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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Celular DESENVOLVIMENTO E MAPEAMENTO DE MARCADORES MICROSSATÉLITES E IDENTIFICAÇÃO DE QTLs LIGADOS À PRODUTIVIDADE E À RESISTÊNCIA À MANCHA PRETA EM Arachis spp. Tese de Doutorado MÁRCIO DE CARVALHO MORETZSOHN Brasília - DF 2006
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UNIVERSIDADE DE BRASLIA Instituto de Cincias Biolgicas Departamento de Biologia Celular
DESENVOLVIMENTO E MAPEAMENTO DE MARCADORES MICROSSATLITES E IDENTIFICAO DE QTLs LIGADOS
PRODUTIVIDADE E RESISTNCIA MANCHA PRETA EM Arachis spp.
Tese de Doutorado
MRCIO DE CARVALHO MORETZSOHN
Braslia - DF
2006
ii
Universidade de Braslia
Departamento de Biologia Celular
Curso de Ps-Graduao em Biologia Molecular
DESENVOLVIMENTO E MAPEAMENTO DE MARCADORES MICROSSATLITES E IDENTIFICAO DE QTLs LIGADOS PRODUTIVIDADE E RESISTNCIA
MANCHA PRETA EM Arachis spp.
Mrcio de Carvalho Moretzsohn
Orientador: Dr. David John Bertioli
Tese apresentada ao Departamento de
Biologia Celular do Instituto de Biologia, da
Universidade de Braslia, como requisito
parcial para obteno do grau de Doutor em
Cincias Biolgicas, rea de concentrao:
Biologia Molecular.
Braslia-DF, 2006
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Termo de Aprovao Tese apresentada ao Departamento de Biologia Celular da Universidade de Braslia, como requisito parcial para obteno do grau de Doutor em Cincias Biolgicas, rea de concentrao Biologia Molecular. Tese defendida e aprovada em 29/11/2006 por:
Dr. David John Bertioli Universidade Catlica de Braslia / UnB
Dr. Dario Grattapaglia Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia / UnB
Dr. Mrcio Elias Ferreira Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia / UnB
Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho Universidade Federal de Gois
Dr. Marcos Aparecido Gimenes Instituto Agronmico de Campinas
Membro suplente: Dra. Glucia Salles Cortopassi Buso (Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia)
iv
minha esposa, Anna,
e aos meus filhos, Jlia e Henrique,
DEDICO.
memria de meu pai,
OFEREO.
v
AGRADECIMENTOS
A realizao dessa tese somente foi possvel pelo apoio recebido de diversas
pessoas e instituies, mas gostaria de agradecer de maneira especial:
Embrapa, pela oportunidade do treinamento e pela concesso da bolsa de
estudo;
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, pela infra-estrutura de
trabalho e pelo apoio recebido; Ao Departamento de Biologia Celular da UnB, pela concesso desse
treinamento e aos professores da UnB, pelos ensinamentos;
Ao Dr. David Bertioli, pela amizade, orientao, sugestes e apoio durante a
realizao desse trabalho;
Ao Dr. Dario Grattapaglia, pela co-orientao, sugestes e tambm pela
amizade e por todo o apoio recebido;
Dra. Patrcia Guimares, pelo acompanhamento desse trabalho, na
condio de Conselheira Acadmica junto Embrapa;
s Dras. Soraya Leal-Bertioli e Alessandra Fvero, pela conduo dos
bioensaios;
Ao BIRD/PRODETAB, Unio Europia e ao Generation Challenge Program
pelo suporte financeiro e aos Drs. David, Patrcia e Soraya pelo empenho na gesto
desses projetos, cuidando do fornecimento dos meios necessrios para a realizao
dessa tese;
Aos estagirios do Laboratrio de Gentica Vegetal da Embrapa Recursos
Genticos e Biotecnologia, Raphael, Aryanne, Saulo, Ronaldo e Ediene, pela ajuda
nas atividades de laboratrio em diferentes fases desse trabalho;
Ao Leandro, pelo cuidado com as plantas nas casas de vegetao;
Llia Leoi, pela ajuda na construo das bibliotecas genmicas;
Carol Jos, pela anlise dos marcadores RGA;
Ao Dr. Valls pela concesso dos acessos de Arachis utilizados;
toda a equipe envolvida nos projetos de amendoim, pela colaborao;
Aos meus amigos do Laboratrio de Gentica Vegetal da Embrapa Recursos
Genticos e Biotecnologia, em especial, Glucia, Ana Ciampi, Marco Antnio,
Zilneide, Marlia e Vnia.
vi
ndice
Lista de figuras ......................................................................................................... viii Lista de tabelas ...........................................................................................................x Resumo ...................................................................................................................... 1 Abstract ...................................................................................................................... 3 1. INTRODUO GERAL .......................................................................................... 5
1.1. O amendoim cultivado (Arachis hypogaea L.) ................................................. 5 1.2. O gnero Arachis ............................................................................................. 7 1.3. Uso de espcies silvestres no melhoramento do amendoim ........................... 8 1.4. Mapeamento gentico.................................................................................... 10
1.4.1. Construo de mapas genticos ............................................................. 10 1.4.2. Mapas genticos em Arachis .................................................................. 14
1.5. Marcadores moleculares................................................................................ 16 1.5.1. Marcadores microssatlites..................................................................... 16 1.5.2. Marcadores ncoras................................................................................ 19 1.5.3. Anlogos a genes de resistncia............................................................. 20
1.6. Mapeamento de QTLs e seleo assistida por marcadores .......................... 22 1.7. Mapeamento de QTLs em Arachis................................................................. 25
2. OBJETIVOS GERAIS........................................................................................... 27 Captulo 1 - Desenvolvimento e caracterizao de marcadores microssatlites para o amendoim (Arachis hypogaea L.) 1. INTRODUO ..................................................................................................... 29 2. MATERIAL E MTODOS ..................................................................................... 31
2.1. Material vegetal.............................................................................................. 31 2.2. Extrao e quantificao de DNA .................................................................. 31 2.3. Construo de bibliotecas genmicas............................................................ 33 2.4. Seqenciamento de DNA e desenho de primers ........................................... 34 2.5. Condies de PCR e eletroforese dos marcadores microssatlites .............. 35 2.6. Caracterizao dos novos marcadores microssatlites ................................. 35
3. RESULTADOS E DISCUSSO............................................................................ 37 3.1. Desenvolvimento de marcadores microssatlites .......................................... 37 3.2. Caractersticas das regies repetitivas em Arachis ....................................... 39 3.3. Polimorfismo e transferibilidade dos novos marcadores microssatlites ....... 40 3.4. Caracterizao do contedo gnico das bibliotecas usadas para desenvolvimento dos marcadores ........................................................................ 46 3.5. Relaes genticas entre acessos de A. hypogaea ...................................... 48
4. CONCLUSES .................................................................................................... 51 Captulo 2 - Construo de um mapa de ligao e mapeamento de QTLs ligados produtividade e resistncia mancha preta em espcies diplides de Arachis com genoma AA 1. INTRODUO ..................................................................................................... 53 2. MATERIAL E MTODOS ..................................................................................... 55
2.1. Material vegetal.............................................................................................. 55 2.2. Extrao de DNA e PCR dos locos microssatlites ....................................... 55
vii
2.3. Construo do mapa...................................................................................... 55 2.4. Avaliao fenotpica....................................................................................... 58 2.5. Anlise de QTLs ............................................................................................ 59
3. RESULTADOS E DISCUSSO............................................................................ 61 3.1. Construo do mapa...................................................................................... 61 3.2. Anlise de QTLs ............................................................................................ 67
3.2.1. QTLs para peso de sementes ................................................................. 69 3.2.2. QTLs para nmero de sementes por planta ............................................ 75 3.2.3. QTLs para resistncia mancha preta (C. personatum)......................... 78 3.2.4. Co-localizao de QTLs .......................................................................... 82 3.2.5. Genes candidatos.................................................................................... 82
4. CONCLUSES .................................................................................................... 84 CONSIDERAES FINAIS...................................................................................... 86 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ......................................................................... 88 ANEXOS
ANEXO 1 - Moretzsohn et al., 2005.....................................................................104 ANEXO 2 - Martins et al., 2006............................................................................117 ANEXO 3 - Planilha com as informaes sobre os marcadores ..........................122
viii
Lista de figuras INTRODUO GERAL
Figura 1 Base gentica dos marcadores microssatlites: (A) Seqncia de DNA contendo as regies repetitivas, (B) gentipos para esse loco de 3 plantas hipotticas e (C) migrao dos diferentes alelos em gel de eletroforese. ............. 17
Captulo 1 - Desenvolvimento e caracterizao de marcadores microssatlites para o amendoim (Arachis hypogaea L.)
