003Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuriaEmbrapa CerradosMinistrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

    Solange Rocha Monteiro de Andrade

  • Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na:

    Embrapa CerradosBR 020, Km 18, Rod. Braslia/FortalezaCaixa Postal 08223CEP 73310-970 Planaltina - DFFone: (61) 388-9898Fax: (61) 388-9879htpp\[email protected]

    Comit de Publicaes

    Presidente: Dimas Vital Siqueira ResckEditor Tcnico: Carlos Roberto SpeharSecretria-Executiva: Nilda Maria da Cunha Sette

    Superviso editorial: Jaime Arbus CarneiroReviso de texto: Jaime Arbus Carneiro

    Maria Helena Gonalves TeixeiraNormalizao bibliogrfica: Shirley da Luz SoaresEditorao eletrnica: Jussara Flores de OliveiraIlustraes: Chaile Cherne Soares EvangelistaCapa: Chaile Cherne Soares EvangelistaEditorao eletrnica: Jussara Flores de Oliveira

    Wellington CavalcantiImpresso e acabamento: Divino Batista de Souza

    Jaime Arbus Carneiro

    Impresso no Servio Grfico da Embrapa Cerrados

    1a edio1a impresso (2003): tiragem 100 exemplares

    Todos os direitos reservados.A reproduo no-autorizada desta publicao, no todo ou emparte, constitui violao dos direitos autorais (Lei n 9.610).

    CIP-Brasil. Catalogao na publicao.Embrapa Cerrados.

    Embrapa 2003

    Andrade, Solange Rocha Monteiro de.

    Transformao de plantas / Solange Rocha Monteiro de Castro. Planaltina, DF : Embrapa Cerrados, 2003.

    28 p. (Documentos / Embrapa Cerrados, ISSN 1517-5111; 102)

    1. Melhoramento vegetal. 2. Transformao de plantas.3. Transformao gentica. I. Ttulo. II. Srie.

    631.5233 - CDD 21

    A553t

  • Autora

    Solange Rocha Monteiro de AndradeBil., Doutora em Gentica e Melhoramento de PlantasEmbrapa [email protected]

  • Apresentao

    A transformao de plantas uma ferramenta com alto potencial para aplicao

    no melhoramento vegetal e em outras reas, como na medicina e na nutracutica.

    Os mtodos de transformao permitem a obteno de cultivares com novas

    caractersticas, nem sempre possveis de serem alcanadas por mtodos

    convencionais.

    Alguns exemplos de cultivares com essas caractersticas so o milho e o algodo

    Bt, resistentes aos insetos; a soja RR, tolerante ao herbicida glifosato; o arroz

    dourado, com maior contedo de -caroteno, visando diminuir a deficincia devitamina A. Todos esses materiais j esto disponveis aos produtores.

    Entretanto, as pesquisas continuam e novos transgnicos esto sendo

    desenvolvidos contendo outras caractersticas como melhoria da qualidade

    nutricional e produo de biofrmacos.

    A polmica a respeito das plantas transgnicas ocorre, principalmente, devido ao

    desconhecimento da populao sobre o assunto. A publicao de documentos

    relativos a transgnicos evidenciando os mtodos e suas aplicaes

    fundamental para informar a populao e diminuir essa polmica. A Embrapa,

    com a publicao dos livros Cultura de Tecidos e Transformao Gentica de

    Plantas, tem ajudado nesse sentido. No entanto, ainda existe a necessidade de

    publicaes de carter mais bsico, visando atingir o pblico leigo, mas curioso

    sobre o assunto.

  • Esta publicao teve como objetivo apresentar os conceitos bsicos da

    transformao de plantas, explicando cada um deles de forma clara e concisa,

    alm de descrever cada etapa do processo, sua aplicao e a utilizao de

    transgnicos no mundo.

    Roberto Teixeira AlvesChefe-Geral da Embrapa Cerrados

  • Sumrio

    Introduo .................................................................................... 9

    Etapas da Transformao .............................................................. 10

    Identificao, clonagem e isolamento do gene ............................... 10

    Mtodos de Transformao ........................................................... 13

    Transformao indireta ............................................................. 13

    Transformao via Agrobacterium .......................................... 13

    Transformao direta ............................................................... 16

    Biolstica ............................................................................ 16

    Eletroporao ..................................................................... 19

    Outras metodologias ............................................................ 20

    Microinjeo....................................................................... 20

    Transformao de Plen ....................................................... 21

    Lipossomos ........................................................................ 21

    Histrico da Comercializao de Transgnicos no Mundo ..................... 21

    Aspectos Futuros ......................................................................... 23

