BRUNO DE OLIVEIRA HOLANDA CAVALCANTE

FUNÇÕES DOS RNAs DE CADEIA CURTA COM ÊNFASE NA

REPRODUÇÃO

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

à Faculdade de Agronomia e Medicina

Veterinária da Universidade de Brasília para

obtenção do grau de Médico Veterinário.

BRASÍLIA

DEZEMBRO/2014

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

BRUNO DE OLIVEIRA HOLANDA CAVALCANTE

FUNÇÕES DOS RNAs DE CADEIA CURTA COM ÊNFASE NA REPRODUÇÃO

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

à Faculdade de Agronomia e Medicina

Veterinária da Universidade de Brasília para

obtenção do grau de Médico Veterinário.

Orientador: Prof. Dr. Ivo Pivato

BRASÍLIA

DEZEMBRO/2014

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

Cessão de direitos

Nome do Autor: Bruno de Oliveira Holanda Cavalcante

Título da Monografia de Conclusão de Curso:

Ano: 2014.

Cessão de Direitos

Nome do Autor: Bruno de Oliveira Holanda Cavalcante

Título da Monografia de Conclusão de Curso: Funções dos RNAs de cadeia

curta com ênfase na reprodução

Ano: 2014

É concedida a Universidade de Brasília permissão para reproduzir cópias desta

monografia e para emprestar ou vender tais cópias somente para propósitos

acadêmicos e científicos. O autor reserva-se a outros direitos de publicação e

nenhuma parte desta monografia pode ser reproduzida sem a autorização por

escrito do autor.

Bruno de Oliveira Holanda Cavalcante

bhcavalcante1@gmail.com

CAVALCANTE, Bruno de Oliveira Holanda

Funções dos RNAs de cadeia curta com ênfase na reprodução /

Bruno de Oliveira Holanda Cavalcante; Orientação de Ivo Pivato - Brasília,

2014.

29p.: il.

Monografia – Universidade de Brasília/Faculdade de Agronomia e Medicina

Veterinária, 2014.

1. Espermatozoide 2. Função 3. Macho 4. microRNA I. PIVATO, I. II.

Funções dos RNAs de cadeia curta com ênfase na reprodução

Agradecimentos

Antes de tudo agradeço a Deus, pela vida, pela inteligência e por tudo que

ele me proporciona em todos os dias da minha vida.

Aos meus pais, que confiaram em mim e torceram para que eu

alcançasse meus sonhos. Agradeço por tudo que fizeram ou deixaram de fazer

para que eu pudesse estar hoje onde estou.

Aos meus amigos, obrigado por me ouvirem e me darem em horas

específicas a força sem a qual eu não seria capaz de terminar essa importante

etapa da minha vida.

Agradeço as EMBRAPA CTZL e CENARGEN por terem me dado a

oportunidade única de fazer coisas que até então não foram possíveis durante a

graduação, uma mistura de teoria e pratica que eu levarei para sempre comigo e

com certeza farão de mim um profissional mais qualificado.

A todos meus professores, em especial a professora Márcia de Aguiar

Ferreira, obrigado por me ouvir e por compartilhar suas experiências e

conhecimentos sem os quais eu não seria a pessoa que sou hoje. Tenha certeza

que vou levar sempre comigo tudo que me foi ensinado.

Ao meu orientador, Professor Ivo Pivato, obrigado pela oportunidade, pelo

aprendizado, dedicação, confiança e pela ajuda em tudo que foi preciso.

Por ultimo, porém não menos importante quero agradecer a todos os

animais. Pequenos, grandes, de estimação e produção todos foram, são e serão

fundamentais em nossos estudos, pesquisas e descobertas. Companheiros e

amigos, eles são os responsáveis pela realização deste sonho. Muitas vezes

doaram suas vidas para que pudéssemos aprender mais a cada dia, desde as

aulas de anatomia, cirurgia até as de reprodução, sem eles a profissão de

veterinário não existiria e a vida seria triste.

“No fim tudo dá certo, e se não deu certo

é porque ainda não chegou ao fim.”