Figura 1 Nmero de marcadores detectados por classe de tamanho de repeties (grfico A) e relaes entre nmero de repeties dos microssatlites e o polimorfismo detectado nas anlises de A. duranensis e A. stenosperma e em seis acessos de A. hypogaea (grfico B). Nessa anlise, foram considerados 225 marcadores que amplificaram produtos com boas resolues em A. duranensis e A. stenosperma e 236 marcadores na anlise de A. hypogaea. ........................... 41 Figura 2 - Dendrograma, obtido pelo mtodo UPGMA, baseado nas distncias de alelos comuns (shared allele distance), entre 16 acessos de A. hypogaea (Tabela 1). As letras aps cada acesso correspondem s subespcies e variedades: FF-fastigiata/fastigiata; FV-fastigiata/vulgaris; FA-fastigiata/ aequatoriana; FP-fastigiata/peruviana; HH-hypogaea/hypogaea; HHi-hypogaea/hirsuta. Xingu corresponde ao tipo Xingu, que parece pertencer subespcie hypogaea. .......................................................................................... 50
Captulo 2 - Construo de um mapa de ligao e mapeamento de QTLs ligados produtividade e resistncia mancha preta em espcies diplides de Arachis com genoma AA
Figura 1 Padres de amplificao obtidos com o primer RN8C09, por eletroforese em gel de poliacrilamida 5% (foto A) e com os primers RN10F09 (foto B) e Leg69, que um marcador ncora (foto C), em gis de agarose 3,5%. Na foto A, a primeira e a ltima linhas so padres de tamanhos conhecidos (10-bp DNA ladder). Nos trs gis, da esquerda para a direita: A. duranensis (acesso K7988), usado como progenitor feminino; A.stenosperma (acesso V10309), progenitor masculino; hbrido F1 e 45 indivduos F2 na foto A e 21 indivduos F2 nas fotos B e C. A seta, na foto A, indica o fragmento de 250 pares de bases. ......................... 62 Figura 2 Mapa gentico obtido pela anlise de 93 plantas F2, resultantes do cruzamento entre A. duranensis e A. stenosperma. Marcadores que no segregaram de acordo com as propores esperadas apresentam o smbolo # aps o nome, sendo # para distores a 5%; ## a 1% e ### para marcadores altamente distorcidos, com valores de X2 maiores do que 30. Marcadores que compem o framework map esto sublinhados e os possveis marcadores gnicos esto em itlico. esquerda de cada grupo aparecem as distncias de Kosambi. Os marcadores dominantes apresentam Ad ou As aps os nomes, dependendo da origem do fragmento amplificado (Ad - A.duranensis e As - A.stenosperma). Marcadores que amplificaram dois locos apresentam os nmeros _1 e _2 aps os nomes. Locos mapeados com LOD
ix
marcadores RGA tm RGA aps o nome da sonda utilizada (RFLP) ou da espcie de origem da banda amplificada (AFLP modificado). Os demais marcadores so microssatlites............................................................................ 64 Figura 3 Distribuio de freqncias fenotpicas das trs caractersticas avaliadas na populao F2: (A) peso de sementes, (B) nmero de sementes por planta e (C) resistncia mancha-preta. Os fentipos dos progenitores feminino (P1) e masculino (P2) e do hbrido F1 so indicados para as caractersticas peso de sementes e resistncia mancha-preta. Para nmero de sementes apresentada somente a mdia fenotpica. ................................................................................. 68
Figura 4 Localizao de QTLs para as trs caractersticas fenotpicas avaliadas: peso de sementes (psem), nmero de sementes por planta (nsem) e resistncia ao fungo Cercosporidium personatum (Cp). Os marcadores adjacentes aos QTLs aparecem em negrito. As demais informaes referentes nomenclatura dos marcadores e ao mapa de ligao encontram-se na legenda da figura 2 (pgina 67)......................................................................................................................... 74
Figura 5 QTLs identificados para a caracterstica nmero de sementes por planta, pelo mtodo de mapeamento por intervalo composto. So apresentados apenas os dois grupos de ligao nos quais foram mapeados QTLs com valores de LOD escore maiores do que 4,1. Cada pico acima da linha horizontal, que indica o ponto de corte (LOD escore=4,1), representa um possvel QTL.. ........... 76
Figura 6 Mapeamento de QTLs para resistncia ao fungo Cercosporidium personatum, causador da mancha-preta em Arachis spp, pelo mtodo de mapeamento por intervalo composto.. .................................................................. 80
x
Lista de tabelas
Captulo 1: Desenvolvimento e caracterizao de marcadores microssatlites para o amendoim (Arachis hypogaea L.)
Tabela 1 Acessos de Arachis hypogaea includos na caracterizao dos novos marcadores microssatlites. Os acessos utilizados na triagem inicial dos 271 novos marcadores so identificados com um asterisco aps o nome. So apresentados tambm a classificao taxonmica e o local de coleta de cada acesso................................................................................................................... 32
Tabela 2 Nmero de marcadores polimrficos detectados na anlise de dois acessos de espcies silvestres de Arachis - A. duranensis (K 7988) e A. stenosperma (V 10309) - e de seis acessos de A. hypogaea, incluindo as seis variedades botnicas. Os seis marcadores desenvolvidos a partir de genes de A. hypogaea, depositados no GenBank, no foram includos. .................................. 42
Tabela 3 Pares de primers, nota referente qualidade dos produtos amplificados, amplitude de comprimento dos fragmentos, nmero de indivduos analisados (n), nmero total de alelos amplificados (A) e diversidade gnica (GD) para os 62 novos marcadores microssatlites polimrficos para A. hypogaea, identificados no presente estudo .......................................................................... 43
Tabela 4 Contedo gnico de diferentes bibliotecas estimado por BlastX (valores de E < 10-8) contra Arabidopsis e protenas de leguminosas. Os dados de ESTs so apresentados apenas para comparao com as bibliotecas genmicas. ...... 47
Tabela 5 Matriz de distncias genticas entre 16 acessos de A. hypogaea, estimadas pelo mtodo de alelos comuns (shared allele distance). As letras aps cada acesso correspondem s subespcies, variedades e tipos: FF-fastigiata/fastigiata; FV-fastigiata/vulgaris; FA-fastigiata/aequatoriana; FP-fastigiata/peruviana; HH-hypogaea/hypogaea; HHi-hypogaea/hirsuta; Xingu - hypogaea tipo Xingu ............................................................................................. 49
Captulo 2: Construo de um mapa de ligao para espcies diplides de Arachis com genoma AA e mapeamento de QTLs de interesse agronmico para o amendoim
Tabela 1 - Mdias e desvios-padres (s) para trs caractersticas fenotpicas estimados para os acessos progenitores e plantas F1 e F2. Para a populao F2 so apresentados tambm os valores mnimos e mximos.................................. 67
Tabela 2 Coeficientes de correlao de Pearson, obtidos para as trs caractersticas avaliadas na populao F2............................................................ 68
Tabela 3 Marcadores significativamente associados caracterstica peso de sementes pela anlise de marcas simples. Todos os marcadores so codominantes........................................................................................................ 69
xi
Tabela 4 QTLs detectados para a caracterstica peso de sementes, pelo mtodo de mapeamento por intervalo mltiplo. Todos os marcadores so codominantes................................................................................................................................ 71
Tabela 5 Marcadores significativamente associados caracterstica nmero de sementes por planta, pela anlise de marcas simples. Todos os marcadores so codominantes........................................................................................................ 75
Tabela 6 QTLs detectados para a caracterstica nmero de sementes por planta, pelo mtodo de mapeamento por intervalo mltiplo. Os marcadores S1A36RGA_B e S1A36RGA_D so dominantes (RGA); os demais so codominantes.. ............ 77
Tabela 7 Marcadores significativamente associados resistncia ao fungo Cercosporidium personatum, causador da mancha preta, pela anlise de marcas simples. Todos os marcadores so codominantes.. ............................................. 79
Tabela 8 QTLs detectados para a caracterstica resistncia ao fungo Cercosporidium personatum, causador da mancha preta em Arachis spp, pelo mtodo de mapeamento por intervalo mltiplo ..................................................... 81
Resumo
O amendoim cultivado (Arachis hypogaea) uma cultura importante, amplamente cultivada nas regies tropicais e subtropicais do mundo. bastante
susceptvel a diversos estresses biticos e abiticos, para os quais muitas das
espcies silvestres so resistentes. Como um primeiro passo visando a introgresso
desses genes de resistncia no amendoim cultivado, um mapa de ligao foi
construdo, usando uma populao F2, obtida do cruzamento entre duas espcies
silvestres diplides de genoma AA (A. duranensis e A. stenosperma). Esse mapa foi
baseado em marcadores microssatlites e marcadores ncoras, ambos
codominantes e transferveis entre espcies aparentadas. Um total de 271 novos
marcadores microssatlites foi desenvolvido no presente trabalho, a partir de
bibliotecas genmicas enriquecidas para microssatlites, de bibliotecas de etiquetas
de seqncias expressas (ESTs ou expressed sequence tags) e por minerao
(data mining) de seqncias disponveis no GenBank. Para facilitar o
desenvolvimento dos marcadores a partir de um grande nmero de seqncias, foi
utilizado um mdulo de programas desenvolvido em parceria com a Universidade
Catlica de Gois e com a Universidade Catlica de Braslia. Esse mdulo integra
um programa para busca de microssatlites (TROLL), um conjunto de programas
para agrupamento e processamento das seqncias (Staden package) e um terceiro
programa, para desenho de primers (Primer3). Com isso, o desenvolvimento dos
marcadores pde ser automatizado, tornando o processo bem mais rpido e
eficiente. Dos 271 novos marcadores microssatlites, 66 mostraram-se polimrficos
para o amendoim cultivado e 62 deles foram utilizados para anlise das relaes
genticas entre acessos representando as seis variedades botnicas descritas de A.
hypogaea. Os resultados obtidos foram consistentes com a classificao taxonmica
atual, exceto para as variedades fastigiata/peruviana e fastigiata/aequatoriana, que
formaram um grupo separado e distante das outras duas variedades da subespcie
fastigiata. Os 271 novos marcadores microssatlites, alm de outros 218 publicados
ou em publicao para o amendoim foram testados, usando-se os dois progenitores.
Desses 489 marcadores microssatlites, 215 (44,0%) mostraram-se polimrficos,
sendo 181 codominantes e 34 dominantes (amplificaram alelos nulos em um dos
progenitores). Os 99 marcadores microssatlites codominantes que no
apresentaram distores da segregao 1:2:1 esperada (p
2
marcadores ncoras no distorcidos (de um total de 72), foram utilizados para o
estabelecimento dos grupos de ligao. Em seguida, os marcadores distorcidos e os
dominantes foram includos no mapa. Usando um LOD escore mnimo de 11, 182
marcadores microssatlites, 66 marcadores ncoras e 12 RGAs foram mapeados
em 10 grupos de ligao, como esperado, uma vez que Arachis duranensis e A.
stenosperma so espcies diplides com 2n=20 cromossomos. Um comprimento de
mapa total igual a 1645,1 cM foi obtido, com uma distncia mdia de 6,32 cM entre
marcadores. Esse mapa foi utilizado para o mapeamento de QTLs que controlam
trs caractersticas de interesse para o melhoramento do amendoim. Dez QTLs que
controlam o peso de sementes, oito QTLs que controlam o nmero de sementes
produzidas por planta e dois QTLs para resistncia ao fungo causador da mancha
preta (Cercosporidium personatum) foram significativamente identificados pelo
mtodo de mapeamento por intervalo mltiplo. Esse o primeiro mapa baseado em
marcadores microssatlites desenvolvido para Arachis. Alm disso, os primeiros
QTLs para componentes da produtividade e para resistncia mancha preta foram
mapeados em Arachis spp. Uma vez que a maioria dos marcadores microssatlites
utilizados foi desenvolvida a partir de ESTs e de bibliotecas genmicas digeridas
com enzimas de restrio sensveis a metilao, mais da metade dos marcadores
mapeados, incluindo os marcadores ncoras, so provavelmente gnicos. Os
grupos de ligao identificados nesse trabalho, as ordens dos marcadores obtidas e
os QTLs mapeados esto sendo validados em outras populaes de mapeamento,
visando a construo de um mapa de referncia para Arachis e a obteno de
estimativas mais robustas sobre os QTLs identificados, para uso dessas informaes
nos programas de melhoramento do amendoim.
