UNICAMP ANA ERIKA DIAS FERREIRA EXPRESSÃO … · shed light on the involvement of the FGF pathway...

i

UNICAMP

ANA ERIKA DIAS FERREIRA

EXPRESSÃO HIPOCAMPAL DE FATORES DE

CRESCIMENTO DE FIBROBLASTOS EM PACIENTES

COM EPILEPSIA DO LOBO TEMPORAL

HIPPOCAMPAL EXPRESSION OF FIBROBLAST GROWTH

FACTORS IN TEMPORAL LOBE EPILEPSY PATIENTS

Campinas

2014

iii

UNICAMP

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Ciências Médicas

ANA ERIKA DIAS FERREIRA

EXPRESSÃO HIPOCAMPAL DE FATORES DE CRESCIMENTO DE

FIBROBLASTOS EM PACIENTES COM EPILEPSIA DO LOBO

TEMPORAL

“HIPPOCAMPAL EXPRESSION OF FIBROBLAST GROWTH FACTORS IN TEMPORAL LOBE EPILEPSY PATIENTS”

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Ciências, na área de concentração Saúde da Criança e do Adolescente.

Masters thesis submitted to the Graduate Program in Child and Adolescent Health of the Faculty of Medical Sciences of the University of Campinas to obtain the title of Master of Science.

Orientador: Lília Freire Rodrigues de Souza Li

Coorientador: Marcelo Ananias Teocchi

Campinas

2014

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO

DEFENDIDA PELA ALUNA ANA ERIKA DIAS

FERREIRA E ORIENTADA PELA PROF.ª. DR.ª.

LÍLIA FREIRE RODRIGUES DE SOUZA LI.

_______________________________

Assinatura da Orientadora

vii

RESUMO

Epilepsia do lobo temporal (ELT) é a forma mais comum de epilepsia em adultos. O

processo de epileptogênese inclui a morte neuronal, brotamento axonal, inflamação,

neurogênese, estresse oxidativo e gliose. No entanto, os mecanismos moleculares

subjacentes não são totalmente compreendidos. Os fatores de crescimento de

fibroblastos (FGFs) são uma família de proteínas com várias funções no organismo,

especialmente no sistema nervoso central. No entanto, o funcionamento dos FGFs no

cérebro humano não é totalmente compreendido. O FGF2 é o membro mais estudado

dessa família e seu papel na fisiopatologia da epilepsia é controversa. Na tentativa de

esclarecer o envolvimento da via de FGF na ELT, nós quantificamos a expressão

hipocampal dos seguintes genes: FGF2, FGF8, FGF22, FGFR1, FGFR2, FGFR3,

ITPR3, PIK3R3 e PIK3R5 em 10 pacientes resistentes a fármacos e quatro controles

post mortem. Além disso, avaliamos a expressão da proteína de FGF2 por

imunofluorescência indireta. Apenas para o FGF2, houve aumento do RNAm no

hipocampo dos pacientes para os dois genes de referência testados, HPRT1 e ENO2

+ TBP em combinação (P = 0,002 e P = 0,036; respectivamente). A porcentagem de

células imunomarcadas para FGF2 no giro dentado foi maior nos pacientes do que

nos controles (P <0,05), mas nenhuma alteração significativa foi encontrada no Corno

de Ammon. O FGF2 pode preservar os neurônios após lesão e atua como um

poderoso fator para a proliferação de células-tronco neurais. Assim, o FGF2 poderia

aliviar os danos induzidos pelas crises, intensificar a reparação e reduzir a

epileptogênese no hipocampo. Por outro lado, evidências têm demonstrado o

viii

envolvimento do FGF2 em mecanismos epileptogênicos, como brotamento de fibras

musgosas e neurogênese. Nossos resultados sugerem a participação do FGF2 na

fisiopatologia da ELT e o indica como um importante alvo para estudos

farmacológicos.

ix

ABSTRACT

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form of epilepsy in adults. The

process of epileptogenesis includes neuronal death, axonal sprouting, inflammation,

neurogenesis, oxidative stress and gliosis. However, the molecular mechanisms

behind them are not fully understood. Fibroblast growth factor (FGF) gene family

encodes proteins with several functions in the organism, especially in the central

nervous system. FGF family member functions in the human brain are unclear. To

shed light on the involvement of the FGF pathway in TLE, we quantified the

hippocampal expression of the following genes: FGF2, FGF8, FGF22, FGFR1,

FGFR2, FGFR3, ITPR3, PIK3R3 and PIK3R5 in 10 pharmacoresistant patients and

four post mortem controls. We also assessed the FGF2 protein expression by indirect

immunofluorescence. Only for FGF2, was the mRNA level markedly increased in

patients’ hippocampi for the two reference genes tested, HPRT1 and ENO2+TBP in

combination (P = 0.002 and P = 0.036, respectively). The percentage of FGF2

immunostained cells in the dentate gyrus was higher in patients than in the controls (P

<0.05), but no significant alteration was found in the Ammon’s horn. FGF2 preserves

neurons from ongoing injury and acts as a powerful proliferation factor for neural stem

cells. It could potentially alleviate seizure-induced damage and intensify repair and

reduce epileptogenesis in the hippocampus. On the other hand, evidence has shown

FGF2’s involvement in epileptogenic mechanisms, such as axonal sprouting and

x

neurogenesis. Our results clearly suggest the FGF2 participation in TLE

physiopathology and point it out as an important target for pharmacological studies.

xi

SUMÁRIO

RESUMO ...................................................................................................................................... vii

ABSTRACT .................................................................................................................................. ix

SUMÁRIO ..................................................................................................................................... xi

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. xix

LISTA DE QUADROS E TABELAS ....................................................................................... xxi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ............................................................................. xxiii

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 1

1.1 Classificação das Epilepsias .................................................................................................... 2

1.2 Epilepsia do Lobo Temporal .................................................................................................. 4

1.3 Hipocampo ............................................................................................................................... 5

1.4 Reorganização hipocampal na ELT ..................................................................................... 10

1.5 Fatores de Crescimento ......................................................................................................... 13

1.6 Fatores de Crescimento de Fibroblastos ............................................................................. 14

1.7 Fatores de Crescimento de Fibroblastos e Epilepsia .......................................................... 19

2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 25

3. CAPÍTULO 1 ........................................................................................................................ 27

4. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 53

5. REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 55

ANEXOS ...................................................................................................................................... 63

xiii

A minha mãe Ana e a minha irmã Qelli que me ensinaram o mais

importante: amar.

xv

AGRADECIMENTOS

A minha orientadora Lília Li pela oportunidade e pelos ensinamentos.

Aos professores membros da banca avaliadora.

A CAPES pela bolsa de estudos e FAPESP pelo apoio financeiro.

Aos pacientes que aceitaram participar desse estudo.

Aos funcionários da secretaria e limpeza do CIPED.

Aos funcionários do LaCTAD pelos serviços prestados.

Aos funcionários e alunos do laboratório de investigação em patologia, laboratório

de imunologia pediátrica e laboratório de biologia molecular por todos os

momentos compartilhados no CIPED e pela ajuda com os experimentos.

Aos estagiários e alunos de IC do laboratório de endocrinologia pediátrica.

A todos meus professores do ensino fundamental, médio, graduação e pós-

graduação que mesmo com todas as dificuldades da profissão compartilharam

comigo um pouco do que sabiam e me ensinaram o gosto pelos estudos.

Aos meus amigos do CIPED: Vinicius Pedroni, Meire Rezende, Paula Hespanholo

e Vanessa Ramalho pelo apoio, pelas conversas, pelos ensinamentos e por toda

ajuda prestada.

A todos os meus amigos, em especial Erica Rodrigues, exemplo de mulher que,

como eu, sabe como é duro para a periferia chegar e se manter até onde estamos.

Meu especial agradecimento ao meu amigo e coorientador Marcelo Teocchi, por

todos os ensinamentos (não foram poucos) técnicos, biológicos, astrológicos e

espirituais; por todas as conversas, por todos os conselhos. Muito obrigada

xvi

mesmo! Sua bondade é uma das coisas que me faz acreditar ainda mais na

humanidade.

Aos meus irmãos: Valdiana, Vânio Flabio, Valdineia, Osvaldo Valerio e Thiago

Fernandes, sei da dedicação e carinho de cada um de vocês. Obrigada pelo

apoio.

Aos meus sobrinhos Jean, Júlio, Bia, Pedro, Anna Julia e Maria Eduarda, por fazer

meus dias mais felizes.

A minha cunhada Ana, pelas correções na dissertação e por todo carinho.

Ao meu companheiro Felipe, pelo amor tranquilo com sabor de fruta mordida. Por

me aconselhar, por me ouvir, pelo carinho, amor e dedicação. Por trazer leveza a

minha vida. Para você todo o meu amor.

Meu agradecimento especial a minha mãe Ana, pelo exemplo de honestidade e

esforço, por ter trabalhado tanto para que os seus filhos estudassem, por ter se

dedicado, por ter amado incondicionalmente. Espero um dia poder retribuir por

tudo isso.

A minha irmã Qelli, por toda amizade, cumplicidade, carinho e amor. Muito

obrigada por ser as flores, o canto dos pássaros, a areia da praia, a brisa do mar e

as estrelas do céu no meu caminho.