(Fernando Sabino)

LISTA DE ABREVIAÇÕES, ABREVIATURAS E SIGLAS

1. 3' UTR - região não traduzida 3’

2. ATP - adenosina trifosfato

3. C. elegans - Caenorhabditis elegans

4. DNA - ácido desoxirribonucleico

5. miRISC - complexo de silenciamento mediado por miRNA

6. miRNAs - microRNAs

7. mRNAs - RNAs mensageiros

8. primiRNA - miRNA primordial

9. RNAse - Ribonuclease

10. stRNA - pequenos RNAs temporais

11. ZP - Zona Pelúcida

12. CTZL- Centro de Transferência de Tecnologias em Raças Zebuínas com

Aptidão Leiteira

13. Embrapa - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

14. IATF - Inseminação artificial em tempo fixo

15. OPU - “Ovum pick-up” - Aspiração Folicular

16. PIV - Produção in vitro

17. TE – Transferência de embrião

18. TETF – Transferência de embrião em tempo fixo

19. TN - Transferência Nuclear

20. TNCS - Transferência Nuclear de Células Somáticas

21. SOV – Superovulação

RESUMO

CAVALCANTE, B. O. H. Funções dos RNAs de cadeia curta com ênfase na

reprodução. Small-chain RNAs Functions with emphasis on reproduction. 2014.

29 p. Monografia de conclusão do Curso de Medicina Veterinária - Faculdade de

Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília, Brasília, DF.

A presença de microRNAs em espermatozoides levantou diversos

questionamentos a respeito da contribuição destes para o desenvolvimento

embrionário. O espermatozoide, considerado até então apenas como um

transportador do genoma do macho, começou a ser estudado visando descobrir

se esses pequenos RNAs presentes e com funções diversas em outros seres

vivos possuiria atributos diferentes. Ainda existem muitas dúvidas quanto às

funções dos microRNAs presentes nos espermatozoides. Descobertas recentes

apontam que essas moléculas têm alguma função no início do desenvolvimento

embrionário, como no crescimento e na diferenciação celular ou ainda que

possam indicar a qualidade da espermatogênese. Embora envolvidos na

mediação da herança epigenética em camundongos, os seus papéis na

fertilização e no desenvolvimento embrionário inicial permanecem

desconhecidos, mais estudos são necessários para defini-los.

Palavras-chave: espermatozoide, função, macho, microRNA.

ABSTRACT

CAVALCANTE, B. O. H. Smalk-chain RNAs Functions, with emphasis on

reproduction. Funções dos RNAs de cadeia curta com ênfase na reprodução.

2014. 29 p. Monografia de conclusão do Curso de Medicina Veterinária -

Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília,

Brasília, DF.

The presence of microRNAs in sperm brought several questions regarding their

contribution to embryonic development. The spermatozoon until then considered

only as a carrier of the male genome began to be studied to find out if this small

RNA present with diverse functions in living beings would possess other

attributes. There are still many questions about the roles of microRNAs in

spermatozoa. Findings indicate that these molecules have some function in early

embryonic development, such as cell growth and differentiation or that may

indicate the quality of spermatogenesis. Although involved in mediating

epigenetic inheritance in mice, their roles in fertilization and early embryo

development remain unknown, further studies are needed to define them.

Keywords: spermatozoon, function, male, microRNA.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 11

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................... 12

2.1. CONCEITOS ............................................................................................. 12

2.1.1. Transcrição ..................................................................................... 12

2.1.2. RNA-polimerase eucarióticas ......................................................... 13

2.1.3. Tradução ......................................................................................... 13

2.2. HISTÓRICO .............................................................................................. 13

2.3. miRNA ....................................................................................................... 14

2.4. FUNÇÕES ................................................................................................. 17

2.5. RNAs EM ESPERMATOZOIDES .............................................................. 18

2.6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................... 19

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 20

4. RELATÓRIO DE ESTÁGIO ............................................................................ 25

4.1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 25

4.2. INDENTIFICAÇÃO DO ESTÁGIO ............................................................. 26

4.3. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ............................................................. 26

4.4. CONSIDERAÇÕES FINAIS SOBRE O ESTÁGIO ................................... 29

11

1. INTRODUÇÃO

O estudo dos microRNAs (miRNA) é bastante novo e pouco se sabe

sobre suas funções especificas. Muito se supõe sobre essas funções uma vez

que se sabe em quais locais eles se encontram. A partir desses conhecimentos

algumas hipóteses são lançadas.