3
Abstract
Cultivated peanut (Arachis hypogaea) is an important crop, widely grown in tropical
and subtropical regions of the world. It is highly susceptible to several biotic and
abiotic stresses to which wild species are resistant. As a first step towards the
introgression of these resistance genes into cultivated peanut, a linkage map was
constructed, using an F2 population obtained from a cross between two diploid wild
species with AA genome (A. duranensis and A. stenosperma). The map was based
on microsatellite and anchor markers that are both codominant and transferable
among related species. A total of 271 new microsatellite markers were developed in
the present study from SSR-enriched genomic libraries, ESTs, and by data-mining
sequences available in GenBank. To aid the development of microsatellite markers
from a great number of sequences, a module, developed in collaboration with the
Catholic University of Gois and the Catholic University of Braslia, was used. This
module integrates a program for the detection of microsatellites (TROLL), the Staden
Package for the assembly and processing of sequences, and a software for primer
design (Primer3). By using this module, the SSR marker development was
automated, and the process proved to be fast and efficient. Of the 271 new SSR
markers, 66 were polymorphic for cultivated peanut and 62 were used for the genetic
relationship analysis of accessions representing the six described botanical varieties
of A. hypogaea. Results were consistent with the actual taxonomic classification,
except for the fastigiata/peruviana and fastigiata/aequatoriana varieties, which
formed a separated group, distant from the other two fastigiata varieties. The 271
new markers plus another 218 published or being published for peanut were
screened against both progenitors. A total of 215 (44.0%) were polymorphic, with 181
codominant and 34 dominant markers (amplified null alleles in one of the
progenitors). The 99 codominant markers segregating 1:2:1 (p
4
for the mapping of QTL for three traits of interest for the peanut breeding programs.
Ten QTL controlling seed weight, eight QTLs for seed number and two QTLs for
resistance against the fungus C. personatum were significantly mapped by using the
multiple interval mapping method. This is the first microsatellite-based map published
for Arachis. Moreover, the first QTLs for yield components and for resistance to late
leafspot were mapped in Arachis spp. Because most markers used were derived
from ESTs and genomic libraries made using methylation sensitive restriction
enzymes, more than a half of the markers, including the anchor markers, are genic.
Linkage group ordering and the mapped QTL are being validated in other mapping
populations, with the aim of constructing a transferable reference map for Arachis
and to obtain more robust estimates about the mapped QTL for use in the peanut
breeding programs.
5
1. INTRODUO GERAL
1.1. O amendoim cultivado (Arachis hypogaea L.)
O amendoim uma cultura importante internacionalmente, tanto para
produo de leo, como para consumo direto, constituindo uma das principais fontes
de protenas e vitaminas em diversos pases em desenvolvimento da sia, frica e
Amrica do Sul (Savage & Keenan, 1994). Seus gros contm cerca de 45% de
leos, 25% de protenas e 20% de carboidratos (Godoy et al., 1999; Holbrook &
Stalker, 2003). Sua folhagem utilizada como forragem e a torta resultante da
extrao do leo usada como rao animal. Alm disso, a capacidade de fixar
nitrognio da raiz do amendoim, mantendo a fertilidade do solo, especialmente
importante para os pequenos produtores que, em geral, no tm condies de
utilizar fertilizantes qumicos. Por isso, o amendoim tambm bastante cultivado
para subsistncia por pequenos agricultores, principalmente na sia, frica e no
nordeste do Brasil (Singh & Singh, 1991; Hammons, 1994). Outras espcies do
gnero Arachis possuem grande valor como plantas forrageiras (A. glabrata, A.
pintoi) e alto potencial como cobertura para controle de eroses e como plantas
ornamentais (A. repens, A. helodes, A. kempff-mercadoi) (Valls, 2000). Alm disso,
A. villosulicarpa e A. stenosperma permanecem sendo cultivadas para produo de
gros alimentcios por indgenas brasileiros (Stalker & Simpson, 1995; Freitas et al.,
2003).
O amendoim cultivado, sob diversos sistemas de produo, em mais de 80
pases nas Amricas, na sia e na frica (Singh & Singh, 1991; Holbrook & Isleib,
2001). A produo mundial encontra-se estvel nos ltimos seis anos, tendo atingido
36,4 milhes de toneladas de amendoim com casca e 5,9 milhes de toneladas de
leo em 2004, o que coloca o amendoim em quinto lugar entre as plantas
oleaginosas, atrs da soja (30 milhes de toneladas), dend (28 Mt), colza (12,6 Mt)
e girassol (9,9 Mt) (FAO, 2006). Mais de 90% da produo de amendoim provm da
sia e da frica, sendo a China (34,1% da produo mundial), ndia (28,5%) e
Nigria (5,2%) os maiores produtores mundiais (FAO, 2006). No Brasil, o cultivo de
amendoim pequeno, representando menos de 1% da produo mundial. Apesar
disso, a produo nacional aumentou cerca de 34% nos ltimos quatro anos, tendo
atingido 291.966 toneladas de amendoim com casca e 45.000 toneladas de leo na
6
safra 2004/2005, colhidos em 125.490 hectares (FAO, 2006). Cerca de 85% da rea
plantada no Brasil encontra-se no estado de So Paulo (CONAB, 2006).
Arachis hypogaea possui duas subespcies fastigiata e hypogaea,
classificadas em seis variedades botnicas, com base em caractersticas
morfolgicas e nos hbitos de crescimento da planta (Krapovickas & Gregory, 1994).
A subespcie hypogaea apresenta ciclo longo, hbito rasteiro, sementes com
dormncia, flores no eixo central e possui duas variedades, hypogaea e hirsuta. A
variedade hypogaea apresenta vagens com 2 ou 3 sementes, enquanto a variedade
hirsuta apresenta vagens com nervuras bem marcadas, com uma salincia em uma
das extremidades em forma de bico de papagaio e 3 ou 4 sementes. A subespcie
fastigiata, de ciclo mais curto, porte ereto, sem dormncia e sem flores no eixo
central, dividida nas variedades fastigiata, vulgaris, aequatoriana e peruviana. A
variedade fastigiata apresenta 3 ou 4 sementes por vagem e a variedade vulgaris,
apenas duas. As variedades aequatoriana e peruviana apresentam distribuio
bastante restrita. A variedade peruviana apresenta vagens com reticulao
acentuada e nervuras longitudinais salientes. A variedade aequatoriana
caracterizada por fololos pilosos e vagens rugosas, contendo de 3 a 5 sementes
coloridas. Agronomicamente, o amendoim tem sido classificado em diferentes
grupos, sendo os principais Valncia, Spanish e Virgnia. Embora cultivares de cada
um desses grupos possam ter em sua origem acessos de diferentes subespcies e
variedades, morfologicamente, o grupo Valncia classificado como subsp.
fastigiata var. fastigiata; o grupo Spanish como fastigiata var. vulgaris e o grupo
Virgnia como pertencente subsp. hypogaea var. hypogaea.
Arachis hypogaea considerada uma espcie autgama, com estrutura floral
que facilita a autofecundao: anteras e estigma na mesma altura e envoltas por
uma quilha (Santos & Godoy, 1999). A peculiaridade do amendoim que, embora as
flores sejam areas, os frutos e as sementes so produzidos abaixo da superfcie do
solo. Aps a fertilizao, a regio basal do ovrio alonga-se, formando uma estrutura
conhecida como pendo (peg) ou ginforo, que dotado de geotropismo positivo.
Devido produo subterrnea da semente, a disperso natural do amendoim
torna-se limitada, resultando em populaes com lenta expanso de permetro e
grande isolamento geogrfico (Valls, 2000).
7
1.2. O gnero Arachis
O gnero Arachis pertence famlia Leguminosae ou Fabaceae e nativo da
Amrica do Sul, provavelmente, da regio de divisa entre o Brasil Central e o
Paraguai (Gregory et al., 1980). Sua distribuio natural restrita ao Brasil, Bolvia,
Paraguai, Argentina e Uruguai (Valls & Simpson, 1994). Possui 80 espcies
descritas, reunidas em nove sees taxonmicas, de acordo com a morfologia,
distribuio geogrfica e viabilidade de cruzamentos (Krapovickas & Gregory, 1994;
Valls & Simpson, 2005). As nove sees so: Trierectoides, Erectoides,
Extranervosae, Triseminatae, Heteranthae, Caulorrhizae, Procumbentes,
Rhizomatosae e Arachis. A seo Arachis, qual pertence o amendoim, apresenta
outras 30 espcies descritas, que so classificadas nessa seo por cruzarem com
A. hypogaea.
A grande maioria das espcies da seo Arachis diplide, mas o amendoim
cultivado (A. hypogaea) alotetraplide (2n=4x=40), com genoma AABB. O genoma
AA caracterizado pela presena de um par de cromossomos, chamado A (Husted,
1936), de tamanho bastante reduzido e que apresenta um menor nvel de
condensao da eucromatina em relao aos demais cromossomos (Seijo et al.,
2004). As espcies diplides de genoma AA podem ser perenes ou anuais, mas
cruzam-se facilmente entre si, produzindo hbridos com viabilidade de plen de
mdia a alta (Gregory & Gregory, 1979; Krapovickas & Gregory, 1994; Fvero,
2004). As demais espcies diplides com 2n=20, todas anuais, formam um grupo
mais heterogneo, com aparentes subgrupos (Valls, 2000; Moretzsohn et al., 2004).
Essas espcies, que no apresentam o par A, so consideradas como possuidoras
do genoma BB de A. hypogaea, com exceo de A. glandulifera, que possui o
genoma chamado DD, caracterizado pela presena de seis pares de cromossomos
subtelocntricos (Stalker, 1991). Alm disso, trs espcies possuem 2n=18
cromossomos (A. decora, A. praecox e A. palustris) (Lavia, 1996; 1998; Pealoza &
Valls, 1997) e uma outra espcie tambm tetraplide, A. monticola, considerada
por vrios autores como uma espcie progenitora do amendoim cultivado (Gregory &
Gregory, 1976; Raina & Mukai, 1999; Raina et al., 2001, Moretzsohn et al., 2004;
Milla et al., 2005).
A origem de A. hypogaea tem sido objeto de bastante debate. Por ser um
alotetraplide, acredita-se que tenha surgido da hibridizao entre duas espcies
8
diplides. Diversas espcies tm sido sugeridas como as possveis doadoras dos
genomas AA e BB (revisto por Fvero et al., 2006). Com base em dados de
marcadores moleculares, de distribuio geogrfica e de FISH (Fluorescent In Situ
Hybridization), acredita-se que o amendoim seja resultante de um cruzamento entre
A. ipansis, doadora do genoma BB, e A. duranensis, doadora do genoma AA
(Kochert et al., 1991; 1996; Seijo et al., 2004). Recentemente, o amendoim pde ser
refeito a partir do cruzamento entre essas duas espcies (Fvero et al., 2006).