    Referncias Bibliogrficas .............................................................. 23

    Abstract .................................................................................... 28

  • Transformao de PlantasSolange Rocha Monteiro de Andrade

    Introduo

    Durante sculos o homem, por meio de cruzamentos intra-especficos, vem

    manipulando geneticamente plantas para obter cultivares com caractersticas

    superiores aos genitores. No entanto, os mtodos convencionais de

    melhoramento apresentam limitaes como a ligao gnica, a incompatibilidade

    sexual, alm de longos perodos de seleo para a obteno da expresso da

    caracterstica desejada. O desenvolvimento de mtodos de transformao gerou

    possibilidades de grandes avanos no melhoramento vegetal, pois, oferece a

    oportunidade de introduzir genes de origem vegetal, animal ou microrganismo

    em cultivares elites, quebrando barreiras interespecficas impossveis no mtodo

    convencional, diminuindo o efeito das ligaes gnicas e o tempo de obteno

    de novas cultivares.

    A transformao gentica a transferncia controlada de genes para o genoma

    de um organismo vivo por via no sexual (TORRES et al., 2000). Pode-se

    definir plantas transgnicas como aquelas que apresentam genes diferentes do

    genoma original obtidos por tcnicas de engenharia gentica (GANDER;

    MARCELLINO, 1997; TORRES et al., 2000). A obteno de plantas

    transgnicas abre novo caminho a ser explorado no melhoramento vegetal e

    tambm permite estudos de desenvolvimento e crescimento vegetal,

    metabolismo, bioqumica, regulao e expresso de genes. As plantas

    michelleTORRES et al., 2000).

    michelleGANDER;MARCELLINO, 1997;

    michelleTORRES et al., 2000).

  • 10 Transformao de Plantas

    transgnicas podem ser utilizadas para extrao de produtos medicinais, vacinas

    transgnicas e produo de anticorpos e metablitos de interesse especfico

    (BRASILEIRO; DUSI, 1999).

    As etapas de transformao consistem na identificao do gene de interesse, seu

    isolamento e clonagem, introduo em clulas ou tecidos vegetais, seleo in

    vitro de clulas transformadas, regenerao de plantas transgnicas, anlisesmoleculares, avaliao em casa de vegetao e campo (Figura 1). Embora a

    manipulao do DNA abra diversas frentes para o melhoramento, vrios fatores

    podem afetar o sucesso da obteno das plantas transformadas, como: a

    integrao do DNA no genoma hospedeiro, a expresso, a herana e a

    estabilidade desse DNA exgeno; problemas de regenerao do explante;

    disponibilidade de genes de interesse e aspectos relacionados biossegurana

    (BRASILEIRO; DUSI, 1999).

    Existem diversos mtodos de transformao, porm, a escolha depende da

    espcie a ser transformada, do tipo de explante utilizado (clula, tecido,

    protoplastos), da capacidade de regenerao do explante, da disponibilidade de

    materiais. Entre os principais mtodos esto:

    1) transformao mediada por Agrobacterium;

    2) biolstica;

    3) eletroporao.

    Etapas da Transformao

    Identificao, clonagem e isolamento do geneA identificao e a localizao de genes de interesse na agricultura so um dos

    entraves para a obteno de transgnicos. Programas de seqenciamento de

    genomas de diversas espcies vegetais, animais e microrganismos tm sido

    realizados em todo o mundo com o intuito de identific-los. No entanto, ainda

    pequeno o conhecimento dos genes relacionados ao aumento de produtividade,

    resistncia a estresses biticos e abiticos, qualidade nutricional e outras

    caractersticas de interesse.

    michelleBRASILEIRO; DUSI, 1999).

    michelleFigura 1).

    michelleBRASILEIRO; DUSI, 1999).

  • 11Transformao de Plantas

    Figura 1. Etapas da transformao: Identificao dos genes, isolamento, clonagem,

    transformao gentica e avaliao da transformao.