Hoje são conhecidos centenas de miRNAs, mas poucos têm suas

funções específicas descritas na literatura.

Sobre o miRNA sabe-se: como ele se forma, iniciando no núcleo celular

e terminando no silenciamento dos RNAs mensageiros (mRNA) de seus genes

alvo, e como ele atua, silenciando, degradando ou deadenilando o mRNA de

seu gene alvo fazendo com que esse mRNA não codifique a proteína que

deveria codificar.

Sabe-se também que ele age de alguma forma nos processos

biológicos, incluindo o controle do ciclo celular, crescimento e diferenciação

celular, apoptose, desenvolvimento do embrião entre outros. Por esse motivo

supõe-se que eles tenham função no controle desses eventos-chave do

desenvolvimento.

Segundo previsões matemáticas muitos genes humanos são possíveis

alvos da ação desses miRNAs.

Essa revisão visa descrever a importâncias dos miRNAs presentes nos

espermatozoides e sua possível função na fecundação e no desenvolvimento

embrionário.

12

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Os espermatozoides se formam devido a um processo chamado de

espermatogênese no qual as células germinativas sofrem divisões celulares

contínuas e modificações de desenvolvimento. O processo se inicia na periferia

e segue em direção à luz do túbulo seminífero. Os espermatozoides atuam de

forma imprescindível na fecundação, atuam na camada do cumulus,

principalmente pela ação da hialuronidase; na zona pelúcida (ZP), onde o

conteúdo acrossômico é liberado, e na membrana plasmática do ovócito,

começando com a ligação à membrana do ovócito e concluindo com a fusão

entre a membrana do espermatozoide e a do ovócito (EVANS, 2002). Para que

isto ocorra, o espermatozoide fecundante precisa sofrer a capacitação

espermática um processo complexo no qual vai ocorrer a desestabilização da

bicamada fosfolipídica causada por mudança ou remoção de componentes,

sem essas modificações ele é incapaz de fecundar o ovócito (HAFEZ E

HAFEZ, 2004). Durante a fertilização, o espermatozoide contribui mais do que

com apenas o genoma paterno para o zigoto resultante. Os espermatozoides

contribuem com fatores solúveis os quais ativam o ovócito, promovem o

recomeço da meiose além de promover a formação dos pronúcleos

(SAUNDERS et al., 2002). Os espermatozoides contribuem também com

centríolos (SIMERLY et al., 1995) e com ácidos ribonucleicos (RNAs), incluindo

RNAs mensageiros (mRNAs) e microRNAs (miRNAs) (OSTERMEIER et al.,

2004).

2.1. CONCEITOS

2.1.1. Transcrição

Os RNAs de todos os tipos são transcritos de um filamento-molde de

DNA, catalisados por diversas enzimas referidas como RNA-polimerases. A

sequência de nucleotídeos do RNA é complementar à do filamento molde de

DNA, exceto ao substituir timina por uracila. Promotores são regiões de

reconhecimento e interação entre a RNA-polimerase e o DNA que sinaliza o

13

começo da transcrição. Essa síntese de um RNA complementar a partir de um

DNA que é denominada transcrição (DE ROBERTIS; HIB, 2006).

2.1.2. RNA-polimerase

Três tipos de RNA-polimerases diferentes são produzidos por

organismos eucariotas. RNA-polimerase I, localizada no nucléolo, sintetiza

apenas RNA-ribossômico. A polimerase II é encontrada no nucleoplasma e

sintetiza RNA pré-mensageiro. A polimerase III, localizada no nucleoplasma,

sintetiza RNA de transferência. A função básica do RNA é o transporte de

mensagem do DNA para o citoplasma, onde serão sintetizadas as cadeias

polipeptídicas (DE ROBERTIS; HIB, 2006).

