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1 UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PELOTAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E COMPORTAMENTO LABORATÓRIO DE NEUROCIÊNCIAS CLÍNICAS MODULAÇÃO DA AKT/GSK3-β E SNAP-25 PELA ADMINITRAÇÃO DE CURCUMINA EM MODELO DE MANIA INDUZIDO POR CETAMINA MARCO SALEH RIBEIRO Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Saúde e Comportamento da Universidade Católica de Pelotas, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Saúde e Comportamento, sob a orientação da Prof. Dra. Gabriele Ghisleni. Pelotas, 31 de agosto de 2015
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UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PELOTAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E COMPORTAMENTO
LABORATÓRIO DE NEUROCIÊNCIAS CLÍNICAS
MODULAÇÃO DA AKT/GSK3-β E SNAP-25 PELA ADMINITRAÇÃO DE CURCUMINA
EM MODELO DE MANIA INDUZIDO POR CETAMINA
MARCO SALEH RIBEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Saúde e Comportamento da
Universidade Católica de Pelotas, como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Saúde e Comportamento, sob a orientação da
Prof. Dra. Gabriele Ghisleni.
Pelotas, 31 de agosto de 2015
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IDENTIFICAÇÃO
Título: MODULAÇÃO DA AKT/GSK3-β E SNAP-25 PELA ADMINITRAÇÃO DE
CURCUMINA EM MODELO DE MANIA INDUZIDO POR CETAMINA
Mestrando: Marco Saleh Ribeiro
Orientador: Profa. Gabriele Ghisleni
Co-orientador: Profa. Daniela Pochmann
Instituição: Universidade Católica de Pelotas (UCPel)
Programa de Pós-Graduação: Saúde e Comportamento (PPGSC)
Data: 31 de Agosto de 2015
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Agradecimentos
À Deus, Louvado Seja, sem O qual nada seria possível.
Aos meus pais, Cláudio e Fátima, e minha irmã, Gabriela, por sempre estarem do meu lado em
todos os momentos da minha vida, me incentivarem a seguir, mesmo nas adversidades.
Meus amigos, irmãos fraternos, Pedro Jaccottet, Pedro Araújo, Felipe Lopes, Samuel e Jonathas
Rivero e o aguardado amigo Joaquim Delazzeri Rivero.
À minha amiga, companheira de todas horas, namorada, quem me ouve e apoia sempre, Maria.
Te amo muito!
À Profa. Dra. Gabriele Ghisleni, a Bibi, por me apoiar, ser paciente, mesmo com os milhares de
tropeços que dei, me incentivar e me mostrar novos caminhos. Obrigado pela amizade!
Às minhas amigas e colegas Profa. Me. Silvia Oliveira e Farm. Me. Josiane Beatriz, a Mana e a
Alemoa, por serem amigas fantásticas de todas as horas.
Aos amigos do Laboratório de Neurociências Clínicas, bolsistas, mestrandos, doutorandos,
obrigado por compartilhar experimentos, ideias e conversas.
Aos professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Saúde e Comportamento da
Universidade Católica de Pelotas.
Obrigado por tudo!
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RESUMO
O transtorno bipolar é uma doença psiquiátrica associada a estados alternados de episódios de
depressão e mania / hipomania. O glicogênio sintase quinase 3β (GSK-3β) e proteína associada
a sinaptossomas de 25 (SNAP-25) estão associados, respectivamente, com a modulação da
expressão gênica e a plasticidade neural na patogênese de perturbações do humor. A curcumina,
composto ativo extraído de Curcuma longa, tem sido descrito como um agente neuroprotetor em
desordens neurodegenerativas, embora o seu mecanismo de ação não está completamente
elucidado. Neste estudo foi investigado o impacto do modelo induzida por cetamina de mania
em GSK-3β e SNAP-25, e avaliado neste modelo, o efeito neuroprotetor da curcumina pré-
tratamento. Os ratos receberam óleo de amendoim (veículo), curcumina 20 ou 50 mg / kg (p.o.),
uma vez por dia durante 14 dias. A partir do dia 8 ao dia 14 os animais também receberam
solução salina ou cetamina (25 mg / kg i.p.), uma vez por dia. No 15º dia de tratamento, os
animais receberam uma única injeção de cetamina ou uma solução salina e a atividade
locomotora foi avaliada no aparelho campo aberto após 30 min. Imunodetecção das proteínas
pGSK-3p e SNAP-25 foram avaliadas por Western Blotting no córtex pré-frontal (PFC) eo
hipocampo (HP). A administração da curcumina, em doses de 20 e 50 mg / kg preveniu o
hiperlocomoção induzida por cetamina no teste de campo aberto. Além disso, ambas as doses de
curcumina evitou a diminuição da densidade de pGSK-3β e SNAP-25 em PFC e HP induzida
por cetamina. Em conclusão, os nossos resultados mostram que a curcumina impede
hiperlocomoção e apresenta um efeito neuroprotector, restaurando SNAP-25, provavelmente,
através da modulação da densidade de GSK-3β.
Palavras-chave: Transtorno Bipolar, Modelo de Mania, Cetamina, Curcumina, GSK3, SNAP-25
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ABSTRACT
Bipolar disorder is a psychiatric illness associated with alternate states of depression and
mania/hypomania episodes. Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) and synaptosomal-
associated protein 25 (SNAP-25) are associated respectively, with the modulation of gene
expression and neural plasticity in the pathogenesis of mood disorders. Curcumin, active
compound extracted from Curcuma longa, has been described as a neuroprotective agent in
neurodegenerative disorders, although their mechanisms of action are not completely elucidated.
In this study we investigate the impact of ketamine-induced model of mania on GSK-3β and
SNAP-25 immunocontent, and assess in this model the neuroprotective effect of Curcumin
pretreatment. Rats received peanut oil (vehicle), curcumin 20 or 50 mg/kg (p.o.), once a day for
14 days. From the 8th to the 14th day the animals also received saline or ketamine (25 mg/kg
i.p.), once a day. On the 15th day of treatment, the animals received a single injection of
ketamine or saline and the locomotor activity was assessed in the open-field apparatus after 30
min. Immunodetection of the proteins pGSK-3β and SNAP-25 were evaluated by Western
Blotting in the prefrontal cortex (PFC) and the hippocampus (HP). The administration of
Curcumin in doses of 20 and 50 mg/kg prevented the hyperlocomotion induced by ketamine in
the open-field test. In addition, both doses of Curcumin prevented the decrease in density of
pGSK-3β and SNAP-25 ketamine-induced in PFC and HP. In conclusion, our results show that
Curcumin prevents hyperlocomotion and presents a neuroprotective effect by restoring SNAP-
25 density probably via modulation of GSK-3β.
Key words: Bipolar Disorder, mania model, ketamin, curcumin, GSK3, SNAP-25
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LISTA DE ABREVIATURAS
AMPA - ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol
BCA – ácido biocinchoninic
BDNF – fator neurotrófico derivado do encéfalo
CPF – Córtex pré-frontal
DMS-V - Associação Americana de Psiquiatria
ERO – Espécies Reativas de Oxigênio
GSK3-β – glicogênio sintase quinase beta
HP – Hipocampo
IL-1β – Interleucina 1β
IL-4 – Interleucina-4
IL-6 – Interleucina 6
NaCl – Solução Salina/Cloreto de Sódio
NFkB – Fator de sinalização kappa B
NMDA – N-Metil-D-Aspartato
sIL-2R - Receptor solúvel de interleucina 2
SNAP-25 – Proteína Associada ao Sinaptossoma 25 kDa
SNARE - Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor
SNC – Sistema Nervoso Central
sTNFR1 – fator de necrose tumoral de receptor 1
TH – Transtornos de humor
THB – Transtorno de Humor Bipolar
TNF-α – fator de necrose tumoral
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Sumário
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 8
2. OBJETIVO ...................................................................................................................... 10
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................................. 10
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................................... 10
3. HIPÓTESES .................................................................................................................... 10
4. JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 11
5. ESTRATÉGIAS DE BUSCA ......................................................................................... 11
6. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ................................................................................. 12
6.1. Transtorno de Humor Bipolar ....................................................................................... 12
6.2. Modelos animais .............................................................................................................. 13
6.2.1. Modelos animais de mania .......................................................................................... 14
6.3. Glicogênio sintase kinase-3 (GSK3) e Proteína associada ao sinaptossoma
(SNAP25) no transtorno de humor bipolar ................................................................. 15
6.4 Curcumina ....................................................................................................................... 18
7. METODOLOGIA ........................................................................................................... 19
7.1 Animais e tratamento ....................................................................................................... 19
7.2 Protocolo Experimental do estado de mania ................................................................. 19
7.3. Análise do comportamento ............................................................................................. 20
7.4. Preparações do tecido e determinação de proteína ...................................................... 20
7.5. Immunoblotting ............................................................................................................... 20
7.6. Análise Estatística ........................................................................................................... 21
8. CRONOGRAMA ............................................................................................................ 22
9. REFERÊNCIAIS ............................................................................................................ 22
10. ARTIGO CIENTÍFICO ................................................................................................. 30
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1. INTRODUÇÃO
Transtornos de humor (TH) são problemas de saúde mental no Brasil e no mundo, que
acarretam um alto custo social e econômico. Estima-se que 14% da população mundial sofra
algum tipo de TH e menos de 75% desta, tem acesso ao tratamento adequado. Acredita-se que
futuramente estes transtornos serão uma das principais causas de incapacitação, elevando a
demanda nos serviços de saúde por atingirem uma ampla faixa etária da população (NESTLER,
et al., 2002; SANTOS, et al., 2012; WHO, 2012).