    Identificao do gene

    de interesse

    Isolamento

    Clonagem Enzimas derestrio

    Insero dogene

    Multiplicaodo gene

    Transformao

    Testes finais

    Bactria incubadacom clulas vegetais

    Transferncia do gene para o

    genoma da planta

    insero do gene no plasmdio Ti

    DNA adsorvido emMicropartculas

    Clulas bombardeadase insero do gene

    no genoma da planta

    Clulas selecionadas para o transgene

    Clulas transformadas selecionadas por

    um marcador

    Anlises moleculares

    Anliseda prognie

    Planta transgnicaregenerada de uma clula transformada

    Replicao do gene

    AgrobacteriumA

    BombardeamentoB

    Seleo das clulas contendo o transgene

    C

    Gene de interresse

    Testes em casa devegetao e no campo

    1 2 3 5 6 7 8

  • 12 Transformao de Plantas

    Nesta primeira etapa (Figura 2) que precede clonagem (amplificao embactrias vetores), necessria uma srie de modificaes do gene antes queseja utilizado por um mtodo de transformao. Nesse processo, empregam-setcnicas de engenharia gentica nas quais enzimas de restries e DNA ligasesso amplamente empregadas como ferramentas para manipular o DNA. Essasenzimas so capazes de cortar o DNA de diferentes origens e, por meio da uniodos fragmentos resultantes gerar molculas novas, denominadas de DNArecombinante. Existe uma especificidade das enzimas de restrio, pois o DNAsempre cortado em locais precisos (em determinada seqncia de bases), ereconhece o stio de corte do DNA em qualquer espcie, tanto vrus, quantoplantas ou animais (GANDER; MARCELLINO, 1997; DELU FILHO et al., 1999).

    +

    Enzimas derestrio

    Multiplicao doplasmdio

    Multiplicao dabactria

    Transformao dabactria

    Insero dogene

    Plasmdiorecombinante

    Figura 2. Isolamento e

    clonagem do gene.

    michelleGANDER; MARCELLINO, 1997;

    michelleDELU FILHO et al., 1999).

  • 13Transformao de Plantas

    Geralmente, o gene assim obtido contm uma seqncia promotora o gene deinteresse uma seqncia terminadora e um gene marcador de seleo (Figura3). A seqncia promotora necessria para a correta expresso do gene, poisas enzimas responsveis pela transcrio do gene reconhecem essa regio e seacoplam a ela para que ocorra o processo. A seqncia terminadora importantepara finalizar o processo de transcrio do gene. E, para seleo das clulastransformadas, preciso um marcador de seleo, em geral, um gene deresistncia a antibiticos ou a herbicidas.

    Figura 3. Esquema da construo de um gene para transformao gentica.

    Mtodos de Transformao

    Transformao indiretaA transformao indireta consiste no uso de um vetor, como a Agrobacterium,para intermediar a transferncia de DNA.

    Transformao via AgrobacteriumAs bactrias do gnero Agrobacterium so fitopatgenos com a capacidadenatural de transferir DNA para algumas espcies de dicotiledneas, induzindo aformao de um tumor conhecido como galha-da-coroa (crown gall) ou asndrome da raiz em cabeleira (hairy root). Para haver a infeco necessrioalgum tipo de ferimento, por meio do qual a agrobactria vai reconhecer a plantae iniciar a transferncia do DNA. Fitopatologistas descobriram que, mesmodepois da desinfeco das plantas, os sintomas permaneciam, sugerindo apresena de um fator determinante nas plantas infectadas. Mais tarde, esse fatorfoi identificado como um fragmento do DNA oriundo da agrobactria,denominado T-DNA ou DNA de transferncia. Esse fragmento era integrado aogenoma vegetal e se expressava de maneira estvel. Assim, foi descoberto e, pormeio de manipulao gentica, desenvolvido o primeiro mtodo detransformao (Figura 4) (CHILTON et al., 1977, 1982; HERRERA-ESTRELLAet al., 1993; WHITE, 1993; BRASILEIRO, 1993; VAN SLUYS, 1999).

    michelleFigura 4)

    michelleCHILTON et al., 1977,

    michelle1982;

    michelleHERRERA-ESTRELLAet al., 1993;

    michelleWHITE, 1993;

    michelleBRASILEIRO, 1993;

    michelleVAN SLUYS, 1999).

  • 14 Transformao de Plantas

    Figura 4. Transformao por Agrobacterium.Adaptado de Arago et al. (1998).

    Plasmdios bacterianos so seqncias de DNA de fita dupla, com formatocircular, que apresentam duplicao autnoma e carregam alguns genes.O T-DNA faz parte do DNA plasmidial da agrobactria e, por meio da engenhariagentica, foi possvel sua manipulao para a integrao de genes de interesse.Essa manipulao consiste, basicamente, na deleo dos genes oncognicos(que causam o tumor) do T-DNA e a manuteno dos genes relacionados transferncia e replicao do plasmdio, isto , a regio vir e as extremidadesdo T-DNA. Com isso, produzem-se linhagens desarmadas, ou seja, aindavirulentas, mas no mais patognicas. Assim, genes de interesse podem serintroduzidos dentro da planta atravs de ligao com a regio desarmada doT-DNA em substituio regio T-DNA original (CHILTON et al., 1977, 1982;WALDEN et al., 1990; HOOYKAAS; BEIJERBERGEN, 1994; ZUPAN;ZAMBRYSKI, 1995).