2.1.3. Tradução

A tradução é o processo de síntese ou fabricação de proteínas

(construção da cadeia de aminoácidos). Para a fabricação das proteínas é

necessário que os ribossomos decodifiquem a mensagem contida na molécula

de mRNA (RNA mensageiro) para uma cadeia de aminoácidos. A

decodificação está baseada em trincas de nucleotídeos (códons), que são

usados para especificar o aminoácido. A correspondência entre uma trinca de

nucleotídeos e um aminoácido é chamada de código genético (DE ROBERTIS;

HIB, 2006).

2.2. HISTÓRICO

O estudo dos microRNAs datam de 1993. O primeiro miRNA foi

descoberto por Victor Ambros, Rosalind Lee e Rhonda Feinbaum durante um

estudo do gene lin-4, que era conhecido por controlar o tempo do

desenvolvimento larval de Caenorhabditis elegans (C. elegans) reprimindo o

gene lin-14. Quando isolaram o gene lin-4, eles descobriram que, em vez de

produzir um mRNA que codifica uma proteína, produzia RNAs não-codificantes

de cadeias curtas, um dos quais era um RNA com 22 nucleotídeos que

14

continham sequências parcialmente complementares à várias sequências da

região não traduzida 3’ (3' UTR) do mRNA do gene lin-14. Sugeriram que essa

complementaridade inibia a tradução do mRNA de lin-14 na proteína LIN-14.

Na época, pensaram que o pequeno RNA do lin-4 seria uma idiossincrasia do

nematóide (LEE et al., 1993).

Somente em 2000, um segundo pequeno RNA foi caracterizado: RNA

let-7, que reprime lin-41 para promover uma transição mais lenta no

desenvolvimento de C. elegans. Logo foi encontrado que o RNA let-7 se

conservava em muitas espécies, levando à sugestão de que o RNA let-7 e

"pequenos RNAs temporais (stRNA)" adicionais poderiam regular o tempo de

desenvolvimento em diversos animais, incluindo seres humanos (REINHART et

al., 2000).

Um ano mais tarde, os RNAs lin-4 e let-7 foram encontrados fazendo

parte de uma grande classe de pequenos RNAs presentes em C. elegans,

Drosophila e células humanas (LAGOS-QUINTANA et al., 2001).

Os muitos RNAs recém-descobertos dessa classe se assemelhavam a

lin-4 e let-7, porém seus padrões de expressão eram geralmente incompatíveis

com um papel na regulação do tempo de desenvolvimento, o que sugere que a

maioria atuaria em outros tipos de vias regulatórias. Neste ponto, os

pesquisadores começaram a usar o termo "microRNA" para se referir a esta

classe de pequenos RNAs regulatórios (LAU et al., 2001).

Pesquisas mais recentes demonstraram que a expressão do miRNA

miR-181 em células progenitoras hematopoiéticas leva a um aumento na

diferenciação linfoide (linhagem B) (CHEN et al., 2004) e que o miRNA

muscular específico miR-133 é fundamental durante a diferenciação dos

mioblastos (BOUTZ, 2007).

2.3. miRNA

Os miRNAs são RNAs de cadeia curta não codificante de 19-24

nucleotídeos encontrados em plantas, animais, e alguns vírus. São conhecidos

por regular os genes nas suas regiões não traduzidas 3' (UTRs 3') de uma

forma imperfeita e são codificados pelo DNA nuclear. O crescente

conhecimento sobre os mecanismos dos miRNAs e sua participação em muitos

15

processos de regulação pós-transcricional (interferindo com a tradução do

mRNA ao silenciar o gene) os torna candidatos interessantes para o controle

de transcritos maternos no embrião inicial (AMBROS, 2004; BORCHERTET et

al., 2006; STEITZ, 2009; JIANG et al., 2009).