Os TH são condições frequentes e debilitantes caracterizados por manifestações afetivas
das quais as mais comuns são os transtornos unipolares (depressivos) e transtornos bipolares
(episódios maníacos, hipomaníacos, depressivos, ou mistos). O Transtorno de Humor Bipolar
(THB) possui ciclicidade quanto aos sintomas, devendo-se ter atenção da parte do clínico quanto
a polaridade e fase da doença (NEMEROFF e OWENS, 2002; BORNSTEIN,et al., 2006;
LEMKE, 2008). O THB é uma doença psiquiátrica crônica e altamente debilitante
(CALABRESE,et al., 2003; TANG e WANG, 2012), no qual episódios de mania,
diferentemente de episódios de depressão, geram um estado de energia excessiva, associada à
euforia, impulsividade, falta de necessidade de sono, e psicose (CALABRESE, et al., 2003;
TANG e WANG, 2012). Embora o diagnóstico e o tratamento precoce do THB reduzam a
gravidade da doença, muitos indivíduos são normalmente diagnosticados no estado depressivo,
sendo erroneamente classificados e tratados para depressão maior (MANNING, et al., 1997;
HIRSCHFELD, et al., 2003).
Evidências recentes mostram que alterações neurobiológicas, comorbidades clínicas,
resistência ao tratamento, e disfunção cognitiva, podem decorrer a partir do número de episódios
e da duração da doença bipolar recorrente (POST, et al., 2012). Entretanto, os principais
mecanismos neuroquímicos relacionados à fisiopatologia do THB não estão completamente
elucidados. Hipóteses têm sugerido o envolvimento da resposta inflamatória, estresse oxidativo,
redução de neurotrofinas e desequilíbrio em sistemas de neurotransmissão (SCOLA &
ANDREAZZA, 2015).
De modo geral, os tratamentos dos TH apresentam resultados frustrantes, sendo que
apenas 30% - 40% dos pacientes respondem às intervenções farmacológicas e psicoterápicas
disponíveis. Além disso, meses de tratamento são usualmente necessários para uma resposta
terapêutica completa, e o grande número de efeitos colaterais associados aos fármacos causa
uma baixa adesão dos pacientes ao tratamento (NESTLER, et al., 2002; CASSANO e FAVA,
9
2004; POST, et al., 2012). Na tentativa de encontrar novos alvos terapêuticos para os TH,
especificamente para o THB, diversos compostos derivados de plantas têm sido estudados. As
terapias à base de plantas podem ser alternativas eficazes no tratamento dos TH, ou mesmo na
prevenção de novos episódios, por apresentarem especialmente alta capacidade antioxidante e
anti-inflamatória (ZHANG, et al., 2004; DHINGRA e SARMA, 2005; QURESHI e AL-
BEDAH, 2013), já que existem estudos que indicam a presença de mediadores inflamatórios e
dano oxidativo na fisiopatologia e neuroprogressão do THB (MAGALHÃES, et al., 2011).
Além disso, o desenvolvimento de novas terapias com eficácia de tratamento e redução de
efeitos adversos mostra-se necessário e imediato para o tratamento do THB.
Pensando nisso, foi selecionado uma espécie promissora para o tratamento do THB, cuja
ação é reconhecida pelo potencial antioxidante: a curcumina, principal curcuminóide da
Curcuma longa Linn. A curcumina, que possui efeito neuroprotetor, tem sido associada ao seu
potencial antioxidante e anti-inflamatório demonstrado em estudos in vivo e in vitro
(KULKARNI, et al, 2008; LOPRESTI, et al, 2012), onde sua ação demonstrou eficácia em
processos neurodegenerativos, assim como em modelos animais de depressão (MONROY, et
al., 2013). Considerando que os TH compartilham mecanismos fisiopatológicos, a avaliação da
curcumina no episódio de mania, bem como seus possíveis mecanismos de ação, é de grande
relevância na investigação do seu potencial como droga coadjuvante para o tratamento do THB.
Por o THB ser uma doença psiquiátrica degenerativa (YASUDA, et al.), o SNAP-25
(proteína associada ao sinaptossoma) tem sido investigado como importante marcador de
doenças neurodegenerativas. O SNAP-25 participa da regulação dos processos de exocitose de
vesículas sinápticas (BRINKMALM, et al., 2014). Assim como o SNAP-25, a glicogênio
sintase quinase 3-β (GSK3-β) tem papel fundamental na fisiopatologia do THB. Tem
envolvimento em diversos processos celulares, incluindo a proliferação celular, apoptose e
inflamação (KOZIKOWSKI, et al. 2007).
O THB apresenta um forte impacto na qualidade de vida dos pacientes, a busca por
estratégias inovadoras para o tratamento deste transtorno e prevenção dos episódios, reduzindo
assim os danos neurológicos gerados pela doença torna-se relevante. Desta forma, a geração de
dados que contribuam para o preenchimento desta atual lacuna são os norteadores desta
proposta. A variedade de compostos encontrados na natureza representa um dispositivo
essencial na descoberta e desenvolvimento de novos fármacos, tornando-se uma ferramenta para
testes farmacológicos que certifiquem suas atividades como novos compostos promissores para
o tratamento do THB.
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2. OBJETIVO
2.1 Objetivo Geral
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito terapêutico da Curcumina, sobre parâmetros
comportamentais e neuroquímicos em um modelo experimental de mania.
2.2 Objetivos Específicos
- Avaliação da eficácia do tratamento com curcumina na reversão da hiperlocomoção, induzida
por cetamina, em um modelo experimental de mania.
- Avaliação da modulação nas vias de sinalização da Proteína quinase B (Akt)/ GSK3-β, e
neurodegeneração avaliada pela proteína sináptica SNAP-25 em Hipocampo (HP) e Córtex pré-
frontal (CPF) no modelo de mania induzido por cetamina.
- Investigação do papel neuroprotetor da curcumina na modulação das vias de sinalização Akt/
GSK3-beta e SNAP-25, em HP e CPF de animais, em reposta ao modelo experimental de mania
induzido por cetamina.
3. HIPÓTESES
- Espera-se encontrar uma reversão da hiperlocomoção induzida pela cetamina através do
tratamento com curcumina.
- Espera-se encontrar uma redução na concentração de AKT/GSK3-β, bem como da proteína
sináptica SNAP-25 em animais submetidos ao modelo de mania induzido por cetamina.
- Espera-se encontrar uma prevenção das alterações no imunoconteúdo de Akt e GSK3-beta,
bem como da proteína sináptica SNAP-25 em animais submetidos ao modelo de mania induzido
por cetamina e tratados com curcumina.
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4. JUSTIFICATIVA
O presente estudo justifica-se na tentativa de contribuirmos para a investigação de um novo
composto com potencial de prevenção de novos episódios de mania do THB, reduzindo assim os
danos neurológicos e gravidade da doença. O estudo prevê a avaliação de possíveis mecanismos
de ação associados aos efeitos da curcumina, potente agente antioxidante e anti-inflamatório, no
avanço do conhecimento dos mecanismos fisiopatológicos da doença e do episódio de mania,
característico do THB. Os resultados deste estudo contribuirão como estratégia de avanço na
investigação de novos compostos terapêuticos naturais passíveis de serem utilizados como
coadjuvantes ao tratamento usado rotineiramente no THB, lítio e ácido valpróico; aumentando a
eficácia do tratamento e prevenção de novos episódios de mania.
5. ESTRATÉGIAS DE BUSCA
As bases de dados consultados foram a PUBMED. O quadro abaixo apresenta os descritores
utilizados em cada e o número de resumos encontrados e selecionados, bem como o número de
artigos incluídos até o momento.
Os critérios de inclusão foram: idioma inglês, português e espanhol, publicação nos
últimos dez anos, transtorno bipolar, curcumina, GSK-3 e transtornos de humor.