A todos aqueles cujo nome não aparece aqui, mas que marcaram e contribuíram

de alguma forma a minha vida.

xvii

“O que vale na vida não é o simples fato de termos vivido. É o que temos

feito de diferença na vida de outras pessoas que irá determinar o

significado da vida que levamos.”

Nelson Mandela.

“Ainda que eu falasse a língua dos homens e falasse a língua dos anjos,

sem amor, eu nada seria.”

Monte Castelo, Legião Urbana.

1 Coríntios 13

xix

LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO

Figura 1. Ilustração do sistema límbico onde está o hipocampo.. .............................. 6

Figura 2. Diagrama de um corte transversal do hipocampo.. ...................................... 7

Figura 3. Regiões do Corno de Ammon.. ....................................................................... 8

Figura 4. Principais circuitos neuronais no hipocampo. . ............................................. 9

Figura 5. Esquema da estrutura do FGFR.. ................................................................. 17

Figura 6. Representação da via de sinalização ativada por FGFR. ......................... 18

Figura 7. Expressão de diferentes isoformas de FGF2 por uso de códon de iniciação

alternativo.. ......................................................................................................................... 21

CAPÍTULO 1

Figura 1. Messenger RNA levels of fibroblast growth factor 2 (FGF2) in

pharmacoresistant temporal lobe epilepsy patients and post mortem

controls……………………………………...……………………………………………50

Figura 2. Immunofluorescence for FGF2 in the hippocampus of TLE patients and post

mortem controls....………………..……………………………………………………..51

Figura S1. Immunofluorescence for FGF2 in the hippocampus of TLE patients and post

mortem controls ………………………….……………………………………….…….52

../Documents/Dissertação%20para%20CORREÇÂO%20FINAL.doc#_Toc401493515






xxi

LISTA DE QUADROS E TABELAS

INTRODUÇÃO

Quadro 1. Classificação das epilepsias. Extraído de Berg et al., 2010 (7) ............... 3

Quadro 2. FGFs e seus receptores. Adaptado de Zhang et al., 2006 (42). ............ 16

CAPÍTULO 1

Table 1. Clinical data of TLE patients. ........................................................................... 48

Tabela 2. Genes and gene expression assays analyzed in this study. .................... 49

xxiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AA: Ácido araquidônico

ATP: Adenosine triphosphate

bFGF: basic fibroblast growth factor

CA: Corno de Ammon

CE: Córtex entorrinal

DG: dentate gyrus

DAG: diacilglicerol

DEPC: diethyl pyrocarbonate

EEG: electroencefalograma

ELT: epilepsia do lobo temporal

ENO2: enolase 2 (gamma, neuronal)

EROs: espécies reativas de oxigênio

ERN: espécies reativas de nitrogênio

FGFs: fatores de crescimento de fibroblastos

FGF2: fibroblast growth factor 2



FGFR1: fibroblast growth factor receptor 1


xxiv



HPRT1: hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1

HS: Hippocampal sclerosis

IL-1β: interleukin 1, beta

IL-6: interleukin 6

IL-10: interleukin 10

ILAE: International League Against Epilepsy

IRES – internal ribosome entry site

ITPR1: inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, type 1



IP3: inositol-1,4,5-trifosfato

MAPK: mitogen-activated protein kinase

MRI: magnetic resonance imaging

mTOR: mechanistic target of rapamycin

NFκB: nuclear factor kappa B

NMDA: N-Methyl-D-aspartate

PBS: phosphate buffered saline

PCL-ϫ: phospholipase Cγ

PI3K: phosphoinosithide 3-kinase

PIK3C2α: class II PI3K alpha

xxv

PIK3C2β: class II PI3K beta

PIK3C2γ: class II PI3K gama

PIK3R3: phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3 (gamma)

PIK3R5: phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 5

RIN: RNA integrity number

RT-qPCR: reverse transcription-quantitative PCR

STAT: signal transducer and activator of transcription

TBP: TATA box binding protein

TBS: tris-buffered saline

TLE: temporal lobe epilepsy

1

1. INTRODUÇÃO

Segundo a International League Against Epilepsy (ILAE), epilepsia é um distúrbio

cerebral caracterizado por predisposição a crises recorrentes e espontâneas. Crises,

por sua vez, são manifestações clínicas de descargas sincrônicas e excessivas de um

grupo de neurônios no cérebro (1).

Estima-se que 70 milhões de pessoas no mundo tenham epilepsia, o que configura

uma das desordens crônicas mais comuns (2). Oitenta e cinco por cento delas

encontram-se nos países em desenvolvimento, onde doenças parasitárias, como a

neurocisticercose, infecções intracranianas, traumas e tratamento médico ineficiente

são as principais causas da alta taxa de incidência (3, 4). No Brasil, estima-se que três

milhões de pessoas tenham epilepsia, sendo mais frequente em classes

socioeconômicas menos favorecidas e nos idosos (5).

Apesar do grande número de casos, os pacientes com epilepsia são socialmente

estigmatizados. O próprio termo “epilepsia”, de origem grega, remete a condição de ser

possuído ou invadido. Frequentemente, as pessoas com epilepsia experimentam

isolamento social, baixa auto-estima, problemas na família, escola e trabalho. Além

disso, o preconceito, também associado a essa condição, pode levar a pessoa a não

procurar tratamento médico ou não relatar adequadamente seus sintomas o que pode

agravar sua condição (6).

2

1.1 Classificação das Epilepsias

Para fins classificatórios, atualmente, as epilepsias são divididas em mais de 30

tipos (Quadro 1) (7).

Segundo a nova terminologia proposta pela ILAE, quanto à etiologia, as epilepsias

podem ser definidas como: [1] genética (idiopática), quando sua causa é decorrente de

um defeito genético; [2] estrutural-metabólica (sintomática) quando a epilepsia é

causada por lesões no sistema nervoso central tanto genéticas como adquiridas, como,

por exemplo, malformações, acidente vascular cerebral ou traumatismo craniano; e [3]

causa desconhecida (criptogênica) (7).

Este trabalho foca no tipo de epilepsia conhecida como Epilepsia do Lobo

Temporal (ELT) associada à esclerose hipocampal.

3

Quadro 1. Classificação das epilepsias. Extraído de Berg et al., 2010 (7)

Síndromes eletroclínicas organizadas por faixa etária de início

Constelações distintas Epilepsias atribuídas e organizadas por causas estrutural-metabólicas

Epilepsias de causa desconhecida

Período neonatal

Epilepsia familial neonatal benigna

Encefalopatia mioclônica precoce

Síndrome de Ohtahara

Lactente

Epilepsia do lactente com crises focais migratórias

Síndrome de West

Epilepsia mioclônica do lactente

Epilepsia benigna do lactente

Epilepsia familial benigna do lactente

Síndrome de Dravet

Encefalopatia mioclônica em distúrbios não progressivos

Infância

Crises febris plus

Síndrome de Panayiotopoulos

Epilepsia mioclônica com crises atônicas

Epilepsia benigna com espículas centrotemporais

Epilepsia do lobo frontal noturna autossômica dominante

Epilepsia occipital da infância de início tardio

Epilepsia com ausências mioclônicas

Síndrome de Lennox-Gastaut

Encefalopatia epiléptica com espícula-onda contínua durante o sono

Síndrome de Landau-Kleffner

Epilepsia ausência da infância

Adolescência – Adulto

Epilepsia ausência juvenil

Epilepsia mioclônica juvenil

Epilepsia somente com crises generalizadas tônico-clônicas

Epilepsias mioclônicas progressivas

Epilepsia autossômica dominante com características auditivas

Correlação menos específica com a idade

Epilepsia focal familiar com focos variáveis

Epilepsias reflexas

Epilepsia do lobo temporal mesial

com esclerose do hipocampo

Síndrome de Rasmussen

Crises gelásticas com hamartoma

hipotalâmico

Epilepsia-hemiconvulsão-hemiplegia

Malformações do

desenvolvimento cortical

Síndromes neurocutâneas

Crises neonatais

benignas

Crises febris

4

1.2 Epilepsia do Lobo Temporal

A ELT é a forma de epilepsia mais comum em adultos, com 40% dos casos

(8, 9). É comum o histórico de insultos cerebrais, tais como traumatismos

cranianos, infecções, status epilepticus ou crises febris na infância antecedentes

ao início da epilepsia, com um período ausente de crises de alguns anos após o

insulto e antes do aparecimento de crises recorrentes (8).

Clinicamente, os pacientes com esse tipo de epilepsia podem apresentar

crises parciais simples (envolve somente um hemisfério cerebral sem perda da

consciência) ou complexas (perda total ou parcial da consciência). A ocorrência de

manifestações motoras e sensitivo-sensoriais características, como mal estar

epigástrico, sensação de medo, angústia e déjà-vu são comuns. Após as crises

podem ocorrer um período de amnésia, afasia e confusão mental (10). Há também

perda da autonomia, declínio cognitivo e de memória com a progressão da doença

(11).

O tratamento é realizado com medicação que não previne o desenvolvimento

ou progressão da doença. Além disso, esse é a forma de epilepsia com maior

índice de refratariedade ao tratamento medicamentoso (12). Nestes casos, a

cirurgia é realizada.

A principal estrutura epileptogênica na ELT é o hipocampo (13).