Assim, A. ipansis, usada como parental feminina foi cruzada com A. duranensis,
usada como doadora de plen. A planta F1 resultante, diplide, foi duplicada com
colchicina, obtendo-se uma planta tetraplide AABB. Essa planta foi cruzada com A.
hypogaea, gerando hbridos frteis e dando suporte hiptese de que A. duranensis
e A. ipansis so os provveis doadores dos genomas AA e BB, respectivamente,
para o amendoim.
O amendoim, portanto, deve ter-se originado da hibridizao de duas
espcies diplides, seguida de um evento de duplicao espontnea de
cromossomos (Halward et al., 1991; Young et al., 1996). A planta resultante devia
apresentar maior vigor hbrido, mas, por ser tetraplide, tornou-se isolada
reprodutivamente de seus parentes silvestres. Como conseqncia, todas as raas
locais de amendoim so, provavelmente, derivadas de uma ou poucas plantas. Esse
fato levou a uma variabilidade gentica reduzida, o que tem dificultado os avanos
no melhoramento molecular do amendoim. Por outro lado, espcies silvestres de
Arachis apresentam maior variabilidade gentica (Hilu & Stalker, 1995; Stalker et al.,
1995; Burow et al., 2001; Moretzsohn et al., 2004; Milla et al., 2005), alm de
possurem resistncias a diferentes fatores biticos e abiticos, que so de interesse
para o melhoramento do amendoim (Stalker & Simpson, 1995; Rao et al., 2003b;
Dwivedi et al., 2003; 2006).
1.3. Uso de espcies silvestres no melhoramento do amendoim
Por constiturem importante fonte de genes teis, espcies silvestres de
Arachis vm sendo introduzidas em programas de melhoramento do amendoim. A
transferncia de genes dessas espcies para A. hypogaea tem tido algum sucesso,
sempre a partir de espcies da seo Arachis. A. monticola, espcie tambm
tetraplide, foi usada em cruzamentos interespecficos com A. hypogaea, resultando
9
nas primeiras cultivares de amendoim com genes de espcies silvestres, Spancross
e Tamnut 74 (Isleib & Wynne, 1992). Apesar disso, essas cultivares no apresentam
nenhuma caracterstica fenotpica que possa ser identificada como derivada de
espcies silvestres.
Simpson & Starr (2001) registraram a primeira cultivar de amendoim com
genes identificveis que foram transferidos de espcies silvestres de Arachis. Essa
cultivar, chamada COAN, foi obtida a partir de retrocruzamentos (RC5) de A.
hypogaea cv. Florunner, usada como parental recorrente, com um complexo hbrido
interespecfico, chamado TxAG-6, resultante do cruzamento entre {A. batizocoi x (A.
cardenasii x A. diogoi)} e posterior duplicao de cromossomos por colchicina.
COAN resistente ao nematide-das-galhas (Meloidogyne arenaria e M. javanica),
mas extremamente susceptvel ao tomato spotted wilt virus- TSWV, que uma das
principais doenas do amendoim, especialmente nos Estados Unidos (Holbrook &
Stalker, 2003). A seleo de plantas na gerao RC7 desse mesmo programa de
retrocruzamentos resultou na cultivar NemaTAM, resistente a nematides, mais
produtiva do que a COAN, mas tambm bastante susceptvel ao TSWV (Starr et al.,
2002; Simpson et al., 2003).
Outras tentativas de introgresso de genes oriundos de espcies silvestres de
Arachis para o amendoim vm sendo feitas em diferentes programas de
melhoramento (Dwivedi et al., 2003; Holbrook & Stalker, 2003). No entanto, essas
iniciativas so ainda bastante reduzidas, se considerado o grande potencial que
essas espcies representam. A introgresso de genes teis em A. hypogaea
apresenta uma srie de dificuldades que tem limitado o uso dessas espcies no
melhoramento do amendoim. Mesmo quando espcies compatveis so utilizadas,
barreiras de esterilidade esto presentes, devido a diferentes nveis de ploidia,
incompatibilidades genmicas e diferenas genticas (Holbrook & Stalker, 2003). O
mtodo mais utilizado tem sido o retrocruzamento, usando-se as espcies silvestres
como parental doador e A. hypogaea como parental recorrente. Dessa forma, junto
com o(s) gene(s) de interesse, partes do genoma do parental doador so
transferidas para o parental recorrente (linkage drag). Freqentemente, essas
regies do genoma possuem genes que controlam caractersticas indesejveis,
como por exemplo, baixa produtividade e qualidade inferior. O processo de
introgresso apenas dos genes teis pode ser otimizado e acelerado pelo uso de
seleo assistida por marcadores. Para isso, a construo de mapas genticos e o
10
mapeamento de genes que controlam as caractersticas de interesse so de
fundamental importncia e essas tcnicas comeam a ser introduzidas nos
principais programas de melhoramento da cultura (Dwivedi et al., 2006).
1.4. Mapeamento gentico
1.4.1. Construo de mapas genticos
Os fundamentos tericos sobre ligao gnica, base para a construo de mapas genticos, surgiram com os trabalhos de Morgan e colaboradores (1910) e
Sturtevant, que em 1913 sugeriu a utilizao de freqncia de recombinantes como
medida da distncia entre dois genes (Coelho & Silva, 2002). Mas foi com o
surgimento dos marcadores moleculares, na dcada de 80, que a construo de
mapas genticos saturados tornou-se possvel. Marcadores moleculares so
disponveis em grande nmero, so polimrficos, seletivamente neutros e no
sofrem influncia ambiental. Mapas genticos de marcadores moleculares permitem
identificar, mapear e medir a magnitude do efeito dos principais genes envolvidos no
controle de caractersticas monognicas ou quantitativas (Ferreira & Grattapaglia,
1998). Uma vez mapeados, marcadores associados a esses genes podem ser
utilizados para seleo indireta, o que torna mais rpido e eficiente o melhoramento
tradicional (seleo assistida por marcadores).
Mapas genticos tambm servem de base para o isolamento de genes,
visando sua utilizao em biotecnologia. Essa estratgia conhecida como
clonagem baseada em mapeamento ou clonagem posicional. Para isso,
necessria a construo de uma biblioteca, contendo grandes fragmentos de DNA
genmico (por exemplo, BACs bacterial artificial chromosomes). Nos ltimos
anos, bibliotecas de BACs tm sido construdas para diversas espcies de plantas,
incluindo o amendoim cultivado (Yuksel & Paterson, 2005) e espcies silvestres de
Arachis com genomas AA (A. duranensis) e BB (A. ipansis) (Bertioli e
colaboradores, ainda no publicado).
A construo de mapas genticos envolve trs etapas principais: (1)
produo da populao de mapeamento; (2) identificao de polimorfismos e (3)
anlise de ligao entre os marcadores.
11
Populaes de mapeamento
A construo de mapas genticos baseia-se na existncia de desequilbrio de
ligao, que definido como desvios das freqncias allicas, em relao s
freqncias esperadas sob independncia (Coelho & Silva, 2002). Fatores como
migrao e seleo podem causar desequilbrio de ligao e, por isso, para a
construo de mapas genticos necessrio o desenvolvimento de populaes de
mapeamento. Nesse caso, o desequilbrio de ligao causado, basicamente, pela
ligao fsica entre os locos. Os indivduos utilizados como progenitores na formao
dessas populaes devem ser contrastantes para caractersticas de interesse, alm
de possurem uma distncia gentica suficiente para a identificao de marcadores
polimrficos, possibilitando a construo do mapa. O tamanho das populaes de
mapeamento em plantas varia, geralmente, de 50 a 250 indivduos, mas populaes
maiores so necessrias para mapeamento de alta resoluo (Mohan et al., 1997;
Collard et al., 2005).
Diferentes tipos de populao podem ser utilizados para a construo de
mapas, sendo as mais comuns as populaes obtidas por retrocruzamentos,
populaes F2, linhagens puras recombinantes (RILs ou Recombinant Inbred
Lines), linhagens de duplo-haplides e, no caso de espcies de fecundao
cruzada, cruzamentos entre indivduos heterozigotos (Ferreira & Grattapaglia, 1998;
Collard et al., 2005). Cada um desses delineamentos possui vantagens e
desvantagens. Populaes F2 e de retrocruzamentos so as mais fceis e rpidas
de serem obtidas, mas apresentam a desvantagem de que os indivduos so nicos,
o que dificulta a avaliao de uma determinada caracterstica em diferentes
ambientes. Uma vantagem da populao F2 sobre a populao de retrocruzamentos,
que os indivduos da gerao F2 so formados por dois gametas com locos em
desequilbrio de ligao, e no por um nico, como no caso dos indivduos obtidos
por retrocruzamentos (Coelho & Silva, 2002). Linhagens puras recombinantes so
obtidas por autofecundaes sucessivas, a partir de F2, gerando uma srie de
linhagens homozigotas, cada uma contendo uma combinao nica de segmentos
cromossmicos provenientes dos progenitores. A principal desvantagem o longo
tempo necessrio para desenvolvimento dessas populaes, que requer,
geralmente, de seis a oito geraes (Collard et al., 2005). Populaes de duplo-
haplides so produzidas pela induo de duplicao cromossmica a partir de
12
gros-de-plen, regenerando plantas inteiras. Esses dois ltimos delineamentos
apresentam a vantagem de produzir populaes imortalizadas, que podem ser
multiplicadas e reproduzidas, sem alteraes genticas. Isso possibilita a conduo
de ensaios em diferentes ambientes e anos. Para espcies algamas, de ciclo longo
ou que apresentam depresso por endogamia, a obteno de linhagens
endogmicas impraticvel. Nesse caso, o cruzamento entre indivduos
heterozigotos geralmente utilizado para a construo de mapas. A escolha do tipo
de populao mais apropriada ao mapeamento est relacionada espcie em
questo, mas tambm ao tipo de marcador empregado (Tanksley et al., 1988),
considerando que o mximo de informao gentica alcanado com uma
populao F2 e marcadores codominantes (Staub et al., 1996; Carneiro & Vieira,
2002).
Identificao de polimorfismos
O segundo passo na construo de mapas genticos a identificao de
marcadores polimrficos. Nesse caso, algumas centenas de marcadores so
testadas nas plantas progenitoras, dependendo da distncia gentica entre elas.
Para escolha do tipo de marcador molecular a ser utilizado devem ser consideradas
as caractersticas de cada marcador, com suas vantagens e desvantagens, alm de
outros fatores, como a disponibilidade de marcadores para a espcie em questo, a
infra-estrutura laboratorial disponvel e o treinamento do pessoal envolvido. Uma vez
identificados, os marcadores polimrficos so genotipados na populao de
mapeamento e os padres de segregao analisados (1:2:1, 3:1 ou 1:1,
dependendo do tipo de populao e marcador utilizados). Para isso, so utilizados
geralmente testes de X2.
