Universidade de Lisboa Faculdade de Cincias

Departamento de Biologia Animal

Efeito da poliploidia no desenvolvimento inicial e

epigentica no complexo pisccola Squalius alburnoides

Joana Filipa de Oliveira Mateus

Mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento 2011

Universidade de Lisboa Faculdade de Cincias

Departamento de Biologia Animal

Efeito da poliploidia no desenvolvimento inicial e epigentica no complexo pisccola Squalius

alburnoides

Joana Filipa de Oliveira Mateus

Dissertao orientada por:

Doutora ngela Incio Doutor Gabriel Martins

Mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento 2011

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ndice

NDICE 4

AGRADECIMENTOS 5

RESUMO 7

ABSTRACT 8

1. INTRODUO 9

1.1 - POLIPLOIDIA 9 1.1.1 - CAUSAS DA POLIPLOIDIA 9 1.1.2 - TOLERNCIA POLIPLOIDIA NA NATUREZA 10 1.2 - COMPLEXO SQUALIUS ALBURNOIDES 10 1.3 - DESENVOLVIMENTO INICIAL 12 1.4 - EPIGENTICA 13 1.4.1 - MODIFICAO DE HISTONAS 14 1.4.2 - PROTENA DA HETEROCROMATINA 1 (HP1) 14

2. MATERIAIS E MTODOS 15

2.1 - DESENVOLVIMENTO INICIAL EM SQUALIUS ALBURNOIDES 15 2.1.1 - AMOSTRAGEM, IDENTIFICAO, MANUTENO, ESTIMULAO HORMONAL DE SQUALIUS ALBURNOIDES ADULTOS E DETERMINAO DA CONSTITUIO GENMICA 15 2.1.2 - CRUZAMENTOS E OBTENO DE EMBRIES 16 2.1.3 - OBSERVAO DO DESENVOLVIMENTO INICIAL 17 2.2 - ESTUDO DO SILENCIAMENTO GNICO ATRAVS DE HISTONAS MODIFICADAS 18 2.2.1 - OBTENO DE AMOSTRAS 18 2.2.2 - IMUNOHISTOQUMICA PARA DETECO DE SILENCIAMENTO GENTICO 19 Seces de barbatana e fgado 19 Cultura de fibroblastos 20 Sangue 20 Embries 20 2.3 ANLISE DE IMAGENS 21 2.3.1 DETERMINAO DA QUEBRA DE SINCRONIA MITTICA (TRANSIO MATERNO-ZIGTICA - MBT) 21 2.3.2 DETERMINAO DOS RCIOS NCLEO-CITOPLASMA (NCR) 23 2.3.3 ANLISE DOS PADRES DE HETEROCROMATINIZAO 24 2.3.4 ANLISE ESTATSTICA 25

3. RESULTADOS 26

3.1 DESCRIO DO DESENVOLVIMENTO INICIAL EM S. ALBURNOIDES 26 3.1.1 DESCRIO DOS ESTDIOS E COMPARAO COM ESTDIOS MODELO DE DANIO RERIO 26 3.1.2 DETERMINAO DA MBT 28 3.1.3 DETERMINAO DE RCIOS NCLEO-CITOPLASMA (NCR) 33 3.2 MODIFICAO DE HISTONAS - ANLISE DA INTENSIDADE E HETEROGENEIDADE DAS MARCAES 36 3.2.1 CULTURA DE FIBROBLASTOS 36 3.2.2 CREBRO 38 3.2.3 SANGUE 39 3.2.4 EMBRIES PR E PS-MBT 40

4. DISCUSSO 42

5. BIBLIOGRAFIA 45

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Agradecimentos

Em primeiro lugar quero agradecer aos meus orientadores ngela Incio e Gabriel Martins (Psre) pela pacincia e apoio em todos os momentos durante a realizao deste projecto, principalmente nos de maior aflio e stress.

Um dos meus maiores agradecimentos vai para a Isa Matos, a minha co-orientadora sem ela este trabalho tinha sido quase impossvel. Obrigado por toda a motivao e ajuda que me deste ao longo deste ano.

Agradeo aos meus dois grupos Biologia do Desenvolvimento e Gentica Evolutiva: Ana Catarina, Ana Rita, Andr, Isa, Joana, Lus, Maria Ana, Marianne, Miguel Machado, Mnica, Patrcia, Raquel Vaz, Raquel Jacinto, Rifes e Tiago por toda a ajuda prestada e opinies dadas durante os Labmeeting que me ajudaram bastante.

Ao grupo de citogentica: Carla, Catarina, Josefina, Max e Miguel Santos por estarem sempre disponveis. Obrigado Max pelo o ensinamento de culturas e cedncia de clulas. Miguel obrigado pelas ajudas no citmetro e pacincia quando perguntava as diferenas entre formas.

Patrcia (a minha amiga PA), Raqueis e Catarina por me terem ajudado nos maus momentos e em tudo o que precisei (a nvel laboratorial e pessoal).

Obrigado Joana Pinho pelas conversas e discusses que tivemos ao longo destes 2 anos de mestrado, mal ns sabamos que aps a mtica primeira aula de DE amos ficar to prximas (vs conseguimos!).

Maria Fernandes por todo o apoio (desde da Holanda) e ajuda em obter os to desejados papers.

s Professoras Gabriela Rodrigues, Slveig Thorsteinsdttir, Manuela Coelho e Maria Joo Collares-Pereira por estarem sempre disponveis para qualquer dvida e ajuda.

Professora Manuela Silva do Instituto Superior de Agronomia, pela ajuda e

cedncia de anticorpos para teste. Um grande agradecimento Professora Lia Ascenso, pela disponibilidade e oferta do reagente de Schiff.

D. Branca, por ter sempre mais um cantinho para o meu material ir a autoclavar em cima da hora. E pelas inmeras conversas que tivemos e que me souberam sempre to bem.

Telma Laurentino por me ter ajudado nas lavagens dos aqurios e dar comida dos peixinhos enquanto eu no podia. Ao Joo por me ter cedido informaes teis para este trabalho.

Ana Margarida Rodrigues por me ensinar o mtodo de Feulgen e a ter cuidado com o reagente de Schiff.

Obrigado a todos os que frequentaram a sala da microscopia e que sofreram com o frio devido manuteno dos meus bebs.

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s minhas amigas Andreia, Isabel, Mariline e Sofia (as minhas amoras!) por entenderem as minhas inmeras ausncias nos to desejados encontros s as 5.

Mariline obrigado por me teres feito companhia nas longas horas de recolhas de embries para no estar sozinha (viva ao skype!).

Sofia obrigado por acreditares sempre em mim, por toda a fora, ajuda e motivao que sempre me deste nestes ltimos 6 anos.

Quero tambm agradecer a um dos melhores professores que tive na vida, que para alm de um excelente professor, um grande amigo. Obrigado Professor/amigo Joo Ramalho Santos por todo o apoio e ajuda sempre que precisei.

E no me posso esquecer da Dr. Ana Barbosa, por tudo o que me ensinou e por nunca se ter esquecido de mim, sem dvida um orgulho em a ter conhecido.

Aos meus Pais por tudo o que fizeram para me ver feliz e me terem apoiado sempre em todas as minhas decises (e me ouvirem sempre que precisava de reclamar!), e claro por terem pago todos estes anos de estudos.

minha mana (que sempre acreditou em mim!) e cunhado pelo apoio que sempre me foi dado.

minha sobrinha Carlota por ter sempre aquele sorriso gigante quando me v e por ver em mim um dolo.

Aos meus avs, a quem muitas vezes me esquecia de ligar para mandar um beijinho e dizer que os adoro. Obrigado aos meus tios e primos (no vou colocar os nomes, so imensos e vocs sabem quem so!).

Ao Pedro por me mostrares sempre uma melhor maneira de ver as coisas que no so sempre to ms como parecem e por estares ao meu lado em todos os momentos.

Teresa e Miguel por terem aceite a ideia de viver na sua casa em Lisboa e estarem sempre disponveis para ajudar, e por me receberem sempre to bem.

Aos meus cunhados Paulo e Cludia pelas boas visitas e momentos bons e diferentes que proporcionaram. Ao Mateus, meu sobrinho mais novo. E claro obrigado ao Joo Francisco, o meu irmo. No posso deixar de agradecer a mim mesma, pois todo o trabalho existe por algum motivo. Sem mim que era totalmente impossvel.

A todos um grande obrigado!

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Resumo

A poliploidia um processo proeminente em plantas e embora menos frequente, tem sido importante na histria evolutiva de alguns vertebrados. Ao contrrio do que acontece nas plantas o conhecimento das razes que possibilitam o sucesso evolutivo da poliploidia em vertebrados permanece pouco explorado.

A poliploidia pode ter consequncias em diversos processos celulares, como por exemplo no desenvolvimento inicial e na regulao da expresso gnica. Um dos grupos de vertebrados onde a poliploidia mais tolerada em peixes, sendo um exemplo o complexo Squalius alburnoides. Este um excelente organismo modelo para estudar o efeito da poliploidia no desenvolvimento e epigentica em vertebrados, pois alm de ser um exemplo de sucesso evolutivo tambm um complexo que apresenta diferentes ploidias (2n, 3n e 4n).

Alguns estudos (Newport&Kirschner, 1982; Edgar, 1986) sugerem que organismos com diferentes quantidades de material gentico apresentam diferenas no desenvolvimento podendo mesmo afectar estdios importantes durante o desenvolvimento inicial, tal como divergncias temporais na ocorrncia da transio materno-zigtica (MBT) e o aparecimento dos diversos rgos. Esses mesmos estudos sublinham que o mecanismo que poder controlar essa transio seja baseado no rcio ncleo-citoplasma (NCR), mas tal no foi formalmente demonstrado.

Como os organismos poliplides contm mais DNA, e assumindo que o tamanho do citoplasma igual entre ploidias (quer no zigoto, blastmeros ou clulas adultas), o primeiro objectivo deste trabalho foi testar se os embries poliplides exibem uma MBT mais precoce.

Devido ao facto de existirem poucos vertebrados poliploides na natureza, neste trabalho tentmos tambm compreender o sucesso evolutivo do Squalius alburnoides e abundncia das formas triploides. Um estudo anteriormente realizado neste complexo, concluiu a existncia de um mecanismo de compensao de dosagem o qual reduz a quantidade de transcritos nas formas triploides para o observado em formas diploides. Levando a outro objectivo neste trabalho o de compreender que tipo de mecanismo de silenciamento gnico lhe poder estar associado. Para isso, estudou-se o padro heterocromtico no ncleo de diferentes ploidias atravs da marcao do DNA nuclear (DAPI/ToPro3) e de dois marcadores tpicos de represso gnica, a protena da heterocromatina 1 (Hp1) e a histona modificada qual se associa, a H3K9 tri-metilada. Este trabalho pretendeu esclarecer alguns aspectos da epigentica deste complexo, como por exemplo perceber se a heterocromatinizao e/ou modificao de histonas est envolvida no silenciamento gnico em triploides em vrios tecido analisados e em que fase do desenvolvimento inicial surge.