    As bactrias da espcie Agrobacterium tumefaciens apresentam o plasmdio tipoTi (tumor-inducing) e as da espcie Agrobacterium rhizogenes, o plasmdio Ri(root-inducing). Tanto o plasmdio Ti (pTi) quanto o Ri (pRi) podem ser

    michelleCHILTON et al., 1977,

    michelle1982;

    michelleWALDEN et al., 1990;

    michelleHOOYKAAS; BEIJERBERGEN, 1994;

    michelleZUPAN;ZAMBRYSKI, 1995).

  • 15Transformao de Plantas

    integrados ao genoma da planta, sendo o sistema pTi o mais conhecido eefetivo, pois abrange maior nmero de espcies hospedeiras (BRASILEIRO,1993; GANDER; MARCELLINO, 1997; VAN SLUYS, 1999).

    Embora aparentemente simples, essa tcnica possui algumas limitaes. Aprincipal refere-se ao tipo de hospedeiro. A Agrobacterium pode colonizar amploespectro de espcies de dicotiledneas, porm, coloniza poucas espcies demonocotiledneas. Mesmo entre as dicotiledneas, a susceptibilidade diferemuito entre as espcies e dentro delas, variando em funo da interao com ohospedeiro. A razo dessa limitao no bem conhecida, mas pode ser devida ausncia de stios de reconhecimento para a bactria na superfcie da planta ouinibio da induo dos genes de transferncia (genes vir), ou ao efeito inibitriodo balano hormonal de auxinas e citocininas das monocotiledneas (GRANTet al., 1993). Portanto, uma etapa inicial importante para obteno detransformantes por meio de Agrobacterium a determinao da melhorcombinao patgeno-hospedeiro para determinada espcie (DRAPERet al., 1988; LACORTE; MANSUR, 1993).

    Estudos mais recentes relatam a susceptibilidade de espcies consideradasrecalcitrantes Agrobacterium, como: o milho, o arroz e o feijoeiro(BRASILEIRO; LACORTE, 1998). Segundo Trick e Finer (1997), tanto a bactriaquanto o tecido-alvo podem ser manipulados para obter a transformao dessasplantas. Modificaes no vetor binrio da Agrobacterium capacitaram atransformao eficiente do arroz e do milho. A adio de antioxidantes no meiode co-cultivo aumentou as taxas de transformao pela reduo da respostahipersensvel, assim como, diferentes mtodos de ferimento do tecido-alvotambm tm sido empregados para aumentar a infeco por Agrobacterium(GODWIN et al., 1992; SONGSTAD et al., 1995).

    Havendo interesse em ajustar a interao entre Agrobacterium e um hospedeirono qual no existem descries prvias de transferncia do T-DNA, deve-se levarem considerao os seguintes fatores: a) cepa da bactria; b) gentipo dohospedeiro e fisiologia do explante; c) condies de co-cultivo; d) marcadores deseleo utilizados. Parmetros-chave para a transferncia por Agrobacteriumincluem o gentipo da bactria e da planta; tratamento com indutores dos genesvir (acetoceringona, extrato de clulas feridas, clulas alimentadoras, acares),pH, temperatura, concentrao das clulas, condies de luminosidade, duraodo tempo de co-cultivo, tipo de explante, qualidade da pr-cultura, tratamentocom fito-hormnios (GODWIN et al., 1992; GRANT et al., 1993; BIRCH,1997).

    michelleBRASILEIRO,1993;

    michelleGANDER; MARCELLINO, 1997;

    michelleVAN SLUYS, 1999).

    michelleGRANTet al., 1993).

    michelleDRAPERet al.,

    michelleLACORTE; MANSUR, 1993).

    michelle1988;

    michelleBRASILEIRO; LACORTE, 1998).

    michelleTrick e Finer (1997),

    michelleGODWIN et al., 1992;

    michelleSONGSTAD et al., 1995).

    michelleGODWIN et al., 1992;

    michelleGRANT et al., 1993;

    michelleBIRCH,1997).