Descritores
PUBMED Artigos Selecionados
Curcumin AND bipolar
disorder
4 2
GSK3-3 and bipolar
disorder
132 9
Neurodegeneration
AND bipolar disorder
70 2
Artigos incluídos 60
12
6. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
6.1. Transtorno de Humor Bipolar
O Transtorno de Humor Bipolar (THB) é uma doença crônica e grave caracterizada por
episódios alternados de depressão, mania/ ou hipomania, ou ainda por episódios mistos. O
diagnóstico do THB é essencialmente clínico e realizado de acordo com o Manual Estatístico e
Diagnóstico de Doenças Mentais, 5ª edição da Associação Americana de Psiquiatria (DSM-V),
e requer a ocorrência de pelo menos um episódio de mania ou hipomania, caracterizados por
humor persistente e anormalmente elevado, expansivo ou irritável durando pelo menos uma
semana. Além da alteração de humor, pelo menos três (ou quatro se o humor é irritável) dos
seguintes sintomas devem estar presentes: grandiosidade, necessidade diminuída de sono,
pressão para falar, fuga de ideias, distração, aumento da atividade dirigida a objetivos ou
agitação psicomotora, envolvimento excessivo em atividades prazerosas (APA, 2002).
O THB pode ser classificado em: Tipo I, caracterizado por episódios recorrentes de
mania e depressão, e Tipo II, o qual se assemelha às características do THB tipo I, entretanto
apresentando uma forma mais branda de elevação do humor denominado como hipomania
(DELGADO, et al., 2012). De acordo com a Associação Brasileira de Transtorno Bipolar
(ABTB), o THB do tipo I afeta cerca de 1% da população geral, enquanto no Tipo II a
prevalência pode chegar a 8%. Além disso, estima-se que cerca de 1,8 a 15 milhões de
brasileiros sejam portadores de THB (ABTB, 2012).
De uma maneira ampla, o tratamento para o THB consiste no uso de estabilizadores de
humor, os quais implicam em uma série de riscos com relação às interações medicamentosas
com antidepressivos, antipsicóticos e benzodiazepínicos, além de graves efeitos adversos.
Existem também variadas modalidades psicoterapêuticas como as psicoterapias de apoio e
terapias cognitivas que melhoram significativamente a qualidade de vida do paciente, porém
sem dispensar o uso da farmacoterapia (SANCHES, et al., 2005).
O tratamento psicofarmacológico do THB é bastante complexo. Além da dificuldade do
diagnóstico clínico, muitos casos não respondem satisfatoriamente aos estabilizadores de humor
convencionais. Além disso, a existência de fases pouco definidas e a presença de ciclos rápidos
ou ultra-rápidos, dificultam a escolha da medicação mais adequada, uma vez que o uso de
algumas medicações, como os antidepressivos, podem piorar o curso do transtorno, quando
utilizados especialmente nas fases mistas da doença, as quais são, em grande parte difíceis de
identificar (MACHADO-VIEIRA & SOARES, 2007).
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O THB é uma doença crônica, de etiologia ainda desconhecida. Pesquisas clínicas
recentes na área da saúde mental têm demonstrado através da análise de marcadores periféricos
o envolvimento de biomarcadores potenciais da fisiopatologia do THB. Dentre estes, a
disfunção mitocondrial e o estresse oxidativo, fatores tróficos, citocinas inflamatórias, e
metabólitos urinários. Estudos clínicos têm revelado um aumento do dano oxidativo avaliado
pelos níveis de carbonilação de proteínas durante o episódio maníaco e depressivo em pacientes
com THB (KAPCZINSKI, et al., 2011), assim como uma redução da enzima antioxidante
superóxido dismutase (SOD) no soro de pacientes com THB em relação a indivíduos controles
(AYDEMIR, et al., 2014). Estudos post-mortem de indivíduos com THB demonstram ainda um
aumento de modificações oxidativas e nitrosativas em áreas do córtex pré-frontal (KIM, et al.,
2014). Mais recentemente uma meta-análise examinando marcadores de estresse oxidativo em
pacientes com THB, relatou um significativo aumento da peroxidação de lipídios nestes
indivíduos (BROWN, et al., 2014). Além disso, uma série de estudos tem revelado uma redução
nos níveis séricos de neurotrofinas na progressão do THB, e alterações morfológicas passíveis
de desencadear um prejuízo na plasticidade sináptica foram demonstradas em estudo post-
mortem de indivíduos com a doença, associadas com uma redução nos níveis de neurotrofinas
(SCOLA & ANDREAZZA, 2015). Crescentes evidências vêm demonstrando ainda um aumento
nos níveis de citocinas pró-inflamatórias no THB, sugerindo que mecanismos mediados pelo
sistema imune estão relacionados à neurobiologia do THB e sua progressão. Neste contexto
recentes meta-análises avaliaram os níveis periféricos de citocinas em pacientes com o THB em
relação a indivíduos controles demonstrando níveis significativamente elevados de de
interleucina 4 (IL-4) Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), Fator de necrose tumoal de receptor
1 (sTNFR1) e Receptor solúvel de interleucina 2 (sIL-2R) (MUNKHOLM, et al., 2013;
MODABBERNIA, et al., 2013; STUART & BAUNE, 2014).
Tenho em vista a complexidade da fisopatologia do THB, uma melhor compreensão dos
mecanismos biológicos envolvidos na doença é de fundamental importância para melhor
diagnosticar e tratar a patologia. Neste contexto, estudos já demonstraram que o lítio é capaz de
frear a progressão da doença modulando os fatores tróficos e assim consequentemente
melhorando a plasticidade sináptica (EMAMGHOREISHI, et al., 2015; TUNCA, et al., 2014),
bem como atuando na redução da resposta imune por inibir a GSK3-β levando uma redução de
moléculas pró-inflamatórias (WANG, et al., 2013).
6.2. Modelos animais
14
Os modelos animais são ferramentas amplamente utilizadas para compreensão dos
mecanismos responsáveis pela etiologia e tratamento de doenças. Estes modelos sofrem
com algumas restrições inerentes ao fato de não se poder reproduzir fidedignamente
algumas características dos transtornos psiquiátricos em humanos, como o sentimento de culpa,
pensamento de morte e suicídio. No entanto, são responsáveis, em grande parte, pelo
desenvolvimento das hipóteses que relacionam as possíveis bases biológicas dos transtornos
mentais e pelo que se sabe atualmente sobre as ações dos psicofármacos em diversas etapas dos
processos de neurotransmissão (VALVASSORI, et al., 2013).
Embora seja impossível recriar todos os aspectos de uma determinada doença,
especialmente aquelas que envolvem condições complexas e multifatoriais como as doenças
psiquiátricas, estes modelos mimetizam um ou alguns dos sintomas associados à doença ou
são sensíveis aos fármacos utilizados clinicamente. Desta maneira, é possível se
estabelecer um paralelo entre os efeitos comportamentais induzidos pelos fármacos com os
sinais clínicos ou neurofisiológicos em humanos, visando contribuir para a elucidação das bases
etiológicas das várias doenças mentais (KATO, et al., 2007; VALVASSORI, et al., 2013) .
6.2.1. Modelos animais de mania
O episódio de mania permanece pouco elucidado, e os modelos animais que mimitizam
este episódio são bastantes escassos baseando-se principalmente na administração de fármacos
que produzem um efeito hiperlocomotor como descrito pela administração de D-anfetamina
(VALVASSORI, et al., 2012), ouabaína (WANG, et al., 2013), e cetamina (GHEDIN, et al.,
2012). Contudo, cabe ressaltar que não existem modelos animais capazes de mimetizar a
alternância entre as fases de depressão e mania característica do THB. Entretanto, os modelos
animais de mania utilizados compartilham alterações comportamentais e neuroquímicas, as
quais foram revertidas pela administração de estabilizadores de humor clássicos utilizados na
clínica como lítio e valproato.
Recentes evidências postulam o envolvimento do sistema glutamatérgico na etiologia do
THB. A cetamina, recente ferramenta farmacológica utilizada no modelo animal de mania e
como modelo de outros transtornos psiquiátricos como a esquizofrenia, atua como um
antagonista não-competitivo de receptores glutamatérgicos do subtipo N-metil-D-aspartato
(NMDA). A cetamina foi inicialmente descrita e reconhecida por seus efeitos anestésicos e
dissociativos de modo dose dependente. Estudos pré-clínicos mostraram que baixas doses de
cetamina (5 a 10 mg / kg) exibem propriedades antidepressivas (KATALINIC, et al., 2013), no
15
entanto, em doses moderadas (10 a 50 mg / kg) induz hiperlocomoção e disfunção celular
(MACHADO-VIEIRA, et al, 2008; GHEDIM, et al., 2012), e nas doses mais elevadas possuem
efeito anestésico dissociativo. Do ponto de vista clínico, infusões de baixas doses de cetamina
induz efeitos antidepressivos rápidos (KATALINIC, et al., 2013).