As diferenas encontradas apontam para diferentes nveis de heterocromatinizao nos triploides, o que presumivelmente est associado a silenciamento gentico. Foi interessante verificar tambm que estas diferenas so visveis em blastmeros apenas depois da MBT.

Nos triploides as citocineses mostraram um atraso quando comparadas com as os diploides hbridos e a MBT foi atingida precocemente, facto observado pela quebra de sincronia das citocineses e cariocineses precoce em triploides. No entanto os nossos dados preliminares no nos permitem estabelecer uma relao entre a ocorrncia precoce da MBT e o NCR dos blastmeros.

Palavras-chave: Squalius alburnoides, poliploidia, rcio ncleo-citoplasmtico, transio-mdia-da-blstula, heterocromatina

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Abstract

Polyploidy occurs prominently in plants and though less frequent, it has been important in the evolutionary history of some vertebrates. The reasons that allow the evolutionary success of some polyploid vertebrates remain poorly understood. However, polyploidy can be surprisingly stable given the apparent polyploid ancestry of many eukaryotic genomes. The diploid-polyploid complex Squalius alburnoides is an excellent non-model organism to study polyploidy and its effects in cellular processes.

Previous studies suggest the existence of a nucleo-cytoplasmic ratio(NCR) effect controlling timing of early cleavages and mid-blastula transition in other organisms. We explored the S. alburnoides complex, to test this. The results clearly show that triploid embryos reach mid-blastula transition earlier than diploid embryos, though a clear relationship between estimated NCRs and times of MBT could not be established. In fact, though triploids have an estimated 50% increase in DNA content/cell, the average zygote volume and blastomere size at MBT are nearly twice those of diploids. We also found no significant differences in NCRs from adult tissues, and in the case of blood evidence or a larger cytoplasm, but less than the expected 50% increase. Analysis of heterochromatinisation patterns did reveal significant differences between triploids and diploids, in adult tissues. Interestingly, we did find evidence that HP1 may appear only after MBT.

This work allowed us to analyze the complex phenomena of early development and epigenetics in this interesting species complex and provided further evidence that alterations of DNA contents can affect the pace of early development. However further analysis to support some of the preliminary observations are necessary.

Keywords: Squalius alburnoides, polyploid, ncleo-cytoplasmatic ratio, mid-blastula transition, heterochromatin

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1. Introduo

1.1 - Poliploidia

A poliploidia resulta de uma alterao gentica na qual ocorre um aumento do nmero de cromossomas para um mltiplo de n, mas diferente de 2n (Moisieniak et al., 2010).

Os organismos eucariotas so geralmente diploides (2n) (Storchova&Pellman, 2004), no entanto a poliploidia comum em plantas, com uma frequncia estimada entre 30 e 80% (Masterson, 1994) e ocorre esporadicamente em vertebrados sobretudo nos inferiores, como rpteis, anfbios e peixes (Lewis, 1980).

Os organismos poliploides podem ser classificados em duas categorias: autopoliplides ou alopoliplides. No caso dos autopoliplides h multiplicao do mesmo genoma, enquanto que os alopoliplides so hbridos.

Contudo um processo que pode ser surpreendentemente estvel, havendo evidncias de que muitos genomas eucariotas tm poliploidia ancestral (Comai, 2005).

1.1.1 - Causas da poliploidia

Uma causa possvel para a poliploidia a poliespermia, aqui o ocito fertilizado por mais do que um espermatozoide, podendo ocorrer tanto em plantas como em animais, sendo uma das vias que mais leva a ocorrncia de triploides humanos (Uchida et al., 1985). A ausncia de citocinese provoca tambm uma duplicao do genoma, podendo ocorrer durante as primeiras divises do zigoto ou mais tarde em tecidos adultos, resultando em mosaicos.

A ausncia de reduo meitica uma das causas mais frequentes da poliploidia. Neste caso, os gmetas no reduzidos ficam com o dobro do genoma esperado e quando fertilizados por um gmeta reduzido ocorre a formao de um zigoto com maior ploidia. Se ocorrer a fertilizao por outro gmeta tambm no reduzido o nvel de ploidia do zigoto ainda maior. Nos casos de alopoliploidia os hbridos produzem uma taxa elevada de gmetas no reduzidos (Ramsey&Schemske, 2002). Aqui, a hibridao apresenta um papel importante na evoluo das plantas e animais (Mallet, 2007), particularmente em peixes. Neste grupo a hibridao um processo generalizado, existindo vrios factores que explicam esta incidncia tais como, fertilizao externa, mecanismos de isolamento comportamental fracos, abundncia desigual das duas espcies parentais, competio pelo habitat de desova, diminuio de complexidade do habitat e susceptibilidade a contacto entre as diferentes espcies (Chvez & Turgeon 2007, Scribner et al. 2001).

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1.1.2 - Tolerncia poliploidia na natureza

A maioria dos vertebrados superiores no toleram a poliploidia como se verifica, por exemplo, nos humanos em que cerca de 10% de abortos espontneos lhes esto associados (Eiben et al., 1990) e os fetos apresentam mltiplas mal formaes (Sonnesen et al., 2009). No entanto, a elevada incidncia de poliploides em alguns taxa (plantas, peixes e anfbios) dever ser justificada por alguma vantagem evolutiva como por exemplo a importante fonte de variabilidade gentica e de adaptao.

Contudo, apesar das vantagens so necessrios mecanismos de tolerncia estando j descritos vrios em plantas com efeitos na dosagem gentica como por exemplos rearranjos cromossmicos e remodelaes nos padres epigenticos (Chen&Ni 2006; Chen, 2007).

Curiosamente, estudos recentes indicam que muitas das espcies que so actualmente diploides, incluindo humanos, derivaram de ancestrais poliploides (Van de Peer & Meyer, 2005).

1.2 - Complexo Squalius alburnoides O complexo pisccola Squalius alburnoides (Steindachner, 1866) foi

inicialmente descrito por Collares-Pereira (1983, 1984), com base nas caractersticas morfolgicas e citogenticas. A sua origem deve-se hibridao entre uma fmea Squalius pyrenaicus (Genoma P) (Alves et al., 1997) e um macho ancestral relacionado com Anaecypris hispanica (Genoma A) (Gromicho et al., 2006).

O complexo Squalius alburnoides endmico da Pennsula Ibrica, existindo em Portugal em simpatria com trs espcies bissexuais do gnero Squalius: o ancestral materno Squalius pyrenaicus (Gnther, 1868) nas bacias do sul (Tejo, Sado, Guadiana e Quarteira), Squalius carolitertii (Doadrio, 1988) nos rios do norte (Douro e Mondego) e Squalius aradensis (Coelho, Bogutskaya, Rodrigues & Collares-Pereira, 1998) numa bacia do sul independente (Quarteira).

Este complexo constitudo por diferentes ploidias (Sousa-Santos et al., 2006), incluindo formas diploides (2n=50), triploides (3n=75) e tetraploides (4n=100) sendo a forma triplide a mais comum (Cunha et al., 2008). Para cada ploidia podemos ter variadas constituies genmicas com diferentes propores dos genomas parentais (Collares-Pereira & Coelho, 2010). Relativamente s populaes do sul o complexo S. alburnoides em simpatria com S. pyrenaicus, apresenta constituies genmicas com formas diploides PA, triploides PAA (e PPA raras) e formas tetraploides PPAA (podendo ocorrer tambm tetraploides de genomas no equilibrados (PAAA e PPPA) (Sousa-Santos et al. 2007). O complexo possui tambm uma forma diploide no hbrida com DNA mitocndrial (DNAmt) de S. pyrenaicus mas de genoma nuclear prximo de Anaecypris (genoma AA). Estes indivduos so geralmente todos machos existindo excepes reportadas apenas para duas fmeas (Carmona 1997, Sousa-Santos et al. 2006b). A presena do DNAmt de S. pyrenaicus nesta forma diploide AA indica que esta forma nuclear no hbrida foi formada atravs de hbridos, descartando assim a hiptese de serem verdadeiros descendentes do ancestral extinto (Alves et al. 2002). Ainda no Sul, na bacia de Quarteira, ocorrem

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cruzamentos interespecficos entre S. alburnoides e S. aradensis (QQ) levando ao aparecimento do genoma Q no complexo. Nas bacias do Norte S. carolitertii (CC) participa tambm activamente na dinmica reprodutiva do S. alburnoides. Como resultado destas interaces surgem as mesmas composies genmicas referidas para a interaco com S. pyrenaicus, mas em que genoma P substitudo pelo genoma Q ou C (com excepo das formas AA que no existem no Norte). O complexo hbrido Squalius alburnoides apresenta variados modos de reproduo sexuada e assexuada sendo diferentes para cada forma, produzindo gmetas com genomas e mecanismo hereditrios distintos (Alves et al., 1998, 1999, 2001, 2004; Gromicho & Collares-Pereira, 2004; Pala & Coelho, 2005; Crespo-Lpez et al., 2006; Sousa-Santos et al., 2007b). Os modos de reproduo exibidos pelas fmeas diploides e triploides incluem a produo de ovos no reduzidos, podendo existir a ocorrncia de ginognese nas fmeas diploides, no entanto essa ocorrncia baixa (

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Tabela I. Representao dos vrios cruzamentos e respectivas descendncias. A cinzento esto representadas as formas mais provveis tendo em conta a frequncia de gmetas formados para cada composio genmica.

Fmeas

PA PAA PPA PPAA

Ovos Esperma PA A AA P PP PA

Mac

hos

PP P PPA PA PAA PP PPP PPA

AA A PAA AA AAA PA PPA PAA

PA PA PPAA PAA PAAA PPA PPPA PPAA

PPAA PA PPAA PAA PAAA PPA PPPA PPAA

1.3 - Desenvolvimento inicial

O desenvolvimento inicial comea na maioria do animais da mesma forma: caracterizado por uma rpida e sncrona sequncia de divises celulares (Kraeussling et al.,2011; Kane&Kimmel,1993; Newport&Kirschener, 1982;). O ciclo celular dos primeiros blastmeros constitudo apenas pelas fases S (Sntese) e M (Mitose), havendo um bypass das fases G (crescimento). Eventualmente estas divises tornam-se assncronas e lentas, e o ciclo celular torna-se mais semelhante ao de clulas adultas, incluindo fases G (crescimento) durante as quais j ocorre transcrio do genoma zigtico. A esta transio d-se o nome genrico de transio mdia da blstula (mid-blastula transition MBT), frequentemente tambm conhecida como transio materno-zigtica, por coincidir com o inicio da expresso de genes zigticos. Mas como que os blastmeros resultantes das primeiras divises rpidas e sincronizadas determinam o momento desta transio?