5

1.3 Hipocampo

O hipocampo é uma estrutura cerebral situada na porção medial do lobo

temporal, próximo ao ventrículo lateral e está envolvido, principalmente, nos

processos de aprendizagem e memória (Figura 1).

Anatomicamente, esse tecido pode ser dividido em duas regiões: o corno de

Ammon (CA) e o giro denteado (14).

O giro denteado pode ser dividido em três camadas: [1] a camada de células

granulares: onde está presente o corpo celular dos principais neurônios dessa

região; [2] camada molecular: contendo os dendritos das células granulares; e [3]

camada polimórfica ou hilo: constituído de axônios das células granulares (fibras

musgosas) e outros neurônios (14).

O corno de Ammon é constituído de seis camadas (Figura 2): [1] alveus:

onde passam as fibras aferentes e eferentes do hipocampo; [2] stratum oriens:

constituído principalmente pelos axônios das células piramidais;[3] stratum

piramidale: onde estão presentes os corpos celulares dos principais neurônios do

corno de Ammon; [4] stratum lucidum: composta pelas fibras musgosas; [5]

stratum radiatum: composta principalmente pelos dendritos das células piramidais;

e [6] stratum lacunosum-moleculare: constituído de fibras aferentes de outras

regiões cerebrais e de interneurônios (14).

Dentro do corno de Ammon se distinguem as regiões CA1, CA2, CA3 e CA4

diferenciadas pela densidade de neurônios e de fibras presentes (Figura 3) (14).

6

Figura 1. Ilustração do sistema límbico onde está o hipocampo. Note que o hipocampo é

uma estrutura bilateral que se estende para os dois hemisférios cerebrais localizada no lobo

temporal próximo à amígdala. Adaptado de: Brain Diagram Amygdala. Revisado por Charles

Rickson. Publicado em: 2013-10-06T05:18:00-07:00. Rating: 4.5. Disponível em:

http://www.ehealthideas.com/2013/10/brain-diagram-amygdala.html (acessado em 19 de

outubro de 2014).

http://www.ehealthideas.com/2013/10/brain-diagram-amygdala.html

7

(14)

Figura 2. Diagrama de um corte transversal do hipocampo. Na figura estão

representadas as regiões CA1, CA2, CA3 e CA4 e Giro denteado. 1: alveus; 2: stratum

oriens; 3: stratum pyramidale; 3’: stratum lucidum; 4: stratum radiatum; 5: stratum

lacunosum; 6: stratum moleculare; 7: sulco do hipocampo; 7’: cavidade residual; 8:

camada molecular do giro denteado; 9: camada de células granulares; 10: camada

polimórfica ou hilo; 11: fímbria; 12: margo denticulatus; 13: sulco fímbrio-denteado; 14:

sulco hipocampal; 15: subículo. FONTE: adaptado de Duvernoy, 1988.

8

A principal via de comunicação dentro do hipocampo é a via trissináptica.

Nela, o estímulo chega do córtex entorrinal através da via perforante (compostas

de fibras glutamatérgicas) e inervam as células granulares do giro denteado. As

fibras musgosas destas células, por sua vez, fazem conexões com células

piramidais da região CA4 e, principalmente, com as células da região CA3 do

hipocampo. Os axônios de CA3 projetam para as células piramidais de CA1,

constituindo a via colateral de Schaffer. Da região CA1, as fibras saem do

hipocampo em direção ao complexo subicular e, então, para o córtex entorrinal.

Na via temporamônica os neurônios da região CA1 recebem projeções

Figura 3. Regiões do Corno de Ammon. A: CA1; B: CA2; C:

CA3; D: CA4. Adaptado de Durvenoy, 1988 (14).

9

diretamente do córtex entorrinal (13, 14). Essas vias estão representadas na

Figura 4.

(15)

No hipocampo de pacientes com ELT pode ocorrer um processo de

reorganização caracterizado por alterações estruturais e moleculares, tais como

esclerose hipocampal, brotamento de fibras musgosas, neurogênese, estresse

oxidativo e neuroinflamação que podem contribuir para o desenvolvimento de

crises recorrentes e progressão da doença. Esse processo gradual e dinâmico de

reorganização cerebral (que pode levar ao desenvolvimento de crises recorrentes)

é chamado de epileptogênese (16). As bases moleculares da epileptogênese,

todavia, permanecem desconhecidas.

Figura 4. Principais circuitos neuronais no hipocampo. Via

trissináptica (córtex entorrinal (CE)–giro denteado–CA3–CA1–CE) –

representado pelas setas. Via temporamonica (CE-CA1-CE).

Adaptado de Deng et al 2010 .

10

1.4 Reorganização hipocampal na ELT

Esclerose hipocampal

A esclerose hipocampal é o achado histopatológico mais comum na ELT (8).

Caracteriza-se por uma acentuada perda de neurônios, principalmente nas regiões

CA1, CA3 e hilo do hipocampo, e intensa proliferação de astrócitos reativos

(gliose) (17).

Uma hipótese levantada diz que a perda de células musgosas que excitam

interneurônios inibitórios no hilo na esclerose hipocampal leva a uma desinibição

das células granulares tornando-as hiperexcitáveis. Essa hipótese é chamada de

“hipótese das células em cesto dormentes” (18).

Brotamento de Fibras Musgosas

Na ELT são observados (tanto em modelo animal quanto em humanos)

brotamento e ramificação de fibras musgosas no giro denteado. Estudos mostram

que essa reorganização das fibras pode formar circuitos excitatórios recorrentes

que levam a ativação anormal de circuitos límbicos, o que pode contribuir para o

processo de epileptogênese (19).

11

Neuroinflamação

Diversos fatores associados à inflamação, tais como IL-1β, IL-6, IL-10 e TNF-

α, são hiperexpressos após indução de crises em modelo animal e em tecido

hipocampal de pacientes com ELT (20, 21).

As funções das citocinas inflamatórias no contexto da epilepsia têm sido

intensamente estudadas em roedores. Os resultados mostram que as moléculas

inflamatórias podem levar a um aumento da frequência de crises, redução do

limiar para crises, indução do influxo de Ca2+ mediado por NMDA dentro dos

neurônios, elevação do nível extracelular de glutamato, redução da transmissão

inibitória e alteração da expressão gênica (22).

Dispersão de células granulares

Cerca de 50% dos pacientes com ELT associada à esclerose hipocampal

apresentam dispersão de células granulares (23). A dispersão de células

granulares pode estar associada a mudanças na orientação e distribuição

dendrítica (24) e falha de memória (25). Além disso, as células granulares do giro

denteado podem migrar para o hilo. Nessa região, essas células ectópicas podem

sofrer descargas espontâneas e assim contribuir para a formação de um circuito

excitatório recorrente (26).

12

Estresse Oxidativo

Estresse oxidativo é o desbalanço entre geração e eliminação de espécies

reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs). O acúmulo

de EROS e ERNs pode causar danos a lipídeos, proteínas e ao DNA. Acredita-se

que esses danos possam estar associados à patogênese da epilepsia (27).

As mitocôndrias são as principais organelas envolvidas no processo de

estresse oxidativo das células. Além disso, essas organelas são responsáveis pela

geração de ATP, biossíntese de metabólitos e neurotransmissores, e regulação da

homeostase de cálcio. Todas essas funções podem, direta e indiretamente, alterar

a excitabilidade neuronal e provocar a morte celular (27, 28).

Estudos demonstraram que há alterações nas funções mitocondriais e

estresse oxidativo em tecido humano de pacientes com epilepsia e em diversos

modelos animais (28-30). Por tudo isso, estresse oxidativo e disfunções

mitocôndrias têm sido postulados como possíveis mecanismos epileptogênicos

(29).

Desregulação da expressão gênica

Diversos genes têm a sua expressão alterada após insultos cerebrais.

Essas alterações na expressão gênica podem estar envolvidas nos processos de

reorganização cerebral (31, 32). Deste modo, o conhecimento acerca destes

genes é essencial para a compreensão da epileptogênese e para o

13

desenvolvimento de novas formas de tratamento (11). Consequentemente, há um

considerável interesse na identificação de genes alvos em epilepsia.

1.5 Fatores de Crescimento

Eventos celulares precisam ser extremamente regulados e coordenados para

garantir a completa homeostase do organismo.

Fatores de crescimento são proteínas secretadas pelas células que têm

como função enviar sinais através de receptores (33). Esses fatores podem

controlar uma ampla variedade de funções no organismo como a regulação do

crescimento e diferenciação celular, inflamação, reparo do tecido e angiogênese

(34).

No sistema nervoso central, novas funções para esses fatores têm sido

descobertas, como a regulação de sinapses, plasticidade neuronal e neurogênese

(35). Deste modo, essas moléculas podem ser importantes na fisiopatologia de

doenças cerebrais como doença de Alzheimer, Parkinson e Epilepsia.

Em epilepsia, muitos estudos têm relacionado esses fatores às alterações

encontradas no tecido hipocampal, como neuroinflamação, estresse oxidativo,

brotamento de fibras musgosas, morte neuronal e gliose. Essas características

colocam os fatores de crescimento como potenciais genes alvos (35). Dentre esse

grupo de moléculas, especial atenção tem sido dada aos fatores de crescimento

de fibroblastos (FGFs).