A primeira estrutura expressa é um miRNA primordial (primiRNA),

transcrito no núcleo e clivado pelo complexo microprocessador, um arranjo de

enzimas tipo ribonuclease (RNase) III, Drosha-DGCR8 e Dicer. O precursor

miRNA (pré-miRNA) produzido por esta clivagem é uma molécula de cadeia

dupla em forma de grampo de cabelo, que é exportado para o citoplasma. O

pré-miRNA é adicionalmente clivado pela Dicer, para que o miRNA de cadeia

dupla bidirecional (Figura 1) perca uma parte da fita (5’) que é descartada e a

cadeia restante (3’) é o miRNA maduro, ele será integrado no complexo de

silenciamento mediado pelo miRNA (miRISC) e induzido pelo RNA a atuar

como um modelo para reconhecimento do mRNA alvo e regular a sua

expressão. Juntamente com miRISC, os miRNAs direcionam a tradução direta

ou promovem o processo de deadenilação dos mRNAs (Figura 1)

(FILIPOWICZ et al., 2008).

Na última década, centenas de miRNAs foram identificados em células

de mamíferos. 30% dos genes humanos estão previstos matematicamente

para serem alvos dos miRNA (LEWIS et al., 2005). As evidências sugerem que

os miRNAs desempenham papéis críticos em vários processos biológicos,

incluindo o controle do ciclo celular, crescimento e diferenciação celular, a

apoptose, o desenvolvimento do embrião e assim por diante (JIANG et al.,

2009).

Embora envolvidos na mediação da herança epigenética em

camundongos, os seus papéis na fertilização e/ou no desenvolvimento

embrionário inicial, permanecem desconhecidos (RASSOULZADEGAN et al.,

2006).

Estudos em peixes-zebra têm mostrado forte expressão de miRNAs

durante e após a segmentação embrionária e a maioria destes miRNAs

mostram uma delicada especificidade por certos tecidos (WIENHOLDS et al.,

2005).

Outros estudos sugerem um papel para os miRNAs na organogênese

em ratos (JOGLEKAR et al., 2007; WILLIAMS et al., 2007; YI et al., 2009).

16

Figura 1 - Ilustração demonstrando o mecanismo de transcrição processamento e ação regulatória dos microRNAs (SRIVASTAVA, 2009).

17

2.4. FUNÇÕES

Desde a descoberta de miRNAs em vertebrados tornou-se claro que

esta família de RNAs é essencial para o desenvolvimento do organismo

vertebrado (HARFE, 2005).

Evidências acumuladas demonstram que os miRNAs são fundamentais

no controle de eventos-chave do desenvolvimento; no entanto, o papel

especifico dos miRNA no desenvolvimento de partes específicas do organismo

é controversa (YANG et al., 2008).

As alterações dinâmicas na expressão de miRNAs em embriões em fase

inicial pré-implantação e o aumento da síntese de miRNAs após o estágio de

duas células em embriões de camundongo sugerem que miRNAs têm um

papel funcional nesse período pré-implantação (TANG et al., 2007;

VISWANATHAN et al., 2009).

Esta evidência é sustentada pelas observações de ovócitos de

camundongos sem a presença da enzima Dicer. Eles têm uma quantidade

mínima de miRNA e seus zigotos resultantes não passam do primeiro estágio

da clivagem. Os embriões sem a enzima Dicer paterna transportando apenas a

Dicer materna morrem no dia 7,5 do desenvolvimento (BERNSTEIN et al.,

2003).

As células tronco embrionárias expressam relativamente poucos

miRNAs, um conjunto de miRNAs específicos de células tronco embrionárias

que são reprimidos após a formação do corpo embrionário também tem sido

descrito. A noção de que estas alterações de expressão de miRNA são

funcionalmente importantes é suportada pela observação de que a inativação

genética da via de biogênese de miRNA quase anula a capacidade das células

tronco embrionárias de se diferenciar adequadamente. Portanto, a regulação

positiva de miRNAs na diferenciação provavelmente é essencial para o

silenciamento da maquinaria de auto-renovação das células tronco

embrionárias e/ou o estabelecimento de programas de transcrição de linhagens

específicas (VISWANATHAN et al., 2009).

18

2.5. RNAs EM ESPERMATOZOIDES

Existem hipóteses de que o RNA dos espermatozoides pode ter função

nos eventos pós-fecundação. O espermatozoide fecundante leva mRNA para o

ovócito e que esse RNA permanece intacto por pelo menos até três horas após

a fecundação (OSTERMEIER et al., 2004). Alguns mRNAs detectados na

célula espermática e no zigoto estão ausentes nos ovócitos não fecundados.