Newport e Kirschner (1982), realizaram uma experincia para tentar perceber que factores determinam esta transio. Para isso analisaram vrios fenmenos associados a esta alterao, tais como o estudo da assincronia celular, activao da transcrio e mobilidade celular. Usaram embries de Xenopus e fizeram uma constrio no citoplasma de modo a provocar a formao de gmeos siameses (Figura 2), sendo que um dos gmeos herdava mais ncleos que o outro. Repararam que no gmeo que herdava mais ncleos essa transio era mais rpida, demonstrando que o tempo da MBT no seria dependente de um mecanismo de contagem de divises celulares ou do tempo aps a fertilizao. Sugerindo que, de alguma forma, os blastmeros so capazes de avaliar a quantidade de DNA por citoplasma usando

Figura 2. Esquema da formao de gmeos siameses para manipulao do NCR (Newport and Kirschner, 1982)

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essa medida para determinar a MBT, um conceito conhecido genericamente por rcio ncleo-citoplasma (NCR) Outra experincia que sugere esta relao entre NCR e MBT foi realizada por Edgar (1986), o qual utilizou embries de Drosophila diplides e haplides resultantes do cruzamento de adultos mutantes, e verificou que a MBT ocorria em tempos diferentes. A observao de ambos os embries demonstrou que os embries haplides faziam a MBT aps mais um ciclo de cariocinese, indicando assim que algum factor estaria a influenciar esse acontecimento. Ambas as experincias sugerem que o mecanismo que controla a MBT possa ser baseado no NCR. No entanto, o funcionamento deste mecanismo ainda no foi formalmente demonstrado, no sentido em que a ocorrncia da MBT mais precoce em indivduos com mais quantidade de genoma se deva realmente a uma mudana no rcio ncleo-citoplasma. Tambm no existem evidncias sobre o mecanismo molecular envolvido.

Uma vez que os organismos poliplides contm mais DNA, e assumindo que o tamanho do citoplasma no muda entre ploidias (quer no zigoto, blastmeros e clulas adultas), embries poliplides de S. alburnoides devero apresentar um NCR mais elevado e por inferncia, devero apresentar uma MBT mais precoce.

1.4 - Epigentica

Em organismos poliplides a existncia de mais do que dois alelos para cada gene potencia uma alterao nos padres de expresso com possveis consequncias deletrias quer no desenvolvimento quer na homeostase. Contudo, existem evidncias de que as clulas poliplides usam mecanismos epigenticos para regular a sua dosagem, nomeadamente por silenciamento gnico. Um estudo, demonstrou que nas formas triplides de S. alburnoides existe silenciamento gnico (Pala et al., 2008), embora ainda no tenha sido possvel determinar qual o mecanismo envolvido.

Os mecanismos mais frequentes associados ao silenciamento gnico ocorrem por mecanismos de regulao pr-transcricionais e/ou ps-transcricionais. No caso da regulao ps-transcricional os transcritos so degradados ou impedidos de serem traduzidos via outros RNAs no codificantes (Halbeisen et al., 2007). Para os mecanismos pr-transcricionais destacam-se a metilao de DNA e/ou remodelao da cromatina nomeadamente atravs de histonas modificadas (Corry et al., 2009). A metilao de DNA envolve a adio de um grupo metil, geralmente ao anel de pirimidina de citosina resultando na represso da expresso gnica. A modificao de histonas pode ocorre por acetilao, metilao e fosforilao, podendo levar activao ou silenciamento gnico dependendo do tipo de modificao. Estas modificaes podem ser herdadas ou removidas sem mudar a sequncia original do DNA e so por isso um fenmeno de regulao epigentica (Berger et al., 2009).

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1.4.1 - Modificao de Histonas

A cromatina composta por DNA e protenas, maioritariamente histonas. Existem diferentes tipos de histonas H2A, H2B, H3 e H4 que formam o nucleossoma e a H1 que une os nucleossomas e estabiliza o seu enrolamento com o DNA. O DNA compactado de forma a ocupar menos espao, mas tambm a permitir a represso da expresso gnica. Existindo dois tipos de cromatina, a eucromatina e heterocromatina. Tradicionalmente na eucromatina o DNA est transcripcionalmente activo e na heterocromatina est inactivo.

Uma das formas de inactivao por heterocromatinizao envolve modificaes ps-tranducionais das histonas. As histonas contm um domnio NH2 terminal que sofre modificaes ps-traducionais. Estas modificaes ocorrem maioritariamente nas histonas H3 e H4. A histona H3 metilada pode activar (H3K4) ou reprimir a transcrio (H3K9). De facto, a histona H3K9 metilada est frequentemente associada ao silenciamento gnico (He and Lehming, 2003), tornando-se crucial para o estudo dos padres de heterocromatinizao.

A protena da heterocromatina 1 (do ingls: heterochromatin Protein 1-HP1), geralmente um marcador de heterocromatina (Festensteins et al., 1999) e associa-se H3K9 tri-metilada (Figura 3) .

1.4.2 - Protena da heterocromatina 1 (HP1)

A Hp1 no uma histona mas foi descrita inicialmente em Drosphila associada a heterocromatina e silenciamento gnico (Eissenberg et al., 1990) sendo um dos maiores componentes existentes da heterocromatina e contribuindo na represso transcricional de genes eucromticos .

Diversos outros estudos reforaram este seu papel em muitos organismos, incluindo fungos e animais. Estudos moleculares demonstraram que a Hp1 filogeneticamente conservada estando presente em muito eucariotas (Wang et al., 2000). A sua capacidade de se ligar a lisina 9 di- ou tri- metilada da histona H3 refora o conceito da sua aptido como marcador epigentico associado represso da expresso gnica (Bannister et al., 2001).

Um estudo em Danio rerio comprovou a eficcia da protena HP1 associao represso da expresso gnica (Anelli et al., 2009), confirmando assim a eficcia da mesma para o estudo em causa.

Figura 3. Representao da ligao da protena HP1 histona H3K9

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2. Materiais e Mtodos

2.1 - Desenvolvimento inicial em Squalius alburnoides

2.1.1 - Amostragem, identificao, manuteno, estimulao hormonal de Squalius alburnoides adultos e determinao da constituio genmica

A amostragem para todas as formas de Squalius alburnoides foi efectuada em

diversas bacias do sul (Tejo e Guadiana), enquanto que a amostragem de Squalius pyrenaicus foi efectuada numa bacia isolada (Cheleiros, Sintra) e tambm numa bacia do sul (Almargem). Para a sua captura foi utilizada a pesca elctrica, que consiste no uso de corrente elctrica para atordoar os peixes e assim facilitar a sua captura, poucos minutos aps a descarga os peixes voltam ao seu comportamento normal.

Os peixes foram mantidos em aqurios de vidro de 60 l expostos a um ciclo de 14 horas de luz e 10 horas de escurido, a uma temperatura constante de 20C. A alimentao foi base de flocos e foi enriquecida com Artemia salina e Daphnia congeladas, cerca de 4 vezes ao dia.

Foi realizada estimulao hormonal atravs de injeco de um anlogo da hormona gonodotropina (Ovaprim, Western Chemical), para promover a maturao e desova, que depois se fez por instigao da ovulao e espermiao em peixes maduros. A injeco foi administrada na cavidade abdominal a uma concentrao de 0,5 l por grama, de acordo com instrues do fabricante e ao longo de quatro semanas, antes e depois da poca de cruzamento (Dezembro-Janeiro e Julho) com o objectivo de antecipar e prolongar a mesma. A ploidia dos peixes capturados foi determinada por citometria de fluxo atravs do protocolo Prspero & Collares-Pereira (2000), executada com recurso a barbatanas ou sangue dos indivduos em questo. A determinao da constituio genmica dos peixes capturados foi realizada atravs de um PCR quantitativo conforme descrito em Incio et al., 2010. Neste caso, o DNA genmico utilizado foi obtido a partir de cortes de barbatana utilizando o mtodo de extraco com recurso a solventes orgnicos descritos por Miller et al., 1998. Nos casos em que no foi possvel a extraco logo aps o corte, as barbatanas foram armazenadas em etanol 100%. Durante o corte da barbatana os peixes foram fotografados, de forma a possibilitar o seu posterior reconhecimento atravs do padro de escamas especfico para cada individuo (Morgado-Santos et al., 2010).

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2.1.2 - Cruzamentos e obteno de embries

Com recurso foto-identificao foi possvel escolher as fmeas e machos cujas constituio genmicas eram j conhecidas e assim antever o genoma e ploidia da descendncia. Antes da fertilizao humedeceu-se uma caixa de petri com algumas gotas de gua, seguidamente seleccionaram-se as fmeas e foi executada uma presso abdominal no sentido da barbatana caudal, com o propsito de obter os ocitos. O mesmo mtodo foi aplicado aos machos para adquirir esperma, mas neste caso o esperma foi colocado por cima dos ocitos, previamente recolhidos para uma caixa de Petri.

No decorrer do trabalho verificmos que para obter sucesso nas fertilizaes o tempo entre a mistura do esperma e ovos no podia ultrapassar um minuto aps a recolha dos ovos. Nos cruzamentos em que esse tempo foi ultrapassado, verificmos mais tarde que apesar dos ovos terem um aspecto normal e mostrarem sinais de activao, no completaram as clivagens iniciais. Estes ocitos no fertilizados foram tambm filmados e as observaes so descritas mais abaixo.

Os embries includos neste estudo foram: AA, PA, PAA e PAAA, obtidos a partir dos cruzamentos descritos na Tabela II. Os embries foram mantidos para observao por time-lapse e para recolhas em intervalos de tempo regulares, conforme descrito em baixo.

Tabela II. Cruzamentos realizados ao longo deste trabalho e xito dos mesmos. Este sucesso/insucesso (xito) apenas representativo para os cruzamentos que foram usados na realizao do trabalho.