Anlise de ligao entre os marcadores
As etapas seguintes envolvem a deteco de ligao entre os marcadores, a
determinao das distncias genticas e o ordenamento dos marcadores nos grupos
de ligao.
A ligao entre cada par de marcadores verificada por comparaes entre
as freqncias allicas observadas e as freqncias esperadas sob independncia.
Para isso, geralmente so utilizados os testes de significncia de X2 ou pela razo
13
de verossimilhana (LR). Segundo Lynch & Walsh (1998), LR calculada pela razo
da funo de verossimilhana, sob a hiptese de que h ligao e sob a hiptese
nula de que no h ligao. Esse teste estatstico tem distribuio aproximada de X2.
Para facilitar a interpretao desse teste, tem sido utilizada a estatstica do LOD
escore (Log of the odds), que consiste em utilizar a estatstica da razo de
verossimilhana convertida para o logaritmo na base 10. Em geral, consideram-se
ligados locos que apresentam valores de LOD superiores ou iguais a 3, uma vez que
esse valor indica que a hiptese alternativa 103 = 1000 vezes mais verossmil do
que a hiptese nula de segregao independente.
As distncias genticas entre os marcadores ligados so calculadas, pelas
freqncias de recombinantes, em porcentagens. No entanto, essa medida no
aditiva, uma vez que permutas duplas em segmentos adjacentes no so
detectadas. Com isso, a incluso de novos marcadores no mapa requer que as
distncias j mapeadas sejam ajustadas. Para se evitar esse problema, so
utilizadas funes de mapeamento. Um grande nmero de funes de mapeamento
foi desenvolvido, mas as mais utilizadas em plantas so as funes de Haldane
(1919) e de Kosambi (1944) (Liu, 1998; Coelho & Silva, 2002). A funo de Haldane
assume que as ocorrncias de permutas gnicas em segmentos adjacentes so
independentes (sem interferncia), enquanto a de Kosambi leva em considerao a
interferncia, sendo, provavelmente, mais prxima da situao real. As funes de
mapeamento so, em geral, expressas em cM (centiMorgan) que igual a 0,01
Morgan. Um Morgan equivale distncia entre dois genes ao longo da qual se
espera que ocorra uma permuta (crossing-over) por gameta por gerao (Weir,
1996).
Uma vez conhecidas as fraes de recombinao entre cada par de
marcadores, os grupos de ligao so identificados. Do ponto de vista biolgico,
grupos de ligao so definidos como grupos de genes (marcadores), cujos locos
esto localizados no mesmo cromossomo (Carneiro & Vieira, 2002). Programas
como Mapmaker (Lander et al., 1987) e GQMOL (Cruz, 2004) permitem a deteco
de ligao em um conjunto de centenas de marcadores, como comum nos
experimentos atuais, e o ordenamento dos marcadores dentro dos grupos de
ligao. O estabelecimento dos grupos de ligao, usando-se esses programas,
feito pela funo de verossimilhana ou LOD escore. Dessa forma, um valor de LOD
mnimo utilizado (geralmente 3) para identificao dos grupos de ligao. A
14
etapa seguinte consiste na determinao da melhor ordem dos marcadores dentro
de cada grupo. Historicamente, o ordenamento de locos tem sido um processo que
visa minimizar o nmero de crossing-overs ou permutas genticas (Liu, 1998). O
ordenamento de grupos de trs marcadores pode ser feito, de maneira simples, pela
identificao dos duplo-recombinantes, ou seja, por comparaes das classes
paternais (com maior freqncia) e as classes originadas de permutas duplas, com
menor freqncia, obtidas a partir do cruzamento entre o triplo heterozigoto e um
homozigoto recessivo (Schuster & Cruz, 2004). Para ordenamento de marcadores
mltiplos, vrios mtodos tm sido desenvolvidos, incluindo mnima soma de fraes
de recombinao adjacentes (SARF), mnimo produto de fraes de recombinao
adjacentes (PARF), mxima soma de LOD escores adjacentes (SALOD), mnima
soma de probabilidades de duplas recombinaes (PDR) e mxima verossimilhana
(ML) (Liu, 1998; Carneiro & Vieira, 2002; Coelho & Silva, 2002). Esses mtodos so
impraticveis quando muitos locos esto envolvidos, uma vez que o nmero de
ordens possvel para m locos igual a m!/2. Por isso, alguns algoritmos tm sido
utilizados para determinao da ordem dos marcadores nos grupos de ligao, tais
como seriao, anelamento simulado, ramos e conexes ou combinaes de mais
de um desses mtodos (Liu, 1998). Seriao e anelamento simulado so algoritmos
de aproximao e, portanto, no garantem que a melhor ordem seja obtida. Por
outro lado, o mtodo de ramos e conexes garante a melhor ordem, mas a anlise
pode demorar bastante tempo, no caso de grupos com muitos marcadores.
Simulaes de ordenamento de locos usando cinco desses mtodos (SARF, PARF,
SALOD, ML e seriao) em uma populao hipottica de duplo-haplides resultaram
em coeficientes de correlao maiores do que 0,99, indicando que todos os mtodos
produziram ordens de marcadores bastante similares (Wu et al., 2003). Deve-se
ressaltar, no entanto, que a acurcia da determinao da melhor ordem de
marcadores em um grupo de ligao est diretamente relacionada ao nmero de
indivduos da populao de mapeamento e, quanto maior o nmero de indivduos,
maior a acurcia.
1.4.2. Mapas genticos em Arachis
Mapas de ligao baseados em diferentes tipos de marcadores moleculares
tm sido construdos para as mais diversas espcies de plantas (revisto por Ferreira
15
& Grattapaglia, 1998; Collard et al., 2005). No entanto, poucos mapas genticos
foram publicados para Arachis. Halward e colaboradores (1993) desenvolveram um
mapa baseado em marcadores RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism),
utilizando uma populao de 87 indivduos F2, derivada de um cruzamento entre
duas espcies silvestres diplides com genoma AA (A. stenosperma x A. cardenasii).
Foram mapeados 117 locos em 11 grupos de ligao, com uma distncia de mapa
total de 1063 cM e uma distncia mdia de 9,08 cM. Com base nesse mapa, embora
pouco saturado, Garcia e colaboradores (1995) utilizaram marcadores RFLP
dispersos pelos 11 grupos de ligao, junto a marcadores RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA) no mapeados, para a anlise de linhas de
introgresso tetraplides, resultantes de um cruzamento entre A. hypogaea (AABB)
e A. cardenasii (genoma AA, duplicado com colchicina). Com isso, os autores
detectaram a introgresso de regies cromossmicas da espcie silvestre diplide
no amendoim cultivado. Essa anlise mostrou que recombinao, e no substituio
cromossmica era o mecanismo de introgresso, o que um resultado importante
para o uso de espcies silvestres de Arachis nos programas de melhoramento do
amendoim.
Devido baixa variabilidade gentica do amendoim cultivado, populaes
anfidiplides sintticas tm sido usadas para a construo de mapas genticos
(Dwivedi et al., 2006). Dessa forma, uma planta anfidiplide sinttica, obtida pelo
cruzamento de {A. batizocoi x (A. cardenasii x A. diogoi)} e posterior duplicao de
cromossomos com colchicina, foi utilizada como parental doador em um cruzamento
com A. hypogaea, gerando uma populao RC1 de 78 indivduos, que foi utilizada
para a construo de um mapa de ligao (Burow et al., 2001). A. cardenasii e A.
diogoi possuem genoma AA, enquanto A. batizocoi possui genoma BB. Esse mapa
consistiu de 370 marcadores RFLP, mapeados em 23 grupos de ligao, com uma
distncia total de 2210 cM e uma densidade mdia de 5,97 cM. Esse foi o primeiro
mapa tetraplide publicado para Arachis. Recentemente, o primeiro mapa para
o amendoim cultivado, embora bastante preliminar, foi publicado, a partir de uma
populao F2 (Herselman et al., 2004). Cinco grupos de ligao com apenas 11
marcadores AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) foram obtidos,
cobrindo 139,4 cM do genoma.
16
1.5. Marcadores moleculares 1.5.1. Marcadores microssatlites
A anlise com marcadores RFLP requer pessoal tcnico habilitado,
instalaes adequadas para a manipulao de DNA recombinante e de material
radioativo e uma tcnica laboriosa e de alto custo, enquanto marcadores RAPD e
AFLP so dominantes e, portanto, pouco informativos. Conseqentemente, esses
trs tipos de marcadores moleculares no so ferramentas ideais para uso em
seleo assistida. Microssatlites ou SSR (simple sequence repeats ou seqncias
repetitivas simples) so seqncias de 1 a 6 nucleotdeos que se repetem lado a
lado na fita de DNA (Figura 1), no genoma de eucariotos (Tautz & Renz, 1984; Litt &
Luty, 1989). Regies contendo essas seqncias podem ser amplificadas por PCR
(Reao em Cadeia da Polimerase), utilizando um par de primers especficos (cerca
de 20-25 bases) complementares a seqncias conservadas que flanqueiam o
microssatlite. Essa tcnica revela polimorfismo em um loco, devido a diferenas no
nmero de vezes que o microssatlite (por exemplo, CA, AG, TTG, ATGC) repete-se
naquele loco (Tautz, 1989; Weber & May 1989; Hancock, 1995). Cada segmento
amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo loco. A
taxa de mutao nestas seqncias repetitivas em geral alta. Isso ocorre devido
alta incidncia de slippage ou escorregamento da enzima polimerase, causando
um pareamento incorreto dos microssatlites durante a replicao, resultando em
cpias de trechos de DNA com tamanhos diferentes (Levinson & Gutman, 1987;
Schltterer & Tautz, 1992). Marcadores SSR caracterizam-se por serem
codominantes, abundantes, aparentemente distribudos por todo o genoma,
multiallicos e dependentes de pequena quantidade de DNA dos indivduos
analisados, por serem baseados em PCR e em eletroforese em gel.
17
Figura 1 Base gentica dos marcadores microssatlites: (A) Seqncia de DNA contendo as regies repetitivas, (B) gentipos para esse loco de 3 plantas hipotticas e (C) migrao dos diferentes alelos em gel de eletroforese.