A neurofarmacologia da cetamina é bastante complexa e ainda permanece pouco
elucidada. Estudos demonstraram duas hipóteses para o efeito hiperlocomotor da cetamina.
Primeiro, que o bloqueio dos receptores NMDA pode aumentar a liberação dos aminoácidos
excitatórios, glutamato e aspartato (LIU e MOGHADDAM, 1995; WANG e THUKRAL, 1996;
MOGHADDAM, et al, 1997), com subsequente ativação da neurotransmissão glutamatérgica
em receptores não-NMDA, como os receptores ionotrópicos, ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-
4-isoxazol (AMPA) e cainato. A estimulação dos receptores AMPA ou cainato em neurônios
dopaminérgicos aumenta a liberação de dopamina na fenda sináptica, atuando desta forma na
promoção dos sintomas positivos obsevados na ezquizofrenia e episódios de mania através da
estimulação do sistema nervoso central (SNC) (TAN, et al., 2012 e DUAM, et al., 2013). Por
outro lado, a cetamina, atuando como antagonista de receptores NMDA localizados em
interneurônios GABAérgicos promovendo a liberação de glutamato e consequente desinibição
da transmissão glutamatérgica (ZUNSZAIN, et al., 2013).
A administração de doses sub-anestésicas de cetamina em ratos, demonstrou ser capaz de
causar um aumento na atividade locomotora dos animais concomitante ao aumento do dano
oxidativo evidenciado pela peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas em áreas envolvidas
na modulação do humor como o hipocampo e córtex pré-rontal(GAZAL, et al, 2014). Segundo
Guedin, 2012, os efeitos comportamentais e neuroquímicos induzidos pela administração da
cetamina, foram prevenidos ou revertidos pela administração de litio e ácido
valpróico/valproato, fármacos utilizados na clínica para o tratamento do THB fazendo com que
a administração de cetamina represente um modelo farmacológico promissor para o estudo das
bases biológicas de mania em ratos.
6.3. Glicogênio sintase kinase-3 (GSK3) e Proteína associada ao sinaptossoma
(SNAP25) no transtorno de humor bipolar
Transtornos psiquiátricos tem sido considerados atualmente como doenças
neurodegenerativas. Este grupo de doenças, podem ser associados à idade, como a doença de
Alzheimer e Parkinson, ou se desenvolver em qualquer estágio da vida. São progressivas e
afetam a qualidade de vida dos pacientes (YASUDA, et al., 2013). No contexto da
16
neuroprogressão, Brinkmalm et al. (2014) mostrou que a proteína associada ao sinaptossoma
(SNAP-25) tem um papel importante como marcador de função sináptica em pacientes com
transtornos neurodegenerativos. A SNAP-25 participa na regulação do processo de exocitose
das vesículas sinápticas e faz parte do complexo proteico SNARE (soluble N-ethylmaleimide-
sensitive factor attachment protein receptor), viabilizando a aproximação e fusão da vesícula
sináptica (processo chamado de docking) no terminal pré-sináptico (ARISI, et al., 2001).
Alterações na estrutura, expressão e função da SNAP-25 parecem ter contribuição no
desenvolvimento de doenças neurodegenerativas (CORRADINI, et al., 2009). Thompson et al.
(1999) conduziu um estudo com pacientes esquizofrênicos e bipolares, dosando a SNAP-25 no
líquor, e demonstrou neste grupo de pacientes um nível elevado da proteína SNAP-25 em
relação ao grupo de indivíduos controle. De acordo com Müller et al. (2005), variantes do gene
da SNAP-25 afetam a resposta dos pacientes ao tratamento com antipsicóticos. Estudos sugerem
diminuição do hipocampo e diminuição da expressão de SNAP-25 em pacientes com
esquizofrenia e THB (THOMPSON, et al. 1999; THOMPSON, et al. 2003) Dessa forma, estes
dados sugerem que a SNAP-25 poderia estar relacionada a fisiopatologia de doenças
neurodegenerativas, podendo ser utilizada como um marcador para doença bem como para o
THB, que atualmente vem sendo descrito como uma doença neuroprogressiva e degenerativa.
A glicogênio sintase kinase-3 (GSK-3) é uma serina/ treonina kinase originalmente
descoberta no estado fosforilada que inativa a síntese de glicogênio. Esta enzima é responsável
pela etapa final na produção de glicogênio e é reconhecida pelo seu envolvimento em uma
ampla variedade de processos celulares incluindo a prolifereção celular, apoptose e inflamação
(KING, et al., 2014). Existem duas isoformas de GSK-3, a GSK-3β e GSK-3α, ambas
produzidas nos mamíferos.
A GSK-3β tem papel fundamental na ação dos estabilizadores de humor e na
fisiopatologia dos TH. Quando inibida, regula o crescimento axonal e o remodelamento
sináptico. Estudos in vitro mostram que a GSK-3β modula a sinalização de Fator Neurotrófico
derivado do cérebro (BDNF) (EMAMGHOREISHI, et al., 2015; KOZIKOWSKI, et al., 2007).
Quando hiperativada leva à apoptose e morte neuronal. (KOZIKOWSKI, et al., 2007), sendo
também associada à diabetes melitos, obesidade e tumorogênese (WU e PAN, 2010)
Estudos postmortem revelaram que há níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias em
pacientes com THB (BARBOSA, et al., 2014). Dentre as células da glia, a microglia é a
responsável pela regulação da produção de serotonina, que é mediada por citocinas pró-
inflamatórias. A produção de serotonina e também a conectividade neuronal são dependentes
17
das citocinas pró-inflamatórias, logo, por haver baixa quantidade de triptofano sérico (precursor
da serotonina) na fase maníaca do THB, os níveis de citocinas pró-inflamatórias estão elevados.
Mudanças na produção de serotonina alteram as funções sinápticas. Por esta razão, a atividade
da GSK-3β é elevada nestes pacientes. O lítio e o ácido valpróico reduzem a sinalização das
células imunes pela inativação da GSK-3β pela via Wnt. A via Wnt bloqueia a fosforilação da β-
catenina, levando a translocação do núcleo com a subsequente transcrição dos genes necessários
para o crescimento neuronal e neuroplasticidade (KOZIKOWSKI, et al., 2007). Além disso, o
lítio e o ácido valpróico também reduzem a cicloxigenase-2 e o ácido aracdônico (WATKINS,
et al., 2014). O lítio inibe a atividade da GSK-3β, regulando assim a plasticidade neuronal, além
de aumentar as proteínas envolvidas na sinapse (KOZIKOWSKI, et al., 2007).
Atualmente o lítio continua sendo um dos fármacos mais utilizados para o tratamento do
THB. A ação do lítio ocorre via inibição da GSK-3β de forma direta e reversível. Uma vez que a
superexpressão de GSK-3β promove um aumento na ocorrênca de apoptose, o lítio foi
demonstrado por atenuar esta resposta celular (Li, et al, 2002). Além do mais, os íons de lítio
protegem grânulos neuronais cerebelares por diminuir a concentração de potássio no meio.
Apesar da eficácia do lítio como estabilizador do humor, ainda há elevada descontinuação do
tratamento devido aos efeitos adversos que o íon produz no organismo, seja usado sozinho na
terapia ou em combinação com outros fármacos (BRIETZKE, et al., 2013). Isso faz com que
haja a procura por novas alternativas farmacoterapêuticas, que apresentem melhores resultados,
tanto no aspecto farmacológico quanto no toxicológico.
Embora o desenvolvimento das áreas de síntese orgânica, microbiologia industrial,
biologia molecular, grande parte dos fármacos ainda é obtida de fontes naturais, em sua grande
maioria de matérias-primas vegetais. O alto custo para a indústria farmacêutica, adicionado o
grande risco de efeitos adversos por parte das medicações sintéticas, fazem com que terapias
baseadas em produtos naturais ganhem importância como recurso terapêutico, por possuírem
menor risco de toxicidade e intolerância pelos pacientes (PINTO, et al., 2002; MONTANARI e
BOLZANI, 2001; BOLZANI & BARREIRO, 2006). Dentre os recursos terapêuticos naturais, a
Curcuma longa (curcumina) surge como alternativa para o tratamento de diversos TH, inclusive
o THB. Estudos farmacológicos demonstraram diversas ações da curcumina, entre elas a
antioxidante (KULKARNI, et al., 2009), neuroprotetora (BRIETZKE, et al., 2013) e anti-
inflamatória (FIDALGO, 2007).