Portanto, os RNAs do espermatozoide que são levados para o ovócito podem

estar envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial (MILLER, 2007).

O papel exato dos RNAs do espermatozoide permanece desconhecido.

Acredita-se que possa estar relacionado com a regulação da expressão de

genes do início do desenvolvimento embrionário, epigenética e a condensação

da cromatina do espermatozoide. Sabe-se que indivíduos de alta e baixa

fertilidade possuem tipos e quantidade de transcritos diferentes, sugerindo que

a presença desses transcritos possa no futuro ser utilizada para avaliar o

potencial de fertilidade de uma amostra de sêmen (LALANCETTE et al., 2008).

Mais recentemente, foi comprovado que os espermatozoides de bovinos

também apresentam uma grande quantidade de miRNAs e que há maior

concentração desses transcritos em touros de baixa fertilidade, quando

comparados com touros de alta fertilidade, no entanto, apenas alguns (sete)

miRNAs foram significativamente expressos diferenciadamente, sugerindo que

os miRNAs influenciam a fertilidade. Porém, entre os sete miRNAs

identificados, não havia nenhum com anotações publicadas. Portanto, no

presente momento, as suas funções são desconhecidas (GOVINDARAJU et

al., 2012).

Os maiores níveis de expressão dos miRNAs em touros de baixa

fertilidade pode significar que miRNAs podem atuar inativando a regulação da

expressão de genes cujos produtos desempenham papéis importantes na

fecundação e desenvolvimento embrionário inicial. Um exemplo, recentemente

descoberto desse fato, são os miRNAs espermáticos envolvidos na primeira

clivagem em camundongos (LIU et al., 2012).

19

2.6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Pouco se sabe sobre a função dos miRNAs, por ser um assunto muito

novo a literatura é escassa quanto a suas funções especificas, supõe-se muitas

funções para eles devido a sua presença em certos locais e ausência em

outros. Sua presença em grande quantidade é provavelmente um empecilho à

fertilidade, ao desenvolvimento embrionário e ao controle da expressão gênica.

Mais estudos são necessários para que realmente se compreendam as

funções exercidas por esse componente tão especializado. A descoberta da

função dos miRNAs do espermatozoide no desenvolvimento embrionário inicial

poderá tornar a sua presença e quantidade um potencial indicador de

fertilidade, tanto em animais quanto em humanos.

20

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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25

4. RELATÓRIO DE ESTÁGIO

4.1. INTRODUÇÃO

O estágio de caráter obrigatório para conclusão do curso de Medicina

Veterinária na Universidade de Brasília (UnB) foi realizado em duas etapas

sendo a primeira realizada no Centro de Transferência de Tecnologias de

Raças Zebuínas com Aptidão Leiteira (CTZL) no período de 1 de setembro a

23 de outubro e a segunda na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

(CENARGEN) com início em 27 de outubro e término em 9 de dezembro de

2014.

A criação do CTZL, localizado no Núcleo Rural Ponte Alta, no Gama

(DF), teve iniciativa conjunta das Unidades Cerrados (Planaltina – DF), Gado

de Leite (Juiz de Fora – MG) e Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília –

DF). Recebeu apoio do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento,

Ministério do Desenvolvimento Agrário, Ministério da Ciência e Tecnologia,

Emater-DF, CNPq, Associação Brasileira dos Criadores de Zebu (ABCZ) e

Associações de Criadores de Raças Zebuínas Leiteiras (Gir, Guzerá, Indubrasil

e Sindi).

Melhorar a qualidade do rebanho brasileiro, criar um selo de qualidade

para identificar germoplasma zebuíno trabalhado e oferecer treinamento a

agricultores, extensionistas e estudantes são alguns dos objetivos que

justificam a criação do CTZL.

Em 1974, a Embrapa criou o Centro Nacional de Recursos Genéticos

(CENARGEN) e atualmente seu nome é Embrapa Recursos Genéticos e

Biotecnologia. Devido ao estímulo das Nações Unidas em estabelecer uma

rede mundial de Centros para Conservação de Recursos Genéticos, em

regiões consideradas de alta variabilidade genética.