14

1.6 Fatores de Crescimento de Fibroblastos

Os fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs) são uma família de

proteínas que compreendem 22 membros em humanos (FGF1-FGF23). FGF15

não é encontrado em humanos (36).

Os membros dessa família são polipeptídeos com cerca de 150 a 300

aminoácidos caracterizados por uma região central conservada com

aproximadamente 120 resíduos de aminoácidos (37).

A maioria dos FGFs possui uma sequência de aminoácidos que sinalizam a

secreção para fora da célula através da via clássica que envolve o retículo

endoplasmático e complexo de Golgi. No entanto, alguns FGFs não possuem esta

sequência sinal e, portanto, residem intracelularmente como no caso dos FGF11-

14, ou são secretados para fora da célula por uma via não convencional, como no

caso do FGF1, FGF2 e FGF3 (38).

Essa família pode ser dividida em três classes: os FGFs intrácrinos,

parácrinos e endócrinos. Enquanto os FGFs intrácrinos (FGF11-14) agem

independentes de receptores, os FGFs parácrinos (FGF1-10, FGF16-18, FGF20 e

FGF22) e endócrinos (FGF19, FGF21 e FGF23) agem fora da célula através da

ligação a receptores de membrana do tipo tirosina quinase, os FGFRs (36). Para a

completa estabilização da ligação de um FGF ao seu receptor é necessária ainda

a ligação de cofatores como α-Klotho, β-Klotho ou glicosaminoglicanos sulfatados,

como heparan sulfato (39).

15

Existem quatro genes para os receptores de FGFs (FGFR1-4) (40). No

entanto, existem sete diferentes isoformas de receptores para essa família

(FGFR1b, 1c, 2b, 2c, 3b, 3c e 4) (40) decorrentes de splicing alternativos no

domínio IgIII da imunoglobulina desses receptores. Essas isoformas conferem

distintas especificidades de ligação aos FGFs (37). A estrutura dos FGFRs está

apresentada na Figura 1 e as diferentes especificidades de ligação entre os FGFS

e seus receptores são mostradas no quadro 2.

16

Quadro 2. FGFs e seus receptores. Adaptado de Zhang et al., 2006 (41).

Fator de Crescimento de Fibroblastos Especificidade de Ligação

FGF1 FGFR1b, FGFR1c, FGFR2b, FGFR2c, FGFR3b, FGFR3c e FGFR4

FGF2 FGFR1b, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4

FGF3 FGFR1b, FGFR2b

FGF4 FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c e FGFR4



FGF7 FGFR1b, FGFR2b

FGF8 FGFR1c, FGFR2c, FGFR3b, FGFR3c e FGFR4


FGF10 FGFR1b, FGFR2b







FGF22 FGFR1b, FGFR2b


17

(40)

A ligação de um FGF e o seu cofator a um receptor provoca a dimerização e

autofosforilação do receptor, o que leva a ativação de vias de sinalização, como as

vias Ras/Raf/MAPK, PI3K-AKT, signal transducer and activator of transcription

(STAT) e phospholipase Cγ (PCL-ϫ) (42). A ativação dessas vias pode culminar

na ativação de fatores de transcrição que modulam a expressão de diversos

genes levando, assim, a alteração das funções celulares (43). A figura 5 mostra

um exemplo da via de sinalização dos FGFs.

Os FGFs são amplamente expressos no organismo, tanto durante o

desenvolvimento como na vida pós-natal e têm sido intensamente estudados em

diversas doenças como câncer, doenças metabólicas e doenças associadas ao

sistema nervoso central, como a epilepsia (40, 44, 45)

Figura 5. Esquema da estrutura do FGFR. Esquema da estrutura de FGFR. O

receptor consiste de um domínio kinase intracelular na região C-terminal e um

domínio extracelular. O domínio extracelular dos FGFRs consiste de três domínios

IgIII (D1, D2 E D3). Entre D1 e D2 observa-se um segmento característico do

FGFRs composto de ácido glutâmico e aspártico, chamado de caixa ácida.

Adaptada de Beenken & Mohammadi 2009.

18

(43)

Figura 6. Representação da via de sinalização ativada por FGFR. A ligação de

um FGF ao seu receptor leva a autofosforilação do receptor e ativação de vias de

sinalização como RAS/RAF/MAPK (mostrada em azul), PI3K/Akt (mostrada em

verde) e PCL-ϫ (em amarelo). AA Ácido araquidônico; DAG, diacilglicerol; HS,

heparan sulfato; IP3 inositol-1,4,5-trifosfato. Adaptada de Bottcher & Niehrs, 2005.

19

1. 7 Fatores de Crescimento de Fibroblastos e Epilepsia

Os FGFs têm sido associados a uma extensa gama de modificações

encontradas na ELT, como por exemplo, neuroinflamação, neurogênese,

brotamento de fibras musgosas, excitabilidade neuronal, gliose e estresse

oxidativo (46-50). Somado a isso, dados na literatura relatam aumento da

expressão do RNAm e proteína de membros dessa família e seus receptores após

a indução de crises em ratos (51-53). Esses resultados evidenciam que os FGFs

podem estar relacionados às modificações induzidas por crises. No entanto, não

há estudos desses fatores na ELT em humanos.

Os genes que foram estudados nesse trabalho, todos relacionados à família

de FGFs, são descritos a seguir.

Fator de Crescimento de Fibroblasto 2 – FGF2

O FGF2, também conhecido como FGF básico (bFGF), é o membro da

família dos FGFs mais estudado. Essa proteína possui 146 aminoácidos

estruturados em uma única cadeia. Em humanos foram descritas cinco isoformas

da proteína, sendo quatro isoformas de alto peso molecular (22; 22,5, 24 e 34

kDa) e uma isoforma de baixo peso molecular (18 kDa) (54). As isoformas são

geradas por diferentes códons de iniciação. As isoformas de alto peso molecular

(Hmv FGF2) são geradas a partir de códons alternativos de início CUG, enquanto

a isoforma de baixo peso molecular (Lmv FGF2) é gerada pelo códon clássico de

início AUG. O início da tradução por códons alternativos é condicionado por

20

elementos regulatórios presentes no mRNA, como, por exemplo o sítio interno de

entrada do ribossomo (IRES – internal ribosome entry site) (Figura 7) (38).

As isoformas de alto peso molecular são translocadas para o núcleo e podem

regular a expressão gênica. A isoforma de baixo peso molecular é citoplasmática e

excretada para fora da célula, e exerce suas funções através da ligação aos

FGFRs e heparan sulfato (54). O receptor com mais alta afinidade para FGF2 é o

FGFR1 (55).

No sistema nervoso, FGF2 é expresso em neurônios e células gliais (56).

Seu RNAm é amplamente expresso e pode ser encontrado no bulbo olfatório,

córtex, hipocampo, corpo estriado, tálamo, substância negra, ponte, medula

oblonga, e hipófise (55). No hipocampo, FGF2 está relacionado à proliferação

celular, neuroproteção, mecanismos de reparo, excitabilidade neuronal,

neuroinflamação e mecanismos de plasticidade neuronal (55, 57-59).

21

Figura 7. Expressão de diferentes isoformas de FGF2 por uso de códon de iniciação

alternativo. O RNAm de FGF2 contém quatro sítios de iniciação alternativa da tradução através

dos códons CUG e um sítio de iniciação clássica com o códon AUG. As isoformas de alto peso

molecular (34, 24, 22,5 e 22 kD) são geradas pelos códons alternativos, enquanto a isoforma de

baixo peso molecular (18kD) é gerada pelo códon clássico AUG. As isoformas de alto peso

molecular contém uma sequência de localização nuclear (NLS). Todas as isoformas possuem uma

NLS bipartida na região C-terminal. Adaptado de Sorensen, 2006. (38).

Fator de Crescimento de Fibroblastos 8 – FGF8

O fator de crescimento de fibroblasto 8 (FGF8) é um membro da família dos

FGFs com importantes funções no desenvolvimento embrionário. Existem quatro

isoformas de FGF8 em humanos: FGF8a, FGF8b, FGF8e e FGF8f. Essas

proteínas sinalizam através dos receptores FGFR1-4 (60).

22

Poucos estudos analisaram o papel de FGF8 no sistema nervoso. O estudo

de Garcia-Hernandez e colegas mostrou que, em cultura celular de neurônios do

gânglio espiral (coclear), as isoformas FGF8a e FGF8b promovem o crescimento

de neuritos através da ativação de FGFRs e NFκB (60). Já em cultura celular de

neurônios hipocampais de ratos, o FGF8b foi capaz de proteger os neurônios de

insultos oxidativos (47).

Fator de Crescimento de Fibroblastos 22 – FGF22

Ao contrário do FGF2, o FGF22 tem uma expressão mais restrita, sendo

encontrado principalmente na placenta, pele e cérebro (61). Suas ações biológicas

são mediadas principalmente através do FGFR2 (41).

No hipocampo de camundongos, tanto o RNAm quanto a proteína do FGF22

são expressos após o nascimento, principalmente nos neurônios da região CA3,

enquanto seus receptores são amplamente expressos no hipocampo (50).