Cruzamento Ploidia Descendncia xito

QAA* (fmea) x PP (macho) 2n PA

PP (fmea) x AA (macho) 2n PA

PAA (fmea) x PP (macho) 2n PA

PA (fmea) x AA (macho) 3n PAA

PAA (fmea) x PA (macho) 3n PAA

QAA (fmea) x PA (macho) 3n PAA

QAA (fmea) x PAA (macho) 4n PAAA

PAA (fmea) x AA (macho) 2n AA

PP (fmea) x PP (macho) 2n PP

Embora no previsto inicialmente, no decorrer do estudo usmos tambm uma

fmea triploide (QAA) frtil, que apesar de conter um genoma diferente dos propostos inicialmente (P e A), foi tambm utlizada devido a produzir, gmetas de genoma A e descendncia pretendida para este estudo (PA ou PAA) quando cruzada com machos diplides.

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2.1.3 - Observao do desenvolvimento inicial

Para observao de embries vivos, alguns foram recolhidos e montados numa caixa de Petri com agarose (2% - Low melting agarose) na qual foi criada uma concavidade para imobilizar os embries durante a observao. A caixa de Petri foi montada numa lupa Zeiss STEREO-Lumar na qual estava acoplada uma Axiocam e ambas controladas pelo software Axiovision v4.7, numa sala aclimatizada e mantida a 20C durante o tempo de observao. Foram obtidas imagens em campo claro com luz transmitida, em intervalos de 1 minuto durante as primeiras 6-7h de desenvolvimento; aps este tempo e at s 24 horas foram adquiridas imagens apenas de alguns estdios representativos do desenvolvimento at ecloso.

Os restantes embries foram mantidos numa caixa de Petri sem tampa numa incubadora a 20C. Todos os embries tinham gua (gua engarrafada do engarrafada do Caramulo) de pH~6,3 e esta gua era mudada duas horas aps a fertilizao e seguidamente reposta todos os dias at ecloso. Aps a ecloso foram retirados todos os crions da gua para a manter limpa e ao fim de duas semanas os embries passaram para um aqurio de 10L onde foram alimentados com comida especializada para alevins.

Destes embries e com o propsito de posteriormente verificar estdios relevantes do desenvolvimento inicial foram efectuadas recolhas, de acordo com a tabela III. Os embries recolhidos foram fixados em PFA 4% a 4C, tendo sido posteriormente desidratados numa srie crescente de metanol (25%,50%,75% e 100%) durante 10 minutos em cada fase. Depois foram preservados a -20C.

Para anlise, os embries recolhidos foram re-hidratados numa srie decrescente de metanol (100%, 75%, 50% e 25%) durante 10 minutos cada passagem seguidas de lavagens em PBT (2x10min). Aps isto realizou-se o mtodo de Feulgen para marcao de cidos nucleicos que possibilitou a identificao em detalhe das diferentes fases do ciclo celular nas clulas do embrio com recurso microscopia confocal. Os outros mtodos para marcao do DNA foram tambm experimentados, como a marcao com ToPro3 (Molecular Probes) e Draq5 (BioStatus), no entanto o mtodo de Feulgen produziu uma marcao mais reprodutvel e facilmente detectvel, apesar de termos verificado uma considervel marcao citoplasmtica inespecfica que por vezes dificultou a identificao das figuras mitticas.

O mtodo de Feulgen inicou-se com lavagens em gua destilada (2x5min), lavagem em cido clordrico (HCl) (20Cx3min) seguidas de colocao numa placa quente a 60C durante 8 minutos (com agitao). Depois, foram efectuadas novas lavagens em gua destilada (3x5min) e s depois a colocao de reagente de Schiff (2:12, Merck) durante 90 minutos.

Por fim executou-se uma nova lavagem em gua destilada e uma rpida desidratao (10 minutos metanol 100%) colocando seguidamente metilsalicilato (Sigma) para melhor observao das amostras por microscopia confocal (Martins, et al. 1998).

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Com recurso ao microscpio confocal Leica SPE adquiriam-se as imagens dos diferentes estdios e ploidias.

As imagens foram analisadas e as reconstrues 3D produzidas com recurso aos softwares ImageJ v1.4x e Amira v5.3.3, como descrito mais abaixo. Estas imagens foram usadas para determinar o sincronismo dos ciclos celulares dos blastmeros pr-MBT e ps-MBT.

2.2 - Estudo do silenciamento gnico atravs de histonas modificadas

2.2.1 - Obteno de amostras

O silenciamento gnico foi estudado em culturas de fibroblastos, em tecidos de peixes adultos tais como, fgado, crebro, barbatana e sangue e em embries antes e depois da MBT.

Para a obteno de fgado e crebro foram sacrificados dois peixes diploides (PP e PA) e um triploide (PAA), todos provenientes da bacia do Almargem. Para os estudos de imunohistoqumica foi necessrio fixar os tecidos em PFA 4 % durante a noite.

A recolha de sangue foi feita com recurso uma seringa (Terum Myjector U-100 insulin) impregnada em heparina (Sigma-Aldrich H3149-50Ku) em trs indivduos diploides (PAA, AA, PP) e um triploide (PAA). As amostras foram fixadas em suspenso com PFA 1% cerca de 15 minutos sendo depois realizada a imunohistoqumica. Para determinar a rea do ncleo e citoplasma calculando assim o rcio ncleo-citoplasma (NCR) foi realizado um esfregao com clulas de sangue fixadas e observadas num microscpio Olympus BX-60 com uma cmara Olympus DP50.

Durante a aquisio da barbatana o pedao cortado foi mantido em PFA 4% durante a noite antes de ter incio o protocolo de imunohistoqumica, aproveitando-se estas clulas para medir o seu NCR. Neste caso, foram obtidas amostras apenas de peixes em reas da barbatana que no tivessem sido anteriormente intervencionadas de forma a evitar alteraes de sinais nos padres epigenticos devido a um corte recente (Stewart et al., 2009).

Para a cultura de fibroblastos utilizaram-se fragmentos de barbatanas cortados de S. alburnoides (PAA) e de S. pyrenaicus (PP). Aps o corte as barbatanas foram embebidas em meio de cultura (Leibovitz L-15). De seguida, em ambiente estril seguiu-se o protocolo de Rodrigues & Collares-Pereira (1996). As culturas foram mantidas a 27C e controladas quanto sua confluncia e quando necessrio as clulas foram passadas para um novo frasco atravs de lavagens com PBS e adio de Tripsina-EDTA 10x (Sigma-T4174) a 37C.

Para a anlise dos embries, foram escolhidos embries com de 5 e 9 h ps-

fertilizao com o intuito de obter embries pr e ps-MBT, respectivamente, para posterior anlise atravs de imunohistoqumica.

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2.2.2 - Imunohistoqumica para deteco de silenciamento gentico

Os tecidos adultos (fgado e crebro) conservados em metanol 100%, foram re-hidratados numa srie decrescente de metanol (100%, 75%, 50% e 25% ) e feitas duas lavagens em PBT, 10 minutos cada. Enquanto que no caso da barbatana, esta foi adquirida e depois fixada em PFA 4% durante a noite a 4C.

Efectuaram-se lavagens em PBS (3x5 min) antes de colocar Triton 2%, cerca de 5 horas, para uma melhor permeabilizao dos tecidos.

Foi ento utilizado o anticorpo primrio Anti-HP1 1:100 (Clone 42s2 mouse monoclonal IgG1, Millipore), durante a noite a 4C. Numa fase inicial do projecto usmos tambm o anticorpo primrio H3K9me3 (07-442; Upstate, Billerica, MA) e apenas foi testado na cultura de fibroblastos, por no haver mais em stock. No caso do fgado, o anticorpo primrio Hp1 usado foi diferente (gentilmente cedido pela Professora Manuela Silva do Instituto Superior de Agronomia) e no funcionou podendo dever-se ao facto de ter estado muito tempo armazenado. Aps a incubao com os anticorpos fizeram-se lavagens em PBS 1% (3x5min) e iniciou-se a incubao em anticorpo secundrio contra ratinho conjugado com o flurocromo Alexa 488 (Molecular Probes) diludo a 1:400, ao qual se adicionou tambm um corante nuclear ToPro3 1:500 (Molecular Probes) e RNAse (10L/mL, Sigma -R6513) 1:50 durante a noite a 4C.

Seces de barbatana e fgado

Inicialmente re-hidrataram-se os tecidos numa srie decrescente de metanol (100%, 75%,50% e 25%), seguida de duas lavagens de 10 minutos em PBT. Os tecidos foram depois preparados e conservados a -80C para mais tarde se efectuar os cortes no criostato (marca). Os cortes no cristato foram feitos de forma a obter seces com cerca de 14 m. No caso da barbatana este procedimento no foi realizado com sucesso, possivelmente por os raios da barbatana serem demasiado duros para um corte de espessura to fina; os cortes mais espessos no aderiram eficazmente lamela e foram perdidos. Com o fgado os cortes tivemos mais sucesso na obteno dos cortes nos quais seguimos depois para o protocolo de imunohistoqumica. No entanto, tal como descrito previamente o anticorpo utilizado no produziu a marcao desejada. Sendo que quando conseguimos sucesso com o anticorpo, j no havia amostras de fgado disponveis para uma nova imunohistoqumica, In toto em tecidos adultos (Crebro e barbatana) Devido ao facto dos cortes no terem decorrido como previsto, foi efectuada a imunohistoqumica in toto. Colocou-se os tecidos em eppedorfs 1,5ml para a realizao das lavagens em PBS e durante a incubao com o anticorpo primrio e secundrio os tecidos foram colocadas numa cmara hmida em gota suspensa durante a noite para o anticorpo primrio e 6 horas para o anticorpo secundrio.

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Aps a realizao da imunohistoqumica adquiriu-se imagens no microscpio confocal Leica SPE para medir a intensidade do sinal de HP1. Aproveitou-se as imagens da barbatana para medir o NCR das diferentes formas (AA, PA, PAA e PP).

Cultura de fibroblastos

Aps o protocolo de cultura de fibroblastos para S. alburnoides (PAA) e S. pyrenaicus (PP) e manuteno das mesmas, efectuaram-se duas lavagens com PBS 1%, seguidamente adicionou-se Tripsina-EDTA 10x (Sigma-T4174) para remover as clulas aderidas ao frasco (5 minutos-37C) a aco da tripsina foi depois parada adicionando-se 750L de meio de cultura. Aps isto adicionaram-se 10ml de novo meio de cultura e retirou-se 1l para a superfcie de uma lamela que permaneceu dentro de uma caixa de petri onde se criou uma cmara hmida. Aps isto fixaram-se as clulas com PFA 4% durante 20 minutos, aplicando em seguida o protocolo de imunohistoqumica.