  • 16 Transformao de Plantas

    Outro ponto limitante da tcnica a capacidade de regenerao do tecidotransformado. A eficincia da transferncia via Agrobacterium varia drasticamentepara diferentes espcies vegetais, cultivares ou tecidos. freqente obterculturas de clulas in vitro com alta capacidade de transformao, porm, elasno so competentes, isto , no so capazes de regenerar novas plantas. Comoexemplo, podem-se citar clulas derivadas de protoplastos ou suspenses bemestabelecidas de cultura celular de tecido. Essa ampla variao na eficincia podeser devida ao regime de cultura de tecido, s condies nas quais as plantasesto crescendo ou mesmo cepa de Agrobacterium utilizada (DRAPER et al.,1988; HOOYKAAS, 1995).

    Por fim, o tamanho e a complexidade do plasmdio Ti tambm interferem nessacapacidade de transformao. Genes destinados transferncia so,primeiramente, manipulados in vitro e, em seguida, incorporados em um simplesplasmdio transportador (sistema co-integrativo) ou, num plasmdio maiscomplexo e sofisticado e com maior limite de hospedeiros (sistema binrio)(DRAPER et al., 1988).

    No entanto, as vantagens relacionadas habilidade natural da Agrobacterium emtransferir seqncias definidas de DNA podem ser exploradas com o intuito dedesenvolver novas variedades de plantas transformadas. Alm do mais, depoisda transformao e obteno de plantas adultas, os novos genes integrados aogenoma hospedeiro so transmitidos s prognies seguindo uma heranamendeliana.

    Transformao diretaCom o intuito de obter mtodos de transformao independentes do gentipo,vrias tcnicas de transferncia direta de DNA foram desenvolvidas. Atransformao direta consiste no uso de mtodos qumicos ou fsicos e,atualmente, as duas principais so a biolstica e a eletroporao.

    BiolsticaA biolstica tambm conhecida como gene gun (arma de genes), acelerao departculas ou bombardeamento com micropartculas (CHRISTOU, 1992; DEBLOCK, 1993; BIRCH, 1997). O mtodo descrito pelo grupo do Dr. Sanford daUniversidade de Cornell (KLEIN et al., 1987; SANFORD et al., 1987), consisteem bombardear clulas ou tecidos com micropartculas de tungstnio ou ourocarregando o DNA exgeno, lanadas a partir de um acelerador e por meio deuma cmara especial em condio de vcuo (Figura 5). O mecanismo visapenetrar na parede celular e na membrana plasmtica as duas principais barreiras transferncia direta de DNA (SANFORD, 1990).

    michelleDRAPER et al.,1988;

    michelleHOOYKAAS, 1995).

    michelleDRAPER et al., 1988).

    michelleCHRISTOU, 1992;

    michelleDEBLOCK, 1993;

    michelleBIRCH, 1997).

    michelleKLEIN et al., 1987;

    michelleSANFORD et al., 1987),

    michelleFigura 5).

    michelleSANFORD, 1990).

  • 17Transformao de Plantas

    Figura 5. Transformao por bombardeamento de micropartculas.A: Desenho esquemtico do aparelho de bombardeamento por presso de gs;B: Protocolo de transformao por bombardeamento de micropartculas.Adaptado de Arago et al. (1998).

    ATubo de acelerao de gs

    Disco de rupturaMembrana carreadora

    Tela de reteno

    micropartculas adsorvidas com DNA

    Tecido-alvoSuporte da placa

    Fonte de explante

    Planta transgnicaem casa de vegetao

    ExplantesBombardeamento

    com micropartculascom DNA adsorvido

    Co-cultivo emmeio slido

    Meio de induo de brotoscom agentes de seleoMeio de enraizamento

    B

    d

  • 18 Transformao de Plantas

    As micropartculas (0,2 a 4 mm de dimetro) cobertas com seqncias de cidosnuclicos a velocidades superiores a 1.500 km.h-1 penetram na parede e namembrana celular de maneira no letal, localizando-se aleatoriamente nasorganelas celulares. Uma vez dentro da clula, o DNA precipitado sobre aspartculas dissociado delas atravs da ao do lquido celular e integrado aogenoma do organismo a ser modificado (POTRYKUS, 1990; SANFORD, 1990;RECH; ARAGO, 1998).

    O processo consiste numa fonte que produz uma onda de choque para aceleraras partculas. Essa onda pode ser gerada por exploso qumica (plvora seca),descarga de hlio a alta presso ou pela vaporizao de uma gota de gua(SANFORD et al., 1987; SANFORD et al., 1991; CHRISTOU, 1995).Diferentes sistemas foram desenvolvidos com intuito de acelerar as partculas; noentanto, os sistemas que utilizam gs hlio sob alta presso e descarga eltricatm demonstrado maior eficincia na obteno dos transformantes (RECH;ARAGO, 1998; LACORTE et al., 1999).