Ainda em camundongos, o FGF22 tem sido relacionado à organização de

sinapses excitatórias, promovendo a diferenciação de terminais nervosos pré-

sinápticos (62). Sua ausência em camundongos nocautes leva a um aumento da

resistência a indução de crises generalizadas por pentilenetetrazol (50),

diminuição da neurogênese e ausência de células granulares ectópicas (63).

23

Inositol 1,4,5-trisfosfato - ITPR

Receptores de inositol 1,4,5-trisfosfato, os ITPRs, também conhecidos como

IP3Rs, são canais de cálcio intracelulares que estimulam a liberação de cálcio dos

estoques intracelulares do retículo endoplasmático em resposta a estimulação por

fatores de crescimento, hormônios e neurotransmissores (64-66).

No sistema nervoso central a sinalização de cálcio tem um importante papel

nos mecanismos de aprendizado e memória. O cálcio liberado pelos ITPRs pode

ainda estimular a síntese de ATP e iniciar a sinalização de apoptose dentro das

mitocôndrias. Além disso, nos neurônios hipocampais, os ITPRs estão envolvidos

na modulação da transmissão sináptica (67).

Existem três receptores para IP3: ITPR1, ITPR2 e ITPR3, com expressão em

diferentes células no organismo, mas as propriedades funcionais de cada receptor

ainda não estão completamente entendidas. O estudo de Mendes e colaboradores

mostra que o gene ITPR3 tem sido relacionado à indução da morte celular por

apoptose via mitocôndria (68).

Fosfatidilinositol 3’- quinases (PI3Ks)

Fosfatidilinositol 3’-quinases (PI3K) são enzimas que fosforilam o grupamento

3’-hidroxila dos fosfoinositídeos (69). Membros da família PIK3 são agrupados em

três classes. A classe I é dividida em duas subfamílias: classe IA, que são

heterodímeros, compostos por uma subunidade regulatória (p85) e uma

subunidade catalítica (p110), ativados por receptores do tipo tirosina quinase; e

24

classe IB, que são heterodímeros, compostos por uma subunidade regulatória

(p101) e uma subunidade catalítica (p110γ), ativados por receptores acoplados a

proteína-G. Os genes estudados nesse trabalho, PIK3R3 e PIKR5, codificam as

isoformas p55γ da subunidade regulatória da classe IA e a isoforma p101 da

subunidade regulatória da classe IB, respectivamente. A classe II é constituída de

três isoformas: PIK3C2α, PIK3C2β e PIK3C2γ com somente uma subunidade

catalítica. A classe III consiste de somente um membro, Vps34 (69).

A atividade das PI3Ks pode regular a proliferação celular, sobrevivência,

resposta imune e metabolismo (70). No sistema nervoso central, a atividade de

PIK3 está envolvida na sinaptogênese e formação axonal (70, 71). Além dessas

funções, PIK3 pode ainda ativar mTOR que, por sua vez, está envolvido em

mecanismos de morte celular, brotamento axonal e redução da atividade epiléptica

(Berdichevsky, Y et al 2013).

25

2. Objetivos

2.1 Objetivos Gerais

Analisar a expressão gênica e proteica de membros da família FGFs no

hipocampo de pacientes com ELT.

2.2 Objetivos Específicos

Analisar a expressão dos genes FGF2, FGF8 e FGF22 em pacientes com

ELT.

Analisar a expressão gênica dos receptores de FGFR1, FGFR2 e FGFR3

em pacientes com ELT.

Analisar a expressão gênica dos seguintes membros da via de sinalização

de FGFs: ITPR3, PIK3R3, PIK3R5.

Verificar a relação entre a expressão gênica e dados clínicos dos pacientes.

Verificar a expressão e localização celular proteica de FGF2 no hipocampo

de pacientes e controles.

26

Capítulo 1

FGF2 upregulation in

temporal lobe epilepsy

27

3. Capítulo 1

O capítulo 1 corresponde ao artigo intitulado “Fibroblast growth factor 2

upregulation in chronic temporal lobe epilepsy”.

Esse artigo foi submetido para o periódico Epilepsy Research em 12 de

setembro de 2014 e até o momento da conclusão final dessa dissertação,

encontrava-se em revisão.

28

TITLE: HIPPOCAMPAL UPREGULATION OF FIBROBLAST GROWTH FACTOR

2 IN PHARMACORESISTANT TEMPORAL LOBE EPILEPSY PATIENTS

SHORT TITLE: FGF2 UPREGULATION IN TEMPORAL LOBE EPILEPSY

Ana Erika Dias Ferreiraa; Marcelo Ananias Teocchia; Evandro de Oliveirab; Helder

Tedeschib; Lília D’Souza-Lia*

a Laboratory of Pediatric Endocrinology, Center for Investigation in Pediatrics,

Faculty of Medical Sciences, University of Campinas – UNICAMP, Campinas, SP,

Brazil

b Neurology Department - Faculty of Medical Sciences, University of Campinas –

UNICAMP, Campinas, SP, Brazil

*Corresponding Author: Lília D’Souza-Li

E-mail: [email protected]

Address: Center for Investigation in Pediatrics (CIPED) - Faculty of Medical

Science - University of Campinas.

Rua Tessália Vieira de Camargo, 126 - Cidade Universitária “Zeferino Vaz”

Campinas - São Paulo - Brasil - CEP 13083-887

Phone: +55 19 3521 8986 - Fax: +55 19 3521 8964

Grant sponsor: São Paulo Research Foundation (FAPESP); Grant number:

2013/07559-3

Number of text pages: 14 Figures: 2 Tables: 2

Key Words: epileptogenesis; plasticity synaptic; axonal sprouting; neurogenesis,

hippocampal sclerosis.

29

ABSTRACT

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form of epilepsy in

adults. The process of epileptogenesis includes neuronal death, axonal sprouting,

inflammation, neurogenesis, oxidative stress and gliosis. However, the molecular

mechanisms behind them are not fully understood. Fibroblast growth factor (FGF)

gene family encodes proteins with several functions in the organism, especially in

the central nervous system. FGF family member functions in the normal and in the

pathological (epileptic) human brain are unclear and even controversial, such as

with FGF2, the most studied of these proteins. To shed light on the involvement of

the FGF pathway in TLE, we quantified the hippocampal expression of the

following genes: FGF2, FGF8, FGF22, FGFR1, FGFR2, FGFR3, ITPR3, PIK3R3

and PIK3R5 in 10 pharmacoresistant patients and four post mortem controls. We

also assessed the FGF2 protein expression by indirect immunofluorescence. Only

for FGF2, was the mRNA level markedly increased in patients’ hippocampi for the

two reference genes tested, HPRT1 and ENO2+TBP in combination (P = 0.002

and P = 0.036, respectively). The percentage of FGF2 immunostained cells in the

dentate gyrus was higher in patients than in the controls (P <0.05), but no

significant alteration was found in the Ammon’s horn. FGF2 preserves neurons

from ongoing injury and acts as a powerful proliferation factor for neural stem cells.

It could potentially alleviate seizure-induced damage and intensify repair and

reduce epileptogenesis in the hippocampus. On the other hand, evidence has

shown FGF2’s involvement in epileptogenic mechanisms, such as axonal sprouting

30

and neurogenesis. Our results clearly suggest the FGF2 participation in TLE

physiopathology and point it out as an important target for pharmacological studies.

INTRODUCTION

All forms of epilepsy are characterized by recurrent unprovoked seizures

resulting in persistent increase of neuronal excitability (McNamara, 1999). In

temporal lobe epilepsy (TLE), which is the most refractory and common form of

epilepsy in adults, the hippocampus is the main epileptogenic region (Engel, 2001).

Hippocampal sclerosis (HS) is the most important pathological finding observed in

resected tissue from refractory TLE patients who underwent an

amygdalohippocampectomy.

Epileptogenesis is a gradual process of molecular and structural changes in

the brain, associated with neurodegeneration, neurogenesis, gliosis, axonal

sprouting, dendritic plasticity, blood–brain barrier (BBB) damage and

neuroinflammation that progressively alters the neuronal excitability leading to

spontaneous seizures (Pitkanen and Lukasiuk, 2009).

Seizure activity is associated with a disturbance in the expression of several

genes in hippocampus (Pitkanen and Lukasiuk, 2009). Recognizing such genes is

crucial for shedding light on the TLE molecular physiopathology and for identifying

new targets for treatment. Growth factors have emerged as therapeutic candidates

since they may be involved in a plethora of effects found in TLE (Jankowsky and

31

Patterson, 2001). Among them, special attention has been given to the fibroblast

growth factor family.

The vast majority of FGF members are widely expressed in the central

nervous system, including the hippocampus, and usually signals through tyrosine

kinase receptors FGFR1-4 (Zechel et al., 2010). The FGF-FGFR complex triggers

several signaling cascades which may activate transcription factors which are

responsible for the expression of numerous genes (Bottcher and Niehrs, 2005).

Despite intensive studies using seizure models, the role of FGFs on human TLE

pathophysiology is not fully understood.

Fibroblast growth factor 2 (FGF2), also termed basic fibroblast growth factor

(bFGF), is one of the most studied FGF family members (Zechel et al., 2010).

FGF2 controls several cellular responses, including proliferation, differentiation and

survival. Studies of the central nervous systems in adult rodents suggest the

involvement of FGF2 in neuroprotection and lesion repair (Zechel et al., 2010).

