UNIÃO DA TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO DENTRO DO NÚCLEO

DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS

Coupled transcription and translation within nuclei of mammalian cells

Francisco J. Iborra, Dean A. Jackson, Peter R. Cook

Science vol 293, 1139-1142

Agosto 2001

Introdução

Procariotos X Eucariotos

RNA polRNA pol

DNADNA

mRNA

mRNA

mRNA degradado

Tradução

Tradução

Ribossomo

Ribossomos Citoplasma

Citoplasma

Citoplasma

Transporte

Núcleo

Transcrição

Transcrição

mRNA maduro

Introdução

A membrana nuclear é a característica

que define os eucariotos.

Ela divide a célula em dois

compartimentos e assume-se que a tradução está

restrita somente a um deles - o citoplasma.

A idéia seria EVITAR a tradução antes

do splicing.

Introdução

Três evidências para que ocorra tradução

no núcleo:

1. Núcleo contém componentes necessários, mas

estes podem não estar ativos;

Introdução

2. Experimentos “pouco” controlados levam a

acreditar que núcleos podem aminoacilar tRNAs e

incorporar aminoácidos radioativos em proteínas.

Suspeita de contaminação

Núcleo Citoplasma

ProteínasMigração

Introdução

3. Degradação dos transcritos que possuem stop

códons prematuros (fenômeno conhecido como

“nonsense-mediated decay” - NMD).

UAA

Stop códon prematuro

Degradação

mRNA

mRNA

Introdução

Como pode a única maquinaria capaz

de reconhecer um stop códon - um ribossomo

citoplasmático ativo - disparar a degradação de

um transcrito que ainda está no núcleo?

Metodologia antiga de localização de sítios de tradução no núcleo:

[ 3H ] leucina tRNAleu - [ 3H ] leucina. Proteína

Desvantagem: tempo de incubação longo para a conversão da [ 3H ] leucina o que dá tempo à proteína recém sintetizada de entrar no núcleo.

Metodologia Antiga

Conversão

Síntese

Metodologia Atual

Um sistema de tradução in vitro que

utilizasse temperatura baixa e concentrações

subótimas de precursores, de modo que poucas

proteínas, que continham em média 350 resíduos

de aminoácidos, fossem completadas durante a

reação e estivessem aptas a escapar dos sítios de

síntese.

Metodologia Atual

Materiais a serem utilizados:

HCO3-

ATP

Na+

Mg2+

K+

[ 3H ] leu

19 aa

Aminoacil tRNA sintetases

GTP

Metodologia Atual

Condições do experimento:

Incubação a baixas temperaturas, 27.5o

Curto tempo, 3 minutos

Consequentemente, poucas proteínas seriam completadas durante a incubação.

Somente 15 resíduos seriam polimerizados.

Tamanho médio das proteínas seria de ~350aa.

Padronização do sistema

Verificação do efeito de inibidores na incorporação de [ 3H ] lisina durante a síntese de proteínas.

9%

Padronização do sistema

A mesma verificação foi feita ao se incorporar [35S] Met durante a síntese protéica.

Produtos marcados tinham o tamanho esperado de uma população de polipeptídeos recém-sintetizados normais.

Padronização do sistema

Para garantir, verificaram que a incorporação de [3H] Leu na presença de biotina-lisina-tRNA não inibia a síntese de proteínas.

Além disso, viram que a biotina era melhor imunolocalizador que os precursores radioativos.

Imunolocalização da biotina

A imunolocalização de polipeptídeos recém-

sintetizados com biotina é complicada pela existência

de biotina endógena.

Esta é encontrada solúvel e/ou

covalentemente ligada a carboxilases na matriz

mitocondrial.

A biotina solúvel foi extraída utilizando-se

tRNAs carregados. E a biotina covalentemente ligada

foi imunomarcada.

Imunolocalização da biotina

Biotina nas mitocôndrias foi

prontamente detectada, mas a dos

núcleos não.

Núcleo e citoplasma mais

marcados após incubação com

biotina-lisina-tRNA. A marcação

nuclear está concentrada em sítios

discretos.

Controle com cicloheximida

reduziu a marcação porque inibe a

síntese protéica.

Alguns peptídeos com biotina poderiam ter sido feitos no citoplasma e importados para dentro do núcleo, mas marcação similar foi obtida com núcleos isolados desprovidos de > 95% dos ribossomos citoplasmáticos.

Imunolocalização da biotina

Célula X Núcleo

Imunolocalização da biotina

Nenhum sinal mitocondrial foi visto do lado de fora dos núcleos, confirmando que a maior parte do citoplasma havia sido removida.