Posteriormente, foram adquiridas imagens com recurso ao Olympus BX-60 e uma cmara DP50. Iniciaram-se, entretanto, novas culturas para as restantes formas do complexo mas sem sucesso devido a recorrentes contaminaes. Por esta razo os resultados apresentado com culturas so apenas para PAA e PP.

Sangue

Aps a recolha, o sangue foi fixado numa soluo de PFA 1%, durante 15 minutos a 4C, seguido do protocolo de imunohistoqumica que sofreu algumas alteraes nos tempos de incubao dos anticorpos, sendo de 30 minutos para ambos. Seguidamente, foram adquiridas imagens com recurso ao Olympus Bx-60 para clculo de NCR em eritrcitos e a obteno de imagens no (Cmara do Lumar?) para medies de intensidade de sinal de Hp1 das diferentes formas.

Embries

Para esta tarefa foram utilizados embries que tinham sido recolhidos durante o estudo do desenvolvimento inicial. Para a realizao da imunohistoqumica os embries das 5 e 9 h ps-fertilizao foram re-hidratados numa srie decrescente de metanol (100%,75%, 50%,25%) e descorionados com a ajuda da proteinase K (Roche) cerca de 30 segundos para simplificar, visto que o crion dos embries de S. alburnoides aparentam ser mais espessos comparativamente aos de Danio rerio. Durante este processo foram perdidos muitos dos embries recolhidos. Utilizando os embries que resistiram durante este processo o protocolo de imunohistoqumica foi realizada in toto em gota suspensa numa cmara hmida e o tempo de incubao para ambos os anticorpos foi de 48 horas a 4C. Posteriormente foi efectuada a aquisio de imagens no microscpio confocal Leica SPE.

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2.3 Anlise de imagens

2.3.1 Determinao da quebra de sincronia mittica (Transio materno-zigtica - MBT)

A anlise da MBT consistiu em dois tipos de observao: primeiro recorreu-se

aos vdeos obtidos por time-lapse na lupa, e atravs do Image J reconstruiu-se um cimograma (Figura 4) para cada embrio. Permitindo determinar com maior preciso os tempos de durao de cada clivagem. Neste cimogramas possvel ver a expanso do citoplasma das clulas que ocorre no momento que antecede cada citocinese (Figura 4; Filme 1- Primeiras clivagens em material suplementar). Quando j no era possvel identificar visualmente o momento da citocinese considerou-se que havia quebra de sincronia. Houve casos em que devido a movimentos bruscos durante a filmagem, como o adicionar de gua Petri, no foi possvel determinar a MBT para esses embries mas nos tempos das primeiras clivagens e assim aumentou-se a amostragem de observao para essas mesmas clivagens. Os tempos mdios de cada clivagem para cada ploidia esto representados na seco dos resultados.

Figura 4. Anlise das clivagens. A) Cimograma representando a alterao da forma da superfcie da blastoderme que ocorre durante as clivagens sncronas (A). Alguns exemplos de imagens da sequncia temporal esto representados em B-D. No cimograma (A) Alguns exemplos de imagens da sequncia temporal esto representados em B-D. No cimograma (A) o eixo dos YY representa a linha traada nas imagens da sequncia temporal (visveis em B-D) e o eixo dos XX representa o tempo desde do incio da filmagem. Cada pico no cimograma (setas) representa o momento em que os blastmeros assumem uma forma mais esfrica o que acontece sincronizadamente sempre que se inicia uma nova citocinese. Enquanto as citocineses so sncronas toda blastoderme muda de forma ritmadamente; quando essas pulsaes deixam de ser visveis considerou-se que ocorreu quebra de sincronia mittica (Filme 1, material suplementar).

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Apesar de terem sido recolhidos embries tetraplides a observao do seu desenvolvimento mostrou anomalias significativas com frequentes perdas da adeso entre blastmeros pelo que no se procedeu anlise dos ritmos mitticos nesta forma. Das restantes formas, foram analisados um total de 21 embries triploides (PAA), 6 diploides (PA) e 4 diploides (AA). Durante a aquisio das imagens em embries triploides verificou-se um individuo no fertilizado (Filme 2, material suplementar), tambm demonstrava oscilaes semelhantes aos dos embries fertilizados esses ritmos foram tambm medidos (Tabela III, seco resultados). Nestas imagens foi possvel tambm medir o dimetro mdio de cada embrio, e esses dados foram usados para estimar o NCR dos blastmeros nas diferentes ploidias (seco resultados).

A determinao da assincronia das cariocineses foi determinada a partir de reconstrues 3D de embries observados ao microscpio confocal. Para isso concentraram-se as observaes nas horas principais a que a MBT podia ocorrer (5h, 5,5h e 6h) e realizou-se uma reconstruo 3D no Amira de forma a visualizar, simultaneamente, vrios ncleos dos blastmeros a cada tempo pr-definido e determinar se estavam em sincronia ou assincronia. Esta anlise foi feita atravs da identificao para cada ncleo visvel das fases mitticas (Figura 5), ou seja, se foi apenas visualizada uma fase da mitose em todas as clulas observadas ento foi considerado que todo o embrio se encontrava sincronizado, caso isso no se verificasse considerou-se que j havia ocorrido assincronia. Depois de identificada cada figura mittica foi colocada uma esfera colorida a representar esse ncleo de acordo com a classificao dada na figura 5. Para poder identificar correctamente as diferentes fases mitticas foi necessrio usar ampliaes que no permitiam ver o embrio completo, sendo assim esta anlise foi feita apenas com base nos blastmeros visveis ao microscpio confocal, que variou entre 20-405 clulas dependendo do volume visvel, da ampliao e do estdio embrionrio. Para esta anlise apesar de terem sido recolhidos 5-10 embries para cada estdio e ploidia, o sucesso na recuperao de embries aps os testes com diferentes marcadores nucleares e a marcao de Feulgen s permitiu uma observao com sucesso de 1-3 para cada estdio nas principais horas onde a MBT poderia ocorrer (ver seco de resultados) em cada ploidia. A identificao das figuras mitticas e a sua distribuio permitiu computar para cada embrio um ndice de assincronia de acordo com a seguinte frmula:

[(contagem da fase menos frequente) (contagem da mais frequente)] ndice assincronia (IA) = 1 - ----------------------------------------------------------------------------------------

nmero total de blastmeros observados Quando todas as figuras mitticas identificadas esto na mesma fase, os valores do IA aproximam-se de 1, e quando h uma distribuio aleatria das diferentes fases esse valor aproxima-se de 0.

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Figura 5. Relao das fases mitticas com as cores de cada esfera durante a marcao na reconstruo 3D.

2.3.2 Determinao dos Rcios ncleo-citoplasma (NCR)

O NCR foi estimado a partir de medidas do dimetro dos embries filmados, obtidas usando o software ImageJ v1.44: para estimar o dimetro do zigoto (incluindo vitelo), optou-se por medir o dimetro mximo no momento da primeira clivagem (Figura 6.A), uma vez que antes da primeira clivagem ocorrem variaes no dimetro devidas entrada de gua aps a fertilizao. Usando o dimetro do zigoto estimou-se o volume da seguinte forma:

VOLzig = 4/3 * * ((dimetro zigoto)/2)3

A segunda estimativa do tamanho do embrio foi feita no momento da MBT medindo o dimetro da blastoderme conforme a figura 6. Uma vez que, ao contrrio do zigoto, a blastoderme no tem uma forma esfrica, para estimar o tamanho dos blastmeros optou-se pelo clculo de um ndice de tamanho celular (ITC) de acordo com a seguinte frmula:

ITC = Dimetro blastoderme na MBT / nmero estimado de clulas

O Volume estimado do zigoto e o ITC foram depois usados para computar um valor abstracto de NCR da seguinte forma:

NCRzig=ncromossomas/VOLzig

NCRMBT=ncromossomas/ITC

Figura 6. Representao da medio do dimetro do vitelo na I clivagem (A) e da blastoderme na MBT(B)). Estes valores foram utilizados para estimar NCRs.

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Fizeram-se tambm observaes do tamanho mdio celular em clulas de tecidos adultos (sangue, barbatana e fibroblastos), para saber se eventuais alteraes do NCR de embries se reflectiam tambm em tecidos adultos. Para tal fizeram-se medies do ncleo e do citoplasma para as diferentes ploidias (Figura 7. A.B.C).

Figura 7. Demonstrao do procedimento do clculo NCR, medio do ncleo utilizando um ROI (A), seleco da clula (B) e por fim a rea do citoplasma obtida atravs da subtrao (XOR) da rea do ncleo clula (C)

Para estimativa dos NCRs a partir de clulas adultas usei imagens obtidas ao microscpio medi as reas (de projeco) dos ncleos e citoplasmas desenhando uma ROI (Region Of Interest) volta do ncleo e da clula (Figura 7.A), tendo depois sido excluda a rea do ncleo rea total da clula usando a funo XOR para obter a rea de projeco do citoplasma, conforme a figura 7.C. As estimativas do NCR assim obtidas consistiram no rcio entre as duas reas; um aumento do NCR corresponderia a um aumento do ncleo (cujo tamanho est presumivelmente relacionado com a ploidia) sempre maior do um possvel aumento do citoplasma.

Uma anlise semelhante foi feita para fibroblastos, no entanto como no foi possvel obter culturas de confluncias equivalentes e como a confluncia afecta a rea total da clula no reportmos as medies do citoplasma, apenas as do ncleo pois a sua rea no alterada pela confluncia.

O NCR foi estimado tambm a partir de medies de clulas de barbatana in toto observadas no microscpio confocal. Sempre que foi possvel identificar clulas isoladas (o que diminuiu drasticamente o nmero de clulas medidas) foi medida a ROI do seu ncleo e citoplasma apenas numa das fatias pticas visveis.

2.3.3 Anlise dos padres de heterocromatinizao

Para a quantificao da marcao do anticorpo para a heterocromatina das diferentes ploidias e tecidos utilizou-se o software ImageJ 1.44K. Primeiro seleccionou-se uma ROI nuclear contornando o ncleo e obteve-se a intensidade mdia da fluorescncia para cada marcador de heterocromatinizao (Figura 8.A), Para normalizar esse valor (de forma a compensar diferenas devidas a variaes na marcao que ocorrem de amostra para amostra), alargou-se a ROI nuclear de

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forma a abranger uma poro do citoplasma 1 m fora do ncleo e depois subtraiu-se a rea do ncleo para obter a intensidade mdia do citoplasma circundante (Figura 8.B e .C). Os valores reportados representam a intensidade mdia do ncleo normalizada para a intensidade mdia do citoplasma circundante. Para o ncleo obtiveram-se tambm medidas da heterogeneidade da marcao, expressas como o desvio padro dos nveis de cinzento dentro da ROI nuclear.