Conversely, FGF2 could potentially be involved in epileptogenic mechanisms

(Eves et al., 2001; Liu et al., 2014; Palmer et al., 1999; Patel and McNamara,

1995). Nevertheless, the molecular mechanisms that regulate its diverse biological

effects are unknown.

Herein, we present an analysis of the TLE hippocampal mRNA quantification

of three FGF members: FGF2, FGF8 and FGF22; three FGFRs: FGFR1, FGFR2

and FGFR3; and three genes involved in the FGF signaling cascade: ITPR3,

PIK3R3 and PIK3R5. Finally, we studied the hippocampal pattern of FGF2 protein

expression.

32

METHODS

Tissue collection and all procedures were carried out with the approval of the

local research ethics committee (CEP #470/2003).

Patients and Controls

Autopsy control tissues were kindly provided by the “Instituto Médico Legal of

Campinas” from four individuals with no clinical evidence of dementia or history of

brain disease. Collections were performed in March 2009 and May 2010 and the

post mortem delay averaged 7.8 h (range: 6.0 – 9.0 h). The control group

consisted of one female and three males with the age mean of 22.75 ± 5.56 years

ranging from 19 to 31.

The patient group included hippocampal specimens from 10 TLE patients with

hippocampal sclerosis (HS) who underwent a therapeutical surgery due to the

epilepsy pharmacoresistance. HS was confirmed in all patients by

electroencephalogram (EEG) video monitoring/telemetry and magnetic resonance

imaging (MRI). Surgeries occurred in the “Hospital de Clínicas of the University of

Campinas” in December 2005 (TLE16), May 2007 (TLE15) and between March

2009 and September 2010 (for the other patients). Each patient signed an

informed consent agreement to allow scientific use of the tissue.

33

Patient’s clinical data included in this study are described in Table 1. Part of

patients was reported in a recent study (Teocchi et al., 2013).

Tissue preparation

All hippocampal tissue samples were immediately collected and divided into

two parts. One part was frozen in liquid nitrogen and kept at - 80° C until RNA

extraction. The other part was fixed in paraformaldehyde 4% solution diluted in

PBS (pH 7.4) for 24 hours for histopathological analysis. After fixation, the tissue

was immersed in paraffin. Paraffin-embedded hippocampi were cut in successive 5

μm cross sections.

Gene Expression

RNA Extraction and cDNA Synthesis

Total RNA was harvested from tissues using 1 mL of TRIzol® reagent (Life

Technologies, Foster City, USA) per 75 mg of frozen tissue sample and processed

according to the manufacturer’s instructions. Sterilized and filtered DEPC treated

water was used in all RNA procedures.

The RNA integrity was checked by Agilent 2100 Bioanalyzer instrument. RNA

integrity number (RIN) means in the control and patient groups were 7.67 ± 1.02

(n=4) and 5.72 ± 1.42 (n= 10), respectively.

34

Subsequently, 1μg of total RNA of each sample was reverse transcribed into

cDNA using the commercial High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life

Technologies, USA) following the manufacturer’s instructions.

Reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR)

Messenger RNA was quantified using an ABI PRISM 7500 Sequence

Detection System (Life Technologies, USA) and TaqMan Gene Expression Assays

with FAM dye-labeled hydrolysis probes (Life Technologies, USA) using the

method of ∆∆Ct. All genes in this study had their amplification efficiencies near to

100%. Information about the assays used in this study is shown on Table 2. We

used as reference genes: HPRT1, and ENO2 and TBP in combination as

suggested by Wierschke et al. (Wierschke et al., 2010).

The real-time reaction mixture was prepared in a total volume of 12.5 μl with

10 ng of cDNA sample diluted in 5μl of purified H2O, 6.25 μl TaqMan Gene

Expression Master Mix (Life Technologies, USA), 0.625 μl of the respective

probe/primer mix (Life Technologies, USA), and 0.625 μl purified H2O. All samples

were run as triplicates.

35

Protein Pattern

Immunofluorescence

Immunofluorescence was performed on hippocampal paraffin-embedded

sections from patients and autopsy controls. Antigen retrieval was achieved by the

citrate buffer method, in which slides were placed in boiling citrate buffer solution

1X (Diagnostic Biosystem, USA) for 25 min followed by 30 min incubation at room

temperature. Tissue sections were blocked followed by overnight incubation at 4ºC

with goat polyclonal anti-FGF2 (1:40; RD System, USA) diluted in Tris-buffered

saline (TBS), pH 7.4 containing 0.2% Triton X-100 (TBST) Sections were washed 3

times with TBST and then incubated with anti-goat secondary antibody conjugated

Alexa Fluor 488 (1:2000, Life Technologies, USA). TO-PRO3 was used for nuclei

staining (1:400; Life Technologies, USA). Sections were washed, mounted and

cover slipped on glass slides. Incubation with the primary antibody was omitted in

negative controls. The slides were analyzed on Leica TCS SP5 II confocal

microscope.

Data analysis

Statistical differences for the gene expression data were verified by the Mann-

Whitney U test using the GraphPad Prism software (San Diego, USA). The

Spearman test was used for correlation analyses.

36

Eight-bit images of the Ammon's horn and the dentate gyrus from controls

and TLE patients were analyzed by the ImageJ software (NIH, Bethesda, MD,

USA). Percentages of cells were stipulated by automated counting of total amount

of cell nuclei and stained cells. Again, statistical analyses were performed by the

GraphPad Prism software (San Diego, USA) with an unpaired t test (one-tail).

Differences of P <0.05 were considered significant for all analyses.

RESULTS AND DISCUSSION

The first aim of this study was to evaluate and compare the hippocampal

gene expression of FGF-related targets in pharmacoresistant TLE patients and

post mortem controls. The nine target genes were divided into the following

categories: (1) FGF family members: FGF2, FGF8 and FGF22; (2) the three major

FGFRs: FGFR1, FGFR2 and FGFR3; and three proteins involved in the FGF

signaling pathway: ITPR3, PIK3R3 and PIK3R5. FGF family members are key

players in a number of biological processes, particularly in the central nervous

system.

We found that the relative expression level of the FGF2 mRNA was higher in

the TLE group when compared with the control group for the two reference genes

analyzed, HPRT1 and ENO2+TBP (P = 0.002 and P = 0.036, respectively) (Figure

1). There was no correlation between the FGF2 expression and age, age at

epilepsy onset or disease duration. In addition, the expression of FGF2 did not

differ in respect to the gender, status epilepticus occurrence and the side of HS.

37

Our second aim was to explore the FGF2 protein expression in our patient

and control hippocampal tissue samples and, as expected, the FGF2 mRNA

hyperexpression was also accompanied by an increase in the FGF2 protein

expression. The role of FGF2 in epileptogenesis is controversial and this is the first

study conducted in human TLE hippocampal samples.

FGF2 increases in response to seizure in several acute phase rodent models

(Bugra et al., 1994; Gall et al., 1994; Gomez-Pinilla et al., 1995a; Humpel et al.,

1993; Riva et al., 1994). Although FGF2 mRNA expression appears within 3 to 24

h after seizure induction (Bugra et al., 1994; Gall et al., 1994; Gomez-Pinilla et al.,

1995a; Humpel et al., 1993; Riva et al., 1994), protein levels may remain elevated

for 30 days, showing that even rapid changes in gene expression can lead to

prolonged effects (Ballabriga et al., 1997).

Only one study, in a rat epilepsy model, evaluated the FGF2 expression in the

chronic phase, and contrary to our finding, there was a decrease in the FGF2

protein expression (Hattiangady et al., 2004). These contrary findings are hard to

reconcile and differences in methods should be carefully considered.

Indeed, the significance of FGF2 overexpression in epilepsy is far from being

elucidated. On the one hand, FGF2 may function as a neuroprotective response to

seizure-induced brain insult. This hypothesis is supported by results of in vivo and

in vitro experiments. In vivo experiments showed that FGF2 infusion protected

hippocampal neurons from cell death induced by seizures (Liu et al., 1993),

reduced the number of spontaneous seizures and increased the seizure threshold

(Liu and Holmes, 1997b). In addition, for both lesioned middle-aged and aged

38

hippocampus from a kainate-induced TLE model, the pre-treatment and

transplantation of CA3 cell grafts with FGF2 resulted in an augmentation of

surviving cells from grafts (Zaman and Shetty, 2003). In vitro, FGF2 promoted

survival in hippocampal neurons cultured under serum-free and low-insulin

conditions (Johnson-Farley et al., 2007).

On the other hand, the harmful effects of FGF2 have been reported, inciting

several features associated with epileptogenesis. FGF2 supplementation in

neuronal hippocampal cell culture caused the increase of excitatory synapses (Li et

al., 2002). FGF2 overexpression in transgenic mice intensified excitability and

increased the number of glutamatergic synaptic vesicles in the hippocampus,

although cell loss was been decreased (Zucchini et al., 2008). Hippocampal FGF2

injection in mice produced seizures in seven out of nine mice tested (Liu and

Holmes, 1997a).