A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia tem atuado fortemente

no intercâmbio e quarentena de germoplasma vegetal e animal, garantindo a

continuidade dos programas de melhoramento genético da Embrapa.

A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia tem, ao longo dos anos,

atuado no cenário nacional e internacional de forma a "Viabilizar soluções de

26

pesquisa, desenvolvimento e inovação em recursos genéticos para a

sustentabilidade da agropecuária brasileira", o que se tornou a sua missão.

A área de reprodução animal e biotecnologia da reprodução foram

escolhidas com objetivo de aprofundar os conhecimentos adquiridos durante o

período da graduação, além de participar do manejo sanitário e clínico dos

animais, rotina do laboratório e da fazenda.

4.2. IDENTIFICAÇÃO DO ESTÁGIO

PRIMEIRA ETAPA

Local: CTZL (EMBRAPA CERRADOS)

Supervisor de estágio: Dr. Carlos Frederico Martins

Período de estágio: 01 de Setembro de 2014 a 23 de Outubro de 2014.

SEGUNDA ETAPA

Local: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

Supervisor de estágio: Dr. Maurício Machain Franco

Período de estágio: 27 de Outubro de 2014 a 09 de dezembro de 2014.

4.3. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

PRIMEIRA ETAPA

Na primeira etapa do estágio tive a oportunidade de fazer palpação retal

para avaliação do útero e ovários em busca de saber a fase do ciclo estral ou

se havia gestação ou não. No útero, observa-se o tamanho, simetria dos

cornos uterinos, consistência, contratilidade e eventuais conteúdos. No ovário é

interessante ver a posição, tamanho, consistência superficial se há presença

de cisto, folículos e corpo lúteo para verificar a fase do ciclo reprodutivo.

Além da palpação pude fazer diagnóstico de gestação em vacas por

ultrassonografia (emissão de ultrassom e captação de ecos). Essa técnica é

27

um meio complementar ao exame clínico, possibilitando o registro de imagens

para serem utilizadas em laudos ou atestados clínicos.

Acompanhei também a aspiração de cistos foliculares, isso foi feito como

forma de tratamento de vacas que não emprenhavam, juntamente com a

colocação de um implante de progesterona. A técnica usada foi a mesma da

aspiração folicular guiada por ultrassom na qual uma agulha é acoplada na

ponta da sonda (transdutor) e ela fica ligada a uma bomba de vácuo.

Pude acompanhar a inovulação de embriões, para sua realização o

técnico deve ter experiência e habilidade, pois erros podem gerar taxas mais

baixas de sucesso. Essa biotécnica consiste na transferência de embriões

retirados do útero de fêmeas doadoras ou de embriões produzidos in vitro, para

o útero de receptoras para que se complete a gestação.

Acompanhei a visita de uma técnica governamental que foi fazer os

exames clínicos de febre aftosa à procura de: a) febre alta de até 41°C; b)

vesículas e bolhas íntegras na boca; c) queda brusca na produção de leite

precedendo os primeiros sinais clínicos; d) salivação e claudicação; e) erosões

secundárias vermelho-vivas, úmidas e sem sangramento, com ou sem depósito

de fibrina, nas regiões do focinho, narinas, boca, banda coronária (coroa) dos

cascos, espaço interdigital, tetos e úbere; f) morte súbita em animais muito

jovens causada por miocardite hiperaguda.

Também pude acompanhar a biopsia e cultivo de células, essa técnica é

uma possibilidade para preservar o germoplasma de animais mortos. Consiste

no isolamento, cultivo e criopreservação de fibroblastos ou células do tecido

adiposo (adipócitos). Essas células podem servir para caracterizações

moleculares e também para multiplicação animal pela técnica de transferência

nuclear (clonagem).

Acompanhei também o manejo do gado fora da área de biotecnologias.

Foi possível acompanhar a fabricação de ração, a distribuição dessa ração,

silagem e sal mineral diariamente, também pude observar e ajudar na

implantação de um novo método de pastejo na propriedade, o pastejo

rotacionado. A nutrição é muito importante, pois o animal vai parar suas

atividades reprodutivas em caso de falta de comida.