    Nesse processo efetivo e simples, podem-se bombardear embries, hipoctilos,cotildones, discos foliares, calos ou suspenses celulares. Virtualmente,qualquer tipo de clula ou tecido pode ser utilizado para transformao. ,tambm, um mtodo til na introduo e expresso de genes em animais in vivo,e na induo da resposta imune utilizando DNA, por meio do processo deno-minado imunizao gentica (RECH; ARAGO, 1998; LACORTE et al., 1999).

    A grande vantagem da biolstica que ela permite a transformao de clulas,tecidos e espcies de forma direta, simples e rpida, sendo aplicvel paratransferncia de genes a espcies em que os outros mtodos so falhos. Aeficincia na obteno de transformantes estveis cerca de 1 a 5% dostransformantes transientes (SANFORD, 1990; POTRYKUS, 1990).

    O explante bombardeado tem de ser criteriosamente selecionado. Para issoutiliza-se um gene-reprter que possa ser facilmente detectado. Esse cuidadodeve ser tomado, pois, s vezes, so obtidas quimeras dos genes introduzidosdevido ao bombardeamento randmico de um pequeno nmero de clulas numsistema mltiplo (SANFORD, 1990). Outra desvantagem refere-se ao nmero decpias, pois freqente a integrao de cpias mltiplas, em geral, fortementeligadas. Essas cpias podem estar fragmentadas com os genes e vetores em

    michellePOTRYKUS, 1990;

    michelleSANFORD, 1990;

    michelleRECH; ARAGO, 1998).

    michelleSANFORD et al., 1987;

    michelleSANFORD et al., 1991;

    michelleCHRISTOU, 1995).

    michelleRECH;ARAGO, 1998;

    michelleLACORTE et al., 1999).

    michelleRECH; ARAGO, 1998;

    michelleLACORTE et al., 1999).

    michelleSANFORD, 1990;

    michellePOTRYKUS, 1990).

    michelleSANFORD, 1990).

  • 19Transformao de Plantas

    diferentes posies no genoma, o que pode alterar ou silenciar a expresso dosgenes exgenos (SANFORD, 1990; DE BLOCK, 1993).

    EletroporaoA eletroporao um mtodo desenvolvido como alternativa transformao viaAgrobacterium, foi inicialmente proposto para transformao de cereais e,posteriormente, a metodologia foi extendida a outras espcies vegetais. Essemtodo consiste no emprego de pulsos eltricos curtos de alta voltagem quemodificam, temporariamente, a estrutura da membrana plasmtica, induzindo aformao de poros ao longo de sua superfcie. Dessa maneira, possvelaumentar a permeabilidade da membrana, possibilitando a entrada do geneexgeno (Figura 6) (LINDSEY; JONES, 1990; POTRYKUS, 1990;SONGSTADT et al., 1995; JONES, 1995).

    A carga imposta sobre a membrana plasmtica resulta em foras eletrostticasque levam compresso e formao de poros nessa membrana. Aumentando afora do campo, observa-se sua formao primeiramente no equador doprotoplasma. O nmero e o tamanho dos poros podem aumentar at asmembranas estarem irreversivelmente danificadas. No entanto, as condies deeletroporao precisam ser escolhidas de modo que a formao de poros sejareversvel e haja recuperao dos protoplastos depois do tratamento (JONES,1995).

    Figura 6. Transformao por eletroporao.

    michelleSANFORD, 1990;

    michelleDE BLOCK, 1993).

    michelleLINDSEY; JONES, 1990;

    michellePOTRYKUS, 1990;

    michelleSONGSTADT et al., 1995;

    michelleJONES, 1995).

    michelleJONES,1995).

  • 20 Transformao de Plantas

    Os parmetros timos de qualquer tipo particular de protoplasto sodeterminados empiricamente e dependem do dimetro; qualidade (sobrevivnciaa altas voltagens, fase do ciclo da clula); fonte (por exemplo, clulas domesfilo ou de uma suspenso celular); meio de eletroporao (pH,condutividade eltrica, poder do tampo); estado fisiolgico e composio damembrana; forma do DNA introduzido (superenrolado, lineares ou relaxados); edo plasmdio utilizado. Em geral, o nmero de pulsos eltricos consecutivos aser administrado, bem como sua intensidade e durao devem inviabilizar 50%das clulas (DL50), pois, assim considera-se que dessa maneira a formao dosporos e a absoro de material exgeno seriam maximizadas (JONES, 1995).