Figura 8. Procedimento para medio da intensidade mdia dos marcadores de heterocromatinizao. Inicialmente delimitou-se o ncleo (ROI nuclear representada pela linha amarela em A). Para normalizar os valores de intensidade mdios fez-se uma expanso automtica da ROI de 1 m, subtrai-se a ROI nuclear e obteve-se a rea de citoplasma circundante (B) da qual se calculou a intensidade mdia para normalizao.

2.3.4 Anlise estatstica

Para a realizao da anlise estatstica foi sempre determinada a normalidade das amostras em causa com um teste estatstico no-paramtrico Kolmogorov-Smirnov e caso se verificasse, procedeu-se anlise da homogeneidade das amostras que foi realizada atravs do teste de Levene.

Se ambos os pressuspostos se verificassem realizou-se uma ANOVA de 1 via, e testmos a hiptese nula (H0) de no existncia de diferenas entre as formas; o valor de significncia usado for de 0.05. Ento realizou-se um teste no paramtrico de Newman-Keuls para averiguar se a nossa H0 era aceite ou no. No caso de rejeio da H0 realizou-se um teste Pos hoc para saber entre cada formas havia diferenas, neste caso o teste utilizado foi o de Tukey.

A B C

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3. Resultados

3.1 Descrio do desenvolvimento inicial em S. alburnoides

3.1.1 Descrio dos estdios e comparao com estdios modelo de Danio rerio

De uma forma geral foi possvel identificar os estdio tipo j descritos por

Kimmel et al. (1995), apesar do desenvolvimento de S. alburnoides ser notoriamente mais lento, uma vez que ambos se desenvolvem a temperaturas muito diferentes (28C para D. rerio, e 20C para S. alburnoides). Embora no tenhamos feito uma anlise das condies ptimas de cultura de S. alburnoides, durante a realizao de um cruzamento foram testados 30 embries para diferentes temperaturas (20, 22 e ~25) e a temperatura ptima rondou entre 20-22, pois foi onde houve menor taxa de mortalidade. Optou-se por manter os embries mesma temperatura a que foram mantidos os aqurios 20C. Devido escassez de amostras e a mortandade verificada durante as filmagens no foi possvel recolher exemplos de todos em estdios.

A anlise dos tempos de clivagens foi alvo de uma anlise mais detalhada e est relatada na seco determinao da MBT tabela III. No foram observadas diferenas bvias nos estdios de desenvolvimento posteriores MBT nas diferentes formas. A gastrulao (50% epibolia) foi identificada s 15.4 h, quer em PAA quer em PA e AA (~10 h de atraso relativamente ao Danio rerio). A formao de primeiro smito foi identificada num PAA s 30h, o surgimento de 10 smitos ocorre em todas as formas por volta das 37h e antes da ecloso (tal como em Danio rerio) o estdio observado Long Pec, que ocorre por volta das 68h e a ecloso ocorre ~72 h (maior detalhe na Tabela V). O vitelo parece durar mais tempo em S. alburnoides, na fase Protruding mouth o volume do vitelo maior que o equivalente estdio em D. rerio. O aparecimento de melancitos tambm diferente, em D. rerio comeam a ser visveis s 33h (Kimmel et al., 1995), enquanto em S. alburnoides s foi detectado no incio do 5 dia, apenas um embrio amostrado. Na figura 13 podemos verificar as diferenas temporais entre os diferentes estdios tipo de D. rerio comparativamente com S. alburnoides

A descrio de estdios tipo proposta por Kimmel pode ser usada para identificar estdios em S. alburnoides, com as devidos ajustes (Figura 9) para os tempos de ocorrncia assim como a diferena no tamanho e durao do vitelo, e aparecimento de melanforos.

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Figura 9. Durao dos estdios representativos do desenvolvimento em Danio rerio em comparao com o complexo S. alburnoides.

28

3.1.2 Determinao da MBT

Durante as primeiras clivagens observaram-se movimentos citoplasmticos durante a formao do blastodisco (1 blastmero; Figura 4.A), que se sucederam ritmicamente a cada nova clivagem. Estes movimentos parecem resultar do transporte massivo de citoplasma do vitelo para os primeiros blastmeros em formao, e depois a um alterao da forma dos blastmeros que se tornam mais esfricos nos momentos que antecedem cada citocinese. Os movimentos podem ser vistos nos filmes como uma aparente expanso da superfcie dos blastmeros/blastoderme, acompanhado de uma regresso (contraco) antes de cada nova citocinese (Filme1- material suplementar).

Nas primeiras 3-4 clivagens no ocorre uma separao entre os citoplasmas dos blastmeros e do vitelo (i.e, no ocorre celularizao), o que torna mais difcil a identificao do fim dessas clivagens. No entanto, pelos movimentos de expanso citoplasmtica conseguimos determinar o ritmo de cada diviso; uma forma particularmente til de visualizar estas ondas de expanso citoplasmtica foi a anlise de cimogramas (ver material e mtodos). A tabela III resume a anlise dos cimogramas e a determinao dos tempos mdios para cada clivagem nas diferentes ploidias e formas.

Curiosamente, estas ondas de expanso/contraco citoplasmtica foram observadas tambm em ocitos activados e no fertilizados, o que sugere que o mecanismo da sua formao independente da mitose. No entanto, estes casos, no ocorreu a formao de planos de clivagem e aparecimento de blastmeros (Filme 2- material suplementar). Tabela III. Durao do tempo mdio de cada clivagem (em minutos) para as diferentes formas, com base na anlise dos cimogramas.

Clivagem I II III IV V VI VII VIII IX X XI

Tempo(min)1 99 140 178 213 248 283 319 357 395 420 480

Form

as

PAA(n=2:21)2 99 41 38 35 35 35 36 38 38 MBT MBT

PA(n=1:6)2 83 36 34 32 32 32 33 35 35 36 MBT

AA(n=1:4)2 82 44 39 37 36 37 38 35 33 34 MBT

PAA(nofrtil) 120 46 32 34 36 42 46 50 50 54 56 1 Tempo mdio de ocorrncia das clivagem usando triploides como referncia. 2 Indicao de n representam posturas:embries analisados. Nos embries triplides observou-se um atraso no tempo mdio do fim da

primeira clivagem (99 2.5 min) quando comparado com o tempo da primeira diviso de ambas as formas diplides analisadas (PA e AA). Esta diferena, embora menos evidente, manteve-se ao longo das primeiras X clivagens. Nos triplides, em todos os embries analisados (n=21) nunca foi possvel identificar o fim da X clivagem, o que sugere que a assincronia mittica ocorre logo aps a IX clivagem. Nos diploides hbridos foi possvel identificar com preciso o fim da X clivagem em todos os

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embries (n=6), enquanto nos AA foi possvel identificar a X clivagem em quatro de um total de cinco embries, o que sugere que nestes casos a quebra de assincronia ocorre apenas X clivagem. A figura 10 ajuda a entender a durao de cada clivagem entre formas, demonstrando o atraso na 1clivagem dos triploides.

Figura 10. Durao das diferentes clivagens para as diferentes formas. Note-se, por exemplo que s 4h (240min), os triploides estavam ainda a meio da V clivagem, enquanto os PA e AA estavam j na VI. Curiosamente, os 4 embries AA analisados mostraram tempos de clivagens mais longos que os PA, mais consistentes com os tempos observados nos PAA. Apesar disso, ao contrrio que que aconteceu com os PAA, nos AA foi possvel identificar o fim da X clivagem (~410min) o que mostra que os blastmeros se mantiveram sincronizados por mais tempo nesta forma.

A sincronia mittica foi analisada tambm por identificao das figuras

mitticas em embries fixados e recolhidos a intervalos de tempo fixos (ver materiais e mtodos). Para melhor identificar a assincronia das cariocineses, em cada conjunto de embries recolhidos em intervalos de tempo de 30min abrangendo o tempo previsto para a MBT (5h, 5.5h, 6h e 6.5h) fizeram-se reconstrues 3D das imagens de confocal recolhidas nas quais foi possvel identificar as diferentes figuras mitticas e calcular ndices de assincronia para cada embrio (ver materiais e mtodos). Essas contagens e ndices esto apresentados na Tabela IV

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540PAA

PA

AA

Form

as

Tempo(minutos)

IIIIIIIVVVIVIIVIIIIXXXI

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Tabela IV. Contagens mitticas e respectivos ndices de assincronia para as diferentes formas (AA, PA e PAA) nas horas circundantes da MBT.

A identificao e contagem das figuras mitticas demonstrou que s 5 h (em

embries cultivados para recolha e fixao) aps a fertilizao no existe um nvel de assincronia associado para ambas as ploidias (Figura 11). No entanto, a perda de sincronia nos triploides (PAA) ocorre s 5.5 h ps-fertilizao (Figura 12), na mesma altura nos diploides a sincronia ainda existe (Figura 13), ocorrendo em ambos os diploides (PA e AA) apenas s 6 horas (Figura 14). O clculo do ndice de assincronia (ver materiais e mtodos) demonstrou que a assincronia vai aumentando medida que o tempo avana, pode-se observar este aumento no ndice de assincronia em PAA (Figura 15).

Estes resultados sugerem que a quebra de sincronia das cariocineses nos triplides ocorre mais cedo do que nos diplides, confirmando de igual modo a anlise das filmagens.

Esta anlise mostrou que nos embries triplides a quebra de assincronia da cariocinese acontece na IX diviso (s 5.5h) enquanto em diploides ocorre s 6h (X clivagem).

Forma Horas(p.f) Blastmerosvsiveis Profase Metafase Anafase Telofase ndicedeAssincroniaAA 5,5 189 189 0,0 0,0 0,0 0,05,5 176 176 0,0 0,0 0,0 0,06,0 95 35 36 14 10 0,736,0 158 41 39 4 74 0,566,0 95 34 27 4 30 0,68PA

4,5 58 0 0 0 58 0,005,0 345 338 1 0 6 0,025,0 295 277 8 0 10 0,065,5 195 195 0 0 0 0,06,0 405 262 39 5 99 0,376,0 322 206 60 2 54 0,37PAA 5,0 20 0 0 20 0 0,005,5 77 51 14 4 8 0,395,5 24 15 3 2 4 0,466,0 230 62 39 37 92 0,76

31

Figura 11. Reconstrues 3D de embries fixados e corados pelo mtodo de Feulgen. Embora o mtodo seja para marcao de DNA, o citoplasma tambm era visvel o que permite ver a forma dos blastmeros. Em alguns casos so mostradas tambm as esferas coloridas que assinalam as diferentes fases mitticas identificadas de acordo com a figura 5 nos materiais e mtodos. A) Embrio triploides PAA fixado s 5h (p.f.); A) detalhe mostrando trs anafases; B) Embrio PA s 5h; B detalhe mostrando profases. Nesta imagem esto representadas tambm as bolhas coloridas que identificam a fase de cada ncleo analisado. (barras=300m).