Essas caractersticas fazem dos microssatlites os marcadores mais
indicados para diversos estudos, incluindo a construo de mapas de ligao
(revisto por Gupta & Varshney, 2000; Ellegren, 2004). Uma vantagem adicional
que esses marcadores apresentam, em geral, alta taxa de transferncia entre
espcies aparentadas e at mesmo entre gneros da mesma famlia (Choumane et
al., 2004; Gutierrez et al., 2005). Isso ocorre porque, embora as regies
microssatlites estejam sujeitas a altas taxas de mutao, as regies flanqueadoras
so freqentemente conservadas entre espcies ou gneros prximos. Em Arachis,
a taxa de transferncia foi estimada em 76% para espcies da seo Arachis e em
45% para as demais oito sees do gnero (Moretzsohn et al., 2004). Isso possibilita
55
TTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGAACAACAACAACAACAACAACAAC
Alelo (TTG)8
55
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Alelo (TTG)9
Alelo (TTG)10
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Alelo (TTG)8
A5
5TTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGAACAACAACAACAACAACAACAAC
Alelo (TTG)8
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Alelo (TTG)9
Alelo (TTG)10
55
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Alelo (TTG)8
A
Planta 1
Planta 2
Planta 3
TTG8 / TTG8
TTG9 / TTG10
TTG13 / TTG15
1 2 3B CPlanta 1
Planta 2
Planta 3
TTG8 / TTG8
TTG9 / TTG10
TTG13 / TTG15
1 2 3B C
18
o uso dos marcadores microssatlites em estudos de genmica comparativa e para
validao de mapas de ligao obtidos em diferentes backgrounds genticos. A
principal desvantagem desses marcadores o alto custo inicial para seu
desenvolvimento, que geralmente requer a construo de bibliotecas genmicas
enriquecidas para seqncias contendo SSRs. No entanto, com a crescente
disponibilidade de etiquetas de seqncias expressas (expressed sequence tags
ou ESTs) e de outros dados de seqncias de DNA, o desenvolvimento de
marcadores SSR, por meio de minerao de dados (data mining), tornou-se uma
opo rpida, eficiente e de baixo custo para muitas espcies de plantas.
Um grande nmero de marcadores microssatlites tem sido desenvolvido
para o amendoim nos ltimos anos. Hopkins e colaboradores (1999) publicaram os
primeiros marcadores microssatlites para o amendoim, desenvolvidos a partir de
bibliotecas genmicas enriquecidas para repeties GT/CA e CT/GA. De um total de
26 pares de primers desenhados, seis mostraram-se polimrficos em uma anlise de
19 acessos de A. hypogaea, incluindo quatro das seis variedades botnicas
conhecidas. Nesse trabalho, apenas as seqncias dos seis primers polimrficos
foram publicadas. Posteriormente, 56 novos marcadores foram desenvolvidos a
partir de uma biblioteca genmica enriquecida para repeties GA/CT (He et al.,
2003). Desses, 19 mostraram-se polimrficos na anlise de 24 acessos de
amendoim, incluindo as seis variedades conhecidas. Esses mesmos autores
publicaram outros 19 marcadores SSR polimrficos para o amendoim, sendo 10 a
partir da biblioteca mencionada acima e nove, a partir de uma biblioteca de cDNAs
(He et al., 2005). O nmero de marcadores microssatlites disponvel para Arachis
aumentou consideravelmente com a publicao de Ferguson e colaboradores
(2004b). Nesse trabalho, foram desenvolvidos 192 novos marcadores, a partir de
bibliotecas enriquecidas para diferentes repeties de di, tri e tetranucleotdeos. A
anlise de 24 acessos das seis variedades de A. hypogaea resultou na identificao
de 110 marcadores polimrficos para o amendoim. Alm disso, 67 marcadores
microssatlites foram desenvolvidos, a partir de uma biblioteca genmica
enriquecida para repeties TTG/AAC, dos quais apenas trs mostraram-se
polimrficos na anlise de cinco acessos de A. hypogaea representando cinco
variedades botnicas (Moretzsohn et al., 2004). Finalmente, 36 marcadores
microssatlites foram desenvolvidos para A. hypogaea, A. pintoi e A. glabrata pelo
mesmo grupo de pesquisa, a partir de bibliotecas genmicas enriquecidas para
19
AC/TG, AG/TC, TA/AT e TTC/AAG (Palmieri et al., 2002; 2005; Bravo et al., 2006;
Gimenes et al., 2006). Devido estreita base gentica de A. hypogaea, esses 396
marcadores disponveis so ainda insuficientes para a construo de mapas
genticos intra-especficos para o amendoim e, mesmo, para a construo de
mapas saturados para as espcies silvestres de Arachis. Por isso, neste trabalho,
uma bateria de marcadores microssatlites foi desenvolvida, a partir de bibliotecas
genmicas enriquecidas, de bibliotecas de cDNAs e por busca de seqncias no
GenBank (Captulo 1).
1.5.2. Marcadores ncoras Diversas iniciativas de seqenciamento de ESTs ou do genoma completo
encontram-se em andamento para diferentes espcies de plantas, incluindo
leguminosas. Com isso, tornou-se possvel o desenvolvimento de marcadores
universais (ncoras), que so marcadores gnicos e de cpias nicas, transferveis
entre espcies de uma mesma famlia, o que possibilita seu uso em estudos de
genmica comparativa. Mapeamento gentico comparativo permite a integrao de
informaes entre diferentes taxa e possibilita que espcies menos estudadas,
como Arachis, se beneficiem da grande quantidade de dados genmicos que esto
sendo gerados para espcies-modelos de leguminosas, como Lotus japonicus e
Medicago truncatula, a partir dos projetos de sequenciamento em larga escala que
se encontram atualmente em andamento para estas duas espcies (Young et al.,
2005; Cannon et al., 2006).
Em leguminosas, o desenvolvimento desses marcadores tem sido feito
seguindo a metodologia descrita por Lyons e colaboradores (1997), mas usando
programas de computador recentemente desenvolvidos para aumentar a eficincia
do processo (Fredslund et al., 2005; Fredslund et al., 2006). Por comparaes de
ESTs de Medicago truncatula, Glycine max e Lotus japonicus, so identificadas
seqncias conservadas evolutivamente (ECSs ou evolutionary conserved
sequences). As ECSs so alinhadas e introns so identificados, uma vez que essas
regies so mais sujeitas a mutaes e, portanto, tendem a ser mais polimrficas do
que as regies codificadoras. O comprimento dos introns importante porque a PCR
final limitada a um amplicon de 2,5 kb, aproximadamente, usando-se polimerases
padres e tambm porque introns muito pequenos tm menor probabilidade de ser
20
polimrficos. Em seguida, seqncias com similaridades nicas no proteoma de
Arabidopsis so selecionadas para desenho de primers, geralmente com bases
degeneradas, complementares s seqncias conservadas que flanqueiam os
introns. Esses primers so ento usados em PCR com os progenitores das
populaes de mapeamento e os fragmentos obtidos so seqenciados para
identificao de polimorfismos em introns e desenho de novos primers, especficos
para Arachis (ou outra espcie em questo). Dessa forma, possvel amplificar
regies ortlogas, com primers especficos para cada espcie analisada.
Alguns desses marcadores revelam polimorfismo de comprimento. No
entanto, para a grande maioria, so identificados SNPs (single nucleotide
polymorphisms ou polimorfismos de nucleotdeo nico) e os produtos de PCR so
clivados com enzimas de restrio especficas para cada marcador, gerando
marcadores dos tipos CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
(Konieczny & Ausubel, 1993) ou dCAPS derived CAPS (Neff et al., 1998). A
tcnica de CAPS consiste do uso de primers especficos para amplificar uma
determinada regio no genoma, na qual polimorfismos so detectados pela perda ou
ganho de um stio de reconhecimento de uma determinada enzima de restrio. Na
tcnica dCAPS, um stio de reconhecimento de uma enzima de restrio que inclui
um SNP introduzido no produto de PCR por um primer que contm uma ou mais
bases no complementares ao DNA molde. Essas duas tcnicas apresentam as
vantagens de produzirem marcadores codominantes e de serem baseadas em PCR
e eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida.
1.5.3. Anlogos a genes de resistncia
Ao longo da evoluo, as plantas tm desenvolvido vrios mecanismos de
defesa para sua proteo contra doenas e parasitas. Um desses mecanismos
envolve o reconhecimento especfico do patgeno. Entre os eventos celulares que
caracterizam este tipo de resistncia esto a induo da expresso de genes de
defesa, freqentemente manifestada como uma resposta de hipersensibilidade
envolvendo morte celular programada no local da infeco (De Wit, 1995). Estes
genes so chamados genes de resistncia (R-genes).
Nos ltimos anos, um grande nmero de genes de resistncia para diferentes
patgenos tem sido isolado em plantas (Dixon et al., 1998; Yoshimura et al., 1998;
21
Wang et al., 1999; Wang et al., 2002). Esses genes de resistncia podem ser
agrupados pela similaridade em sua seqncia de aminocidos e apresentam
regies comuns. O maior grupo de genes de resistncia, em plantas, codifica para
protenas com o que se supe ser uma regio para ligao de nucleotdeos (NBS
nucleotide binding sites) no N-terminal, assim como uma regio com repeties de
leucina (LRR leucine-rich repeat) no C-terminal. O domnio LRR parece estar
ligado ao reconhecimento do patgeno (Jones & Jones, 1997). Em plantas, a nica
funo associada ao domnio NBS em resistncia a doenas (Tameling et al.,
2002). Enquanto a regio LRR muito varivel, a regio NBS apresenta motivos
conservados (Kobe & Deisenhofer, 1994). Esses motivos (por exemplo, P-loop,
Kinase-2, Kinase-3a) tm sido bastante utilizados para o desenho de primers
degenerados. Os fragmentos amplificados usando-se esses primers so
seqenciados e o produto de traduo putativo desses fragmentos tem indicado
similaridade com genes de resistncia conhecidos. Portanto, estes fragmentos so
chamados anlogos a genes de resistncia (RGAs). Esses trabalhos tm mostrado
que RGAs so freqentemente ligados a genes de resistncia ou, mesmo, partes de
genes de resistncia funcionais (Kanazin et al. 1996; Aarts et al., 1998; Collins et al.,
2001; Donald et al., 2002; McIntyre et al., 2005; Mammadov et al., 2006).
Essa metodologia foi utilizada, com sucesso, em Arachis (Bertioli et al., 2003;
Yuksel et al., 2005). No primeiro trabalho, primers degenerados para a regio NBS
foram desenhados e usados para amplificao em A. hypogaea var. Tatu e quatro
espcies silvestres (A. duranensis, A. cardenasii, A. stenosperma e A. simpsonii) que
apresentam resistncias a vrias doenas que atacam o amendoim. Setenta e oito
RGAs foram identificados, sendo que 63 deles apresentavam ORFs (Open Reading
Frames) no interrompidos. Anlises filogenticas dessas 63 seqncias e de
RGAs de outras espcies, como Glycine max, Lotus japonicus, Medicago truncatula,
Phaseolus vulgaris e Arabidopsis thaliana mostraram a formao de clados,
especficos para as leguminosas, de acordo com o tipo de RGA.