18
6.4 Curcumina
A curcumina é polifenol não-flavonóide extraído do rizoma do açafrão-da-india
(Curcuma longa), comumente usado em países asiáticos. Nessa região, é conhecido por suas
propriedades anti-inflamatórias em diversas patologias (BRIETZKE, et al., 2013). O potencial
anti-inflamatório da curcumina, está relacionado com a inibição do fator de sinalização nuclear
kappa B (NFkB) e redução de citocinas pró-inflamatórias, tais como interleucina-1β (IL-1β),
interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). A curcumina também é um forte
inibidor de enzimas geradoras de espécies reativas de oxigênio (ERO), tais como a lipoxigenase,
cicloxigenase, xantina-desidrogenase, oxidase e óxido nítrico sintase induzível, atuando como
um potente antioxidante (LIN, 2007). A eficácia da curcumina como agente neuroprotetor em
vários modelos pré-clínicos está sendo amplamente investigada, devido principalmente a sua
baixa toxicidade, sugerindo este composto como um forte candidato para a prevenção dos TH
(KULKARNI e DHIR, 2010; BRIETZKE, et al., 2013). Por ser altamente lipofílica, atravessa
com facilidade a barreira hemato-encefálica, sendo em baixas concentrações, neuroproliferativa,
além do caráter neuroprotetor e antiapoptótico em doenças neurodegenerativas (PLUTA et al.,
2015).
Em relação ao potencial da curcumina no tratamento dos TH, a curcumina foi capaz de
aumentar os níveis do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) no hipocampo e córtex
pré-frontal em animais submetidos ao modelo de depressão induzido pela administração de
corticosterona (WEI, et al., 2010). Estudos demostraram que um possível mecanismo
responsável pela ação antidepressiva da curcumina ocorre via inibição da enzima monoamina
oxidade (MAO), envolvida no metabolismo das monoaminas (LOPRESTI, et al., 2012).
Recentemente, foi demonstrado que o efeito antidepressivo da curcumina pode ser mediado,
pelo menos em parte, pela ativação do sistema glutamatérgico via subunidade GluN2B do
receptor NMDA (ZHANG et al., 2013).
Além disso, outros estudos mostram um efeito antioxidante considerável em modelos
animais, o que fortalece cada vez mais a hipótese de que o princípio ativo possui uma atividade
neuroprotetora e antioxidante no organismo (BASNET e SKALKO-BASNET, 2011,
BUHRMANN, et al., 2011; MOLINA-JIJÓN, et al., 2011; KULKARNI e DHIR, 2010;
LOPRESTI, et al., 2012). Uma revisão recente sugeriu que o efeito antimaníaco da curcumina
pode resultar das suas propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias ou pelo aumento dos níveis
de BDNF (BRIETZKE,et al., 2013), embora suas ações em modelos pré-clínicos de mania não
19
tenham sido avaliadas. Recentemente nosso grupo demonstrou que o tratamento com curcumina
previne a hiperlocomoção e o estresse oxidativo em um modelo de animal de mania induzido
por cetamina (GAZAL et al., 2014). Neste contexto, em busca da compreensão dos mecanismos
de ação pela qual a curcumina atua como antidepressivo e ainda como antimaníaco, o presente
projeto pretende investigar o potencial neuroprotetor deste composto, bem como avaliar
possíveis vias de sinalização responsáveis pelos mecanismos de ação da curcumina na
prevenção do episódio de mania.
7. METODOLOGIA
7.1 Animais e tratamento
Foram utilizados ratos fêmeas adultas da espérie Wistar, com idade entre 11-12 semanas
(250-300g), obtidas do Biotério da Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil. Os
animais foram mantidos sobre ambiente controlado (23±2C, ciclagem 12h-claro/escuro , acesso
livre a água e comida) e tratados de acordo com a Federação das Sociedades Brasileiras de
diretrizes de Biologia Experimental, após a aprovação do Comitê de Ética da Universidade
Federal de Pelotas. As seguintes drogas foram utilizadas: cetamina (Sigma Chemical Co., USA),
dissolvida em solução salina (NaCl0.9%,w/v) e administrada por via intraperitonial; e
curcumina (Sigma Chemical Co., USA) dissolvida em óleo de amendoim administrado via oral;
cloridrato de lítio dissolvido em solução salina e administrado por via oral duas vezes ao dia. Os
veículos também foram testados simultaneamente. As doses de lítio, cetamina e curcumina
usadas no presente estudo foram escolhidas de acordo com a literatura (GHEDIM et al., 2012;
GAZAL et al., 2014; BRUNING et al., 2012).
7.2 Protocolo Experimental do estado de mania
Este protocolo foi concebido para mimetizar o protocolo de prevenção do estado mania,
como anteriormente proposto por Ghedin et al. (2012). Os ratos receberam óleo de amendoim, a
curcumina 20 mg/kg ou curcumina 50mg/kg, uma vez por dia durante 14 dias. A partir do dia 8
ao dia 14 os animais também receberam soro fisiológico ou cetamina (25mg/kg), uma vez por
dia, num total de seis grupos experimentais: soro fisiológico/óleo de amendoim, cetamina/óleo
de amendoim, soro fisiológico/curcumina 20 mg/kg, cetamina/curcumina 20mg/kg, solução
salina/curcumina 50 mg/kg, cetamina/curcumina 50 mg/kg. Em outro momento do experimento,
ratos receberam soro fisiológico ou cloridrato de lítio (45 mg / kg, duas vezes por dia, e usado
20
como um controlo positivo) durante 14 dias. A partir do dia 8 ao dia 14 os animais também
receberam soro fisiológico ou cetamina (25mg / kg), uma vez por dia, num total de quatro
grupos experimentais: solução salina/salina, cetamina/salina, salina/cloridrato de lítio,
cetamina/cloridrato de lítio. No 15º dia de tratamento, os animais receberam uma única injecção
de cetamina ou uma solução salina e a atividade locomotora foi avaliada no teste de campo
aberto após 30 min (Gazal et al., 2014).
7.3. Análise do comportamento
Locomoção relacionado ao comportamento ansioso foi monitorado utilizando um aparelho de
campo aberto, tal como descrito anteriormente (KASTER et al., 2004). O aparelho consistia
numa caixa de madeira medindo 40x60x50 cm³ com uma parede de vidro frontal. O piso da
arena foi dividido em 12 quadrados iguais e colocados em um som ambiente. Os animais foram
colocados na parte traseira esquerda para explorá-lo livremente para 5 minutos. O número total
de quadrados atravessados com todas as patas (de passagem) foi contado, a fim de avaliar o
comportamento. O número de passagens centrais foi a medida utilizada para avaliar a ansiedade.
O aparelho foi limpo com uma solução de álcool a 10% e secou-se depois de cada sessão
individual rato.
7.4. Preparações do tecido e determinação de proteína
Os ratos foram mortos por decapitação imediatamente após o teste de campo aberto.
Córtex pré-frontal (CPF) e hipocampo (HP) foram dissecados manualmente e homogeneizou-se
em 10 volumes (1:10w/v) de tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4 contendo 140 mM de
cloreto de potássio (KCl). Os homogenatos foram centrifugados a 750 g durante 10 min a 4 ° C,
o sedimento foi descartado e o sobrenadante foi imediatamente separado e usado para o ensaio
de imunotransferência. A proteína foi medida utilizando ácido biocinchoninic (BCA) ensaio
utilizando albumina de soro bovino como padrão.
7.5. Immunoblotting
Foram realizadas análises de immunoblotting de fosfo-GSK3β e SNAP-25. Actina foi
utilizada como controle interno para westernblot de modo a que os dados foram padronizados de
acordo com os valores de actina, amostras foram misturadas com tampão (125 de base Tris, 20%
de glicerol, 4% SDS, 10% de mercaptoetanol, 0,05% de azul de bromofenol, pH 6,8 ) e
21
aquecido a 95 ° C durante 8 min.. Proteínas solubilizadas foram separadas por eletroforese em
um gel de poliacrilamida a 10% e eletrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose.
Membranas de nitrocelulose foram bloqueadas utilizando 3% de albumina de soro bovino
(BSA) em soro fisiológico tamponado com Tris (TBS) durante 2 horas, lavou-se em tampão
(0,05% de Tween-20 em TBS) e, em seguida, incubadas com anticorpos primários durante a
noite a 4 °C: anti-actina (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-SNAP-25 (1:
1000; Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), e anti-pGSK-3β (1: 1000; Cell Signaling, MA,
EUA ), seguido de anti-coelho (1: 5000; Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) e anti-mouse (1:
5000; Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) de conjugado de imunoglobulina G (IgG) de
peroxidase de rábano, respectivamente. Após lavagem com tampão, os complexos imunitários
foram visualizados utilizando o 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma, EUA) de acordo
com as instruções do fabricante. Os sinais do filme foram escaneados digitalmente e depois
quantificados utilizando o software ImageJ.