It is well documented that the hippocampus of TLE patients has an important

inflammatory component with clinical significance, which is believed to be involved

in the disease progression (Yang et al., 2010). Using rat hippocampal cells, Eves

and colleagues found an association between FGF2 and an increase in the

neuronal TNF level, implicated in the induction of apoptosis through death TNF

receptor (Eves et al., 2001). This finding is reinforced by the fact that FGF2 triggers

the transcription factor ELK1 (Chung et al., 1998), which can activate the TNF

promoter (Tsai et al., 2000). TNF level augmentation has already been reported in

seizure models and in hippocampal tissues from TLE patients (Balosso et al.,

39

2013; Teocchi et al., 2013), highlighting this cytokine as a major inflammatory

mediator in TLE.

In our study, hippocampal tissues from controls and patients showed a FGF2

cytoplasmatic staining in morphologically similar neuronal and glial cells (Figure 2).

The percentage of FGF2 staining cells was higher in the patient group when

compared to controls in the dentate gyrus (DG) (P = 0.0458), but not in the

Ammon’s horn (P = 0.1182) (Figure 2). No immunereactivity was seen in negative

controls when the primary antibody was omitted (data not shown).

Our result on FGF2 protein overexpression is supported by other studies in

rodents and humans (Eckenstein et al., 1991; Weickert et al., 2005). FGF2 may

have distinct roles in different cells. In neuronal cells, FGF2 may be involved in

synaptic plasticity and neuroprotection; while in glial cells FGF2 may participate in

proliferation and contribute to astrocyte reactivity (Eclancher et al., 1990; Gomez-

Pinilla et al., 1995b). Reactive glial cells are extremely important in

epileptogenesis, since they regulate ions, neurotransmitters and act on

inflammatory mechanisms (Jabs et al., 2008). The dual role of FGF2 in neuronal

ad glial cells may be in part explained by differences in receptor expression.

FGFR1 is expressed mainly in neuronal cells; FGFR2, in glial cells (Asai et al.,

1993).

Animal studies have shown the well-defined role of FGF2 in both neuronal

reorganization (Palmer et al., 1999; Patel and McNamara, 1995; Rai et al., 2007;

Tao et al., 1997) and neuroprotection (Johnson-Farley et al., 2007; Liu et al.,

1993). Our result on FGF2 upregulation in the DG of hippocampus from TLE

40

patients highlights these two well-defined roles of FGF2 and suggests its

participation in TLE physiopathology. Axonal sprouting and neurogenesis, two

important epileptogenic features, contributed to the neuronal reorganization

mechanism in the DG, identifying this hippocampal region as an important site

involved in TLE physiopathology. Moreover, this region shows a considerable

preservation of neurons. It is plausible that FGF2 may play reorganization and

neuroprotection roles in the DG of TLE patients, and functional studies are required

to prove this hypothesis.

Notwithstanding, FGF2 role in neuroprotection and neurogegeneration in

epilepsy is far from being demystified. Its effects may depend of its concentration,

isoform, cellular localization, activated receptors, and the triggering event. Also, the

combination with other neurotrophic factors may be important for its role. The use

of a vector to supplement FGF2 and BDNF in the rat hippocampus after

pilocarpine-induced status epilepticus attenuated neuroinflammation, increased

neurogenesis, reduced neuronal loss and the occurrence of spontaneous seizures

(Bovolenta et al., 2010; Paradiso et al., 2009). Nevertheless, the progressive

condition of TLE associated with an isolated FGF2 upregulation, especially in the

chronic phase, would suggest a damaging scenario, with its harmful outcomes

greater than any possible neuroprotection.

A better comprehension of the FGF signaling pathways in TLE patients would

provide more clues regarding the controversy of FGF effects in the brain. To shed

light on this issue, we evaluated the mRNA expression of genes encoding the three

major FGF receptors: FGFR1, FGFR2 and FGFR3; three proteins related with the

41

FGF signaling pathway: ITPR3, PIK3R3 and PIK3R5; and two other members of

the FGF family: FGF8 and FGF22. Despite several studies showing the role of

these FGF related proteins in a variety of hippocampal process such as

neurogenesis and synaptic plasticity (Kelly et al., 2005; Lee and Umemori, 2013;

Zhao et al., 2007), synaptogenesis (Cuesto et al., 2011; Tohda et al., 2006), and

oxidative stress (Mark et al., 1999), no difference in the expression of these genes

was found when we compared controls and patients (Table 2). For statistical

significance, we considered a P value lower than 0.05 for the gene expression

relative to the both reference genes. For PIK3R5 we found a significant

upregulation (P = 0.0240), but only when ENO2/TBP was the reference gene. Also,

we did not look at the phosphorylated status of these tyrosine cascade-signaling

proteins to completely rule out their relevance in TLE.

In conclusion, this is the first report on the hippocampal FGF2 upregulation in

TLE patients. We showed that the FGF2 protein was overexpressed in the DG,

speculating on its involvement in axonal sprounting and neurogenesis, two

important epileptic features of TLE. Since the DG neurons are preserved in

hippocampal sclerosis, it is plausible to infer the neuroprotective effect of FGF2 in

this hippocampal region. Our work is in agreement with seizure models and our

results emphasize the preponderant role of this multifunctional growth factor in

TLE. FGF2 is a potential therapeutic target; however, as a pleiotropic growth

factor, further investigation is required to delineate its beneficial and harmful

outcomes.

42

ACKNOWLEDGEMENTS

The São Paulo Research Foundation (FAPESP process 05/565778-4 and

2013/07559-3) and the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES) financially supported this study. Quantitative PCRs were carried

out in the Multiuser Laboratory (www.laboratoriomultiusuario.com.br) and RIN

detection and confocal images were performed in the Central Laboratory of High

Performance Technologies (LaCTAD; www.lactad.unicamp.br)

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48

Table 1. Clinical data of TLE patients.

The TLE patient group consisted of five males and five females. The age mean for the patient group was 43.13 ± 12.16 years and

the age mean for their epilepsy onset was 3.20 ± 2.71 years. The duration of disease was 39.93 ± 14.03 years. Childhood febrile seizures

were present in only one case (TLE 13). HS, hippocampal sclerosis; M, male; F, female; B, bilateral; R, right; L, left; SE, status epilepticus;

FS, febrile seizure; ND, not determined; AED,antiepileptic drug; CBZ, carbamazepine; CLB, clobazam; PHT, phenytoin; OXC,

oxcarbazepine; LTG, lamotrigine; VPA, valproate; nd, not determined.

Patients Age

(Years)

Gender

Age at

onset of

epilepsy

(years)

Duration

of Illness

(years)

SE Side of

HS

FS in

childhood

AEDs before

surgery

Last

Seizure(days

before surgery)

TLE1 34.6 F 6.0 28.6 No L No PHT, OXC, CBZ nd

TLE5 41.2 M 7.0 34.2 No L No CBZ 5

TLE6 50.8 M 2.0 48.8 No R No CBZ 7

TLE8 43.8 F 2.0 41.8 Yes B No CBZ, LTG, CLB 3

TLE9 58.2 F 0.5 57.7 No R No VPA, OXC nd

TLE10 54.9 F 4.0 50.9 Yes L No CBZ, CLB nd

TLE13 54.1 F 0.75 53.3 Yes L Yes OXC, CLB nd

TLE14 34.4 M 0.25 34.2 No R No OXC nd

TLE15 44.1 M 1.5 42.6 No R No PHT, CLB, OXC nd

TLE16

15.2 M 8.0 7.2 No L No LMG, CLB nd

49

.

Tabela 2. Genes and gene expression assays analyzed in this study.

Gene Symbol Name Task TaqMan Assay No. Slope R2 Efficiency P value

HPRT1

ENO2/TBP

ENO2 enolase 2 (gamma, neuronal) Reference gene Hs00157360_m1 -3.367 1.00 98.153 - -

HPRT1 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 Reference gene 4333768F -3.333 0.999 99.532 - -

TBP TATA box binding protein Reference gene Hs99999910_m1 -3.223 0.997 104.31 - -

FGF2 Fibroblast growth factor 2 (basic) Target Hs00266645_m1 -3.445 0.994 95.116 0.0020 0.0360

FGF8 Fibroblast growth factor 8 (androgen-induced) Target Hs00171832_m1 -3.398 0.99 96.905 0.1059 0.1878

FGF22 Fibroblast growth factor 22 Target Hs00221001_m1 -3.329 0.998 99.714 0.2398 0.5395

FGFR1 Fibroblast growth factor receptor 1 Target Hs00915142_m1 -3.312 0.998 100.403 0.4535 0.8392



ITPR3 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, type 3 Target Hs01573555_m1 -3.425 0.997 95.867 0.5395 0.5395

PIK3R3 phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3

(gamma)

Target Hs00177524_m1 -3.317 0.99 100.21 0.1027 0.7441

PIK3R5 phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 5 Target Hs01046353_m1 -3.29 0.995 101.35 0.1119 0.0240

50

Figura 1. Messenger RNA levels of Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) mRNA in

pharmacoresistant temporal lobe epilepsy (TLE) patients and post mortem controls. The y-axis

represents the quantitative data of the relative mRNA expression of the target molecules in TLE

patient group (n = 10) compared with the post mortem control group (n = 4). The data are presented

as mean ± SD in gene expression normalized to endogenous reference genes: HPRT and ENO2+TBP

in combination. All samples were run three times. The Mann–Whitney U tests were used for

comparisons between groups. In detail, box plot of FGF2 expression in patients and controls. Central

lines corresponds to the median. TLE9 was an outlier. *P<0.05, **P<0.01.