    Na eletroporao possvel introduzir molculas de vrios tamanhos emprotoplastos ou clulas intactas, como por exemplo, DNA e RNA. Alm disso,esse mtodo, pode ser utilizado para a extrao de metablitos secundrios deuma suspenso celular (POTRYKUS, 1990).

    As limitaes referentes a esse mtodo so: obteno de protoplastos,regenerao do material transformado, tampo de transferncia que pode afetar aeficincia da transferncia do gene, bem como a sobrevivncia do protoplasto(POTRYKUS, 1990). No entanto, os mtodos esto sendo aprimorados paratransformao de clulas intactas ou digeridas parcialmente. A parede celular,embora no impea a permeabilidade da membrana uma barreira para asmolculas maiores que 5 kb (LINDSEY; JONES, 1990).

    Outras metodologiasMicroinjeoA microinjeo um processo preciso e especfico para a introduo demacromolculas dentro de uma clula ou compartimentos especficos dela, demaneira no letal. As clulas podem estar intactas ou desprovidas parcial outotalmente de suas paredes celulares. Para introduo do material exgeno,utilizam-se microscpio, micromanipuladores (micropipetas de vidro emicroseringas), cmara assptica que no sofra vibraes, com temperatura eumidade relativa controlada (NEUHAUS; SPANGENBERG, 1990; POTRYKUS,1990; NEUHAUS, 1995).

    As principais vantagens do mtodo so: a introduo de macromolculas dentroda clula ou de um compartimento celular de maneira precisa; a possibilidade decontrolar o volume introduzido na clula e a alta freqncia de transformao

    michelleJONES, 1995).

    michellePOTRYKUS, 1990).

    michellePOTRYKUS, 1990).

    michelleLINDSEY; JONES, 1990).

    michelleNEUHAUS; SPANGENBERG, 1990;

    michellePOTRYKUS,1990;

    michelleNEUHAUS, 1995).

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    (15% a 26%). A desvantagem do mtodo ser trabalhosa, requererinstrumentos caros e grande habilidade de manuseio. um mtodo que consomemuito tempo, no sendo indicado quando se deseja um grande nmero detransformantes. Por essa razo, a microinjeo pouco utilizada paratransformao vegetal (NEUHAUS; SPANGENBERG, 1990; POTRYKUS, 1990;NEUHAUS, 1995; BRASILEIRO; DUSI, 1999).

    Transformao de PlenPor esse mtodo, o plen maduro embebido em soluo com DNA e efetua-sea polinizao das flores femininas da planta. Detectam-se os transformantes logona fase inicial da plntula mediante o emprego de um gene marcador. Porm, um mtodo de baixa eficincia, difcil de reproduzir e necessita mais estudos paraaumentar a eficincia (POTRYKUS, 1990; BRASILEIRO; DUSI, 1999).

    LipossomosEsse mtodo baseia-se na utilizao de vesculas lipdicas artificiais comoveculos para introduo de partculas ou material exgeno dentro deprotoplastos. A vescula visa proteger o DNA que se encarrega do ataque deendonucleases. O mtodo requer a digesto da parede celular e incubao dessesprotoplastos com lipossomos na presena de agentes fusognicos como o PEGou o PVA com lavagem subseqente em elevado pH saturado em ons de clcio(CABOCHE, 1990; BRASILEIRO; DUSI, 1999).

    Embora parea haver maior dificuldade de incorporao de molculas maiores, omtodo pode ser empregado para encapsular e introduzir plasmdios e DNAsrecombinantes e RNA viral em protoplastos. No entanto, apresenta baixa eficin-cia de transformao estvel (CABOCHE, 1990; BRASILEIRO; DUSI, 1999).

    Histrico da Comercializao deTransgnicos no Mundo

    Em 1986, nos EUA e na Frana, foi liberado o primeiro teste em campo de umvegetal transgnico. Era uma variedade de tabaco contendo um gene deresistncia a herbicida (JAMES; KRATTIGER, 1996). A partir desse evento,vrios pases iniciaram seus testes, em campo, com vegetais transgnicos e, noperodo de 1986 a 1995, foram conduzidos 3500 testes, em 34 pases, com56 culturas. A maioria dos estudos foi conduzida nos EUA, Canad, Frana,Inglaterra, Holanda, Blgica, Argentina, Itlia, China, Alemanha, Austrlia, Chile e

    michelleNEUHAUS; SPANGENBERG, 1990;

    michellePOTRYKUS, 1990;

    michelleNEUHAUS, 1995;

    michelleBRASILEIRO; DUSI, 1999).

    michellePOTRYKUS, 1990;

    michelleBRASILEIRO; DUSI, 1999).

    michelleCABOCHE, 1990;

    michelleBRASILEIRO; DUSI, 1999).

    michelleCABOCHE, 1990;

    michelleBRASILEIRO; DUSI, 1999).

    michelleJAMES; KRATTIGER, 1996).