7.6. Análise Estatística
Os dados foram processados utilizando GraphPad Prism 5 (La Jolla, EUA). As
comparações entre os grupos foram realizadas usando ANOVA de duas vias seguida pelo teste
de Bonferroni post hoc, quando apropriado. Os valores são expressos como a média ± S.D. P ≤
0,05 foi considerado significativo.
22
8. CRONOGRAMA
Atividade 1° Semestre
2013
2° Semestre
2013
1° Semestre
2014
2° Semestre
2014
Revisão
Bibliográfica
X X X X
Elaboração do
Projeto
X X
Tratamento dos
animais
X X
Protocolo
Experimental de
mania
X X
Análise
Comportamental
X X X
Preparação de
tecidos e
determinação de
proteínas
X X X
Immunoblotting X X
Análise
Estatística
X X
Elaboração do
Artigo
X
Apresentação X
23
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30
10. ARTIGO CIENTÍFICO
31
Modulation of Akt/GSK3β signaling and SNAP-25 by curcumin administration in rats
submitted to a model of mania induced by ketamine.
Running title: Potential mechanisms of curcumin in rats submitted to a model of mania induced
by ketamine.
Marco Saleh Ribeiro1#, Marta Gazal3,5#, Daniela Pochmann2, Fernanda N Kaufmann1, Matheus
Valente1, Clarissa Bastos1, Claiton Lencina3, Francieli M. Stefanelo3, Lisiane O Porciúncula2,
Manuella P. Kaster4, Gabriele Ghisleni1*.
¹ Laboratório de Neurociências Clínicas, Programa de Pós-Graduação em Saúde e
Comportamento, Universidade Católica de Pelotas, RS – Brazil
2 Programa de Pós Graduação em Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Porto Alegre, RS – Brazil
3 Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos – Universidade Federal de
Pelotas, Pelotas, RS, Brazil.
4 Programa de Pós Graduação em Bioquímica, Universidade Federal de Santa Catarina,
Florianópolis, SC - Brazil
5 Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Pontifícia Universidade
Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS-Brazil.
* Corresponding Authors
* Gabriele Ghisleni
Programa de Pós-Graduação em Saúde e Comportamento, Centro de Ciências da Vida e da
Saúde, Universidade Católica de Pelotas, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brazil.
Rua Gonçalves Chaves 373, 324C, 96015560, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brazil
Phone: +55 53 2128 8031 Fax: +55 53 2128 8229
32
E-mail address: [email protected]
# Both Authors contributed equally.
Abstract
Bipolar disorder is a psychiatric illness associated with alternate states of depression and
mania/hypomania episodes in which signaling pathways and synaptic degeneration were showed
to contribute to its pathogenesis. Curcumin, the active compound extracted from Curcuma
longa, has been described as a neuroprotective agent involved in psychiatric conditions. Here we
investigate the impact of ketamine-induced manic-like behavior on p(ser9)-GSK3β, Akt and
SNAP-25 immunocontent, and the neuroprotective effect of curcumin pretreatment in this
model. Rats received vehicle, curcumin 20 or 50 mg/kg (p.o.), once a day for 14 days and from
the 8th to the 14th day the animals also received saline or ketamine (25 mg/kg i.p.), once a day.
The locomotor activity was assessed in the open-field apparatus after 30 min of the last ketamine
administration and the immunodetection of the proteins p(Ser9)-GSK3β, Akt and SNAP-25 was
evaluated by Western Blotting in prefrontal cortex (PFC) and hippocampus (HP). Curcumin
administration in both doses prevented the hyperlocomotion induced by ketamine. In addition,
both doses of curcumin prevented the decrease in density of p(Ser9)-GSK3β and SNAP-25
ketamine-induced in PFC and HP, and Akt immunocontent was decreased only in HP. In
conclusion, our results show that curcumin prevented hyperlocomotion induced by ketamine and
restored SNAP-25 density probably via modulation of GSK3β and Akt signaling. This effect
might represent an important neuroprotective strategy to counteract the neurodegeneration
associated with manic episodes in BD.
Key words: Bipolar disorder, mania model, curcumin, GSK3β, Akt, SNAP-25.
33
1. Introduction
Bipolar disorder (BD) is a debilitating and recurrent neuropsychiatric condition that
affects 1-4% of the world population and it is characterized by alternating states of depression
and mania in patients, which significantly impact their functionality and quality of life (Gunde et
al., 2011; Andreazza et al., 2008). BD is associated with low recovery rates and high chronicity
and can include a high rate of medical comorbidities. Clinical and preclinical studies have raised
many hypotheses to explain the mechanisms enrolled in BD pathophysiology however, the role
of intracellular pathways in the neurodegenerative processes that accompany the psychiatric
symptoms remain unclear (Ghezzo et al., 2009; Cole, 2013; Ronai et al., 2013).
Glycogen synthase kinase-3 (GSK-3), a member of the serine/threonine kinase family which is known to
be involved in neuronal structure, growth, differentiation, synaptic plasticity and many other cellular events
(Gould et al., 2004; Sahin et al., 2014). Many signaling pathways that activate kinases such as Akt, can
inhibit GSK3 by phosphorylating the serine residues on this protein. The activity of the two GSK3 isoforms,
GSK3α and GSK3β, is predominately regulated by inhibitory phosphorylation on Ser21-GSK3α and Ser9-GSK3β.
Nowadays, a growing body of evidence strongly points to the possibility that hyper-activated GSK3β might be
involved in the development of mood disorders such as BD. This signaling pathway has been used as a
pharmacological target for of lithium chloride effects (Lin et al., 2006; Malhi et al., 2013; Sahin et al.,
2014). Studies in transgenic mice with reduced GSK3 activity (GSK3β+/-; GSK3α
-/-) show behaviors
that reflect chronic lithium treatment, whereas mice that overexpress GSK-3β show
34
hyperactivity, consistent with manic state in humans (De Sarno et al., 2002; Malhi et al., 2013;
Sahin et al., 2014).
Synaptosomal-associated protein of 25 kDa (SNAP-25) is a protein that participates in
the regulation of synaptic vesicles exocytosis (Bark et al., 1995). Briefly, the SNARE complex
(soluble N-ethylmaleimidesensitive, factor attachment protein receptor complex) is made up of
three proteins, SNAP-25, syntaxin (located on the neuronal membrane) and vesicle-associated
membrane protein (VAMP), also known as synaptobrevin and located in the vesicle membrane
(Washbourne et al., 2002; Corradini et al., 2009). Generation of SNAP-25 null mutant mice
revealed that SNAP-25 is essential for evoked synaptic transmission, although it is not required
for stimulus-independent neurotransmitter release (Washbourne et al., 2002; Corradini et al.,
2009). Postmortem studies have shown modifications of SNAP25 protein levels in some brain
regions of BD patients (Thompson et al., 1999; Thompson et al., 2003; Corradini et al., 2009),
suggesting that a deregulation in expression patterns and function might be associated with BD
and schizophrenia (Thompson et al., 2003; Corradini et al., 2009).
Curcumin is a polyphenol non-flavonoid with an orange-yellow color and it is the major
curcuminoid extracted from the rhizome of Curcuma longa plant, a spice widely used by Indian
and Chinese traditional medicine. In recent years, this compound received increased attention
because of its anti-inflammatory and antioxidant properties and its possible use to treat several
diseases including psychiatric conditions without major side effects (Lopresti et al., 2012;
Khurana et al., 2012; Jiang et al., 2013). It has also been reported to be effective in relieving
chronic illness induced by stress in pre-clinical models, with potential neuroprotective activity
(Lopresti et al., 2012; Khurana et al., 2012; Jiang et al., 2013; Gazal et al.; 2014). In this context,
this study investigated the modulation of curcumin pretreatment in the manic-like behavior and
density of p(Ser9)-GSK3β, Akt and SNAP-25 induced by ketamine administration in rats.
35
2. Experimental procedures
2.1. Animals and treatment
Female Wistar rats aged 11–12 weeks (250–300g) were obtained from the Central
Animal House of the Federal University of Pelotas, Pelotas, RS, Brazil. Animals were
maintained under controlled environment (23±2C, 12h-light/dark cycle, free access to
food and water), and handled according to the Federation of Brazilian Societies for
Experimental Biology guidelines upon approval by the Ethics Committee of the Federal
University of Pelotas, Brazil. The following drugs were used: ketamine (Sigma
Chemical Co., USA), dissolved in saline solution (NaCl 0.9%,w/v) and administrated by
intra peritoneal route (i.p.) and curcumin (Sigma Chemical Co., USA), dissolved in
peanut oil and administered by oral route (p.o.), lithium chloride was dissolved in (NaCl
0.9%, w/v) and administered by p.o. route twice a day. Appropriated vehicle groups
were also assessed simultaneously. The doses of ketamine, curcumin and lithium used
in the present study were chosen according to the literature (Ghedim et al., 2012;
Gazal et al., 2014; Bruning et al., 2012).