51

Figura 2. Immunofluorescence for FGF2 (green) in the hippocampus of

TLE patients (C and D) and post-mortem controls (A and B). TO-PRO3 was

used for nuclei staining (blue). A and C shows the FGF2 expression in dentate

gyrus. B and D describes the FGF2 expression in Ammon’s horn. FGF2 is

expressed in morphologically similar neuronal and glial cells. The percentage of

immunostaining cells in dentate gyrus was higher in TLE patients than controls

(P = 0.0458) and no significance was found in Ammon’s horn (P = 0.1182).

Differences between groups were analyzed by the Test t.

52

Supplementary Material

Figura S1. Immunofluorescence for FGF2 (green) in the hippocampus of TLE patients

(C,D,G) and post-mortem controls (A,B,E,F). TO-PRO3 was used for nuclei staining (blue).

(A-D) shows the FGF2 expression in dentate gyrus. E-G describes the FGF2 expression in

Ammon’s horn. FGF2 is expressed in morphologically similar neuronal and glial cells.

53

4. Conclusões

A principal descoberta deste estudo consiste na hiperexpressão gênica e

proteica do FGF2 no hipocampo de pacientes com ELT. Esta conclusão é

baseada nos seguintes fatos:

A quantificação relativa do RNAm do FGF2 no grupo de pacientes com

ELT foi maior em relação ao grupo de controles post mortem (P = 0,002

para o gene de referência HPRT1; e P = 0,036 para o gene de referência

ENO2+TBP).

A porcentagem de células imunomarcadas para o FGF2 no giro dentado foi

maior nos pacientes do que nos controles (P <0,05), e nenhuma alteração

significativa foi encontrada no Corno de Ammon.

A hiperexpressão gênica e proteica do FGF2 parece não estar associada a

alterações na expressão de outros genes da família do FGF (FGF8 e

FGF22) e fatores envolvidos na via de sinalização (ITPR3, PIK3R3 e

PIK3R5).

Este é o primeiro estudo a avaliar a expressão do FGF2 no hipocampo de

pacientes com ELT. Nosso achado sobre a hiperexpressão desse fator de

crescimento reforça o envolvimento deste na fisiopatologia da ELT, especialmente

em pacientes crônicos e refratários aos medicamentos.

54

O gene do FGF2 codifica uma proteína com múltiplas funções no organismo,

especialmente no hipocampo. Evidências experimentais demonstraram a

participação do FGF2 não só em mecanismos anticonvulsivantes, mas também

em proconvulsivantes, o que denota contrariedades sobre seus efeitos nos

pacientes com ELT. A indução de crises em modelos murinos associou o FGF2 a

neuroproteção, excitabilidade neuronal, reorganização sináptica, neuroinflamação

e neurodegeneração.

É sabido que o giro denteado de pacientes com ELT apresenta intensa

reorganização sináptica e preservação neuronal, ao contrário de áreas como o

CA1 e CA3, onde ocorre grande perda neuronal acompanhada de gliose. A

hiperexpressão do FGF2 no giro denteado dos pacientes sugere seu envolvimento

nessas duas importantes características – reorganização sináptica e

neuropreservação.

Dessa forma, nossos achados tornam ainda mais relevante a atuação do FGF2

como alvo crítico relacionado à epileptogênese, elegendo-o como uma importante

linha para estudos funcionais e farmacológicos na ELT.

55

5. REFERÊNCIAS

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63

ANEXOS

Anexo 1: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

FORMULÁRIO DE CONSENTIMENTO PARA PESQUISA MÉDICA, Página 1 de 3

Título do projeto: Caracterização neuropatológica da epilepsia de lobo temporal mesial

familiar

Investigadores principais:

Profa. Cláudia V. Maurer Morelli, Prof. Dr. Luciano de Souza Queiroz, Prof. Dr. Fernando

Cendes e Profa. Dra. Iscia Lopes Cendes

OBJETIVO DA PESQUISA:

Eu entendo que fui convidado (a) a participar em um projeto de pesquisa envolvendo

pacientes e famílias de indivíduos com epilepsia. O objetivo geral do estudo é comparar se

a lesão do tecido nervoso cerebral encontrada em pacientes com epilepsia familiar são

iguais àquelas encontradas em pacientes com epilepsia na forma esporádica (sem

antecedentes familiares). Esse estudo pode eventualmente melhorar o diagnóstico e levar a

um melhor tratamento dessa doença. Tanto as amostras de tecido nervoso como a

informação médica a meu respeito, bem como a respeito de minha família que forem

obtidas para esse estudo, poderão ser compartilhadas com outros pesquisadores que

trabalham com epilepsia. O sigilo será mantido em todos os estudos colaborativos através

da utilização de um número de código para a identificação dos indivíduos participantes.

PROCEDIMENTO:

Eu entendo que se concordar em participar desse estudo, os pesquisadores participantes

farão perguntas a respeito dos meus antecedentes médicos e familiais. O meu

consentimento se refere ao uso do material que será retirado durante a cirurgia para a

realização de estudos científicos. É importante lembrar que a cirurgia mencionada acima,

faz parte do tratamento médico. A pesquisa laboratorial utilizando as amostras de tecido

poderá ser feita durante um período máximo de 30 anos após a coleta. Após o término desta

pesquisa com prazo de duração de cerca de 4 anos, pretende-se armazenar este material

durante no máximo 30 anos caso haja a necessidade de se dar continuidade a pesquisas

complementares. Neste caso será feito novo protocolo para submissão à aprovação do

Comitê de Ética em Pesquisa local e se necessário ao Conselho Nacional de Ética em Saúde

(CONEP).

64

RISCO E DESCONFORTO:

Não há quaisquer riscos ou prejuízos adicionais para os sujeitos da pesquisa, já que o

material utilizado para a pesquisa (pequena amostra de tecido nervoso) será obtido de

pacientes submetidos à retirada cirúrgica do tecido lesado, como forma de tratamento.

65



familiar




VANTAGENS:

Eu entendo que não terei nenhuma vantagem pessoal com a participação neste estudo e que

o diagnóstico e o tratamento de possíveis familiares com a epilepsia familiar ou esporádica

não serão modificados. Contudo, os resultados desse estudo podem, em longo prazo,

oferecer vantagens para os indivíduos com epilepsia e suas famílias, possibilitando um

melhor diagnóstico e um tratamento mais adequado. Caso, no futuro, pesquisas com o

material venham a trazer resultados com algum tipo de benefício aos familiares envolvidos,

estes serão prontamente informados.

SIGILO:

Eu entendo que toda informação médica, assim como os resultados dos estudos decorrentes

desse projeto de pesquisa, serão submetidos aos regulamentos do HC-UNICAMP referentes

ao sigilo da informação médica, o que garante que os dados pessoais dos participantes não

serão de livre acesso. Se os resultados ou informações fornecidas forem utilizados para fins

de publicação científica, nenhum nome será revelado.

FORNECIMENTO DE INFORMAÇÃO ADICIONAL:

Eu entendo que posso requisitar informações adicionais relativas ao estudo a qualquer

momento. A Dra. Iscia Lopes Cendes, tel (019) 3788-8907 estará disponível para responder

minhas questões e preocupações. Em caso de recurso, dúvidas ou reclamações contactar a

secretaria da comissão de ética da Faculdade de Ciências Médicas-UNICAMP, tel. (019)

3788-7232.

RECUSA OU DESCONTINUAÇÃO DA PARTICIPAÇÃO:

Eu entendo que a minha participação é voluntária e que eu posso me recusar a participar ou

retirar meu consentimento e interromper a minha participação no estudo a qualquer

momento sem comprometer os cuidados médicos que recebo atualmente ou receberei no

futuro no HC-UNICAMP. Eu reconheço também que a Dra. Iscia Lopes Cendes pode

interromper a minha participação nesse estudo a qualquer momento que julgarem

apropriado.

66



familiar




Eu confirmo que o(a) Dr(a)._______________________________________________ me

explicou o objetivo do estudo, os procedimentos aos quais serei submetido e os riscos,

desconforto e possíveis vantagens advindas desse projeto de pesquisa. Eu li e/ou me foi

explicado, assim como compreendi esse formulário de consentimento e estou de pleno

acordo em participar desse estudo.

_______________________________________________________________________

Nome do participante ou responsável

_________________________________________________ __________________

Assinatura do participante ou responsável data

________________________________________________________________________

Nome da testemunha

__________________________________________________ ___________________

Assinatura da testemunha data

RESPONSABILIDADE DO PESQUISADOR:

Eu expliquei a _____________________________________________________o objetivo

do estudo, os procedimentos requeridos e os possíveis riscos e vantagens que poderão advir

do estudo, usando o melhor do meu conhecimento. Eu me comprometo a fornecer uma

cópia desse formulário de consentimento ao participante ou responsável.

________________________________________________________________________

Nome do pesquisador ou associado

___________________________________________________ _______________

Assinatura do pesquisador ou associado data

67

Anexo 2: Parecer do Comitê de Ética

UNICAMP ANA ERIKA DIAS FERREIRA EXPRESSÃO … · shed light on the involvement of the FGF pathway...

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