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    Mxico. As principais culturas estudadas foram: milho, tomate, soja, canola,batata e algodo, e as caractersticas introduzidas foram tolerncia a herbicida,resistncia a insetos, qualidade de produtos e resistncia a vrus (JAMES;KRATTIGER, 1996).

    O primeiro pas a comercializar transgnicos foi a China quando liberou, no inciodos anos 90, o plantio e a comercializao do tabaco resistente a vrus seguidopelo tomate resistente a vrus (JAMES, 1997). O tomate longa vida (FlavrSavrTM) da Calgene foi, em 1994, o primeiro transgnico aprovadocomercialmente nos EUA. Esse processo evoluiu rapidamente e, em 1996,aproximadamente 2,8 milhes de hectares de sete culturas (tabaco, algodo,soja, milho, canola, tomate, batata) estavam sendo plantados em seis pases(USA, China, Canad, Argentina, Austrlia, Mxico) (JAMES, 1997).

    Em 2003, a rea plantada com transgnicos foi de 67,7 milhes de hectares,incluindo os trs milhes de hectares de soja plantados no Brasil; isso equivaleao crescimento mundial de 40 vezes de 1996 a 2003 (Figura 7). O plantioocorre principalmente nos pases desenvolvidos, entretanto, est havendoaumento substancial de plantio em pases em desenvolvimento (Figura 7). Dosquatro principais pases produtores de OGMs (Figura 8) dois so industrializados(EUA e Canad) e dois so pases em desenvolvimento (Argentina e China),sendo que os pases em desenvolvimento foram responsveis pela ampliao decerca de 30% da rea plantada em 2003 (JAMES, 2003).

    Figura 7. Crescimento do plantio de transgnicos no mundo de 1996 a 2003.

    Fonte: Adaptado de James (2003).

    michelleJAMES;KRATTIGER, 1996).

    michelleJAMES, 1997).

    michelleJAMES, 1997).

    michelleFigura 8)

    michelleJAMES, 2003).

    michelleJames (2003).

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    Figura 8. Crescimento do plantio de transgnicos nos principais pases produtores.

    Fonte: Adaptado de James (2003).

    Aspectos Futuros

    Os mtodos de transformao abrem novas fronteiras para o melhoramento deplantas, uma vez que, permitem a reduo no tempo de obteno de variedadescom novas caractersticas, bem como a transferncia de caractersticas deinteresse entre espcies que, em geral, so sexualmente incompatveis. Emoutras palavras, as barreiras naturais entre as espcies podem ser derrubadas, oque oferece a possibilidade de obter novas variedades na forma de plantastransgnicas. Alm disso, possvel, com os mtodos da biologia molecularmoderna, isolar e manipular genes especficos, o que no acontece nomelhoramento clssico, em que o melhorista obrigado a trabalhar com genomasinteiros.

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  • 28 Transformao de Plantas

    Plant Transformation

    Abstract During centuries mankind manipulate plants to obtain cultivars withsuperior characteristics. However, conventional methods of plant breedingpresent limitations. The development of transformation methods createdpossibilities of great progresses in plant breeding because it offers theopportunity to introduce exogenous genes into superior cultivars to obtain newvarieties. Genetic transformation is the controlled transfer of genes to the targetorganism using non sexual methods. Transgenic plants can be defined as thosethat present genes different from the original genoma obtained by techniques ofgenetic engineering. The transformation stages consist of the identificationisolation, cloning and introduction of the gene into the cells. There are severaltransformation methods, and the choice depends on the species to betransformed, the type of the explant (cell, tissue, protoplasts) and the capacity ofexplant regeneration. Among the principal methods are: 1) transformationmediated by Agrobacterium; 2) biolistic; 3) eletroporation.

    Index terms: Agrobacterium, plant transformation, transgenic, biolistic,eletroporation.

    Sumrio - Escolha o tem desejado e clique diretamente sobre ele.Introduo Etapas da Transformao Identificao, clonagem e isolamento do gene

    Mtodos de Transformao Transformao indireta Transformao via Agrobacterium

    Transformao direta Biolstica Eletroporao Outras metodologias Microinjeo Transformao de Plen Lipossomos

    Histrico da Comercializao de Transgnicos no Mundo Aspectos Futuros Referncias Bibliogrficas Abstract