2.1. Experimental protocol of mania state
This protocol was designed to mimic the prevention protocol of the manic state, as
previously proposed by Ghedin et al. (2012). Rats received peanut oil, curcumin 20
mg/kg or curcumin 50 mg/kg, once a day for 14 days. From the 8th to the 14th day the
animals also received saline or ketamine (25 mg/kg), once a day, totaling six
experimental groups: saline/peanut oil, ketamine/penaut oil, saline/curcumin 20 mg/kg,
ketamine/curcumin 20 mg/kg, saline/curcumin 50mg/kg, ketamine/curcumin 50 mg/kg.
36
In a separate set of experiments, rats received saline or lithium chloride (45 mg/kg,
twice a day, used as a positive control) for 14 days. From the 8th to the 14th day the
animals also received saline or ketamine (25 mg/kg), once a day, totaling four
experimental groups: saline/saline, ketamine/saline, saline/lithium chloride,
ketamine/lithium chloride. On the 15th day of treatment, the animals received a single
injection of ketamine or saline and the locomotor activity was assessed in the open-
field apparatus after 30 min (Gazal et al., 2014). It is important to highlight that the dose
of ketamine capable to induce a hyperlocomotion is a sub-anesthetic dose, higher than
the doses used to induce a fast antidepressant-effect in animal models (Réus et al.,
2015).
2.3. Behavioral analysis
Locomotor and anxiety-related behaviors were monitored using an open-field apparatus, as
previously described (Kaster et al., 2004). The apparatus consisted of a wood box measuring
40x60x50 cm3 with a frontal glass wall. The floor of the arena was divided into 12 equal squares
and placed in a sound free room. Animals were placed in the rear left square and left to explore
it freely for 5 min. The total number of squares crossed with all paws (crossing) was counted in
order to evaluate the ambulatory behavior. The number of central crossings was the measure
used to evaluate anxiety. The apparatus was cleaned up with a 10% alcohol solution and dried
after each individual mouse session
2.2. Tissue preparations and protein determination
37
Rats were killed by decapitation immediately after the open field test. Prefrontal cortex (PFC)
and hippocampus (HP) were manually dissected and homogenized in 10 volumes (1:10w/v) of
20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4 containing 140 mM KCl. Homogenates were
centrifuged at 750g for 10 min at 4°C, the pellet was discarded and the supernatant was
immediately separated and used for the immunoblotting assay. Protein was measured using
biocinchoninic acid (BCA) assay using bovine serum albumin as standard.
2.3. Immunoblotting
Immunoblotting analyses were performed of p(Ser9)-GSK3β, Akt and SNAP-25. Tubulin was
used as an internal control for western blot experiments and data were standardized according to
its values. Samples were mixed with sample buffer (125 mM Tris base, 20% glycerol, 4% SDS,
10% Mercaptoethanol, 0.05% bromophenol blue, pH 6.8) and heated at 95°C for 8 min.
Solubilized proteins were separated by electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel and
electrotransferred to a nitrocellulose membrane. Nitrocellulose membranes were blocked using
3% serum bovine albumin (BSA) in Tris-buffered saline (TBS) for 2 h. Membranes were rinsed
in buffer (0.05% Tween-20 in TBS), and then incubated with primary antibodies overnight at
4ºC: anti-tubulin (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-SNAP-25 (1:2000; Santa
Cruz Biotechnology, CA, USA), anti- p(Ser9)-GSK3β (1:1000; Cell Signaling, MA, USA), and
anti-Akt (1:1000; Cell Signaling, MA, USA), followed by anti-rabbit (1:1000; Santa Cruz
Biotechnology, CA, USA) and anti-mouse (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)
immunoglobulin G (IgG) horseradish peroxidase conjugate, respectively. After rinsing with
buffer, the immunocomplexes were visualized using the 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
(Sigma, USA) according to the manufacturer’s instructions. The film signals were digitally
scanned and then quantified using the ImageJ software.
38
2.4. Statistical analysis
Data were processed using Graphpad prism 5 (La Jolla, USA). Comparisons between groups
were performed using two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni post hoc
test when appropriated. Values were expressed as mean ± S.E.M. and p≤0.05 was considered
significant.
3. Results
3.1. Ketamine- induced hyperlocomotion
Treatment with ketamine was efficient to induce manic-like episode evaluated by the
increase in the number of crossings in the open field test. As shown in Fig 2A curcumin
pretreatment (20 and 50 mg/kg) was able to prevent the hyperlocomotion induced by ketamine
treatment: (curcumin pretreatment: [F(2,26)=4.11, p<0.05] ketamine treatment: [F(1,26)=16.93,
p<0.001], interaction: [F(2,26)=7.99, p<0.01]). No changes were observed in anxiety-like
behavior analyzed by the number of central crossings in the open field test after ketamine
treatment or curcumin pretreatment, as demonstrated in Fig 2B, curcumin pretreatment:
[F(2,36)=0.60, p=0.55], ketamine treatment: [F(1,36)=0.28, p=0.59], interaction: [F(2,36)=0.26,
p=0.77].
3.2. Levels of synaptic marker SNAP-25 in HP and PFC after ketamine and curcumin
treatment
The results depicted in Fig 3 show the immunocontent of SNAP-25 in HP (A) and PFC (B)
of rats. In HP ketamine treatment decreased SNAP-25 immunocontent as compared to
vehicle/saline group and the pretreatment with curcumin (20 and 50 mg/kg) restored SNAP-25
39
immunocontent in ketamine treated animals: (curcumin pretreatment: [F(2,35)=6.54, p<0.01]
ketamine treatment: [F(1,35)=11.14, p<0.01], interaction: [F(2,35)=7.35, p<0.01]). In PFC
ketamine treatment caused a significant reduction in SNAP-25 density when compared to
vehicle/saline group (Fig 3B). Also, curcumin pretreatment (20 and 50 mg/kg) was able to
restore SNAP-25 immunocontent in ketamine treated animals: (curcumin pretreatment:
[F(2,32)=5.53, p<0.01] ketamine treatment: [F(1,32)=0.14, p>0.05], interaction:
[F(2,32)=5.535, p<0.01]). Western blot analysis of SNAP-25 suggests a synaptotoxicity in HP
and PFC caused by ketamine administration that was prevented by curcumin treatment.
3.3. Signaling pathways involved in the effect of ketamine and curcumin
In the HP, ketamine treatment reduced the Akt density when compared to vehicle/saline
group and pretreatment with curcumin (20 and 50 mg/kg) restored the immunocontent analyzed:
(curcumin pretreatment: [F(2,30)=11.65, p<0.001] ketamine treatment: [F(1,30)=10.34, p<0.01],
interaction: [F(2,30)=8.09, p<0.01]) (Fig 4A). On the other hand Akt density was not modified
by ketamine treatment in PFC and only the higher dose of curcumin (50 mg/kg) was able to
reduced Akt density when compared to ketamine group: (curmumin pretreatment:
[F(2,30)=4.12, p=0.026], ketamine treatment: [F(1,30)=3.12, p=0.087, interaction:
[F(2,30)=0.846, p=0.439] (Fig 4B). These results suggest that Akt signaling pathway is involved
in the effect of ketamine in the HP, but not in PFC and curcumin pretreatment is able to
counteract this effect.
Since GSK3β is a downstream target for Akt we also evaluated the levels of p(Ser9)-GSK3β
in ketamine and curcumin- treated animals. In the HP, induction of manic state by ketamine
treatment caused significant reduction in p(Ser9)-GSK3β density as compared to vehicle/saline
group. Pretreatment with curcumin (20 and 50 mg/kg mg/kg) restored the density of analyzed
40
protein as showed in Fig 4C: (curcumin pretreatment: [F(2,34)=1.63, p>0.01] ketamine
treatment: [F(1,34)=5.03, p=0.031], interaction: [F(2,34)=6.67, p<0.01]). Interestingly, Fig 4D
shows that p(Ser9)-GSK3β content in PFC was also significantly reduced in ketamine treatment
when compared to the vehicle/saline group. Curcumin pretreatment (20 and 50 mg/kg) was able
to prevent the decrease in p(Ser9)-GSK3β density in ketamine treated animals: (curcumin
pretreatment: [F(2,28)=3.55, p=0.0042], ketamine treatment: [F(1,28)=4. 69, p=0.039],
interaction: [F(2,28)=7.94, p<0.01]). Therefore, these results suggest that the activation of
GSK3β might be a final intracellular target involved in the manic- like effect of ketamine.
However, the upstream kinases associated with GSK3β phosphorylation seems to be different in
the HP and PFC.