Representantes de cada um desses clados foram utilizados como sondas na
anlise de RFLPs e primers complementares ao motivo kinase-2 foram utilizados em
uma tcnica de AFLP modificada (Hayes & Saghai Maroof, 2000; van der Linden et
al., 2004), para desenvolvimento e mapeamento de RGAs em Arachis spp. (Jos,
2006). Essa tcnica similar ao AFLP (Vos et al., 1995), mas, na segunda PCR
utilizado um primer, especfico ou degenerado, complementar a regies conservadas
22
do motivo NBS, alm de um primer complementar ao adaptador ligado
extremidade do fragmento cortada com a enzima de corte freqente (nesse caso,
Mse I).
1.6. Mapeamento de QTLs e seleo assistida por marcadores
Tradicionalmente, nos programas de melhoramento de plantas em que se
utilizam espcies silvestres, so comuns os retrocruzamentos para a introduo de
genes que conferem caractersticas de interesse, como por exemplo, genes de
resistncia a pragas ou doenas. Em cada gerao de retrocruzamento so
selecionadas as plantas que apresentam o fentipo do alelo a ser introgredido e o
fentipo do parental recorrente para as outras caractersticas. Este processo resulta
na manuteno de parte do genoma doador associada ao gene a ser introgredido
(linkage drag), ou seja, genes no desejveis ou deletrios do parental doador
podem ser transferidos junto aos genes de interesse. Nesse esquema, vrias
geraes de retrocruzamento (8 a 10 geraes) so, em geral, necessrias para a
eliminao das caractersticas indesejveis.
O processo de seleo aps a introgresso pode ser otimizado por meio da
construo de mapas genticos e da identificao de marcadores moleculares
associados aos genes de interesse. Desta forma, possvel, em cada fase de
seleo, a escolha dos indivduos que contm o(s) gene(s) de interesse, mas
tambm, o mximo do gentipo do parental recorrente, diminuindo assim o tempo do
processo de melhoramento. Isso particularmente importante em programas que
visam a introgresso de genes de resistncia a doenas. Neste caso, a seleo
indireta atravs de marcadores moleculares oferece, alm da reduo de tempo, a
possibilidade de identificao e seleo de gentipos resistentes, sem que haja
necessidade da presena do patgeno e ainda possibilita a transferncia e a
manuteno de mais de um gene de resistncia principal durante a seleo
(piramidizao de genes de resistncia).
Para implementao de um esquema efetivo de seleo assistida por
marcadores em programas de melhoramento gentico, trs requerimentos so
essenciais: (1) os marcadores devem estar fortemente ligados aos genes que
controlam as caractersticas de interesse; (2) os marcadores moleculares utilizados
devem estar facilmente disponveis para a anlise de grandes populaes (portanto,
23
baseados em PCR), devem ser codominantes e dispersos por todo o genoma e (3)
as tcnicas utilizadas devem ser de baixo custo e reproduzveis entre laboratrios
(Mohan et al., 1997).
A maioria das caractersticas importantes agronomicamente, como
produtividade, precocidade, qualidade do gro e resistncias a alguns estresses
biticos ou abiticos em plantas controlada por vrios genes (caractersticas
polignicas, quantitativas ou de herana complexa). Nesse caso, os fentipos
resultantes apresentam uma variao contnua, em vez de classes fenotpicas
discretas. Os genes ou locos cromossmicos que controlam uma determinada
caracterstica quantitativa so denominados QTLs (Quantitative Trait Loci).
O mapeamento de QTLs consiste em se detectar uma associao entre o
fentipo em questo e o gentipo de marcadores. Marcadores so utilizados para
dividir a populao de mapeamento em classes genotpicas diferentes de acordo
com os gentipos do loco marcador. Em seguida, mtodos estatsticos so utilizados
para determinar se os indivduos das diferentes classes genotpicas diferem
significativamente, com respeito caracterstica sendo avaliada (Tanksley, 1993).
Se h diferenas significativas, considera-se que os genes que controlam a
caracterstica em questo esto ligados ao loco marcador. Os testes de significncia
desses parmetros so, geralmente, feitos pela razo de verossimilhana (LR) ou
por LOD escore. Os valores de LR ou de LOD so estimados para cada posio do
cromossomo e ento plotados em grficos, para facilitar a visualizao.
Trs mtodos tm sido mais utilizados para mapeamento de QTLs: anlises
de marcas simples, mapeamento por intervalo (Lander & Botstein, 1989) e
mapeamento por intervalo composto (Jansen, 1993; Zeng, 1993; 1994). O mtodo
de marcas simples baseia-se na comparao entre as mdias fenotpicas obtidas
para as diferentes classes genotpicas de um determinado marcador
individualmente. Os mtodos estatsticos geralmente utilizados para verificar se as
diferenas observadas so significativas incluem o teste de t, anlises de varincia
(ANOVA), regresso linear simples e o mtodo de mxima verossimilhana (Ferreira
& Grattapaglia, 1998; Coelho & Silva, 2002). Esse mtodo o mais simples e no
requer a construo de mapas. No entanto, de acordo com Liu (1998), a posio do
QTL no pode ser precisamente determinada e no possvel distinguir um QTL de
pequeno efeito situado muito prximo ao marcador de um QTL de grande efeito
situado mais longe.
24
O mapeamento por intervalo feito com base nas freqncias conjuntas de
um par de marcadores adjacentes e um QTL localizado entre esses dois marcadores
e, portanto, requer a existncia de um mapa de ligao. De acordo com Schuster &
Cruz (2004), esse mtodo consiste resumidamente das seguintes etapas: (a) como a
distncia entre cada par de marcadores conhecida, o mtodo investiga o intervalo
em incrementos predefinidos, usando a funo de mapeamento e estimando os
parmetros do modelo a cada ponto de anlise; (b) a funo de verossimilhana (ou
a anlise de regresso, Haley & Knott, 1992) ento usada para os clculos,
utilizando os valores estimados e tambm sob a hiptese nula de ausncia de QTL,
sendo calculada na forma de LOD escores para cada ponto ao longo do genoma; (c)
o mximo LOD escore entre todas as anlises indica a presena de um QTL, caso
seja maior do que um mnimo estabelecido estatisticamente. Esse mtodo apresenta
vantagens em relao ao mtodo de marcas simples, pois permite que sejam
estimados os parmetros envolvidos na anlise, como a mdia, a varincia, o efeito
do QTL e a distncia entre o QTL e os marcadores adjacentes (Lander & Botstein,
1989; Liu, 1998). No entanto, esse mtodo apresenta problemas quando h QTLs
ligados ou interaes entre QTLs (Liu, 1998). Por isolar o intervalo analisado do
restante do genoma, no considera os efeitos de outros QTLs prximos ao QTL
contido no intervalo, levando identificao de QTLs fantasmas (Lynch & Walsh,
1998; Coelho & Silva, 2002).
Esses problemas so quase totalmente resolvidos com o mtodo de
mapeamento por intervalo composto (Schuster & Cruz, 2004). Esse mtodo combina
o mapeamento por intervalo com a anlise de regresso linear mltipla, com o intuito
de se eliminar a interferncia de QTLs adjacentes ao intervalo que est sendo
mapeado, reduzindo a identificao de QTLs inexistentes (Coelho & Silva, 2002).
Atualmente, esse tem sido o mtodo mais utilizado, por permitir um aumento na
preciso e no poder de deteco de QTLs, especialmente quando QTLs ligados
esto envolvidos. No mtodo de mapeamento por intervalo composto, marcadores,
selecionados por regresso, so utilizados como cofatores, permitindo controlar os
efeitos de outros QTLs, enquanto o QTL do intervalo de interesse investigado. No
entanto, esse mtodo considera um nico QTL de cada vez. Recentemente, um
quarto mtodo foi desenvolvido, chamado mapeamento por intervalo mltiplo (Kao et
al., 1999). Esse mtodo utiliza intervalos mltiplos de marcadores simultaneamente
para a identificao de mltiplos possveis QTLs. Com isso, podem ser estimados os
25
efeitos de interao entre QTLs (epistasia), os valores genotpicos dos indivduos e
as herdabilidades das caractersticas quantitativas (Kao et al., 1999). Comparado
aos mtodos de marcas simples, de mapeamento por intervalo e por intervalo
composto, esse mtodo permite um aumento na preciso e no poder de deteco de
QTLs (Kao et al., 1999; Coelho & Silva, 2002).
1.7. Mapeamento de QTLs em Arachis
Poucos estudos de mapeamento de genes individuais ou de QTLs tm sido
publicados em Arachis. Garcia e colaboradores (1996) identificaram dois genes
dominantes, ligados, que conferiam resistncia ao nematide-das-galhas
(Meloidogyne arenaria raa 1), usando uma populao F2 tetraplide, derivada de
um cruzamento entre A. hypogaea e A. cardenasii (tratada com colchicina). Esses
genes foram designados Mae, gene que reduz a capacidade de reproduo do
patgeno (produo de ovos) e Mag, gene que inibe a formao de galhas.
Marcadores RAPD, SCAR e RFLP, junto a BSA ou Bulked Segregant Analysis
(Michelmore et al., 1991), foram utilizados para anlise dessa populao F2, sendo
detectada a ligao de um marcador RAPD a 10 cM e a 14 cM de Mag e Mae,
respectivamente. Tambm para mapeamento de genes de resistncia a nematides,
uma populao de retrocruzamento (BC4F2) entre A. hypogaea e uma planta
anfidiplide sinttica, obtida por duplicao de cromossomos com colchicina da
planta resultante de cruzamentos entre trs espcies silvestres diplides {A.
batizocoi x (A. cardenasii x A. diogoi)}c foi utilizada, junto tcnica de BSA (Burow et
al., 1996). Trs marcadores RAPD foram identificados ligados a um nico gene
dominante (RKN para Root-knot nematode), que confere resistncia a M.
arenaria, estando o mais prximo a 5,4 cM desse gene. Anlises de seis populaes
BC5F2 resultantes desses cruzamentos, possibilitaram a identificao de trs
marcadores RFLP distantes a 4,2; 5,2 e 11,2 cM desse gene (Choi et al., 1999). Os
dois marcadores RFLP mais prximos a esse gene de resistncia foram utilizados,
posteriormente, na seleo assistida do amendoim (Church et al., 2000). Com isso,
indivduos homozigotos para resistncia a M. arenaria puderam ser identificados,
ainda no viveiro, resultando em grande economia de tempo e espao. No entanto,
esses marcadores encontram-se ainda distantes dos genes de resistncia,
resultando em erros de identificao das plantas selecionadas (estimados em 4%).