Figura 12. Demonstrao da forma PAA s 5.5h (p.f), que ao contrrio das imagens anteriores foi encontrada assincronia. (escala=125 m) Figura 13. Demonstrao de sincronia nos embries diploide AA (A) e PA (B) s 5.5 h (p.f). (escala=50m)

32

Figura 14. Demonstrao da reconstruo 3D para AA (A) e PA (B) s 6h (p.f), confirmando a perda de sincronia.(escala A= 125 m e B=200 m) Figura 15. ndice de assincronia mittica relativamente ao tempo ps-fertilizao nas diferentes formas (PAA, PA, AA). de salientar que aps a anlise das cariocineses estes embries (fixados e corados) pareciam estar adiantados em relao aos embries filmados. Por exemplo, de acordo com os filmes, s 5h os PAA deviam ter 64 blastmeros e estar a fazer a VII clivagem, enquanto os PA deviam ter 128 blastmeros e estar a fazer a VIII clivagem. A contagem das figuras mitticas mostrou consistentemente mais ncleos nos diploides que os esperados, embora isto seja espectvel pois as cariocineses antecedem as citocineses, o tamanho dos blastmeros visveis nas reconstrues 3D, e a diferena no nmero de ncleos sugerem que estes embries estariam efectivamente avanados. As possveis causas desta diferena so discutidas mais a baixo. De qualquer das formas, estas observaes confirmaram a tendncia para os triploides (PAA) mostrarem uma quebra de sincronia mais precoce.

0,00,10,20,30,40,50,60,70,8

4.5h 5h 5.5h 6h

ndice

deas

sinc

ronia

Tempo(p.f)

PAAPAAA

33

3.1.3 Determinao de rcios ncleo-citoplasma (NCR)

Para melhor compreender os efeitos da ploidia no controlo dos ritmos das clivagens tentmos estimar o NCR. Mais do que um valor absoluto, este um conceito abstrato, pelo que optmos por fazer uma estimativa dividindo o nmero de cromossomas presente em cada ploidia e uma medida do tamanho dos blastmeros. No entanto, como no nos foi possvel medir de forma rigorosa os dimetros dos blastmeros a partir das imagens dos filmes, ou sequer a partir das reconstrues 3D de embries fixados (apresentavam deformaes significativas devido ao processamento do tecido, assim como uma dimenso reduzida em relao aos embries frescos), optou-se por estimar o NCR a partir da medio do dimetro da blastoderme no momento da MBT. Apesar de a posio dos embries ser varivel, a blastoderme tem um contorno circular pelo que as medies do dimetro eram consistentes a partir de qualquer ngulo.

Figura 16. Relao entre o nmero de cromossomas e o volume do zigoto (VOLzig) e ITC (ndice de tamanho celular de blastmeros em MBT). Apesar de haver uma relao aparentemente linear entre a ploidia e o tamanho do zigoto ou blastmeros, os zigotos de embries AA apresentaram um volume inesperadamente elevado (crculo tracejado). Este valor afectou significativamente as estimativas de NCR apresentadas. Tabela VI. Resultados das medies de dimetros dos zigotos e blastodermes e clculos de NCRs abstratos.

DNA

Dimetrozigoto(um)

VOLzig(um3)

NCRzig

dimetroblastoderme

(um)

nblastmerosestimado

ITC

NCRMBT

PA 50 911.1 3.96E+08 126.2E9 704.9 1024 0.74 72.6PAA 75 1069.3 6.40E+08 117.2E9 784.0 512 1.53 49.0AA 50 1056.9 6.18E+08 768.1 1024 0.75 66.7

34

Embora parea existir uma relao linear entre a ploidia e o tamanho do zigoto e

dos blastmeros em MBT (Figura 16), os embries AA apresentavam valores de zigotos anormalmente grandes, facto para o qual no encontrmos um explicao e pelo qual decidimos comparar apenas os NCRs de PAA e PA.

Para a primeira diviso estimamos um valor abstracto de NCRzig para o zigoto, e para a MBT estimmos um NCRMBT, uma vez que j havia separao entre o citoplasma dos blastmeros e do vitelo (de acordo com as frmulas descritas nos matrias e mtodos). Curiosamente em ambos os casos os PAA parecem ter valores de NCR abstratos menores que os PA, o que no nos permite concluir que uma MBT precoce em triploides devida de um aumento no NCR.

De seguida fomos determinar os NCRs em clulas de tecidos adultos para

tentar confirmar um padro de NCR. Nas clulas de barbatana observadas ao microscpio confocal, o tamanho nuclear maior nos triploides (Figura 17) comparativamente com os ncleos diploides (AA, PA e PP), sendo esta uma diferena estatisticamente significativa (p

35

Figura 18. Demonstrao dos tamanhos nucleares (normalizado para PP) para as diferentes ploidias nos fibroblastos, sendo PAA diferente de PP.

No entanto, tambm o citoplasma maior nos eritrcitos, assim como nas clulas de barbatana (Figura 19). Infelizmente no nos foi possvel obter medidas fiveis do tamanho do citoplasma de fibroblastos em cultura uma vez que as amostras comparadas estavam com diferentes nveis de confluncia o que afecta a capacidade das clulas expandirem o seu citoplasma.

Figura 19. Demonstrao dos tamanhos do citoplasma para as clulas da barbatana e sangue nas diferentes ploidias.

Estes dados em conjunto sugerem que o tamanho celular normal quer em

blastmeros quer em clulas adultas influenciado pela ploidia. Embora exista um aumento notrio no tamanho do ncleo, no claro que exista um aumento do citoplasma equivalente.

No clculo do NCR estas diferenas observadas no so estatisticamente diferentes entre PA e PAA. Contudo, nas clulas do sangue existem diferenas entre AA e as restantes formas (p

36

Figura 20. Valores do NCR (normalizado para PP) para as clulas da barbatana e do sangue, havendo diferenas entre AA para o sangue e em PP para a barbatana.

3.2 Modificao de histonas - Anlise da Intensidade e heterogeneidade das marcaes

3.2.1 Cultura de fibroblastos

Com recurso s culturas de fibroblastos efectuadas, apenas foi possvel analisar para os genomas PAA e PP, devido ao facto das outras culturas no terem crescido.

Analisando a intensidade nuclear dos anticorpos Hp1 e H3K9 para ambas as formas, podemos verificar nas Figuras 21 e 22 que temos uma maior intensidade para ambos os anticorpos no triplide (PAA) relativamente ao diploide (PP), no entanto apenas na marcao de Hp1 se verificaram diferenas estatsticas significativas. Figura 21. Intensidade mdia de H3K9 nuclear para as diferentes formas, normalizado para a intensidade mdia do diploide.

0,00,20,40,60,81,01,2

PAA PPInten

sida

dem

dia(u

.a)

Formas

37

Figura 22. Intensidade mdia de HP1 nuclear para as diferentes formas, normalizado para a intensidade mdia do diploide, havendo diferenas estatsticas entre eles.. Depois disto, realizou-se a anlise da heterogeneidade da marcao no ncleo para tentar entender se existiam focos de intensidade para algum dos marcadores. Com essa anlise verificou-se na anlise de H3K9 que a heterogeneidade maior no diploide (Figura 23), enquanto que para a Hp1 existe maior heterogeneidade no triploide (Figura 24). A anlise estatstica veio comprovar a existncia de diferenas significativas para ambos os casos.

Figura 23. Heterogeneidade mdia de H3K9 nuclear, normalizado para a heterogeneidade mdia do diploide, mostrando diferenas significativas nos triploides (asterisco).

Figura 24. Heterogeneidade mdia de Hp1 nuclear, normalizada para os diploides, com diferenas significativas nos triploides (asterisco).

0,00,20,40,60,81,01,2

PAA PP

Heterog

eneida

dem

dia

Formas

*

*

0,00,51,01,52,02,5

PAA PP

Heterog

eneida

dem

dia

Formas

*

*

0,00,20,40,60,81,01,21,4

PAA PPInten

sida

dem

dia

Formas

**

38

Atravs da observao das imagens obtidas na cultura de fibroblastos, verificou-se que na periferia dos ncleos no eram visveis focos de heterocromatina, fentipo que por vezes est relacionado com o silenciamento. Nem a marcao de DAPI nem a de marcadores heterocromticos para ambas as ploidias mostrou esse efeito (Figura 25 e 26).

Figura 25. Imagens de cultura de fibroblastos PAA com marcao para H3K9, HP1 e respectiva marcao nuclear (DAPI). (escala= 5 m) Figura 26. Imagens de cultura de fibroblastos PAA com marcao para H3K9, HP1 e respectiva marcao nuclear (DAPI). (escala= 5 m)

3.2.2 Crebro

O estudo da verificao de diferenas da marcao de Hp1 no ncleo foi tambm realizado em clulas do crebro. Sendo executada a mesma anlise que no caso dos fibroblastos.

Neste caso, abordamos mais uma forma para os diplides (PA), para alm das analisadas anteriormente. Aqui verificou-se que a intensidade nuclear de Hp1 diferente entre ploidias, essa intensidade mais elevada no caso dos triploides (Figura 27). Esta diferena estatisiticamente significativa, verificando-se essas diferenas

H3K9PAA DAPIPAA

HP1PAA DAPIPAA

DAPIPP H3K9PAA

HP1PP DAPIPP

39

entre o triplide PAA e ambos os diplides (PA e PP). O mesmo se verificou em relao heterogeneidade da marcao (Figura 28).

Figura 27. Anlise da intensidade mdia da marcao nuclear de Hp1 nas diferentes ploidias, normalizado para a intensidade mdia de PP), mostrando uma diferena significativa do triploides (asterisco). Figura 28. Heterogeneidade mdia nuclear de HP1 para clulas de crebro nas diferentes formas (normalizado para os PP), mostrando diferenas significativas no triplide (asterisco).