4. Discussion
Mechanisms regulating synaptic integrity were previously associated with BD. These
plasticity processes are crucial to better understand disease progression and develop more
effectiveness therapeutic interventions. The present study extended literature data by showing
that ketamine- induced hyperlocomotion involve activation of GSK3β and reduction of the
presynaptic protein SNAP-25 in HP and PFC. Also, curcumin treatment was able to prevent the
behavioral effect of ketamine and restore the density of SNAP-25.
Ketamine is a dissociative anesthetic that acts as a noncompetitive antagonist of the N-
methyl-D-aspartate (NMDA) glutamate receptor. High densities of this receptor are found in HP
and cerebral cortex, critical areas involved in several behavioral functions, including emotional
patterns, memory processing and cognition. The administration of a high but sub-anesthetic dose
of ketamine mimics several behavioral (e.g., hyperactivity) and neurochemical alterations (i.e.
oxidative stress) observed in individuals with BD experiencing a manic episode. In addition,
41
previous studies have established that conventional mood stabilizers, such as lithium chloride
and valproate were able to prevent behavioral and biochemical alterations observed in ketamine-
treated animals, thereby indicating the predictive validity of the model (Ghedim et al., 2012;
Gazal et al., 2014, 2015).
Image studies suggest that ongoing neuronal atrophy accompanies BD progression, and a
reduction of cortical volume could correspond to decrement in brain activity and neuronal
dysfunction (Knöchel et al., 2014; Barysheva et al., 2013). In the present study, we evaluated the
density of presynaptic protein SNAP-25 as an indirect measure of the synapse integrity. Our
results showed that ketamine administration caused a significant decrease in SNAP-25 density
in HP and PFC, further reinforcing the validity of this model to induce behavior and
neurochemical alterations that resemble the manic episode in BD. In fact, complex and region-
specific alterations in presynaptic proteins such as SNAP-25 were related to alterations in
synaptic activity in both schizophrenia and BD patients (Gray et al., 2010). Postmortem studies
have shown modifications of SNAP-25 levels in some brain regions of BD patients (Thompson
et al., 2003; Corradini et al., 2009). Curcumin treatment restored the immunocontent of SNAP-
25 in HP and PFC suggesting that the behavioral effects of curcumin might be associated with
normalization of neurodegenerative processes or neurotransmitter release in these regions. This
is in agreement with previous studies showing the neuroprotective potential of curcumin in pre-
clinical models of degenerative disorders (Huang et al., 2015; Pluta et al., 2015; Mohajeri et al.,
2015).
GSK3, a serine/threonine protein kinase with high levels of expression seen in the HP
and cerebral cortex, is a down-stream mediator of signaling pathways involved in a diverse array
of cellular functions, including apoptosis, inflammation and regulation of neurodegenerative
42
process (Yao et al., 2002, Lei et al., 2011). Central nervous system GSK3β is implicated in a
number of neuropsychiatric diseases, such as BD, depression, schizophrenia and anxiety
disorders. Its inhibition has recently attracted widespread attention as one of the critical
therapeutic targets whereby lithium chloride exerts its effects on mood stabilization,
neurogenesis, neurotrophicity, neuroprotection, anti-inflammatory and others (Beurel et al.,
2010; Rowe and Chuang, 2004; Rowe et al., 2007). Indeed, lithium chloride can directly inhibit
the adenosine triphosphate (ATP)-magnesium-dependent catalytic activity of GSK3 (Klein &
Melton, 1996; Stambolic et al., 1996) and at similar concentration to those found in human
plasma after therapeutic administration, lithium chloride also indirectly inhibits GSK3 activity
by enhancing phosphorylation of GSK3β and GSK3α (Klein & Melton, 1996; Ryves &
Harwood, 2001). Similar to lithium chloride, the inhibitory action of curcumin on GSK-3β was
shown to be ATP competitive inhibition taking place through hydrogen bonding interactions
with the key amino acids in the substrate enzyme (Elumalai et al., 2012). Along this conceptual
framework, our study showed a key role for the Akt/GSK3β signalling in the protective effects
of curcumin against ketamine administration. In fact, several works reported that curcumin
treatment is capable to down-regulate both total GSK-3β expression and p(Ser9)GSK-3β in
several in vitro and in vivo models associated with degenerative processes (Xiong et al., 2011;
Zhang et al., 2011).
Inhibition of GSK3 activity is a critical step upon activation of the Wnt signaling
cascade and its downstream target genes regulate proliferation of neuronal precursors,
differentiation and integration of juvenile neurons into developing networks and synaptic
plasticity, thereby influencing cognitive functions and behavior (Budnik & Salinas, 2011;
Salinas & Zou, 2008; Salcedo-Tello et al., 2011). Importantly, in a genetic model of
neurodegeneration using GSK3β transgenic mice, different susceptibility to hippocampal
neurodegeneration was demonstrated to be mediated by distinct GSK3β regulation in this area
43
(Fuster-Matanzo et al., 2011). In this study, our results also showed distinct Akt regulation
according to the brain area analyzed. These findings should be further investigated but studies
suggest that bi-directional interactions between GSK3 and kinases that phosphorylate GSK3
mainly Akt/GSK3 interaction are likely driven by specific signaling pathways in a cell type-
specific manner, and there are mechanisms by which active GSK3 can perpetuate its own
activity (Beurel et al., 2015).
Furthermore, studies showed that mechanisms regulating the β-arrestin/Akt/GSK3
complex were vital to dopamine-mediated signaling in another manic-like behavior model,
induced by acute amphetamine treatment. In this model, amphetamine decreases Thr308-Akt
phosphorylation and consequent activation and decreases the inhibitory phosphorylation of
Ser21-GSk3α and Ser9-GSK3β, required for amphetamine-induced locomotor hyperactivity
(Beaulieu et al., 2004; 2011). In addition, at glutamatergic synapses, inhibition of GSK3β was
showed to suppress the induction of NMDA receptor-dependent long-term depression, a
recognized physiological correlate of synaptic plasticity and memory (Dewachter et al., 2009;
Peineau et al., 2007). However, it is unknown whether inhibition of GSK3β also has
consequences at the level of structural synaptic plasticity, which typically is associated with
alterations in number and turnover rate of dendritic spines as well as by alterations in the
presynaptic proteins. GSK3β activation decrease presynaptic release of neurotransmitters by
retards the presynaptic vesicle exocytosis, decrease Ca+2 influx, and decrease the association of
presynaptic proteins as synaptotagmin, SNAP-25, syntaxin, required for SNARE complex
formation (Zhu et al., 2010).
In this context, the results reported in this work showed that ketamine treatment decrease
the phosphorylation of GSK3β while curcumin pretreatment was able to enhance the
immunocontent of p(Ser9)-GSK3β in HP and PFC, probably leading to inactivation of this
enzyme and preventing the behavioral effects produced by ketamine. These effects might be
44
direct or indirect related to activation of Akt in the HP, but only direct or dependent of another
signaling pathway in the PFC. Our findings also support the hypothesis that decreased
phosphorylation of GSK3β and reduced SNAP-25 immunocontent could indicate a
neurodegenerative process that accounts for the progression of BD. Curcumin also promoted
neuroprotective effects by enhancing the density of synaptic protein SNAP-25, indicating the
therapeutic relevance and potential role as a novel corrective strategy for brain disorders that
involve a synaptic dysfunction.
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51
Figure 1. Treatment protocol
52
Figure 2.
Effect of curcumin pretreatment (20 and 50 mg/kg p.o) on ketamine induction of hyperactivity
(A); anxiety behavior (B); effect of lithium chloride (45 mg/kg p.o. twice a day) on ketamine
induction of hyperactivity (C); anxiety behavior in the open field test (D). The number of
crossings was recorded. Data are given as the mean(s) ± S.D. (n=6-7 per group). **p<0.01 as
compared to the vehicle/saline group. # Denotes p<0.05 when compared to the ketamine/saline
group.
53
Figure 3.
Effects of curcumin (20 and 50 mg/kg p.o.) in SNAP-25 density normalized to tubulin in the HP
(A) and PFC (B). Data are given as the mean(s) ± S.D. (n=6-7 per group). * p<0.05 and
**p<0.01 when compared to the vehicle/saline group. # Denotes p<0.05 when compared to
vehicle/ketamine group.
54
Figure 4.
Effects of curcumin (20 and 50 mg/kg p.o.) in Akt density in HP (A) and PFC (B), and in
p(ser9)GSK-3β density in the HP (C) and PFC (D), normalized to tubulin. Data are given as the
mean(s) ± S.D. (n=6-7 per group). * p<0.05 and ** p<0.01 when compared to the vehicle/saline
group. # Denotes p<0.05 when compared to vehicle/ketamine group.