26
Stalker & Mozingo (2001) relataram a identificao de marcadores RAPD que
explicavam cerca de 35% da variao para resistncia mancha castanha
(Cercospora arachidicola) em uma populao de amendoim que tinha A. cardenasii
em seu pedigree e 10% da variao em um cruzamento de A. hypogaea x A.
hypogaea. Esse ltimo foi o primeiro relato de marcadores moleculares associados a
genes de resistncia em um cruzamento intraespecfico de A. hypogaea.
Recentemente, marcadores AFLP, em conjunto com BSA, foram utilizados para o
mapeamento de genes de resistncia a um afdeo, vetor do vrus rosette, que a
principal doena do amendoim causada por vrus na frica (Herselman et al., 2004).
Foi utilizada uma populao segregante F2, resultante do cruzamento entre dois
acessos de A. hypogaea. Um marcador foi mapeado a 3,9 cM de um nico gene
recessivo, que explicava 76,1% da variao para resistncia ao afdeo.
27
2. OBJETIVOS GERAIS
1 - Desenvolver uma bateria de marcadores microssatlites para o amendoim, a
partir de bibliotecas genmicas enriquecidas para dinucleotdeos, de
bibliotecas de ESTs e por minerao (data mining) de seqncias
depositadas no GenBank para Arachis spp. (Captulo 1);
2 - Caracterizar os marcadores obtidos em um grupo de acessos de A.
hypogaea, representando as seis variedades botnicas descritas para o
amendoim (Captulo 1);
3 - Construir um mapa gentico para espcies diplides de Arachis, de genoma
AA, usando marcadores microssatlites, marcadores ncoras e RGAs
(Captulo 2);
4 - Mapear QTLs que controlam caractersticas de interesse agronmico para o
melhoramento gentico do amendoim, sendo dois componentes da
produtividade (peso de sementes e nmero de sementes por planta) e
resistncia ao fungo causador da mancha preta (Cercosporidium
personatum) no amendoim (Captulo 2).
28
Captulo 1
Desenvolvimento e caracterizao de marcadores microssatlites para o amendoim (Arachis hypogaea L.)*
*Este captulo a traduo de parte do artigo publicado na Theoretical and Applied Genetics (Moretzsohn et al., 2005 ANEXO 1), acrescida da anlise das
relaes genticas entre acessos de Arachis hypogaea.
29
1. INTRODUO
Arachis hypogaea possui considervel variabilidade para diversas
caractersticas morfolgicas, fisiolgicas e agronmicas. No entanto, pouca variao
tem sido detectada por marcadores moleculares, tais como RAPD, AFLP, RFLP e
microssatlites (Halward et al., 1991; Kochert et al., 1991, 1996; Lanham et al.,
1992; Paik-Ro et al., 1992; Hilu & Stalker, 1995; He & Prakash, 1997; Subramanian
et al., 2000; Gimenes et al., 2002; Herselman, 2003; Moretzsohn et al., 2004; He et
al., 2005; Milla et al., 2005). Acredita-se que essa baixa variabilidade gentica seja
decorrente de trs fatores: (1) isolamento reprodutivo do amendoim em relao s
espcies silvestres diplides, devido poliploidizao (Young et al., 1996); (2)
evento de poliploidizao recente, a partir de um ou poucos indivduos de cada
espcie ancestral, associado ao modo de reproduo autgamo do amendoim
(Halward et al., 1991) e (3) uso de poucas linhagens-elite e pouco germoplasma
extico nos programas de melhoramento da cultura, resultando em uma base
gentica estreita (Knauft & Gorbet, 1989; Isleib & Wynne, 1992; Isleib et al., 2001).
Essa pouca variabilidade gentica tem dificultado os avanos no
melhoramento molecular do amendoim. A identificao de marcadores moleculares
polimrficos seria, portanto, de grande utilidade. Marcadores microssatlites
constituem a ferramenta ideal para a construo de mapas genticos, para o
mapeamento de QTLs e para o uso em seleo assistida por marcadores, por serem
multiallicos, codominantes e baseados em PCR. Microssatlites tm sido utilizados
em diversas espcies de plantas com esse fim (revisto por Gupta & Varshney, 2000,
Ellegren, 2004). No entanto, pouco tem sido feito com o amendoim e, at o
momento, nenhum mapa baseado em marcadores microssatlites foi publicado para
Arachis.
At recentemente, marcadores microssatlites eram desenvolvidos
basicamente a partir de bibliotecas genmicas enriquecidas para essas seqncias.
Esse processo apresenta custo elevado, lento e bastante intensivo em mo-de-
obra, considerando-se todas as etapas. Nos ltimos anos, diversos projetos de
seqenciamento de ESTs tm surgido para as mais diversas espcies de animais e
plantas. Esses projetos tm mostrado que SSRs esto localizados tambm em
regies transcritas do genoma (Kantety et al., 2002; Morgante et al., 2002; Gao et
al., 2003; Eujayl et al., 2004; Li et al., 2004; Varshney et al., 2005). Muitas dessas
30
seqncias so depositadas em bases de dados pblicas e constituem uma nova
fonte de desenvolvimento de marcadores microssatlites. Com isso, esses
marcadores podem ser gerados rapidamente e quase sem custo.
Embora um grande nmero de marcadores microssatlites tenha sido
publicado para o amendoim nos ltimos anos (Hopkins et al., 1999; He et al., 2003;
2005; Ferguson et al., 2004b; Moretzsohn et al., 2004), os marcadores disponveis
so ainda insuficientes para a construo de mapas saturados para o amendoim.
Alm disso, o uso de marcadores desenvolvidos de diferentes formas, amostrando
diferentes regies do genoma, com diferentes modos de evoluo, dever
possibilitar uma melhor cobertura do genoma, na construo de mapas genticos.
Portanto, os objetivos do presente trabalho foram: (1) desenvolver um grande
nmero de marcadores microssatlites para o amendoim, a partir de bibliotecas
genmicas enriquecidas para dinucleotdeos TC/AG e AC/TG, de bibliotecas de
ESTs e por minerao (data mining) de seqncias publicadas no GenBank para
Arachis spp.; (2) caracterizar os novos marcadores em um grupo de acessos de A.
hypogaea; e (3) analisar as relaes genticas entre acessos de A. hypogaea,
representando as seis variedades conhecidas de amendoim.
31
2. MATERIAL E MTODOS 2.1. Material vegetal
Uma nica planta de A. hypogaea cv. Tatu foi utilizada para a construo das duas bibliotecas genmicas. Para a caracterizao dos novos marcadores e anlise
das relaes genticas, foram includos 16 acessos de A. hypogaea representando
as duas subspcies (hypogaea e fastigiata) e as seis variedades descritas por
Krapovickas & Gregory, 1994 (Tabela 1). Essas plantas foram obtidas no Banco
Ativo de Germoplasma de Arachis (BAG-Arachis), mantido na Embrapa Recursos
Genticos e Biotecnologia, Braslia, DF.
2.2. Extrao e quantificao de DNA
DNA genmico total foi extrado de fololos jovens, de acordo com o mtodo descrito por Ferreira & Grattapaglia (1998), com algumas modificaes. Aps a
extrao com clorofrmio-lcool isoamlico (24:1), a fase aquosa foi dividida em dois
tubos e acrescentados 3 volumes de tampo de precipitao (CTAB 1%, Tris-HCl 50
mM, EDTA 20 mM). Aps centrifugao, o sobrenadante foi descartado e o pellet
ressuspenso em NaCl 1,2 M. Em seguida, o DNA foi precipitado com etanol 100% e
lavado duas vezes com etanol 70%.
A concentrao de DNA de cada tubo foi estimada por eletroforese em gel de
agarose a 1,5% de concentrao, comparando-se as intensidades de fluorescncia
de cada amostra corada com brometo de etdio com diferentes padres de DNA
Lambda.
32
Tabela 1 Acessos de Arachis hypogaea includos na caracterizao dos novos marcadores microssatlites. Os acessos utilizados na triagem inicial dos 271 novos marcadores so identificados com um asterisco aps o nome. So apresentados tambm a classificao taxonmica e o local de coleta de cada acesso.
Nmero Acesso Espcie / Subespcie / Variedade (Tipo) Local de coleta 1 cv. BR-1* A. hypogaea ssp. fastigiata var. fastigiata (Valncia) Paraba, Brasil 2 cv. IAC Tatu-ST A. hypogaea ssp. fastigiata var. fastigiata (Valncia) So Paulo, Brasil 3 V 6265 A. hypogaea ssp. fastigiata var. fastigiata (Valncia) Bahia, Brasil 4 Mf 3207* A. hypogaea ssp. fastigiata var. vulgaris (Spanish) Desconhecido 5 V 13115 A. hypogaea ssp. fastigiata var. vulgaris (Spanish) Minas Gerais, Brasil 6 Mf 1560* A. hypogaea ssp. fastigiata var. peruviana Pastaza, Ecuador 7 Sv 429 A. hypogaea ssp. fastigiata var. peruviana Yurimguas, Peru 8 Mf 1678* A. hypogaea ssp. fastigiata var. aequatoriana Sucurubios, Ecuador 9 Mf 2389 A. hypogaea ssp. fastigiata var. aequatoriana Desconhecido
10 cv. IAC Runner 886 A. hypogaea ssp. hypogaea var. hypogaea (Virgnia) So Paulo, Brasil 11 V 10067 A. hypogaea ssp. hypogaea var. hypogaea (Virgnia) Santa Catarina, Brasil 12 V 13009* A. hypogaea ssp. hypogaea var. hypogaea (Virgnia) Tocantins, Brasil 13 Of 109 A. hypogaea ssp. hypogaea var. hypogaea (Xingu) Mato Grosso, Brasil 14 Of 128 A. hypogaea ssp. hypogaea var. hypogaea (Xingu) Mato Grosso, Brasil 15 Mf 3618 A. hypogaea ssp. hypogaea var. hirsuta Desconhecido 16 Mf 1538* A. hypogaea ssp. hypogaea var. hirsuta Pichincha, Ecuador
33
2.3. Construo de bibliotecas genmicas
Duas bibliotecas de DNA genmico total, enriquecidas para dinucleotdeos
TC/AG e AC/TG foram construdas, seguindo o protocolo descrito por Rafalski e
colaboradores (1996), com modificaes. DNA genmico total foi extrado de uma
nica planta de amendoim (A. hypogaea c