3.2.3 Sangue O mesmo tipo de anlise foi efectuada em esfregaos de sangue, aps observao da marcao de HP1. Desta forma, conseguimos abranger todas as formas diplides (AA, PA e PP) do nosso estudo, enquanto que relativamente aos triploides a mesma forma (PAA) foi utilizada. Esta anlise veio demonstrar que as diferenas j anteriormente detectadas nos triploides (PAA) so outra vez significativas para este tecido (Figura 29).

0,00,20,40,60,81,01,21,4

PAA PA PP

Intens

idad

emd

ia

Formas

*

0,00,51,01,52,02,5

PAA PA PP

Heterog

eneida

dem

dia

Formas

*

40

Figura 30. Intensidade mdia da marcao nuclear de Hp1 entre as diferentes formas, normalizadas para a intensidade mdia em PP, mostrando diferenas significativas nos triploides (asterisco).

Quanto anlise da heterogeneidade nuclear da marcao de Hp1 nas diferentes formas, esta anlise mostrou diferenas estatisticamente significativas entre o triplide e os diploides PA e PP, enquanto que relativamente a AA no existe diferenas. Foi tambm verificada diferena entre diplides PA e PP (Figura 31).

Figura 31. Heterogeneidade nuclear de HP1 nas diferentes formas, normalizada para a heterogeneidade mdia de PP, mostrando diferenas significativas entre triploides e os diploides PA e PP (asteriscos), mas no entre triploides e os diploides AA.

3.2.4 Embries pr e ps-MBT

Para a anlise da intensidade da protena HP1 em embries antes e depois da MBT, utilizaram-se cinco embries para cada forma mencionada acima e realizou-se a descorionizao para permitir a entrada do anticorpo o que resultou na destruio da maioria dos embries. Tendo sido aproveitados para pr-MBT n=1 (PAA), n=2 (PA) e para a anlise ps-MBT n=2 (AA), n=1(PAA), n=1(PA).

Atravs da quantificao da intensidade da marcao de HP1 que foi realizada da mesma forma que as anlises anteriores, verificou-se que na observao pr-MBT no existe marcao significativa desta protena para ambas as ploidias analisadas. Enquanto que na anlise ps-MBT existe marcao em todas, com maior intensidade nos triploides (Figura 32).

0,00,20,40,60,81,01,2

AA PA PAA PPIntens

idad

eHp1

Formas

*

0,00,20,40,60,81,01,21,41,6

AA PA PAA PP

Heterog

eneida

deHp1

Formas

*

* *

41

Figura 32. Representao das intensidades mdias da marcao de HP1 nuclear em embries pr e ps-MBT (5h e 9h), normalizadas para os valores de PA, mostrando diferenas significativas entre embries pr- e ps MBT, e aps MBT no triploide em relao aos diploides.

Figura 33. Marcao de HP1 nuclear em embries de diferentes ploidias antes (5h) e depois da MBT (9h). Verde = HP1, vermelho = DNA.

0,0000,5001,0001,5002,0002,500

AA PA PAAIntens

idad

eHp1

Formas

PrMBTPsMBT

*

42

4. Discusso

Este trabalho procurou analisar se a poliploidia originava efeitos durante o desenvolvimento inicial e nos mecanismos de epigentica do complexo Squalius alburnoides.

Relativamente ao desenvolvimento foram realizadas observaes de vrios embries para as diferentes ploidias e formas do complexo, verificou-se que existe uma perda de assincronia mais cedo nos triploides do que nos diploides nos dois mtodos utilizados para esse efeito. No entanto, na anlise realizada com base nos vdeos com recurso a cimogramas verificou-se a perda de sincronia IX clivagem nos triploides e X clivagem para diploides, ambas por volta das 6,5 h. O outro mtodo realizado para verificar esta perda de sincronia demonstrou que nos triploides ocorre s 5,5h, e no caso dos diploides s 6h ps fertilizao, embora no possamos excluir a possibilidade destas diferenas serem devidas a diferentes temperaturas nos dois mtodos de cultura usados. No entanto, em ambos os casos verificou-se que a sincronia surge mais cedo nos triploides, tal como tinha sido previsto no trabalho de Newport e Kirschner. As diferenas entre mtodos devem-se provavelemente ao facto de durante a filmagem terem ocorrido oscilaes de temperatura na sala, e uma diminuio da temperatura provocar atraso no desenvolvimento.

Esta ocorrncia poderia ter sido verificada com a anlise dos embries marcados pelo mtodo de Feulgen, no entanto, aps as desidrataes no processo do mesmo os blastmeros sofreram grandes alteraes e a sua anlise poderia cair em erro. Para confirmar isto ter que se analisar formas mais precoces, uma vez que anlise para j incidiu apenas sobre embries perto da MBT.

A criao de uma tabela com os tempos e estdios respectivos, um dado importante para estudos futuros de S. alburnoides, assim como a verificao de que possvel identificar os mesmos estdios tipo descritos por Kimmel et al., 1995.

Relativamente ao efeito do NCR durante o desenvolvimento, as anlises realizadas relativamente aos dimetros obtidos para o zigoto no momento da MBT embora mostrem diferenas no tamanho do PAA e PA, ela no altamente significativa (p=0.03), o que sugere que os embries regulam o tamanho das suas blastodermes, apesar do seu tamanho inicial maior (para o qual contribui massivamente a reserva do vitelo). Salvaguardando que os triploides fizeram menos uma clivagem e as blastodermes tenham tamanhos equivalentes, os blastmeros dos triploides so quase o 2x maiores. Para confirmar estes valores seriam necessrias medidas mais directas do volume dos blastmeros para que a determinao do NCR. Dessa forma talvez fosse possvel determinar um NCR mais rigoroso e que apontasse para uma confirmao do efeito do NCR no controlo da MBT.

Ficamos com dvidas sobre o significado do maior tamanho dos zigotos de diploides AA. Para comprovar estas diferenas, mais cruzamentos e de diferentes fmeas e machos deveriam de ser feitos, assim como uma anlise rigorosa do tamanho tpico de ocitos nas diferentes formas. Este aspecto foi abordado por Ribeiro et al (2003), embora e os dados apresentados no sejam comparveis com as nossas observaes.

43

Foi ainda interessante observar que existe um ritmo basal de movimentos citoplasmticos pr-programado no ocito, visto nas pulsaes de ocitos no fertilizados, que continuam muito para l do tempo normal da MBT. De que forma esse comportamento ritmado se sobrepe ao ritmo adquirido durante as clivagens (presumivelmente regulado pelo NCR) no claro.

Os clculos que efectumos para estimativas de NCR abstractos mostraram ser menores no zigoto triploide o que veio pr em causa o efeito do NCR na ocorrncia da MBT. As observaes de clulas adultas apontam para poucas diferenas de NCR entre formas, embora revelem claramente um aumento do tamanho nuclear em triploides. A no existncia de diferenas nos NCRs de clulas somticas adultas sugere uma expresso aditiva nos genes de RNA ribosomais, uma vez que estes representam cerca de 90% do RNA total da clula e os ribossomas 30% da massa da clula (Benjamin Lewin, Genes IX). A aditividade na expresso dos genes ribosomais ainda suportada pela inexistncia de focus heterocromticos visveis na periferia dos nuclolos (Figuras 25 e 26), caracterstica geralmente associada a um mecanismo de dominncia nucleolar que se verifica muitas vezes em hbridos. Na dominncia nucleolar um dos genomas parentais silenciado para os genes ribosomais, a ausncia de evidncia para este fenmeno em S. alburnoides vem realar a espetacularidade deste complexo, na medida em que, apesar da necessidade de regular negativamente vrios mRNAs (Pala et al., 2008), no caso dos rRNAs parece no existir essa urgncia, sendo mesmo pouco compreensvel a necessidade em aumentar a produo da maquinaria de traduo, quando por sua vez os mRNAs esto reduzidos a uma dosagem diploide. Assim, mais uma vez, este complexo reala a sua grande tolerncia biolgica agora tambm ao nvel molecular/celular. No podemos no entanto excluir a hiptese de apenas um dos genomas estar a expressar os genes de rRNA mas de uma forma ampliada e assim compensar a ausncia de expresso do outro genoma. Portanto, no podemos excluir por completo a suposio de ausncia de dominncia nucleolar, sendo necessrio reforar esta investigao com outro tipo de experincias, possivelmente testando a sobreposio de imagens com marcadores heterocromticos e FISH para rDNA e/ou rRNA usando sondas especificas do genoma.

Neste trabalho tentou-se ainda identificar um dos possveis mecanismos do silenciamento gnico verificado por Pala et al., 2008, para isso foram realizadas diversas experincias com base na marcao de duas protenas frequentemente utilizadas como marcadores heterocromticos: a HP1 e a H3K9me3. Durante esta anlise deparamo-nos com vrios problemas associados, tais como as cultura de clulas no terem proliferado e a marcao de ToPro3 (marcador nuclear) nem sempre funcionar. Salvo estes problemas, os nossos resultados demonstram no geral a existncia de maior marcao da protena HP1 nos triploides face aos diploides quer nas clulas somticas adultas quer nas clulas do embrio. Nos embries verificmos a inexistncia de marcao pr-MBT, o que esta de acordo com o descrito, na medida que nesta fase o genoma do ocito est transcripcionalmente silenciado, sendo a expresso exclusivamente materna (Lindeman&Pelegri, 2010). Assim, tal como esperado, aps a MBT a marcao de HP1 surge indicando que o controlo da expresso gnica tem incio durante o desenvolvimento inicial logo aps a MBT. Contudo, algum cuidado tem de se ter na anlise destes resultados, na medida em que a literatura se tem mostrado recentemente contraditria relativamente participao da HP1 na regulao da expresso gnica, por vezes no associada represso mas h activao da transcrio (Caillier et al., 2010)

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Relativamente aos resultados para a marcao por H3K9, estes no foram to claros, possivelmente por que esta marcao se mostra pouco especifica, apresentado extenses para o citoplasma (Imagem H3K9- ver material suplementar)

A heterogeneidade da marcao heterocromtica nuclear mostrou-se consistentemente maior nas formas triploides. Mais uma vez estes resultados suportam a existncia de silenciamento nos triploides via mecanismos heterocromticos, na medida em que expectvel a existncia de mais focus em ncleos sujeito a silenciamento gnico. Por outro lado no h evidncias de grandes marcaes heterocromticas na periferia desses ncleos, suportando as evidncias dadas por Pala et al. 2008 de que no existe um silenciamento de um haploma inteiro, pois nesse caso estes iria tendencialmente localizar-se na periferia (Francastel et al., 2000).

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