Por fim, diariamente, acompanhei a ordenha das vacas as quais

passaram pelos processos anteriormente citados e tiveram resultados

28

positivos, os bezerros. Os zebuínos são animais que a ordenha é feita de forma

diferente, pois as vacas não soltam o leite sem que o bezerro esteja perto,

portanto para se ordenhar uma vaca zebuína é preciso deixar o bezerro perto

delas para que haja o estímulo sensorial e de tato (bezerro ou ordenhadeira

mecânica) para que ela comece a liberar o leite. A ordenha lá é feita de forma

mecanizada no sistema de fila indiana por ser o único que permite a presença

do bezerro ao pé e os princípios das boas práticas de higiene na ordenha como

o pré e o pós-dipping são respeitados.

SEGUNDA ETAPA

Na segunda etapa do estágio, aprendi sobre a lavagem e esterilização

de materiais de laboratório.

Tive a oportunidade de fazer palpação retal para avaliação do útero e

ovários em busca de saber a fase do ciclo estral.

Acompanhei a aspiração folicular guiada por ultrassom para a coleta de

ovócitos diretamente dos ovários de vacas vivas. Bezerras pré-púberes

induzidas à puberdade com protocolos hormonais tiveram seus ovócitos

avaliados, a técnica utilizada na aspiração folicular dessas bezerras foi

adaptada de ovinos devido ao tamanho dos animais. Em vez de ser feita por

ultrassonografia ela é feita por laparoscopia. Também foi feita a aspiração

folicular em ovários de abatedouro utilizando seringas e agulhas hipodérmicas.

Esses ovócitos foram encaminhados para o laboratório e com o uso de uma

lupa, os ovócitos foram procurados, recuperados e classificados. Depois disso

eles foram maturados in vitro. Após essa maturação esse ovócito pode ser

usado para continuar a produção in vitro de embriões ou para a transferência

nuclear. Caso ele vá ser usado na produção in vitro de embriões é preciso

fazer então a capacitação dos espermatozoides que serão usados, a

fertilização in vitro e o cultivo in vitro até o estádio de blastocisto e após isso

escolhe-se entre a transferência ou criopreservação. É possível com essa

técnica aumentar o número de bezerros que uma vaca pode ter por ano de 1

para 40 ou mais o que leva uma vaca de alto valor zootécnico a ter muitas crias

por anos fazendo com que as características maternas sejam prevalentes em

vez das paternas como acontece na inseminação artificial.

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Acompanhei também a inovulação de embriões oriundos de

transferência nuclear, o exame ultrassonográfico em bezerras para avaliar a

resposta do organismo ao tratamento feito com hormônios sexuais e pude fazer

pipetas de manipulação de ovócitos e embriões a partir de capilares de

microhematócritos além de acompanhar a fabricação de micropipetas para

transferência nuclear.

Quadro 1- Atividades desenvolvidas durante o estágio obrigatório

Atividade Repetições

Ecografia retal 7

Lavagem e esterilização de materiais de laboratório 3

Aspiração folicular de bezerras e vacas 10

Produção in vitro de Embriões 2

Produção de pipetas de manipulação de ovócitos e embriões 2

Transferência de Embrião 5

Palpação retal 5

Clínica 3

Rotina da fazenda 25

Aspiração folicular de ovários de abatedouro 2

Avaliação da dinâmica folicular de bezerras 5

Manipulação hormonal em bezerras 5

Diagnóstico de gestação em vacas 3

4.4. CONSIDERAÇÕES FINAIS SOBRE O ESTÁGIO:

Devido ao período de seca não foi possível ter muitas atividades

laboratoriais e de campo, no entanto pude aprender um pouco mais sobre as

biotecnologias da reprodução animal. O estágio na Embrapa foi de enorme

valia, pois, além de ser um centro de pesquisa de referência internacional,

possibilitou uma importante experiência para minha formação, já que muitos

procedimentos aprendidos em sala de aula foram acompanhados e explicados

novamente e feitos por mim para aperfeiçoamento dessas habilidades.