A remoção de > 95% dos ribossomos citoplasmáticos não afetou a intensidade nuclear.

Imunolocalização da biotina

A periferia nuclear não foi marcada,

por isso, a síntese de proteínas na membrana

nuclear externa seguida por importação não

foi a responsável pela marcação interna.

A mesma intensidade nucleoplasmática

foi obtida em amostras de células e núcleos

isolados.

Imunolocalização da biotina

Núcleo

Células

00

50

25

40 80Intensidade

( unidade arbitrária)

Número

Para provar que ribossomos citoplasmáticos não eram os responsáveis pela marcação do núcleo, foi utilizada a droga “thapsigargin” (bloqueador de importação nuclear).

Imunolocalização da biotina

Núcleo + thapsigargin

Proteínas

> 40KDa

Imunolocalização da biotina

Mesmo que os ribossomos citoplasmáticos tivessem entrado, eles não poderiam iniciar a tradução porque foi adicionado ATA (ácido aurintricarboxílico). Este inibe o início da tradução sem afetar a marcação do nucleoplasma.

Todos estes controles serviram para confirmar que a tradução citoplasmática não poderia ser considerada na marcação nuclear.

BODIPY-lisina-tRNA

Resultados similares foram obtidos com BODIPY-lisina -tRNA que também marca proteínas recém-sintetizadas em reações de tradução.

BODIPY-lisina -tRNA não tem o imprevisto da biotina, pois não é um composto endógeno.

BODIPY-lisina-tRNA

Células permeabilizadas

Células permeabilizadas + cicloheximida

O sinal nucleoplasmático constitui 14% do total.

A marcação citoplasmática foi cerca de 5 vezes mais forte que a nuclear.

BODIPY-lisina-tRNA

mRNA

mRNA

Núcleo

Citoplasma

A marcação com biotina-lisina-tRNA e

BODIPY-lisina-tRNA, que foi detectada com

métodos diferentes, deram resultados

similares.

Biotina X BODIPY-lisina-tRNA

Biotina X BODIPY-lisina-tRNA

Biotina-lisina-tRNA

BODIPY-lisina-tRNA

100%

15%

Immunogold

Posteriormente, células permeabilizadas e

incubadas com biotina-lisina-tRNA foram

marcadas com “Immunogold” confirmando que o

interior nuclear continha cerca de 10% dos

peptídeos recém-sintetizados da célula.

Immunogold

Núcleo

Citoplasma

Immunogold

Hipótese:

- Se toda a tradução ocorresse no citoplasma,

proteínas recém-sintetizadas entrariam e se

difundiriam por todo o núcleo; mas, se alguma

tradução estivesse unida à transcrição alguns

peptídeos nascentes teriam que ser encontrados

juntamente com transcritos nascentes.

Immunogold

Polipeptídeos recém-sintetizados e RNA foram estendidos na presença de biotina-lisina-tRNA e Br-UTP e também marcados com “Immunogold”. Os dois foram, muitas vezes, encontrados juntos.

Resultado final

Mostrou-se que :

- lisina ligada a três diferentes marcadores -

3H, biotina e BODIPY - é incorporada dentro de

sítios discretos no núcleo e que alguma desta

tradução nuclear depende de transcrição

simultânea pela RNA polimerase II.

Modelo

A partir deste resultado combinado ao resultado obtido no NMD propõe-se o seguinte modelo:

- Ribossomos são montados dentro do nucléolo e exportados para ambos nucleoplasma e citoplasma, onde eles se associarão com transcritos e se tornarão ativos;

- Exportação não precisa ser seletiva, talvez 10 vezes mais ribossomos terminem ativos no citoplasma, enquanto o nucleoplasma está junto à cromatina.

- Alguns ribossomos nucleares estão incorporados dentro dos sítios de transcrição do nucleoplasma que contêm muitas polimerases ativas e unidades de transcrição.

- Estes ribossomos “corrigem” transcritos recém-sintetizados enquanto eles emergem de polimerases.

Modelo

- Qualquer ribossomo acoplado detecta stop códons incorretamente posicionados, ativando a degradação destes transcritos; simultaneamente polipeptídeos truncados e indesejáveis são degradados por proteasomas.

- Se nenhum stop códon prematuro for encontrado, o transcrito deverá ser exportado para o citoplasma onde sofrerá múltiplas iniciações.

Modelo

Conclusão Geral

Isto leva a crer que os precursores de transcrição e

tradução eucarióticos estão unidos, tanto quanto em procariotos.